EP1476579A2 - Verfahren zur reduktion der hintergrund-kontamination nach markierungsreaktionen - Google Patents

Verfahren zur reduktion der hintergrund-kontamination nach markierungsreaktionen

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Publication number
EP1476579A2
EP1476579A2 EP03739498A EP03739498A EP1476579A2 EP 1476579 A2 EP1476579 A2 EP 1476579A2 EP 03739498 A EP03739498 A EP 03739498A EP 03739498 A EP03739498 A EP 03739498A EP 1476579 A2 EP1476579 A2 EP 1476579A2
Authority
EP
European Patent Office
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marker
labeled
labeling
enzyme
luminescence
Prior art date
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Ceased
Application number
EP03739498A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christian Korfhage
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP1476579A2 publication Critical patent/EP1476579A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the invention relates to a method for reducing the background contamination when carrying out labeling reactions on biomolecules, preferably on biopolymers such as peptides, proteins or nucleic acids with labeling substances.
  • Nucleic acids are labeled with modified nucleotides.
  • labeled substances are used as a code or sensor to identify other molecules or to track processes.
  • nucleic acids (DNA, RNA) of various lengths can be labeled via the enzymatic incorporation of labeled nucleotides.
  • probes can be produced which have a high marking density and a high sensitivity.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method which makes it possible to discriminate similar properties of the labeled reactants. It is therefore the aim of the present invention to provide a substance preparation with as little background contamination as possible and easy to carry out.
  • nucleic acid fragments, oligonucleotides, proteins and peptides are labeled, for example, with radioactive compounds or with dyes.
  • the respective method for labeling is determined, for example, by the length of the nucleic acid fragments, the experimental requirements and the sensitivity of detection.
  • the labeling reaction using polymerases such as e.g. DNA or RNA polymerases or reverse transcriptases are catalyzed.
  • the exchange position is either the a or ⁇ position of the phosphate residues in 2'-deoxyribo, 3'-deoxyribo or 2'-ribonucleotides.
  • the 25 l mark is made at the C-5 position of the cytosine.
  • the introduction of the modification group changes the chemical structure of the labeled nucleotides. This has the consequence, for example, that the reaction conditions for the enzymatic incorporation have to be adapted to the changed substrate properties.
  • the membrane surface must be saturated with blot hybridizations and the cell or tissue surface in s / Yt / hybridizations with suitable blocking reagents.
  • Labeled nucleic acids are used in molecular biological cloning as a reagent or as a sample.
  • the labeling reagent can be covalently bound to the substance to be labeled or non-covalently associated with it.
  • labeled fragments of cloned DNA and / or oligonucleotides of a defined size are used as reagents for chemical and enzymatic sequencing, for nuclease S1 analysis of RNA and in so-called band-shift experiments.
  • labeled nucleic acid samples are required in hybridization techniques for the localization and binding of DNA and RNA of complementary sequences. These techniques include colony and PIaque hybridization, Southern and Northern analyzes, in s / Yu hybridizations and sequencing by hybridizations.
  • the success of introducing the label in DNA or RNA depends on the method used, e.g. End marking, "random priming", nick translation, in wrro transcription and variations of the polymerase chain reaction (PCR) etc.
  • [ ⁇ - 32 P] ATP is used for radioactive labeling of single-stranded hybridization samples or DNA for sequencing according to Maxam-Gilbert.
  • the ⁇ -phosphate group of the ATP is transferred by the enzyme T4 polynucleotide kinase to the 5'-terminal hydroxyl group of the oligodeoxynucleoside triphosphate or the DNA.
  • DNA oligonucleotides can be labeled enzymatically via the terminal transferase by attaching labeled dNTPs independently of the template (tailing).
  • DNA with 5 'protruding ends can be radiolabelled by one filling reaction of the Klenow fragment of E.coli DNA polymerase I at one or both 3' ends.
  • the [ ⁇ -32P] deoxynucleoside triphosphates are used, which are complementary to the respective first base of the 5 'single-strand ends.
  • nick translation also means that
  • E.coli DNA polymerase holoenzyme used. The reason for this is that in addition to polymerase activity, this method also requires 5 ' ⁇ 3' exonuclease activity.
  • the DNase catalyzes the formation of single strand breaks (nicks). To ensure that no further cleavages take place, a precisely set, low DNase concentration is required. The the
  • Single strand break flanking 3 'and 5' ends act as a substrate for the 5'- »3'-polymerase activity and the 5'- 3'-exonuclease activity.
  • the 5'- »3'-exonuclease activity is responsible for the successive degradation of the 5'-phosphorylated nucleotides, while synchronously due to the 5'- 3'-polymerase activity resulting gaps are filled with new, labeled nucleotides.
  • the primers represent a mixture of all possible hexanucleotides (random primers), so that - statistically speaking - every target sequence is covered and hybridization can take place at any desired location.
  • the Klenow fragment the large subtilisin fragment of the DNA polymerase holoenzyme, extends the primers in a template-dependent reaction. Unlabeled dNTPs and hapten-modified dUTPs are incorporated into the elongation reaction. Since the template strands are replicated, a new synthesis takes place. In this way, high probe yields with over 100% of the template DNA used can be obtained via strand displacement.
