CN104955477B - 用于通过使用肾相关抗原1（kaag1）的抑制剂来治疗三阴性乳癌和基底样乳癌的方法 - Google Patents

用于通过使用肾相关抗原1（kaag1）的抑制剂来治疗三阴性乳癌和基底样乳癌的方法 Download PDF

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Abstract

缺乏ER蛋白质表达、PgR蛋白质表达和/或显示不存在HER2蛋白质过度表达的乳癌细胞(即三阴性乳癌细胞，基底样)可以用一种抗KAAG1抗体有效地靶向并且在一种治疗性部分的递送之后被杀死。特异性地结合至KAAG1的抗体和抗原结合片段因此可以被用于针对这些标记中的至少一个是阴性的乳癌细胞的检测和治疗性治疗。在此披露了抗体结合物在三阴性乳癌和/或基底样乳癌的治疗方面的用途。

Description

用于通过使用肾相关抗原1（KAAG1）的抑制剂来治疗三阴性乳 癌和基底样乳癌的方法
背景
全球每年有超过1百万女性诊断出乳癌。乳癌乳房癌是一种十足的异质性疾病，该疾病由几十种不同类型组成，这些类型是使用一种组织学分类系统加以区分。一大类亚型和大多数案例在组织学上被鉴定为管状A型或管状B型，可以将管状A型或管状B型对应地大概表征为展现具有低级或更高级组织学的雌激素受体(ER)表达(桑塔纳·戴维拉(Santana-Davila)和佩雷兹(Perez)，2010)。使用免疫组织化学方法来测量孕酮受体(PgR)的表达，当与ER阳性状态相结合时，孕酮受体的表达允许将肿瘤分类为激素反应性。此外，人类表皮生长因子受体2(HER2)的过度表达或扩增可以用或者免疫组织化学或者荧光原位杂交(FISH)来监测。总体上，这三种标记在乳房肿瘤中的表达是与更佳的临床结果相关的，因为存在若干种靶向这些蛋白质的可用于患者的治疗选择方案(德·勒伊特(de Ruijter)等人，2011)，这些治疗选择方案包括他莫昔芬、ArimidexTM(阿那曲唑)、AromasinTM(依西美坦)、FemaraTM(来曲唑)、FaslodexTM(氟维司群)、HerceptinTM(曲妥珠单抗)或TykerbTM(拉帕替尼)。
乳癌乳房癌的另一个组织学亚型由基底样癌症组成，这些基底样癌症尤其与更高的组织学分级相关，增加有丝分裂指数和高Ki67表达(桑塔纳·戴维拉和佩雷兹，2010)。绝大部分的基底样癌症包括三阴性乳癌(TNBC)案例，三阴性乳癌占所有诊断乳癌案例的15％-20％之间(伊斯梅尔·卡恩(Ismail-Khan)和布伊(Bui)，2010)。TNBC是通过缺乏ER、PgR的蛋白质表达和不存在HER2蛋白质过度表达加以定义。基底样癌症与TNBC之间的关系不容易描述，因为不是所有的TNBC都是基底样并且不是所有的基底样癌症都是TNBC，但是这些类别当中约75％的案例共享两者的特征。TNBC是与不良预后相关的，不良预后由低五年存活率和高复发组成。
相比于其他乳癌亚型，患有TNBC的患者在一生中更早地发展其疾病并且通常在绝经前期被诊断出(凯里(Carey)等人，2006)。三阴性乳癌显示一种增加的治疗后复发倾向，并且似乎比其他乳癌亚型更具侵袭性(诺菲彻·摩泽斯(Nofech-Mozes)等人，2009)，类似于基底样乳癌亚型的那些癌症。因此，TNBC患者的总体五年存活率比诊断患有其他亚型乳癌的那些患者显著更低。目前不存在针对TNBC的可接受的特异性分子标记。虽然有此缺陷，但这些肿瘤确实对化学疗法起反应(克里格(Kriege)等人，2009)。在辅助情况下以及在新辅助情况下，当给予药剂(如5-氟尿嘧啶、多柔比星以及环磷酰胺)时，患者已经显示出对细胞毒性剂的更佳的反应(柔兹尔(Rouzier)等人，2005)。已经显示出一些疗效的其他药剂包括基于铂的化合物(如顺铂)和抗微管蛋白化合物(如紫杉烷)(桑塔纳·戴维拉和佩雷兹，2010)。
