DE60209617T2

DE60209617T2 - Quantitative Multiplex-PCR mit grossem Dynamikbereich

Info

Publication number: DE60209617T2
Application number: DE60209617T
Authority: DE
Inventors: Dr. Karim Tabiti; Gisela Betzl; Dr. Richie Parap Soong; Randy Salt Lake City Rasmussen; Deepika Marine Salt Lake City DeSilva; John G. Salt Lake City Ward; Haliegh Page Riverton Willward
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH; Idaho Technology Inc
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH; Biofire Defense LLC
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2002-11-16
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2022-11-17
Also published as: JP3909010B2; EP1312684A3; ES2260378T3; CA2407744C; EP1312684A2; EP1312684B1; US20030215830A1; ATE319859T1; US7118867B2; DE60209617D1; JP2003210199A; CA2407744A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Echtzeit-PCR. Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Gebiet der Quantifizierung von Nukleinsäuren, im Besonderen zelluläre mRNA.
Hintergrund des Stands der Technik
Die Quantifizierung von mRNA ist eine bedeutende Aufgabe auf dem Gebiet der Molekularbiologie gewesen, um Informationen über die Expression von bestimmten interessierenden Genen zu erhalten. Herkömmlich ist dies entweder mittels semi-quantitativer Northern-Blot Analyse oder mittels semi-quantitativer RNAse-Schutzexperimente getan worden.
Außerdem haben die Verfügbarkeit der PCR-Technologie und im Besonderen die Verfügbarkeit der Reversen Transkriptase-PCR (RT-PCR) einen sensitiveren quantitativen Nachweis von mRNAs mit geringer Abundanz aus kleinen Proben ermöglicht. In der RT-PCR wird zuerst eine einzelsträngige cDNA von einer zu analysierenden mRNA unter Verwendung einer Reversen Transkriptase erzeugt. Anschließend wird ein doppelsträngiges DNA-Amplifikationsprodukt mit Hilfe der PCR generiert.
Es wird ein Unterschied zwischen zwei unterschiedlichen Varianten dieses Verfahrens gemacht. In der sogenannten „relativen Quantifizierung" wird das Verhältnis der Expression einer bestimmten Ziel-RNA relativ zu der Menge an RNA eines sogenannten Haushaltsgens festgestellt, von welchem angenommen wird, in allen Zellen unabhängig von dem jeweiligen physiologischen Status konstitutiv exprimiert zu werden. Folglich ist die mRNA ungefähr in gleicher Menge in allen Zellen vorhanden. Der Vorteil von diesem ist, daß unterschiedliche Ausgangsqualitäten der verschiedenen Probematerialien und das Verfahren der RNA-Präparation keinen Einfluß auf das jeweilige Ergebnis haben. Jedoch ist eine absolute Quantifizierung mit diesem Verfahren nicht möglich.
Alternativ kann die absolute Menge der verwendeten RNA mit Hilfe von Standard-Nukleinsäuren einer bekannten Kopienzahl und der Amplifikation einer entsprechenden Verdünnungsreihe dieser Standard-Nukleinsäuren festgestellt werden. Wenn interne Standards verwendet werden, d.h. bei der Amplifikation der Standard- und Ziel-Nukleinsäuren in einem Reaktionsgefäß, müssen Standards eingesetzt werden, die im Vergleich zu der zu analysierenden Zielsequenz andersartige Sequenzen haben, um in der Lage zu sein, zwischen der Amplifikation der Standard- und Ziel-Nukleinsäure zu unterscheiden.
Weiterer Fortschritt konnte durch die Anwendung von Verfahren der kinetischen Echtzeit-PCR erzielt werden, die eine kinetische Kontrolle der Amplifikationsreaktion und folglich eine genauere Quantifizierung der einzelnen Zielmoleküle ermöglichen.
In diesem Fall wird die Bildung der PCR-Produkte in jedem Zyklus der PCR überwacht. Die Amplifikation wird normalerweise in Thermozyklern gemessen, die zusätzliche Vorrichtungen für das Messen von Fluoreszenzsignalen während der Amplifikationsreaktion haben. Ein typisches Beispiel von diesen ist der Roche Molecular Biochemicals LightCycler (Cat. No. 20110468). Die Amplifikationsprodukte werden zum Beispiel mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Hybridisierungssonden, die nur Fluoreszenzsignale abgeben, wenn sie an die Ziel-Nukleinsäure gebunden werden, oder in bestimmten Fällen auch mit Hilfe von fluoreszierenden Farbstoffen, die doppelsträngige DNA binden, detektiert.
Eine bestimmte Signalschwelle wird für alle zu analysierenden Reaktionen festgelegt und die Anzahl der erforderlichen Zyklen (Cp-Zyklen), um diesen Schwellenwert zu erreichen, wird sowohl für die Ziel-Nukleinsäure als auch für die Referenz-Nukleinsäuren, wie zum Beispiel Standard- oder Haushaltsgene, ermittelt. Die absoluten oder relativen Kopienzahlen des Zielmoleküls können auf der Grundlage der Cp-Werte, die für die Ziel-Nukleinsäure und die Referenz-Nukleinsäure erhalten werden, festgestellt werden (Gibson, U. E., et al., Genome Res 6 (1996) 995–1001.; Bieche, I., et al., Cancer Res 59 (1999) 2759–65.; WO 97/46707). Solche Verfahren werden auch als Echtzeit-PCR bezeichnet.
Zusammenfassend bezieht sich in all den beschriebenen Verfahren für die Quantifizierung einer Nukleinsäure durch PCR die Kopienzahl, die während der Amplifikationsreaktion entsteht, immer auf die Kopienzahl, die von einer Referenz-Nukleinsäure, welche entweder ein Standard oder eine RNA von einem Haushaltsgen ist, gebildet wird.
In vielen Fällen ist es von außerordentlichem Interesse, mehr als ein Nukleinsäureziel innerhalb eines Reaktionsgefäßes in einem sogenannten Multiplex-Ansatz quantitativ zu bestimmen. Dies ist zum Beispiel der Fall für Ausführungsformen der relativen Quantifizierung, worin das Expressionslevel einer bestimmten mRNA im Vergleich zu dem Expressionslevel eines typischen Haushaltsgens festgestellt wird (Meijerink, J., et al., J Mol Diag 3 (2001) 55–61). Außerdem kann die simultane Quantifizierung von unterschiedlichen mRNA-Spezies von Interesse sein, falls komplexere Expressionsmuster untersucht werden müssen, um komplizierte zelluläre Prozesse zu erforschen oder zu analysieren.
Der große Nachteil bei der Multiplex-PCR ist, daß in vielen Fällen eine Nukleinsäureziel-Spezies mit geringer Abundanz im Vergleich zu einer zweiten Nukleinsäureziel-Spezies nicht mit angemessener Effizienz amplifiziert werden kann, so daß ein entsprechendes Amplifikationssignal, das dem Nukleinsäureziel mit geringer Abundanz entspricht, nicht ermittelt wird (zum Beispiel: Berovich, D., et al., Biotechniques 27 (1999) 762–770). Anders gesagt sind die Dynamikbereiche der Nukleinsäuremengen, die in einem Multiplex-Ansatz in vielen Fällen ermittelt werden können, sehr begrenzt.