  • Digoxigenin-labeled probes which are generated by the "random priming" method, can be used to achieve high detection sensitivities in the sub-picogram range
  • Labeled RNA probes of high specific activity can be produced by in vitro transcription of cloned DNA fragments. Suitable promoters are required for this, e.g. in cloning vectors
  • Transcription vectors such as vectors from the Ribo Gemini series (pGEM-3 or pGEM-4). These vectors can be used to produce RNA samples of opposite orientation (eg "sense” and “antisense”) in the case of the corresponding RNA polymerase and in trans-transcription reactions. To do this, the vector are linearized downstream of the sequence to be amplified so that no RNA fragments are generated which run around the entire vector (“run-around” transcripts). In this way, only the desired cloned sequence is labeled with [ ⁇ - 32 P] nucleotides (ATP or CTP).
  • ATP ⁇ - 32 P] nucleotides
  • the first non-radioactive methods were developed as early as 1980 and are based on the labeling of nucleic acid samples with dinitrophenol, bromodeoxyuridine and biotin.
  • biotinylated samples are detected via an interaction with streptavidin, which is often conjugated with alkaline phosphatase as a reporter enzyme, via the enzymatic activity of the phosphatase.
  • the homogeneous DNA labeling is carried out either by "random priming" with the large fragment of E. coli DNA polymerase I (Klenow enzyme), nick translation E. coli DNA polymerase I (Kornberg enzyme) or by PCR amplification Taq polymerase reached.
  • the label densities are one label per 25 to 36 base pairs.
  • Oligonucleotides can be labeled enzymatically using the terminal transferase reaction; depending on the substrate, one to five labels per oligonucleotide are attached here.
  • Nucleic acids can be labeled with biotin and digoxigenin (DIG), which are linked via a nitrophenylazido group. Irradiation of the nitrophenylazido group with UV light leads to a photochemical reaction. Here, reactive nitrenes are split off. Detection of non-radioactive labeled samples after hybridization
  • DIG digoxigenin
  • Chemiluminescence is a fast and sensitive parameter for the detection of DNA.
  • Antibodies are used for this purpose which specifically target the markings made in the DNA, e.g. Bind biotin, fluorescein or digoxigenin, and are coupled, for example, to horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase. Both enzymes can be used in reactions in which light is emitted or a color conversion takes place.
  • HRP horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • Fluorescence labeling with fluorophores is mainly used for polypeptides or small proteins, especially for those that cannot be detected with Coomassie blue and / or with a silver stain.
  • the fluorescent label can be used as an alternative to staining techniques.
  • Fluorophore labeling is widely used in nucleic acids in hybridization systems such as in microarrays.
  • the object of the present invention is to provide a method in which the background contamination is reduced after the marking reaction has taken place.
  • non-radioactive markers can also be used according to the invention.
  • reporter groups are known from the prior art [C. Kessler, Nonradioactive Analysis of Biomolecules, J. Biotechnol. 35 (1994) 165]; among these, the following are preferred:
  • Fluorescence markers - such as markers for direct fluorescence: fluorescein (FITC, FLUOS), cyanines, Alexa fluorophores, rhodamine (RHODOS, RESOS, RESIAC), hydroxycoumarin (AMCA), benzofuran, Texas red, biman, ethidium / Tb 3+ ,
  • Fluorescence markers for time-triggered fluorescence such as lanthanoid (Eu 3+ / Tb 3+ ) complexes, micelles or chelates.
  • Fluorescence markers for fluorescence energy transfer such as fluorescein: rhodamine.
  • Luminescent markers for chemiluminescence e.g. (Iso) luminol derivatives or acridine esters.
  • Luminescent markers for electroluminescence such as Ru 2+ - (2,2'-bipyridyl) 3 - complexes.
  • Luminescence markers for luminescence energy transfer e.g. Rhodamine: luminol.
  • Metal markers e.g. metal-marked - especially Au- and Ag-marked
  • Enzyme markers for direct enzyme coupling e.g. Alkaline phosphatase (AP)
  • Oxidase glucose-6-phosphate dehydrogenase, hexokinase, bacterial luciferase,
  • Enzyme markers for enzyme substrate transfer e.g. Glucose oxidase: horseradish
  • Enzyme markers for enzyme complementation e.g. Inactive? -Galactosidase: ⁇ - peptide.
  • Polymeric markers e.g. Latex dye particles or polyethyleneimine.
  • the labeling agent can be covalently bound to the substance to be labeled (nucleic acids, peptides, oligopeptides, proteins or other biopolymers) or can be non-covalently associated with it.
  • the task is to avoid a high background signal, which leads to a short range of sensitivity and dynamic range of the measurements.
  • this object is achieved by a method in which, before the purification of the labeled substance, preferably before the end of the labeling reaction, particularly preferably in the last third and very particularly preferably at the end of the labeling reaction, an unlabeled substance, preferably an unlabeled one Adds derivative of the starting material used and particularly preferably the corresponding unlabelled starting material to the reaction mixture.
  • the unlabeled substance is preferably chemically, physically or structurally related to the substance used for the marking or a derivative thereof, or particularly preferably with the starting material except for the actual marking.
  • the concentration ratio of the unlabelled reagent to the labeled reagent is preferred in an interval from 1: 1 to 1000: 1, particularly preferably in an interval from 10: 1 to 100: 1.
  • Example 1 shows the reduction in noise after the addition of various amounts of unlabeled reagent after the end of the labeling reaction described in Example 1.
  • Example 2 shows the signal to noise ratio after the addition of various amounts of unlabeled reagent after the end of the labeling reaction described in Example 2.