如上文所提及，不存在针对TNBC的特异性靶标，但这并不妨碍靶药剂的试验，如抑制聚[ADP-核糖]聚合酶1(PARP1)。PARP1是一种酶，该酶通过将损坏的DNA链联合在一起并介导为了修复单链断裂所需酶的募集，参与DNA单链断裂的修复(德·勒伊特等人，2011)。因此，策略一直是抑制PARP1活性作为允许癌细胞积累更多的DNA单链断裂的一种方式，更多的DNA单链断裂最终导致遗传不稳定性、有丝分裂阻滞以及细胞凋亡。在显示出BRCA1和/或BRCA2突变的患者中获得了有前景的临床结果，BRCA1和/或BRCA2是恰当的细胞分裂所需的遗传维护和同源重组的重要介体。实际上，具有BRCA1突变的患者可能在这些遗传稳定性路径中有缺陷，相比于野生型BRCA1患者，显示出对PARP1抑制剂更大的反应(方(Fong)等人，2009)。很明显，靶向作为BRCA突变的载体的TNBC患者中的PARP1代表了一种有前景的策略。ER/PgR/HER2状态与BRCA1/2基因的遗传概况的状态的组合也许提供了用于决定TNBC患者的恰当治疗选择方案的最佳表征。
其他策略也检查了EGFR抑制剂的用途，或者作为单克隆抗体或者小分子抑制剂或者抗血管生成化合物用于靶向VEGF。若干临床试验已经评估了这些化合物的疗效，但是当单独给予时，这些化合物当中没有一个显示出显著的反应。然而，在用这些抑制剂与其他细胞毒性剂的组合治疗的患者中观察到了轻微的疗效(桑塔纳·戴维拉和佩雷兹，2010)。
不管对乳癌的了解和治疗的最新进展如何，化学疗法的使用总是与严重的不良反应相关，这限制了它的使用。因此，对于更具特异性的策略(如抗原组织特异性与单克隆抗体的选择性相组合)的需要将允许脱靶相关的副作用的显著减少。目前在调查研究中不存在TNBC特异性抗原作为单克隆抗体的治疗靶标。因此，TNBC患者具有极少的选择方案，因为不能靶向在这些肿瘤中表达的蛋白质的特异性标记。为了应用，存在以下迫切需要：鉴定在TNBC中表达的新蛋白质作为新诊断标记和新颖的靶向疗法。
肾相关抗原1(KAAG1)的蛋白质序列在此被鉴定为SEQ ID NO.:2，最初从来源于组织相容性白细胞抗原-B7肾癌细胞系的cDNA文库克隆，作为呈递到细胞毒性T淋巴细胞的抗原肽(范·登·艾恩德(Van den Eynde)等人，1999；基因库寄存编号Q9UBP8，该cDNA序列由SEQ ID NO.:1的核苷酸738-992表示)。发现含有KAAG1的基因座编码沿相反链上的两个方向转录的两个基因。发现有义链编码一种转录物，该转录物编码称为DCDC2的蛋白质。这些作者的表达研究发现，KAAG1反义转录物具有肿瘤特异性并且在正常组织中展现出极少表达而DCDC2有义转录物被泛表达(范·登·艾恩德等人，1999)。KAAG1转录物在癌症，并且尤其是卵巢癌、肾癌、肺癌、结肠癌、乳癌以及黑素瘤中的表达披露于2007年12月27日在编号WO2007/147265下公布的国际申请第PCT/CA2007/001134号中。范·登·艾恩德等人在肾癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肉瘤、白血病、脑肿瘤、甲状腺肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、膀胱肿瘤、肺癌以及头颈部肿瘤中还观察到了RNA表达。近来，通过连锁不平衡研究获得的有力的遗传证据发现，VMP/DCDC2/KAAG1基因座与诵读困难相关(舒马赫(Schumacher)等人，2006；科普(Cope)等人，2005)。这些报导中的一个指向DCDC2标记为诵读困难患者的罪魁祸首，因为此蛋白质在皮质神经元迁移中的功能符合这些患者的症状，这些患者通常展现异常的神经元迁移和成熟(舒马赫等人，2006)。