In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu erwähnen, daß der Dynamikbereich eines Multiplex-Ansatzes üblicherweise unabhängig von den absoluten Werten der verschiedenen zu detektierenden Ziel-Nukleinsäuren ist, aber fast ausschließlich vom molaren Verhältnis der verschiedenen Ziel-Nukleinsäuren, die in der zu analysierenden Probe vorhanden sind, abhängt.
Erstaunlicherweise jedoch scheint der Dynamikbereich, der erhalten werden kann, Probe- und Ziel-abhängig zu sein: Vet, J. A., et al., Proc Natl Acad Sci USA 96 (1999) 6394–9 offenbaren eine hoch entwickelte Multiplex-Analyse für den Nachweis von vier pathogenen Retroviren unter Verwendung von molekularen Leuchtsignalen (Molecular Beacons), worin der Dynamikbereich 10⁴ ist. Gleichermaßen legen Direktor-Myska, A. E., et al., Environ Mol Mutagen 37 (2001) 147–154 eine spezifische quantitative Analyse einer Plasmidmischung unter Verwendung des fluorogenen 5' Nuklease-Formats (TaqMan Format) offen, worin ein Dynamikbereich von 10³ bis 10⁴ erzielt wird.
Tucker, R. A., et al., Mol Diagn 6 (2001) 39–47 offenbaren eine TaqMan Echtzeit-PCR Analyse zur relativen Quanifizierung von HPV 16 im Vergleich zu beta-Aktin mRNA, worin die Amplifikation von 5 × 10⁴ Aktin-Kopien die Amplifikation von HPV 16 RNA nicht beeinflußt, jedoch beeinflußt andererseits der 100-fache Überschuß der HPV 16 mRNA-Vorlage die Amplifikation von beta-Aktin. Besonders aus diesem Beispiel kann geschlußfolgert werden, daß die molekulare Grundlage für Probleme, einen angemessenen Dynamikbereich in der Multiplex-PCR zu erhalten, weit davon entfernt ist, verstanden zu werden.
Es sind auf dem Fachgebiet Versuche gemacht worden, um dieses Problem durch ein entsprechendes Anpassen der Primerkonzentrationen zu überwinden. Halminen, M., et al., Cytokine 11 (1999) 87–93 offenbaren die relative Quanifizierung von Interferon-Gamma mRNA und Interferon-4 mRNA im Vergleich zur beta-Aktin Expression, worin begrenzte Mengen von beta-Aktin Primern verwendet werden. Ebenso empfehlen Berovich, D., et al., Biotechniques 27 (1999) 762–770 das Einsetzen eines erhöhten Primeranteils der unter-repräsentierten Ziel-Nukleinsäure oder alternativ, die Erniedrigung der Annealing-Temperatur solcher Multiplex-Reaktionen.
Alle die Verfahren, die in dem Fachgebiet offenbart sind, erfordern jedoch eine Zeit aufwendige Anpassung der PCR-Bedingungen als eine Vorbedingung für die entsprechend genaue Messung der Nukleinsäurekonzentrationen. Folglich besteht auf diesem Fachgebiet das Bedürfnis nach einem standardisierten Multiplex-PCR-Protokoll, das einen angemessenen breiten Dynamikbereich, ohne spezielle Anpassung hinsichtlich der Art des Ziel oder der Konzentration der verwendeten Primer, zur Verfügung stellt.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Dementsprechend stellt die neue Erfindung ein Verfahren für die quantitative Miltiplex-PCR mit einem Dynamikbereich von mindestens 10² zur Verfügung, worin eine thermisch stabile DNA-Polymerase mit einer Endkonzentration von mindestens 0,5 Einheiten/μl verwendet wird. Vorzugsweise wird ein Dynamikbereich von wenigstens 10³ und am meisten bevorzugt wird ein Dynamikbereich von wenigstens 10⁴ erhalten.
Spezieller ist die Erfindung auf ein Verfahren für die Quantifizierung mindestens einer ersten und einer zweiten Nukleinsäure in einer Probe mit Hilfe der PCR gerichtet, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die ursprüngliche Konzentration der ersten Nukleinsäure in der Probe im Überschuß von mehr als einem Faktor 100, im Vergleich zur ursprünglichen Konzentration der zweiten Nukleinsäure, vorliegt, umfassend die Zugabe eines ersten Primerpaars für die Amplifikation der ersten Nukleinsäure, die Zugabe eines zweiten Primerpaars für die Amplifikation einer zweiten Nukleinsäure und die Amplifikation der zwei Nukleinsäuren durch eine thermisch stabile DNA-Polymerase. Entsprechend der Erfindung ist die besagte thermisch stabile DNA-Polymerase in einer Konzentration von mindestens 0,5 Einheiten/μl Reaktion vorhanden und die Amplifikation der zweiten Nukleinsäure nicht bis weniger als 10%, im Vergleich zur Amplifikation der zweiten Nukleinsäure mit dem zweiten Primerpaar in Abwesenheit des ersten Primerpaars, inhibiert.
Es ist auch nachgewiesen worden, zusätzlich vorteilhaft zu sein, wenn eine PCR entsprechend der vorliegenden Erfindung mittels Heißstart durchgeführt wird, d.h. durch geeignete Inhibition der Primerdimer-Bildung. In diesem Fall ist die DNA-Polymerase entsprechend der Erfindung in einer Konzentration von mindestens 0,25 Einheiten/μl vorhanden.
Dieses erfinderische Verfahren ist besonders anwendbar, wenn die PCR-Amplifikation in Echtzeit überwacht wird. Vorzugsweise werden die erhaltenen Amplifikationsprodukte jeweils durch mindestens eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde nachgewiesen.
In einer speziellen Ausführungsform werden zwei benachbarte Hybridisierungssonden für jede Ziel-Nukleinsäure verwendet, und jede Sonde wird in geeigneter Weise mit einer fluoreszierenden Einheit markiert, wobei die Einheiten in der Lage sind, bei der Hybridisierung Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung (FRET-Hybridisierungssonden) durchzuführen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, die auch die Echtzeit-Kontrolle umfassen kann, werden die Amplifikationsreaktionen mit Hilfe des schnellen Thermocyclings durchgeführt, worin ein Zyklus weniger als eine Minute dauert.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf Kits gerichtet, die Reagenzien für das Durchführen des (der) erfinderischen Verfahrens (Verfahren) umfassen. Solch ein Kit umfasst vorzugsweise einen Mastermix, der eine thermisch stabile DNA-Polymerase in einer ausreichenden Konzentration umfasst, um eine Endkonzentration der besagten thermisch stabilen DNA-Polymerase von mindestens 0,5 Einheiten/μl zur Verfügung zu stellen oder alternativ von mindestens 0,25 Einheiten/μl und zusätzliche Mischungen, die für ein Heißstart-Amplifikationsprotokoll erforderlich sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die neue Erfindung stellt ein Verfahren zur quantitativen Multiplex-PCR mit einem Dynamikbereich von mindestens 10² zur Verfügung, worin eine thermisch stabile DNA-Polymerase mit einer Endkonzentration von mindestens 0,5 Einheiten/μl verwendet wird. Bevorzugt wird ein Dynamikbereich von mindestens 10³ und insbesondere wird ein Dynamikbereich von mindestens 10⁴ erhalten.