  • 3 graphically represents the reduction in noise after the addition of unlabeled reagent after the end of the labeling reaction described in Example 3.
  • nucleic acid solutions are purified using a silica purification step (for example "QiaQuick" from Qiagen, D-40724 Hilden).
  • the RNA binds to the silica membrane during the purification process.
  • the eluate obtained in this way which should not contain any free radiolabelled nucleotides, but purified RNA, is measured.
  • a continuous reduction of the background contamination after addition of a 1.7 mM dNTP, 5 mM dNTP to a 10 mM dNTP solution is detected.
  • reaction batches contain Omniscript Reverse Transcriptase (from Qiagen, D-40724 Hilden), while the other reaction batches contain no enzyme for the incorporation of radioactively labeled nucleotides and thus serve as background control.
  • These mixtures are incubated for 1 h at 37 ° C. and then supplemented with 10 ⁇ l of a mixture which contains unlabelled nucleotides of different concentrations in different reaction batches. 10 ⁇ l of water (0 mM dNTP) were added to a reaction mixture. This serves as a control approach.
  • the nucleic acid solutions are purified using a silica purification step (for example "QiaQuick" from Qiagen, D-40724 Hilden).
  • the RNA and radioactively labeled cDNA bind to the silica membrane during the purification process (commercially available from Qiagen, D-40724 Hilden).
  • the RNA binds to the silica membrane.
  • the eluate which should not contain any free radiolabelled nucleotides, but should contain purified RNA or RNA / radiolabelled cDNA, is measured.
  • the signal-to-noise ratio in the eluate from built-in labeled substances to non-built-in labeled substances in comparative reactions was calculated. If unlabeled nucleotides were added after the reaction but before the purification, the signal-to-noise ratio increased to 8 times.
  • 0.1 mM fluorophore-labeled nucleotides are incubated in water together with 0.4 ⁇ g DNA and 0.1 mM dNTP. Fluorophore-labeled nucleotides cannot be incorporated because no enzymes are added. These mixtures are briefly incubated and then supplemented with 10 ⁇ l of a mixture which contains unlabeled nucleotides (10 mM) in various reaction batches. 10 ⁇ l of water (0 mM dNTP) are added to each reaction mixture. This serves as a control approach.
  • All batches are cleaned using a silica cleaning step (e.g. "QiaQuick” from Qiagen, D-40724 Hilden).
  • a silica cleaning step e.g. "QiaQuick” from Qiagen, D-40724 Hilden.
  • the DNA binds to the silica membrane.
  • the optical density of the eluate is measured in the photometer under standard conditions.
  • nucleotides that are not labeled are added to the mixture after incubation, but before nucleic acid purification, the background contamination is reduced by up to 70 times.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Hintergrund-Kontamination nach einer Markierungsreaktion.

Description

Verfahren zur Reduktion der Hintergrund-Kontamination nach
Markierungsreaktionen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion der Hintergrund-Kontamination bei der Durchführung von Markierungsreaktionen an Biomolekülen, vorzugsweise an Biopolymeren wie Peptiden, Proteinen oder Nukleinsäuren mit Markierungssubstanzen.
Im Stand der Technik haben sich Markierungsreaktionen zur Quantifizierung oder Identifizierung von Substanzen nachhaltig etabliert. So können beispielsweise
Nukleinsäuren mit modifizierten Nukleotiden markiert werden. In anderen Fällen werden markierte Substanzen als Code oder Sensor zur Identifizierung anderer Moleküle oder Nach Verfolgung von Prozessabläufen benutzt.
Um reine markierte Substanzen zu erhalten, werden entsprechend markierte Moleküle als Substrat in diesen Markierungsreaktionen eingesetzt. Dabei erfolgt der Einbau von nicht-radioaktiven Modifikationsgruppen durch enzymatische, photochemische oder chemische Reaktionen. Radioaktive Isotope werden dagegen weitgehend durch enzymatische Reaktionen eingebaut. Die Markierungspositionen und Art der Markierung sind bei den verschiedenen Verfahren unterschiedlich, je nachdem, ob radioaktive Isotope oder nicht-radioaktive Reportergruppen zum Einsatz kommen.
Über den enzymatischen Einbau von markierten Nukleotiden sind auf diese Weise Nukleinsäuren (DNA, RNA) unterschiedlichster Länge markierbar. Hierdurch sind Sonden herstellbar, die über eine hohe Markierungsdichte sowie über eine hohe Sensitivität verfügen.
Bei den enzymatischen Markierungsreaktionen werden entweder 5'-markierte Primer (PCR-Markierung) oder markierte Nukleotide anstelle von unmarkierten Nukleotiden oder eine Kombination beider Methoden verwendet.
Der Nachteil, der inhärent allen diesen Markierungstechniken innewohnt, besteht darin, dass das markierte Produkt eine störende Hintergrund-Kontamination aufweist. Dieses Problem ist der Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung. Aus dem Stand der Technik sind eine Vielzahl von Reinigungsprotokollen zum Entfernen unerwünschter Begleitstoffe des angestrebten markierten Produkts bekannt. Diese weisen jedoch häufig den Nachteil auf, dass bei Einsatz der markierten Substanzen eine Kontamination letztendlich doch noch nachweisbar ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es ermöglicht, ähnliche Eigenschaften der markierten Reaktanden zu diskriminieren. Es ist also das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Substanzpräparation mit möglichst geringerer Hintergrund-Kontamination und einfacher Durchführbarkeit zur Verfügung zu stellen.