本申请人已经获得了结合至KAAG1蛋白质的一组抗体和抗原结合片段。这些抗体或抗原结合片段据显示靶向该蛋白质的三个区域：氨基酸1到35、氨基酸36到60、氨基酸61到84。本申请人发现，靶向介于氨基酸30到84之间的一个区域的抗体出于治疗目的是最有利的，因为这些抗体识别位于肿瘤细胞表面的KAAG1。本申请人已经展示，这些抗体和抗原结合片段中的一些可以介导抗体依赖性细胞细胞毒性和/或被肿瘤细胞内化，这使其成为向肿瘤细胞递送有效载荷的良好候选物。本申请人也已经基于所选择的抗体候选物产生了嵌合抗体和人源化抗体并且已经展示，这些抗体可以抑制肿瘤细胞形成和侵袭(参见2010年6月3日在编号WO2010/060186下公布的PCT/CA2009/001586和2011年5月12日在编号WO2011/054112下公布的PCT/CA2010/001785)。最后，本申请人发现，这些抗体可以被用于治疗和诊断卵巢癌、皮肤癌、肾癌、结直肠癌、肉瘤、白血病、脑肿瘤、甲状腺肿瘤、乳癌、前列腺癌、食道肿瘤、膀胱肿瘤、肺肿瘤以及头颈部肿瘤以及这些癌症的转移形式。
本申请人现在谈到以下意外发现：可以用特异性地结合至KAAG1的抗体或抗原结合片段有效地靶向缺乏ER蛋白质表达、PgR蛋白质表达和/或显示不存在HER2蛋白质过度表达的乳癌细胞(即三阴性乳癌细胞，基底样)。抗KAAG1抗体因此可以被用来检测和治疗性治疗对这些标记中的至少一个是阴性的乳癌细胞。
附图简要说明
图1a是鼠和人源化轻链的3A4可变结构域的一个氨基酸序列比对。该轻链具有两种人源化变体(Lh1和Lh2)。CDR显示为粗体，并且由CDRL1、CDRL2以及CDRL3指示。在人源化序列中，是鼠氨基酸的、在人框架区内的回复突变加有下划线。
图1b是鼠和人源化重链的3A4可变结构域的一个氨基酸序列比对。该重链具有四种人源化变体(Hh1到Hh4)。CDR显示为粗体，并且由CDRH1、CDRH2以及CDRH3指示。在人源化序列中，是鼠氨基酸的、在人框架区内的回复突变加有下划线。
图2a是鼠3A4轻链可变区(SEQ ID NO.:4)与轻链可变区变体(SEQ ID NO.:189)使用ClustalW2程序(拉金M.A.(Larkin M.A.)等人，(2007)ClustalW和ClustalX第2版.《生物信息学》(Bioinformatics)200723(21):2947-2948)的一个比对，其中“*”(星号)表示具有单一完全保守残基的位置，其中“：”(冒号)表示保守介于强类似特性的群组之间，即在Gonnet PAM250矩阵中评分>0.5，并且其中“.”(句点)表示保守介于弱类似特性的群组之间，即在Gonnet PAM250矩阵中评分＝<0.5。
图2b是鼠3A4重链可变区(SEQ ID NO.:2)与轻链可变区变体SEQ ID NO.:194)使用ClustalW2程序(拉金M.A.等人，(2007)ClustalW和ClustalX第2版.《生物信息学》200723(21):2947-2948)的一个比对，其中“*”(星号)表示具有单一完全保守残基的位置，其中“：”(冒号)表示保守介于强类似特性的群组之间，即在Gonnet PAM250矩阵中评分> 0.5，并且其中“.”(句点)表示保守介于弱类似特性的群组之间，即在Gonnet PAM250矩阵中评分＝<0.5。
图3a代表pKCR5-3A4-HC-变体1的质粒图谱。人源化3A4变体的重链以相同方式被克隆到pK-CR5的HindIII位点中。因此，所得质粒与pKCR5-3A4-HC变体1相同，除了重链免疫球蛋白可变结构域的序列之外。