Es ist auch wichtig zu erwähnen, daß das erfinderische Verfahren für eine breite Vielfalt verschiedener Ziel-Konzentrationen anwendbar ist. In diesem Zusammenhang wird auch in den Beispielen gezeigt werden, dass der gleiche Dynamikbereich entsprechend der Erfindung wenigstens für den Fall, dass die innerhalb der Multiplex- Analyse zu amplifizierenden Ziel-Nukleinsäuren in Kopienzahlen zwischen 10² und 10⁸ vorhanden sind, erhalten wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine Einheit thermisch stabiler DNA-Polymerase als die Menge Enzym definiert, die 20 nmol Gesamt-Desoxyribonucleosidtriphosphate in sauer, präzipitierbare DNA innerhalb von 60 Minuten bei 65°C unter Standardanalysebedingungen einbaut.
Diese Bedingungen sind 67 mM Tris/HCl, pH 8,3/25°C, 5 mM MgCl₂, 10 mM Mercaptoethanol, 0,2% Polydocanol, 0,2 mg/ml Gelatine, 0,2 mM von jeweils dATP, dGTP, dTTP und 0,1 mM dCTP, pH 8,3/25°C.
Die Aktivität kann durch Inkubation von M13mp9ss, M13 Primer (17 mer) und 1 μCi (alpha-32-P) dCTP mit geeigneten Verdünnungen der Taq-Polymerase in einem 50 μl Inkubationspuffer bei 65°C für 60 min gemessen werden. Die Menge der eingebauten dNTPs wird dann durch die Trichloressigsäure-Präzipitation bestimmt.
Die Multiplex-PCR entsprechend der Erfindung und auch wie im Stand der Technik offenbart, ist definiert als eine PCR Analyse, worin in einem Reaktionsbehälter mehr als eine Nukleinsäure-Zielsequenz in der Anwesenheit von mehr als einem Paar (mindestens von zwei Paaren) Amplifikationsprimern vervielfältigt wird.
Die Erfindung ist ausdrücklich auf ein Verfahren zur Quantifizierung von mindestens einer ersten und einer zweiten Nukleinsäure in einer Probe mittels PCR gerichtet. Für viele Anwendungen werden die zu analysierenden Ziel-Nukleinsäuren aus der gesamten zellulären RNA oder der gesamten PolyA-RNA (mRNA) hergeleitet. Für so eine RT-PCR Analyse wird die Quantifizierung mittels einer RNA-abhängigen cDNA-Synthese vor der Amplifikationsreaktion selbst erreicht. Die cDNA-Synthesereaktion kann entweder unter Verwendung eines speziellen Reverse-Transkriptase Enzyms durchgeführt werden, gefolgt von der Amplifikation mit einer herkömmlichen thermisch stabilen DNA-Polymerase. Alternativ können die cDNA-Synthese und die RT-PCR unter Verwendung eines thermisch stabilen Enzyms durchgeführt werden, welches beides besitzt, eine RNA-abhängige Reverse-Transkriptase- und eine DNA-ahhängige DNA-Polymerase-Aktivität.
Trotz des Vorangegangenen kann genomische DNA auch in einem Multiplex-Ansatz entsprechend der Erfindung, z.B. für die Ermittlung von Gendosen oder der Anzahl von repetitiven Sequenzen, untersucht werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann der Begriff „Quantifizierung einer Nukleinsäure" unterschiedliche Möglichkeiten, wie die absolute Ermittlung der Kopienzahlen von in einer Probe vorhandenen multiplen Nukleinsäuren im Vergleich zu einem absoluten Referenz-Standard oder alternativ die Ermittlung eines relativen Werts im Vergleich zu anderen in der gleichen Probe gefundenen Nukleinsäuren, umfassen.
Es ist natürlich auch innerhalb des Umfangs der Erfindung wenn nicht nur zwei, vielmehr mehrere Ziel-Nukleinsäuren amplifiziert werden. Bezüglich der Anzahl der zu analysierenden Ziele ist experimentell noch keine obere Begrenzung festgestellt worden. In der Versuchspraxis wird allerdings das erfinderische Verfahren nur durch die Anzahl der Möglichkeiten für den Nachweis verschiedener amplifizierter Fragmente begrenzt.
Die ursprünglichen Konzentrationen der interessierenden verschiedenen Ziel-Nukleinsäuren entsprechend der Erfindung können sich von einander mindestens durch einen Faktor von 100 unterscheiden. Außerdem ist es auch von den Erfindern nachgewiesen worden, daß das neue Verfahren allgemein auf Situationen anwendbar ist, worin sich die Anfangskonzentrationen der verschiedenartigen Ziel-Nukleinsäuren von einander durch einen Faktor von 1000 oder sogar von 10000 unterscheiden können. Entsprechende Daten werden in den Beispielen unten gezeigt.
Eine typische Analyse entsprechend der Erfindung umfaßt ein Paar Amplifikationsprimer für jede zu quantifizierende Ziel-Nukleinsäure, einen geeigneten Puffer, Desoxynukleosidtriphosphate und eine thermisch stabile DNA-Polymerase mit einer Konzentration von mindestens 0,5 Einheiten/μl Reaktion. Unabhängig von der Art und von der Anzahl der quantitativ zu bestimmenden Amplifikationsziele, garantiert die hohe Enzymkonzentration, daß die Amplifikation der Ziele mit niedriger Abundanz nicht mehr als 10% durch das Vorhandensein von anderen amplifizierten Zielen inhibiert wird, verglichen mit der Amplifikation von Ziel-Nukleinsäuren mit niedriger Abundanz in einem Monoplex-Ansatz.
Dagegen ist die maximale Konzentration der Polymerase, die eingesetzt werden kann, normalerweise 10 Einheiten/μl. Konzentrationen von ungefähr 5 Einheiten/μl, d.h. zwischen 3 und 7 Einheiten/μl oder vorzugsweise von ungefähr 2 Einheiten/μl, d.h. zwischen 1 und 3 Einheiten/μl, funktionieren auch in den meisten Fällen sehr gut.
Außerdem kann die Amplifikation in Anwesenheit von Mitteln durchgeführt werden, die ein Hilfsmittel für den Nachweis der Amplifikationsprodukte zur Verfügung stellen. Beispielsweise kann der Reaktionsbehälter bereits geeignete Hybridisierungssonden für den gleichartigen Echtzeit-Nachweis der Amplifikationsprodukte enthalten. Vorzugsweise können diese Sonden mit Fluoreszenz-Einheiten entsprechend markiert werden.
Es ist auch nachgewiesen worden, dass es zusätzlich vorteilhaft ist, wenn eine PCR entsprechend der vorliegenden Erfindung mittels Heißstart durchgeführt wird, d.h. durch entsprechende Inhibition der Primerdimerbildung. Solch eine Bildung von Primerdimeren liegt hauptsächlich an einer Restpolymerasetätigkeit bei Umgebungstemperaturen vor der Thermocycling-Reaktion selbst. Im Gegensatz zu normalen Amplifikationsprotokollen, während eines Heißstartprotokolls, wird die Polymeraseaktivität nur nach anfänglicher Erhitzung aktiviert, wodurch jede Aktivität bei niedrigen Temperaturen, die das Anlagern oder die Amplifikation von unspezifischen Produkten (zum Beispiel Primerdimeren) induziert, ausgeschlossen wird. Es stellte sich heraus, dass dieser Schritt im Rahmen einer Multiplex-PCR kritischer ist, wo es im gleichen Reaktionsbehälter eine erhöhte Ladung von Oligonukleotiden (Primer, Fluoreszenz-Sonden, amplifizierte Produkte) gibt.