Bei zahlreichen molekularbiologischen Anwendungen werden Nukleinsäure-Fragmente, Oligonukleotide, Proteine und Peptide beispielsweise mit radioaktiven Verbindungen oder mit Farbstoffen markiert. Die jeweilige Methode für die Markierung wird jedoch beispielsweise von der Länge der Nukleinsäure-Fragmente, von den experimentellen Voraussetzungen und der Nachweisempfindlichkeit bestimmt. Dabei kann die Markierungsreaktion mittels Polymerasen wie z.B. DNA- oder RNA-Polymerasen oder reverser Transkriptasen katalysiert werden.
Die radioaktive Markierung erfolgt durch Einbau von instabilen Isotopen oder von
Substanzen, die instabile Isotope enthalten, oder durch Austausch stabiler natürlicher Isotope durch instabile Isotope [F. Lottspeich und H. Zorbas (Hrsg.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1998]. Durch diesen Isotopenaustausch wird die chemischen Struktur im übrigen nicht geändert, so dass die markierten Moleküle die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie die natürlichen Substanzen haben. Dies bedeutet, dass die Reaktionsbedingungen für den enzymatischen Einbau markierter Nukleotide in Hybridisierungssonden nicht geändert werden müssen. Im Fall der am häufigsten verwendeten 32P- oder 33P- Phosphatmarkierung ist die Austauschposition entweder die a- oder γ-Position der Phosphatreste in 2'-Desoxyribo-, 3'-Desoxyribo- oder 2'-Ribonukleotiden.
Im Fall von 35S erfolgt der Austausch gegen ein Sauerstoffatom des σ-Phosphats.
Die Markierung mit 25l erfolgt an der C-5-Position des Cytosins. Im Gegensatz zur Isotopenmarkierung wird bei der Verwendung von nichtradioaktiven Molekülen zur Modifikation von Sonden durch die Einführung der Modifikationsgruppe die chemische Struktur der markierten Nukleotide geändert. Dies hat z.B. zur Folge, dass die Reaktionsbedingungen für den enzymatischen Einbau den geänderten Substrateigenschaften angepasst werden müssen. Zum Schutz vor unspezifischen Wechselwirkungen müssen bei Blot-Hybridisierungen die Membranoberfläche sowie bei in s/Yt/-Hybridisierungen die Zeil- bzw. Gewebsoberfläche mit geeigneten blockierenden Reagenzien gesättigt werden.
Markierte Nukleinsäuren (DNA wie auch RNA) werden in der molekularbiologischen Klonierung als Reagenz oder als Probe benutzt. Ganz allgemein kann das Markierungsreagenz kovalent an die zu markierende Substanz gebunden oder aber mit dieser nicht-kovalent assoziiert sein.
Hierbei werden markierte Fragmente klonierter DNA und/oder Oligonukleotide von definierter Größe als Reagenz für chemische und enzymatische Sequenzierungen, für Nuklease S1 -Analyse von RNA und in sogenannten Band-shift-Experimenten benutzt. Auf der anderen Seite werden markierte Nukleinsäure-Proben bei Hybridisierungs- Techniken für die Lokalisation und die Bindung von DNA und RNA komplementärer Sequenzen benötigt. Diese Techniken schließen Kolonie- und PIaque-Hybridisierung, Southern und Northern Analysen, in s/Yu-Hybridisierungen und Sequenzierung durch Hybridisierungen mit ein.
In den beschriebenen Fällen ist der Erfolg einer Einführung der Markierung in DNA oder RNA von der jeweils eingesetzten Methode abhängig, wie z.B. Endmarkierung, "random priming", Nick-Translation, in wrro-Transkription und Variationen der Polymerase Kettenreaktion (PCR) etc.
Erläuternd sei zunächst beispielhaft auf einige aus dem Stand der Technik bekannte Markierungen von Nukleinsäuren eingegangen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können auch Abwandlungen oder Variationen dieser Methoden wie auch methodisch andere Verfahren eingesetzt werden. 5'-Phosphorylierunq von DNA
Mit Hilfe von [γ-32P]ATP erfolgt die radioaktive Markierung einzelsträngiger Hybridisierungsproben oder von DNA zur Sequenzierung nach Maxam-Gilbert. Hierbei wird die γ-Phosphatgruppe des ATP durch das Enzym T4-Polynukleotid- Kinase auf die 5'-terminale Hydroxylgruppe des Oligodesoxynukleosidtriphosphats bzw. der DNA übertragen.
Terminale Transferase Reaktion
DNA-Oligonukleotide können über die Terminale Transferase enzymatisch durch matrizenunabhängige Anheftung von markierten dNTPs markiert werden (tailing).
Werden Mischungen von markierten und unmarkierten dNTPs eingesetzt, bilden sich in einer matrizenunabhängigen Reaktion einzelsträngige Ketten (tails), die mehrere Markierungen tragen. Bei der Verwendung von markiertem Cordyceptin- Triphosphat (3'-dATP) oder 2',3'-ddNTPs wird nur ein einziges markiertes Nukleotid angeheftet, da die reduzierte 3'-Position nicht weiter verlängert werden kann.