Es ist von den Erfindern nachgewiesen worden, daß die Anwendung einer willkürlich gewählten Heißstarttechnik den Bedarf einer überschüssigen Menge thermisch stabiler Polymerase um ungefähr einen Faktor von zwei verringert. Deswegen umfaßt, entsprechend der Erfindung, ein bewährtes Multiplex-PCR Protokoll mit einem Dynamikbereich von mindestens 10² die Verwendung einer DNA-Polymerase Endkonzentration von mindestens 0,25 Einheiten/μl in Verbindung mit einer beliebigen Heißstarttechnik.
Folglich ist die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Quantifizierung von mindestens einer ersten und einer zweiten Nukleinsäure in einer Probe mittels PCR gerichtet, dadurch gekennzeichnet, dass die ursprüngliche Konzentration der ersten Nukleinsäure in der Probe im Überschuß von mehr als einem Faktor 100, im Vergleich zur ursprünglichen Konzentration der zweiten Nukleinsäure, vorliegt, umfassend die Zugabe eines ersten Primerpaars für die Amplifikation der ersten Nukleinsäure, die Zugabe eines zweiten Primerpaars für die Amplifikation der zweiten Nukleinsäure, die Amplifikation der zwei Nukleinsäuren durch eine thermisch stabile DNA-Polymerase, worin die thermisch stabile DNA-Polymerase in einer Konzentration von mindestens 0,25 Einheiten/μl Reaktion vorhanden ist und worin die Amplifikation der zweiten Nukleinsäure nicht bis weniger als 10%, im Vergleich zur Amplifikation der zweiten Nukleinsäure mit dem zweiten Primerpaar in Abwesenheit der ersten Primerpaars, inhibiert ist und worin eine Heißstart PCR durchgeführt wird.
Die Bildung von Primerdimeren kann folglich durch verschiedene in der Fachwelt bekannte Verfahren inhibiert werden:
Beispielsweise wird die DNA-Polymerase reversibel als Ergebnis einer chemischen Modifikation inaktiviert. Genauer gesagt werden Hitze-unbeständige blockierende Gruppen in die Taq DNA-Polymerase eingeführt, die das Enzym bei Raumtemperatur inaktiv machen. Diese blockierenden Gruppen werden bei hoher Temperatur, bei einem der PCR vorgeschalteten Schritt, entfernt, so daß das Enzym aktiviert wird. Solch eine Hitze-unbeständige Modifikation kann beispielsweise durch Kopplung von Citraconsäureanhydrid oder Aconitsäureanhydrid an die Lysinreste des Enzyms erreicht werden ( US 5,677,152 ). Enzyme, die solche Änderungen tragen, sind unterdessen als Amplitaq Gold (Moretti, T., et al., Biotechniques 25 (1998) 716–22 oder FastStart DNA Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) kommerziell erhältlich.
Alternativ ist gezeigt worden, dass die Verlängerung von nicht-spezifisch annealten Primern, durch das Hinzufügen von kurzen doppelsträngigen DNA-Fragmenten gehemmt wird (Kainz, P., et al., Biotechniques 28 (2000) 278–82). In diesem Fall wird die Primerverlängerung bei Temperaturen unterhalb des Schmelzpunkt der kurzen doppelsträngigen DNA-Fragmente inhibiert, allerdings unabhängig von der Sequenz der Konkurrenten-DNA selbst. Sogar zielgerichteter können Oligonukleotid-Aptamere mit einer spezifischen Sequenz, die eine definierte Sekundärstruktur ergibt, verwendet werden. Solche Aptamere sind unter Verwendung der SELEX-Technologie, aufgrund einer sehr hohen Affinität zur DNA-Polymerase, ausgewählt worden ( US 5,693,502 ), (Lin, Y. Jayasena, S. D., J Mol Biol 271 (1997) 100–11). Das Vorhandensein von solchen Aptameren innerhalb der Amplifikationsmischung vor dem eigentlichen Thermocycling-Prozeß selbst, ergibt wieder eine Bindung an die DNA-Polymerase mit hoher Affinität und infolgedessen eine Hitze-unbeständige Inhibition ihrer Aktivität.
Ein anderer Ansatz um die Hitze-unbeständige Hemmung der Taq DNA-Polymerase zu erzielen, ist das Hinzufügen von gegen das aufgereinigte Enzym erzeugten, monoklonalen Antikörpern (Kellog, D. E., et al., Biotechniques 16 (1994) 1134–7; Sharkey, D. J., et al., Biotechnology (NY) 12 (1994) 506–9). Wie die Oligonukleotid-Aptamere bindet der Antikörper an die Taq DNA-Polymerase mit hoher Affinität bei Umgebungstemperaturen in einer inhibierenden Art und Weise. Der Komplex wird in einem vorwärmenden Schritt, vor dem Thermocycling-Verfahren selbst, gelöst. Dies führt zu einer erheblich zeitraubenden Verlängerung der Amplifikation als Ganzes, besonders wenn Protokolle für schnelles Thermocycling angewendet werden (WO 97/46706).
Ungeachtet dessen, ob eine Heißstart-Technik angewendet wird oder nicht, ist das erfinderische Verfahren besonders anwendbar, wenn die PCR-Amplifikation in Echtzeit, ein gleichartiges Nachweisformat ergebend, überwacht wird. Demnach werden die erhaltenen Amplifikationsprodukte vorzugsweise durch mindestens eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde ermittelt. Die instrumentelle Grundlage für solch eine Echtzeit-Überwachung wird durch im Handel erhältliche Instrumente, wie den Roche Light Cycler (Roche Molecular Biochemicals), den ABI Prism 7700 (Perkin Elmer) oder den iCycler (BioRad), zu Verfügung gestellt.
Wie angedeutet können Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonden für die Echtzeit-Überwachung verwendet werden. Diese Hybridisierungssonden, die für das erfinderische Verfahren entsprechend der Erfindung eingesetzt werden, sind normalerweise einzelsträngige Nukleinsäuren, wie einzelsträngige DNA oder RNA oder Derivate davon oder wahlweise PNAs, die bei der Annealing-Temperatur der Amplifikationsreaktion mit der Ziel-Nukleinsäure hybridisieren. Diese Oligonukleotide haben normalerweise eine Länge von 20 bis 100 Nukleotiden.
Die Markierung kann auf irgendeiner Ribose- oder Phophatgruppe des Oligonukleotids, abhängig von dem jeweiligen Nachweisformat, eingeführt werden. Die Markierungen am 5' oder 3' Ende des Nukleinsäuremoleküls werden bevorzugt.
Die Art der Markierung muß im Echtzeit-Modus der Amplifikationsreaktion ermittelt werden. Dies ist nicht nur möglich für Fluoreszenz-markierte Sonden sondern auch möglich mit Hilfe von Markierungen, die mit NMR detektiert werden können. Jedoch sind Verfahren besonders bevorzugt, in welchen die amplifizierten Nukleinsäuren mit Hilfe von mindestens einer Fluoreszenz-markierten Hybridisierungssonde ermittelt werden.
Viele Testverfahren sind möglich. Die folgenden drei Nachweisformate sind besonders nützlich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gewesen, aber sollen nicht als den Umfang der Erfindung limitierend verstanden werden.