3'-Endmarkierung von DNA
DNA mit 5'-überstehenden Enden kann durch eine Auffüllreaktion des Klenow- Fragmentes der E.coli DNA-Polymerase I an einem oder beiden 3'-Enden radioaktiv markiert werden. Hierzu werden die [α-32P]Desoxynukleosidtriphosphate verwendet, die zu der jeweiligen ersten Base der 5' Einzelstrangenden komplementär sind.
Radioaktive Markierung von DNA durch Nick-Translation Bei der Nick-Translation wird neben geringen Mengen pankreatischer DNase I das
E.coli DNA-Polymerase Holoenzym verwendet. Der Hintergrund hierfür ist, dass bei dieser Methode neben der Polymeraseaktivität auch die 5'→ 3'- Exonukleaseaktivität erforderlich ist. Die DNase katalysiert zunächst die Bildung von Einzelstrangbrüchen (nicks). Damit keine weitergehenden Spaltungen erfolgen, ist eine genau eingestellte geringe DNase-Konzentration erforderlich. Die den
Einzelstrangbruch flankierenden 3'- und 5'-Enden fungieren als Substrat für die 5'-» 3'-Polymeraseaktivität und die 5'- 3'-Exonukleaseaktivität. Die 5'-» 3'- Exonukleaseaktivität ist für den sukzessiven Abbau der 5'-phosphorylierten Nukleotide verantwortlich, während durch die 5'- 3'-Polymeraseaktivität synchron entstehende Lücken mit neuen, markierten Nukleotiden wieder aufgefüllt werden. Hierdurch wandert der Nick in δ'→ 3'-Richtung (nick translation). Dem gemäß handelt es sich hier um eine DNA-Ersatzsynthese (replacement-synthesis), wobei im Gegensatz zur Random-Priming-Synthese (s.u.) aus den oben beschriebenen - reaktionsbedingten - Gründen die Ausbeuten geringer als 100% bleiben.
Markierung von DNA-Fragmenten durch "random priminq"
Beim "random priming"-Protokoll wird zunächst Doppelstrang-DNA denaturiert. Die
Rehybridisierung beider Stränge wird durch Abkühlung auf niedrige Temperaturen und durch Zugabe hoher Konzentrationen der Primer verhindert. Die Primer stellen ein Gemisch aller möglichen Hexanukleotide (random primer) dar, so dass - statistisch gesehen - jede Zielsequenz abgedeckt ist und die Hybridisierung an jedweder beliebigen Stelle erfolgen kann. Das Klenow-Fragment, das große Subtilisin-Fragment des DNA-Polymerase-Holoenzyms, verlängerrt die Primer in einer matrizenabhängigen Reaktion. Bei der Elongationsreaktion werden unmarkierte dNTPs und haptenmodifizierte dUTPs eingebaut. Da die Templatestränge repliziert werden, erfolgt eine Neusynthese. Auf diese Art und Weise sind via Strangverdrängung hohe Sondenausbeuten mit über 100 % der eingesetzten Template -DNA erhältlich. Da statistisch mehrere Primer pro Target binden, werden pro Primerelongation nur Teilsequenzen repliziert; es entsteht auf diese Weise ein Gemisch unterschiedlicher Sondenlängen, wobei jedoch die Teilsequenzen alle Zielspezifisch sind und homogene Markierung tragen. Mit Digoxigenin-markierten Sonden, die durch die "random priming'-Methode erzeugt werden, können hohe Nachweis-Sensitivitäten im Subpicogrammbereich realisiert werden
Markierung von RNA durch in wYro-Transkription
Markierte RNA-Sonden hoher spezifischer Aktivität können durch in vitro- Transkription klonierter DNA-Fragmente hergestellt werden. Hierfür werden geeignete Promotoren benötigt, die sich z.B. in Klonierungsvektoren
(Transkriptionsvektoren) wie Vektoren der Ribo Gemini Serie (pGEM-3 oder pGEM- 4) finden. Durch diese Vektoren können bei der entsprechenden RNA-Polymerase, durch in wϊro-Transkriptionsreaktionen RNA-Proben gegensätzlicher Orientierung (z.B. "sense" und "antisense") hergestellt werden. Hierzu muss der Vektor downstream der zu amplifizierenden Sequenz linearisiert werden, damit keine RNA- Fragmente erzeugt werden, die den gesamten Vektor umlaufen ("run-around"- Transkripte). Auf diese Weise wird nur die gewünschte Monierte Sequenz mit [α- 32P]-Nukleotiden (ATP oder CTP) markiert.
Nicht-radioaktive Markierung von Nukleinsäuren
Bei Einführung von nicht-radioaktiv markierten Substanzen konjugieren chemische Gruppen oder Komponenten, die nicht Bestandteile von Nukleinsäuren sind, mit der Probe über enzymatische oder andere chemische Reaktionen. Nach der Hybridisierung mit der Nukleinsäure detektieren geeignete Indikatorsysteme oder
Detektionssysteme die modifizierten Gruppen der Probe.
Die ersten nichtradioaktiven Methoden wurden bereits 1980 entwickelt und basieren auf einer Markierung von Nukleinsäure-Proben mit Dinitrophenol, Bromodeoxyuridin und Biotin.
Die biotinylierten Proben werden nach der Hybridisierung über eine Interaktion mit Streptavidin, das oftmals mit Alkalischer Phosphatase als Reporterenzym konjugiert ist, über die enzymatische Aktivität der Phosphatase detektiert.