(i) FRET-Hybridisierungssonden
Für dieses Testformat werden gleichzeitig zwei einzelsträngige Hybridisierungssonden verwendet, die zu benachbarten Stellen des gleichen Strangs der amplifizierten Ziel-Nukleinsäure komplementär sind. Beide Sonden werden mit unterchiedlich fluoreszierenden Komponenten markiert. Wenn diese mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt werden, überträgt eine erste Komponente die absorbierte Energie auf die zweiten Komponente entsprechend dem Prinzip der Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung, so dass eine Fluoreszenzemission der zweiten Komponente gemessen werden kann, wenn beide Hybridisierungssonden an benachbarte Positionen des nachzuweisenden Zielmoleküls binden.
Unter allen Nachweisformaten, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung möglich sind, ist diese „FRET-Hybridisierungssonde" nachgewiesen worden, in hohem Grade empfindlich, genau und zuverlässig zu sein.
Alternativ ist es auch möglich, einen Fluoreszenz-markierten Primer und nur eine markierte Oligonukleotid-Sonde zu verwenden (Bernard, P. S., et al., Anal Biochem 255 (1998) 101–7.).
(ii) TaqMan Hybridisierungssonden
Eine einzelsträngige Hybridisierungssonde wird mit zwei Komponenten markiert. Wenn die erste Komponente mit Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird, wird die absorbierte Energie auf die zweite Komponente, dem so genannten Quencher, entsprechend dem Prinzip der Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung, übertragen. Während des Annealing-Schritts der PCR-Reaktion bindet die Hybridisierungssonde an die Ziel-DNA und wird durch die 5'-3' Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase während der anschließenden Elongationsphase degradiert. Demzufolge werden die angeregte fluoreszierende Komponente und der Quencher räumlich von einander getrennt und somit kann eine Fluoreszenzemission der ersten Komponente gemessen werden.
(iii) Molekulare Leuchtsignale (Molecular Beacons)
Diese Hybridisierungssonden werden auch mit einer ersten Komponente und mit einem Quencher markiert, wobei die Markierungen vorzugsweise an den beiden Enden der Sonde gelegen sind. Als Folge der Sekundärstruktur der Sonde, befinden sich beide Bestandteile in der Lösung in räumlicher Nähe. Nach der Hybridisierung mit den Ziel-Nukleinsäuren werden beide Bestandteile von einander getrennt, so dass, nach der Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge, die Fluoreszenzemission des ersten Bestandteils gemessen werden kann ( US 5,118,801 ).
Es ist auch innerhalb des Umfangs der Erfindung, wenn die Echtzeit-PCR unter Verwendung eines doppelsträngigen Nukleinsäure-bindenden Rest durchgeführt wird. Beispielsweise kann das jeweilige Amplifikationsprodukt entsprechend der Erfindung auch durch einen fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff ermittelt werden, der ein entsprechendes Fluoreszenzsignal als Folge der Interaktion mit der doppelsträngigen Nukleinsäure nach der Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge ausstrahlt. Die Farbstoffe SybrGreen und SybrGold (Molekulare Sonden) sind als besonders geeignet für diese Anwendung nachgewiesen worden. Interkalierende Farbstoffe können alternativ verwendet werden. Für dieses Format jedoch ist es notwendig, eine entsprechende Analyse der Schmelzkurven durchzuführen, um die unterschiedlichen Amplifikationsprodukte zu unterscheiden ( US 6,174,670 ).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform, die auch die Echtzeit-Überwachung umfassen kann, werden die Amplifikationsreaktionen mittels schnellem Thermocycling durchgeführt, worin ein Zyklus weniger als eine Minute beträgt. Die instrumentelle Grundlage für so ein schnelles Thermocycling wird zum Beispiel durch den LightCycler zur Verfügung gestellt (Roche Molecular Biochemicals) und ist in der WO 97/46707 und in der WO 97/46712 offenbart. Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist das Anlagern der Primer nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der quantitativen Amplifikation der Ziel-Nukleinsäuren, die in der Probe nur mit geringer Abundanz anwesend sind. Folglich brauchen die Zeitparameter für ein entsprechendes Multiplex-Thermocycling-Protokoll, um die Parameter mit niedriger Abundanz zu verstärken, nicht verändert werden, im Vergleich zu irgendeinem der auf dem Fachgebiet bekannten Thermocycling-Protokolle.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf Kits, die Reagenzien für die Durchführung des (der) erfinderischen Verfahrens (Verfahren) umfassen, gerichtet. Spezieller kann solch ein Kit einen Mastermix umfassen, der für die Amplifikation auf solch eine Weise verwendet werden kann, daß nur die zu analysierende Probe, geeignete Primer und etwas Wasser, um das notwendige Reaktionsvolumen anzupassen, vor der Thermocycling-Reaktion selbst hinzugefügt werden brauchen.
Entsprechend der Erfindung umfaßt der Mastermix eine thermisch stabile DNA-Polymerase in einer ausreichenden Konzentration, um eine Endkonzentration der besagten thermisch stabilen DNA-Polymerase von mindestens 0,5 Einheiten/μl zur Verfügung zu stellen. Spezielle Kits können zusätzlich Primer mit entsprechenden Sequenzen enthalten. Diese Oligonukleotide können sogar im Matermix enthalten sein.
Außerdem kann solch ein Kit Reagenzien, die für den gleichartigen Nachweis von durch Echtzeit-PCR erzeugten Produkten geeignet sind, enthalten, zum Beispiel Fluoreszenz-markierte Sonden oder doppelsträngige DNA-bindende Einheiten. Wie die jeweiligen Primer, sie können in einigen Fällen auch im Mastermix enthalten sein.
Alternativ kann ein erfindungsgemäßer Kit einen Mastermix für die Heißstart-PCR enthalten. Solch ein Mastermix würde eine thermisch stabile DNA-Polymerase in einer ausreichenden Konzentration, um eine Endkonzentration der besagten thermisch stabilen DNA-Polymerase von mindestens 0,25 Einheiten/μl zur Verfügung zu stellen, und eine zusätzliche Verbindung, um die Heißstart-PCR zu ermöglichen, umfassen. Solch ein Mittel, das die Polymeraseaktivität bei Umgebungstemperatur inaktivieren würde, kann beispielsweise ein Anti-Polymerase-Antikörper oder ein Polymerase bindendes Nukleinsäure-Aptamer sein.
In noch einer anderen Ausführungsform kann der erfinderische Kit einen Mastermix für die Heißstart-PCR enthalten, der eine thermisch stabile DNA-Polymerase in einer ausreichenden Konzentration umfasst, um eine Endkonzentration der besagten thermisch stabilen DNA-Polymerase von mindestens 0,25 Einheiten/μl zur Verfügung zu stellen, die chemisch modifiziert und folglich bei Umgebungstemperatur inaktiv ist, es sei denn, dass die Polymerase erhitzt wird, um die chemische Modifikation zu entfernen.
Es ist auch nachgewiesen worden, dass es vorteilhaft ist, wenn der Kit entweder eine bekannte Menge Standard-DNA enthält, um eine Verdünnungsreihe für eine Standardkurve zu erzeugen oder alternativ eine Kalibrierprobe (Eichprobe) enthält, welche verwendet werden kann, um die Effizienz eines bestimmten Typs der Amplifikationsreaktion festzustellen.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1: Monoplex-Amplifikation 10², 10⁴ und 10⁶ Kopien von CK20 wurden jeweils mit entweder 0,0825 U/μl, 0,165 U/μl, 0,33 U/μl oder 0,66 U/μl Polymerase amplifiziert.
2: Monoplex- und Multiplex-Amplifikation von verschiedenen Verhältnissen von CK20 und PBGD mit 0,0825 U/μl Taq DNA-Polymerase
2a: Amplifikation von CK20 – Monoplex-Analyse und Multiplex-Konfiguartion
2b: Amplifikation von PBGD – Monoplex-Analyse und Multiplex-Konfiguartion
3: Multiplex-Amplifikation von CK20/PBGD mit zunehmenden Mengen Taq-Polymerase
3a: CK20
3b: PBGD
4: Multiplex-Amplifikation mit und ohne Heißstart-PCR unter Verwendung zunehmender Mengen Taq-Polymerase
4a: Taq DNA-Polymerase
4b: FastStart DNA-Polymerase
5: Ausdehnung des Dynamikbereichs, der mit einem Überschuß an Heißstart-Polymerase erhalten werden kann
5a: Amplifikation von variierenden Kopienzahlen von CK20 bei einem Hintergrund von 100 Kopien PBGD
5b: Amplifikation von 100 Kopien PBGD bei einem Hintergrund von variierenden Kopienzahlen von CK20
5c: Regressionsanalyse der CK20-Amplifikation
Beispiel 1
Echtzeit-PCR von CK20- und PBGD-Plasmid-DNA
Um die Gültigkeit der Erfindung zu demonstrieren, wurden Cytokreatin 20 (CK20), ein Gen, welches für den Nachweis von gestreuten Tumorzellen untersucht wird, und Porphorynbilinogendeaminase (PBGD), welches allgemein als ein Haushaltsgen verwendet wird, als Amplifikationsziele ausgewählt.
Teilfragmente der Cytokreatin 20 (CK20)- und Porphorynbilinogendeaminase-(PBGD)-Gene wurden in separate pT3T7-Plasmidvektoren kloniert (Roche Molecular Biochemicals). Die Kopienzahlen der linearisierten Plasmid-DNA wurden mittels Spektralphotometrie, mit der Annahme, dass 1 Mol 6 × 10²³ Kopien entspricht, abgeschätzt. CK20- und PBGD-Plasmid-DNA-Mischungen wurden durch Verdünnungen, unter Verwendung eines aus MS2 RNA (10 ng/μl) in 10 mM Tris-HCl pH 8,5 bestehenden Verdünnungsmittels, hergestellt.
Es wurde eine kinetische PCR an einem LightCycler-Instrument ausgeführt (Roche Molecular Biochemicals). Ein typischer PCR-Ansatz bestand aus 1 μl DNA, 1 × Detektionsmix, 1 × Reaktionspuffer, 4 mM Magnesiumchlorid und variierenden Mengen Taq-Polymerase (alles von Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland), der mit Wasser auf ein Volumen von 10 μl in einer Reaktionskapillare eingestellt wurde.
Für eine normale Monoplex und Multiplex-PCR wurden der Reaktionspuffer und die unmodifizierte Taq-Polymerase vom LightCycler-DNA Master Hybridisation Probes Kit verwendet (Roche Molecular Biochemical, Cat. No. 2 015 102).
Jede der 10 × Detektionsmischungen für CK20 und PBGD bestand aus 5 μM von jedem Primer („Forward" und „Reverse"), 2 μM von jeder Hybridisierungssonde (Fluoreszien und LC-Red640 oder Fluoreszien und LCRed705 markiert), 0,05% Brij-35 in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 Puffer. Für die Multiplex-PCR war ein zusätzlicher 1 × Detektionsmix in der Reaktionskapillare enthalten.
Die folgenden Primersequenzen und die Sequenzen der Hybridisierungssonden wurden verwendet:
CK20 Forward-Primer:
CK20 Reverse-Primer:
CK20-Sonde 1:
CK20-Sonde 2:
PBGD Forward-Primer:
PBGD Reverse-Primer:
PBGD-Sonde 1:
PBGD-Sonde 2:
Die Markierung einer Hybridisierungssonde für die CK20-PCR mit LCRed640 und für die PBGD-PCR mit LCRed705 ermöglichte die simultane Überwachung jeder Reaktion in separaten Kanälen. Der Fluoreszenz-Nebensignaleffekt zwischen den Kanälen 2 (LCRed640) und 3 (LCRed705) wurde durch die Verwendung des LightCycler-Color Compensation Sets (Roche Molecular Biochemicals) kompensiert.
Die normalen PCR-Zyklus Bedingungen bestanden aus einer anfänglichen Inkubation bei 94°C für 1 Minute, gefolgt von 50 Zyklen bei 94°C für 0 Sekunden, 55°C für 10 Sekunden und 72°C für 10 Sekunden und sie wurde bei 40°C für 30 Sekunden abgeschlossen.
Die Crossing Points (Cp-Werte) für jede Reaktion wurden durch die LightCycler-Analysesoftware unter Verwendung der zweiten Ableitung der maximalen Funktion mit einer arithmetischen Grundlinieneinstellung festgestellt.
Beispiel 2
Überschüssige Polymerase erhöht nicht die Leistungsfähigkeit einer Monoplex-PCR-Analyse
Eine Echtzeit-PCR von 10², 10⁴ und 10⁶ CK20-Kopien wurde in einer Monoplex-Konfiguration entsprechend Beispiel 1 mit zunehmenden Mengen von jeweils 0,0825 U/μl, 0,165 U/μl, 0,33 U/μl oder 0,66 U/μl FastStart-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) durchgeführt. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Wie gesehen werden kann, ergibt eine Zunahme der Enzymkonzentration nicht einen niedrigeren Cp-Wert, da die Fluoreszenzsignalkurven für jede identifizierte Kopienzahl, unabhängig von der verwendeten Enzymkonzentration, im Grunde genommen identisch waren (links: 10⁶ Kopien, Mitte: 10⁴ Kopien, recht: 10² Kopien). Es muss gefolgert werden, daß sich bei einer Monoplex-PCR, d.h. Amplifikation von nur einer Ziel-Nukleinsaüre, die Amplifikationsreaktion nicht durch einen Überschuß an Polymerase erhöht, selbst wenn die Ziel-Nukleinsäure anfänglich in hohen Kopienzahlen anwesend ist.
Beispiel 3:
Ziele mit relativ geringer Abundanz werden innerhalb eines Multiplex-PCR-Ansatzes nicht quantitativ amplifiziert
2 zeigt typische Ergebnisse von Monoplex-PCRs von CK20 bzw. PBDG gemäß Beispiel 1 im Vergleich zu einem Multiplex-Ansatz, durch einfaches Kombinieren der Primersätze und der fluoreszierenden Sondensätze für die kinetische PCR von zwei individuellen PCRs zu einer einzelnen PCR (Multiplex-PCR) gemäß Beispiel 1, unter Verwendung von 0,0825 U/μl Taq-Polymerase.