Enzymatische Methoden
Die homogene DNA-Markierung wird entweder über "random priming" mit dem großen Fragment der E.coli DNA-Polymerase I (Klenow Enzym), Nick-Translation E.coli DNA-Polymerase I (Kornberg-Enzyme) oder über PCR-Amplifikation mit Taq- Polymerase erreicht. Hierbei liegen die Markierungsdichten bei einer Markierung pro 25 bis 36 Basenpaare. Oligonukleotide können enzymatisch mit Hilfe der Terminale Transferase-Reaktion markiert werden; je nach Substrat werden hier ein bis fünf Markierungen pro Oligonukleotid angeheftet.
Photochemische Markierungen
Nukleinsäuren können mit Biotin und Digoxigenin (DIG) markiert werden, die über eine Nitrophenylazido-Gruppe verbunden sind. Bestrahlung der Nitrophenylazido- Gruppe mit UV-Licht führt zu einer photochemischen Reaktion. Hierbei werden reaktive Nitrene abgespalten. Detektion von nicht-radioaktiv markierten Proben nach der Hybridisierung
Chemolumineszenz
Die Chemolumineszenz ist ein schneller und sensitiver Parameter zur Detektion von DNA. Hierfür werden Antikörper eingesetzt, die spezifisch die in die DNA eingebrachten Markierungen, z.B. Biotin, Fluorescein oder Digoxigenin, binden und beispielsweise an Meerrettich Peroxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase gekoppelt sind. Beide Enzyme können bei Reaktionen eingesetzt werden, bei denen Licht emittiert wird oder ein Farbumsatz erfolgt.
Fluoreszenzmarkierung
Die Fluoreszenzmarkierung mit Fluorophoren wird vor allem bei Polypeptiden oder kleinen Proteinen eingesetzt, insbesondere bei solchen, die sich nicht mit Coomassie-Blau und/oder mit einer Silberfärbung nachweisen lassen. Die Fluoreszenzmarkierung kann alternativ zu Färbetechniken angewandt werden. Bei
Nukleinsäuren findet die Fluorophormarkierung breite Anwendung in Hybridisierungssystemen wie z.B. in Microarrays.
Wie bereits eingangs erwähnt, besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem die Hintergrund-Kontamination nach erfolgter Markierungsreaktion reduziert wird.
Neben den schon erwähnten radioaktiven Markern bzw. Reportergruppen - unter denen 3H, 14C, 32P, 33P, 35S oder 125l bevorzugt werden - können erfindungsgemäß auch nicht- radioaktive Marker zum Einsatz gelangen. Derartige Reportergruppen sind aus dem Stand der Technik bekannt [C. Kessler, Nonradioactive Analysis of Biomolecules, J. Biotechnol. 35 (1994) 165]; unter diesen werden die folgenden bevorzugt:
Fluoreszenzmarker - wie z.B. Marker für die direkte Fluoreszenz: Fluorescein (FITC, FLUOS), Cyanine, Alexa-Fluorophore, Rhodamin (RHODOS, RESOS, RESIAC), Hydroxycoumarin (AMCA), Benzofuran, Texas-Rot, Biman, Ethidium/Tb3+.
Fluoreszenzmarker für die zeitausgelöste Fluoreszenz, wie z.B. Lanthanoid-(Eu3+/ Tb3+)-Komplexe, -Micellen oder -Chelate. Fluoreszenzmarker für den Fluoreszenz-Energie-Transfer, wie z.B. Fluorescein:Rhodamin.
Lumineszenzmarker für die Chemolumineszenz, wie z.B. (Iso-)Luminolderivate oder Acridinester.
Lumineszenzmarker für die Elektrolumineszenz, wie z.B. Ru2+-(2,2'-bipyridyl)3- Komplexe.
Lumineszenzmarker für den Lumineszenz-Energie-Transfer, wie z.B. Rhodamin:Luminol.
Sog. Metallmarker, wie z.B. metallmarkierte - insbesondere Au- und Ag-markierte
Antikörper.
Enzymmarkerfür die direkte Enzymkopplung, wie z.B. Alkalische Phosphatase (AP),
Meerettich-Peroxidase (POD), Mikroperoxidase, ?-Galactosidase, Urease, Glucose-
Oxidase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, bakterielle Luciferase,
Glühwürmchen-Luciferase.
Enzymmarkerfür den Enzymsubstrattransfer, wie z.B. Glucose-Oxidase:Meerettich-
Peroxidase.
Enzymmarkerfür die Enzym-Komplementation, wie z.B. Inaktive ?-Galactosidase:σ- Peptid.
Polymere Marker, wie z.B. Latex-Farbstoffpartikel oder Polyethylenimin.
Ganz allgemein kann das Markierungsagenz kovalent an die zu markierende Substanz (Nukleinsäuren, Peptide, Oligopeptide, Proteine oder andere Biopolymere) gebunden oder aber mit dieser nicht-kovalent assoziiert sein. Es stellt sich bei allen der oben genannten Verfahren die Aufgabe, ein hohes Hintergrundsignal zu vermeiden, das zu einer geringen Reichweite der Empfindlichkeit und Dynamik der Messungen führt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, in dem man vor der Aufreinigung der markierten Substanz, bevorzugt vor dem Ende der Markierungsreaktion, besonders bevorzugt im letzten Drittel und ganz besonders bevorzugt am Ende der Markierungsreaktion eine nicht-markierte Substanz, vorzugsweise ein nicht-markiertes Derivat des eingesetzten Edukts und besonders bevorzugt das entsprechende nicht-markierte Edukt dem Reaktionsgemisch zufügt.