Die verschiedenen vorgelegten Nukleinsäuren für die Reaktionen beinhalten drei Plasmidmischungen, die CK20/PBGD-Kopienmengen von 10²/10⁴, 10⁴/10⁴ bzw. 10⁶/10⁴ umfassen. Im gleichen PCR-Lauf wird die Reaktionseffizienz für das Amplifizieren von CK20 in einer individuellen PCR ohne konkurrierende Reaktion (2a) und in einer Multiplex-PCR mit einer Hintergrund PBGD-PCR, die im gleichen Reaktionsgefäß stattfindet, in Kanal 2 überwacht (2a). Gleichzeitig wird die Reaktionseffizienz für das Amplifizieren von PBGD in einer individuellen PCR und in einer Multiplex-PCR in Kanal 3 überwacht (2b).
Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Verringerung der Steigung der exponentiellen Phasenkennlinie der Ziel-PCR in einer Multiplex-PCR, wenn sie mit einer individuellen PCR verglichen werden, besonders wenn die Kopienanzahl der Vorlage für die Hintergrundreaktion 100 Mal die von der Zielreaktion übersteigt. Dies ist nämlich die Amplifikation von 10² CK20-Kopien in der Anwesenheit der Amplifikation von 10⁴ PBGD-Kopien und 10⁴ PBGD-Kopien in Anwesenheit der Amplifikation von 10⁶ CK20-Kopien.
Diese Resultate, die gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erhalten wurden, legen nahe, daß unter den typischen PCR-Bedingungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, die Dynamikbereiche eindeutig kleiner als ein Faktor von 100 sind.
Beispiel 4
Überschüssige Polymerase erhöht die Amplifikation von Zielen mit relativ niedriger Abundanz in der Multiplex-PCR
Eine Analyse gemäß Beispiel 1 wurde mit zunehmenden Polymerase-Konzentrationen durchgeführt. Entweder wurden 10² Kopien von CK20 mit einer Hintergrund-PCR von 10⁴ Kopien von PBGD (3a) oder 10⁴ Kopien von PBGD mit einer Hintergrund-PCR von 10⁶ Kopien CK20 (3b) quantifiziert.
Wie aus den Figuren ersichtlich, führt eine Zunahme der Polymerasekonzentration zu einer Zunahme der Steigung der exponentiellen Phase einer Multiplex-PCR. Dieses ist ein überraschender Gegensatz zu dem, was zuvor in einer vergleichbaren Monoplex-Konfiguration beobachtet worden ist (siehe Beispiel 2 oben).
Außerdem zeigen die Resultate, daß eine Polymerasekonzentration von 0,33 Einheiten/μl noch nicht ausreichend ist, die Steigung der exponentiellen Phase der Multiplex-PCR mit der einer individuellen PCR gleichzusetzen. In diesem Experiment ist es nur eine „überschüssige" Menge von 0,66 Einheiten/μl Polymerase, die ein Verhalten ergibt, das mit der Monoplex-Kontrolle vergleichbar ist.
Weitere Experimente in Bezug auf die Verbesserung einer üblichen bona fide-Polymerasekonzentration (Ergebnisse nicht gezeigt) deckten auf, daß eine Polymerasekonzentration von mindestens ungefähr 0,5 Einheiten/μl benötigt wird, damit die Steigung der Multiplexkurve mit der einer einzelnen PCR gleichwertig wird (Ergebnisse nicht gezeigt).
Beispiel 5
Erhöhte Leistungsfähigkeit von Heißstart-Protokollen durch normale PCR-Amplifikation
Das Heißstart PCR-Cycling wurde gemäß Beispiel 1 ausgeführt, mit den Ausnahmen, dass für die Monoplex- und auch für die Multiplex-PCR der Reaktionspuffer und die modifizierte Taq-Polymerase aus dem LightCycler-FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit (Roche Molecular Biochemicals, Cat No. 3 003 248) im Vergleich verwendet wurden. Die Amplifikation von 10⁴ Kopien von PBGD wurde bei einer Hintergrund PCR von 10⁶ Kopien CK20 für Enzymkonzentrationen von entweder 0,0825 U/μl, 0,165 U/μl, 0,33 U/μl oder 0,66 U/μl Polymerase (Endkonzentration) analysiert. Das Thermocycling-Protokoll wurde durch anfängliches Erhitzen auf 94°C für 10 Minuten und 94°C für 10 Sekunden während der Zyklen abgeändert.
4 zeigt einen Vergleich der Enzymmengen, die bei einer Heißstart-Polymerase erforderlich sind, verglichen mit einer normalen Polymerase unter identischen Titrationsbedingungen, mit Ausnahme des Enzyms und seinem entsprechenden Puffer. Während 0,66 Polymerase Einheiten/μl Reaktionsvolumen einer normalen Polymerase eine Steigung der exponentiellen Phase der Multiplex-PCR ergibt, die äquivalent zu einer individuellen PCR ist (4a), reduziert die Verwendung einer Heißstart-Polymerase den Bedarf um einen Faktor von ungefähr 2 (4b).
Beispiel 6
Möglicher Dynamikbereich für eine Multiplex-PCR mit überschüssiger Polymerase (Heißstart)
5 zeigt ein Multiplex-Experiment gemäß Beispiel 1 unter Verwendung der FastStart-Polymerase. Die PCR-Amplifikation von 10² PBGD-Kopien wurde mit einem jeweiligen Hintergrund von 10², 10⁴, 10⁶ und 10⁸ Kopien von CK20 und einer überschüssigen Menge von 0,55 Einheiten/μl Reaktionsvolumen FastStart-Polymerase durchgeführt. Wie in der Figur gesehen werden kann, sind die Steigungen der exponentiellen Phasenkurve der PBGD-PCR (5b) und die Crossing-Points (Cp-Werte) zueinander, ungeachtet des CK20-PCR Hintergrundes (5a), ähnlich. Für die CK20-PCR Amplifikation wird das lineare Verhältnis zwischen dem Crossing-Point und der logarithmischen Konzentration, die für eine genaue PCR-Quantifizierung wesentlich sind, aufrechterhalten (R² = –1) (5c).
Folglich zeigen diese Daten, daß für die Multiplex-Amplifikation von PBGD und CK20 gemäß der Erfindung, ein Dynamikbereich von 10⁶ mit der Heißstart-Ausführungsform erhalten wird.
Beispiel 7
Möglicher Dynamikbereich für eine Multiplex-PCR mit überschüssiger Polymerase (Heißstart)
Identische Ergebnisse sind in einem ähnlichen Experiment mit Her2/neu und beta Globin als unterschiedliche Amplifikationsziele erzielt worden. Die Amplifikationsbedingungen waren im Wesentlichen mit denen von Beispiel 1 identisch. In diesem Fall jedoch ist die PCR unter Verwendung von 1 U Klentaq-Polymerase (Clontech, entspricht 6 U Standardpolymerase) in Verbindung mit einem Klentaq-Antikörper (Clontech), unter vom Anbieter vorgeschlagenen Bedingungen, als ein Mittel für die Heißstart-Amplifikation, entsprechend der Herstellerangaben, durchgeführt worden.
Die folgenden Primer, entsprechend der Seq. Id. Nr. 9–10 für Her2/neu und der Seq. Id. Nr. 11–12 für beta Globin, sind verwendet worden.
Her2/neu Forward-Primer:
Her2/neu Reverse-Primer:
β-Globin Forward-Primer:
β-Globin Reverse-Primer:
Die Hybridisierungssonden für Her2/neu waren Oligonukleotide, die Sequenzen entsprechend der Seq. Id. Nr. 13, 5' markiert mit LC-Red640, und der Seq. Id. Nr. 14, 3' markiert mit Fluoreszien, umfassen. Die Hybridisierungssonden für beta Globin waren Oligonukleotide, die Sequenzen entsprechend der Seq. Id. Nr. 15, 5' markiert mit LC-Red705, und der Seq. Id. Nr. 16, 3' markiert mit Fluoreszien, umfassen.
Her2neu:
β-Globin:
In diesem Experiment konnten 10 Kopien von Her2/neu Plasmid-DNA mit identischer Effizienz, unabhängig von einem Hintergrund von 10–10⁷ Kopien von beta Globin Plasmid-DNA, amplifiziert werden, was einem Dynamikbereich von 10⁶ entspricht.
Beispiel 8:
Unabhängigkeit der Dynamikbereiche von der absoluten Anzahl an Zielkopien, erhalten durch Hinzufügung überschüssige Polymerase
Um die Kapazitäten der Multiplex-Heißstart-PCR mit überschüssiger Polymerase zu beurteilen und um außerdem eine mögliche Abhängigkeit der Dynamikbereiche von den absoluten Zielkonzentrationen auszuschließen, wurde ein Experiment, welches grundsätzlich den in Beispiel 1 offenbarten Bedingungen entspricht, mit einigen kleinen Änderungen durchgeführt:
Genauer gesagt wurden 10² Kopien von PBGD mit einer Hintergrund-PCR von 10², 10⁴, 10⁶ und 10⁸ Kopien von CK20 mit variierenden Mengen FastStart-Polymerase amplifiziert und unter den gleichen Bedingungen analysiert.
Als ein Indikator für die quantitative Amplifikation von PBDG wurden die Crossing-Points (Cp-Werte), unter Verwendung des sogenannten „Algorithmus der zweiten Ableitung" ( US 6,303,305 ), entsprechend dem RocheLightCycler-Handbuch ermittelt (Roche Molecular Biochemicals). Unter Verwendung des zweite Ableitung-Datenerzeugungsalgorithmus innerhalb einer angenommenen statistischen Toleranz wurden gleiche Cp-Werte für eine gegebene Zielkonzentration, unabhängig von dem hinzugefügten Überschuß an CK20, erhalten, sofern eine Enzymkonzentration entsprechend der Erfindung verwendet wurde.
Die erhaltenen Cp-Werte für PBDG werden in der folgenden Tabelle angegeben:
Tabelle 1: Cp-Werte für PBDG
Von diesen Ergebnissen ausgehend, ist es angemessen, die folgenden Rückschlüsse zu ziehen:
Erstens zeigen die Daten, die für eine Enzymkonzentration entsprechend der Erfindung (Tabelle 1, rechte Spalte, 0,3300 U/μl) erhalten werden, daß in diesem Fall eine Multiplex-PCR entsprechend der Erfindung einen Gesamt-Dynamikbereich von 10⁶ ergibt, sofern die innerhalb des Multiplex-Ansatzes zu amplifizierenden Ziel-Nukleinsäuren in Kopienzahlen zwischen 10² und 10⁸ vorliegen.
Es ist zweitens unbedeutend, daß unter identischen experimentellen Bedingungen 10⁴ Kopien von PBDG mit der gleichen Amplifikationseffizienz amplifiziert worden sein würden, wie es für 10² Kopien von PBDG der Fall ist. Wenn dann das Ergebnis der Amplifikation von 10² Kopien von PBDG im Hintergrund von 10⁶ Kopien von CK20 mit einer Amplifikation von 10⁴ Kopien im Hintergrund von 10⁸ Kopien von CK20 verglichen wird (nicht gezeigt), kann auch geschlußfolgert werden, daß der Effekt der Zunahme des Dynamikbereichs, infolge der erfinderischen Verwendung von überschüssigen Mengen Polymerase, von den absoluten Kopienzahlen der ursprünglich in der Probe vorhandenen Ziel-DNA unabhängig ist.
Referenzen:

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US 5,693,502
US 6,174,670
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WO 97/46706
WO 97/46707
WO 97/46712

Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren für die quantitative Multiplex-PCR mit einem Dynamikbereich von mindestens 10², bevorzugt 10³ und insbesondere 10⁴, worin eine thermisch stabile DNA-Polymerase mit einer Endkonzentration von mindestens 0,5 Einheiten/μl verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 für die Quantifizierung mindestens einer ersten und einer zweiten Nukleinsäure in einer Probe mit PCR, dadurch gekennzeichnet, dass die ursprüngliche Konzentration der ersten Nukleinsäure in der Probe im Überschuss von mehr als einem Faktor 100, im Vergleich zur ursprünglichen Konzentration der zweiten Nukleinsäure, vorliegt, umfassend die Zugabe eines ersten Primerpaars für die Amplifikation der ersten Nukleinsäure, die Zugabe eines zweiten Primerpaars für die Amplifikation einer zweiten Nukleinsäure, die Amplifikation der zwei Nukleinsäuren durch eine thermisch stabile DNA-Polymerase, worin die thermisch stabile DNA-Polymerase in einer Konzentration von mindestens 0,5 Einheiten/μl Reaktion vorhanden ist und worin die Amplifikation der zweiten Nukleinsäure nicht bis weniger als 10%, im Vergleich zur Amplifikation der zweiten Nukleinsäure mit dem zweiten Primerpaar in Abwesenheit des ersten Primerpaars, inhibiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 für die Quantifizierung mindestens einer ersten und einer zweiten Nukleinsäure in einer Probe mit einer Heißstart-PCR, dadurch gekennzeichnet, dass die ursprüngliche Konzentration der ersten Nukleinsäure in der Probe im Überschuss von mehr als einem Faktor 100, im Vergleich zur ursprünglichen Konzentration der zweiten Nukleinsäure, vorliegt, umfassend die Zugabe eines ersten Primerpaars für die Amplifikation der ersten Nukleinsäure, die Zugabe eines zweiten Primerpaars für die Amplifikation einer zweiten Nukleinsäure, die Amplifikation der zwei Nukleinsäuren durch eine thermisch stabile DNA-Polymerase, worin die thermisch stabile DNA-Polymerase in einer Konzentration von mindestens 0,25 Einheiten/μl Reaktion vorhanden ist und worin die Amplifikation der zweiten Nukleinsäure nicht bis weniger als 10%, im Vergleich zur Amplifikation der zweiten Nukleinsäure mit dem zweiten Primerpaar in Abwesenheit des ersten Primerpaars, inhibiert ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, worin die Amplifikation in Echtzeit beobachtet wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die aus der Amplifikation der beiden Nukleinsäuren erhaltenen Amplifikationsprodukte jeweils durch mindestens eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde nachgewiesen werden.
Verfahren nach Anspruch 5, worin für jede Ziel-Nukleinsäure zwei benachbart hybridisierende Sonden verwendet werden, und jede Sonde in geeigneter Weise mit einer fluoreszierenden Einheit markiert wird, wobei die Einheiten in der Lage sind, eine Fluoreszenzresonanz-Energieübertragung bei der Hybridisierung (FRET-Hybridisierungssonden) durchzuführen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, worin ein Amplifikationszyklus weniger als eine Minute beträgt.