Dabei ist die nicht-markierte Substanz vorzugsweise chemisch, physikalisch oder strukturell mit der zur Markierung eingesetzten Substanz verwandt oder ein Derivat von dieser, bzw. besonders bevorzugt mit dem Edukt bis auf die eigentliche Markierung identisch.
Bevorzugt wird dabei Konzentrationsverhältnis des nicht-markierten Reagenz zum markierten Reagenz in einem Intervall von 1 :1 bis 1000:1 , besonders bevorzugt in einem Intervall von 10:1 bis 100:1.
Nach dieser Zugabe schließt sich ein an sich aus dem Stand der Technik bekanntes Reinigungsverfahren an. Dieses kann jedes Verfahren sein, welches zu einer Aufreinigung der markierten Substanz führt.
Fig. 1 zeigt die Reduktion des Rauschens nach Zugabe von verschiedenen Mengen unmarkierten Reagenzes nach dem Ende der in Beispiel 1 beschriebenen Markierungsreaktion.
Fig. 2 zeigt das Verhältnis von Signal zu Rauschen (signal to noise ratio) nach der Zugabe von verschiedenen Mengen unmarkierten Reagenzes nach dem Ende der in Beispiel 2 beschriebenen Markierungsreaktion. Fig. 3 gibt graphisch die Reduktion des Rauschen nach der Zugabe unmarkierten Reagenzes nach dem Ende der in Beispiel 3 beschriebenen Markierungsreaktion wieder.
Fig. 4 zeigt eine 70-fache Reduzierung des Hintergrundes für das Beispiel 3.
Weitere Einzelheiten der Erfindung werden in den Beispielen erläutert.
Beispiele
Beispiel 1 : Radioaktive Markierung
In diesem Experiment wird die Hintergrund-Kontamination der radioaktiven Nukleotide nach einer Aufreinigung gemessen.
10 μCi von 32P-dCTP werden zusammen mit 1 μg poly(A)-RNA, Standard-Puffer, der in einem pH-Bereich von 7 bis 10 puffert (beispielsweise RT Puffer der Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden), 0,1 mM (mmol/L) dNTP, 10 U RNase Inhibitor (Promega) und 1μM oligo- dT15 inkubiert.
Während dieser Inkubation können keine radioaktiv markierten Nukleotide eingebaut werden, da keine Enzyme zugesetzt werden. Danach wird das Gemisch für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation wird dem Gemisch 10 μl einer Mischung, die nicht markierte Nukleotide von unterschiedlichen Konzentrationen enthält, in verschiedenen Reaktionsansätzen zugegeben. Ein Reaktionsansatz, dem 10 μl Wasser (0 mM dNTP) zugegeben wurde, dient dabei als Kontrollansatz.
Diese Nukleinsäure-Lösungen werden über einen Silica-Reinigungsschritt (z.B. "QiaQuick" der Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden) aufgereinigt. Die RNA bindet während des Reinigungsverfahrens an die Silica-Membran. Das so erhaltende Eluat, das keine freien radioaktiv markierten Nukleotide enthalten sollte, jedoch aufgereinigte RNA, wird gemessen. Hierbei wird eine kontinuierliche Reduktion der Hintergrund-Kontamination nach Zugabe von einer 1 ,7 mM dNTP-, 5 mM dNTP- bis zu einer 10 mM dNTP-Lösung nachgewiesen.
Beispiel 2: Radioaktive Markierung
In diesem Experiment wird das Verhältnis von Signal zu Rauschen von eingebauten markierten Substanzen zu nicht-eingebauten markierten Substanzen in Vergleichsreaktionen gemessen.
10 μCi von 32P-dCTP werden zusammen mit 1 μg poly(A)-RNA, Standard-Puffer, der in einem pH-Bereich von 7 bis 10 puffert (beispielsweise RT Puffer der Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden), 0,1 mM dNTP, 10 U RNase Inhibitor (Promega) und 1μM oligo-dT15 inkubiert.
Ein Teil der Reaktionsansätze enthält Omniscript Reverse Transkriptase (Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden), während die anderen Reaktionsansätze kein Enzym für den Einbau von radioaktiv-markierten Nukleotiden enthalten und damit als Hintergrund-Kontrolle dienen. Diese Gemische werden 1 h bei 37° C inkubiert und anschließend mit 10 μl einer Mischung, die nicht-markierte Nukleotide von unterschiedlichen Konzentrationen enthält, in verschiedenen Reaktionsansätzen ergänzt. Einem Reaktionsansatz wurden 10 μl Wasser (0 mM dNTP) hinzugegeben. Dieser dient als Kontrollansatz.
Die Nukleinsäure-Lösungen, werden über einen Silica-Reinigungsschritt (z.B. "QiaQuick" der Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden) aufgereinigt. Die RNA und radioaktiv markierte cDNA binden während des Reinigungsverfahren an die Silica-Membran (kommerziell erhältlich von der Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden). In der Kontroll-Reaktion bindet die RNA an die Silica-Membran. Das Eluat, das keine freien radioaktiv markierten Nukleotide, aber aufgereinigte RNA oder RNA/radioaktiv markierte cDNA enthalten sollte, wird gemessen. Das Signal-Rauschverhältnis im Eluat von eingebauten markierten Substanzen zu nicht-eingebauten markierten Substanzen in Vergleichsreaktionen wurde berechnet. Bei Zugabe von nicht markierten Nukleotiden nach der Reaktion aber vor der Aufreinigung erhöhte sich das Signal-Rauschverhältnis auf ein 8-faches.
Beispiel 3: Fluoreszenzmarkierung
In diesem Experiment wird die Hintergrund-Kontamination von Nukleotiden, die Fluorophor-markiert sind, nach der Aufreinigung gemessen.
0,1 mM Fluorophor-markierte Nukleotide werden zusammen mit 0,4 μg DNA und 0,1 mM dNTP in Wasser inkubiert. Fluorophor-markierte Nukleotide können nicht eingebaut werden, da keine Enzyme zugesetzt werden. Diese Gemische werden kurz inkubiert und anschließend mit 10 μl einer Mischung, die nicht markierte Nukleotide (10 mM) enthält, in verschiedenen Reaktionsansätzen ergänzt. Jeweils einem Reaktionsansatz werden 10 μl Wasser (0 mM dNTP) zugegeben. Dieser dient als Kontrollansatz.
Alle Ansätze werden über einen Silica-Reinigungsschritt (z.B. "QiaQuick" der Fa. Qiagen, D- 40724 Hilden) aufgereinigt.
Während des Reinigungsverfahrens bindet die DNA an die Silica-Membran. Die optische Dichte des Eluats wird unter Standard-Bedingungen im Photometer gemessen.
Gibt man nach der Inkubation, aber vor der Nukleinsäure-Aufreinigung dem Ansatz nicht markierte Nukleotiden zu, erniedrigt sich die Hintergrund-Kontamination um ein bis zu 70-faches.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Markierung von Biomolekülen, bevorzugt von Peptiden, Proteinen und Nukleinsäuren, wobei die Biomoleküle mit einem Markierungsreagenz umgesetzt werden und nicht umgesetztes Markierungsreagenz von der markierten Substanz abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man vor der Aufreinigung der markierten Biomoleküle, bevorzugt vor dem Ende der Markierungsreaktion, besonders bevorzugt im letzten Drittel und ganz besonders bevorzugt am Ende der Markierungsreaktion, eine nicht-markierte Substanz, vorzugsweise ein nicht-markiertes Derivat und besonders bevorzugt das entsprechende nicht-markierte Edukt, dem Reaktionsgemisch zufügt.
2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren DNA (DNS)und/oder RNA (RNS) umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsagenz ein radioaktives Isotop, bevorzugt 3H, 14C, 32P, 33P, 35S oder 125l, ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsagenz ein Fluoreszenzmarker ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzmarker Fluorescein (FITC, FLUOS), Rhodamin (RHODOS, RESOS,
RESIAC), Hydroxycoumarin (AMCA), Benzofuran, Texas-Rot, Biman, und/oder Ethidium/Tb3+.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzmarker ein Fluoreszenzmarker für zeitausgelöste Fluoreszenz, vorzugsweise ein Lanthanoid-(Eu37 Tb3+)-Komp!ex, eine -Micelle oder ein - Chelat, ist.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzmarker ein Fluoreszenzmarker für den Fluoreszenz-Energie- Transfer, vorzugseise Fluorescein :Rhodamin, ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsagenz ein Lumineszenzmarker ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Lumineszenzmarker ein Lumineszenzmarker für die Chemolumineszenz, vorzugsweise ein (/so-)Luminolderivate oder Acridinester, ist.
10.Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der
Lumineszenzmarker ein Lumineszenzmarker für die Elektrolumineszenz, vorzugsweise ein Ru2+-(2,2'-bipyridyl)3-Komplex, ist.
11.Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der
Lumineszenzmarker ein Lumineszenzmarker für den Lumineszenz-Energie- Transfer, vorzugsweise Rhodamin:Luminol, ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsagenz ein Metallmarker, vorzugsweise ein metall-markierter und besonders bevorzugt ein Au-markierter oder Ag-markierter Antikörper, ist.
13.Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsagenz ein Enzymmarker ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Enzymmarker ein Enzymmarker für die direkte Enzymkopplung, vorzugsweise Alkalische Phosphatase (AP), Meerettich-Peroxidase (POD), Mikroperoxidase, ß- Galactosidase, Urease, Glucose-Oxidase, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, bakterielle Luciferase, Glühwürmchen-Luciferase, ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Enzymmarker ein Enzymmarker für den Enzymsubstrattransfer, vorzugsweise Glucose- Oxidase:Meerettich-Peroxidase, ist. 16Nerfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Enzymmarker ein Enzymmarker für die Enzym-Komplementation, vorzugsweise ein inaktives ß- Galactosidase: -Peptid, ist.
17.Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass
Markierungsagenz ein polymerer Marker, vorzugsweise Latex-Farbstoffpartikel oder Polyethylenimin, ist.
18Nerfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsagenz kovalent an das zu markierende Peptid, Protein oder die
Nukleinsäure gebunden ist oder nicht-kovalent assoziiert ist.
19.Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung von DNA-Polymerase, RNA-Polymerase oder Reverser Transkriptase katalysiert wird.
20.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Konzentrationsverhältnis des nicht-markierten Reagenz zum markierten Reagenz in einem Intervall von 1 :1 bis 1000:1 , vorzugsweise in einem Intervall von 10:1 bis100:1, liegt.
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