图3b代表pMPG-CR5-3A4-LC-变体1的质粒图谱。3A4抗体的人源化变体1和2的轻链以相同方式被克隆到pMPG-CR5的BamHI位点中。因此，所得质粒与pMPG-CR5-3A4-LC-变体1相同，除了轻链免疫球蛋白可变结构域的序列之外。
图4代表在CHO细胞中瞬时转染之后的抗体产量分析。通过蛋白质印迹法来分析用人源化3A4抗体的轻链和重链的不同组合转染的CHOcTA细胞的上清液(转染后13天)。在上清液中产生的抗体的定量是在针对已知标准品(纯化的人类IgG抗体)的稀释物的蛋白质印迹的带扫描之后确定的。Mr分子量标记(kDa)。
图5是重组KAAG1样品的Superdex G75凝胶过滤图。在凝胶过滤期间注射KAAG1并相隔0.4ml/min。最大峰介于部分15-19之间。
图6是一张表，列举了3A4抗体的鼠和人源化变体的速率和亲和常数。
图7a是一个直方图，展示了人源化抗体的结合速率(Ka)。
图7b是一个直方图，展示了人源化抗体的解离速率(Kd)。
图7c是一个直方图，展示了人源化抗体的亲和常数(KD)。
图8a展示了在ELISA中，结合至KAAG1的人源化3A4变体。这个图示出了3A4人源化抗体变体和鼠3A4的对比结合。与Lh1轻链变体组装的人源化重链(Hh1、Hh2、Hh3以及Hh4)的浓度依赖性结合曲线。
图8b展示了在ELISA中，结合至KAAG1的人源化3A4变体。这个图示出了3A4人源化抗体变体和鼠3A4的对比结合。与Lh2轻链变体组装的人源化重链(Hh1、Hh2、Hh3以及Hh4)的浓度依赖性结合曲线。
图9展示了结合至癌细胞表面上的KAAG1的人源化3A4变体。这个图解示出了人源化和鼠3A4抗体在未透性化的SKOV-3卵巢癌细胞上的对比结合活性。
图10示出了含有139个从乳癌患者获得的生检样品的组织微阵列的扫描。样品用3A4抗KAAG1抗体进行印迹并显示出绝大部分乳房肿瘤表达了极高水平的KAAG1抗原。确诊TNBC样品用星号标记。
图11示出了使用MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468、BT-20、BT-549、T47D、MCF-7以及293-6E细胞系进行的流式细胞术的结果，这些细胞系与3A4抗KAAG1抗体(直方图的蓝色条)对比对照IgG(红色条)一起孵育。这是以一式三份形式进行的实验的一个代表性结果。TNBC细胞系用星号标记。
图12代表通过用3A4抗KAAG1抗体的流式细胞术来检测在MDA-MB-231细胞表面上的KAAG1抗原。当细胞在37℃下孵育时，荧光信号随时间降低，这表明当这些细胞与3A4一起孵育时，KAAG1/抗体复合物在孵育期间内化。
图13代表通过用3A4抗KAAG1抗体的流式细胞术来检测在MDA-MB-436细胞表面上的KAAG1抗原。当细胞在37℃下孵育时，荧光信号随时间降低，这表明当这些细胞与3A4一起孵育时，KAAG1/抗体复合物在孵育期间内化。
图14代表通过用3A4抗KAAG1抗体的流式细胞术来检测在BT-20细胞表面上的KAAG1抗原。当细胞在37℃下孵育时，荧光信号随时间降低，这表明当这些细胞与3A4一起孵育时，KAAG1/抗体复合物在孵育期间内化。
图15代表通过用3A4抗KAAG1抗体的流式细胞术来检测在T47D细胞表面上的KAAG1抗原。当细胞在37℃下孵育时，荧光信号随时间降低，这表明当这些细胞与3A4一起孵育时，KAAG1/抗体复合物在孵育期间内化。
图16代表用3A4抗KAAG1抗体和抗LAMP1抗体对活的MDA-MB-231细胞进行的免疫荧光数据。与抗KAAG1抗体相关的免疫荧光信号示出在左图中，与LAMP1相关的免疫荧光信号示出在中图中，并且两个图像的合并示出在右图中。这些数据展示了KAAG1和LAMP1在核周区域附近的共定位。
图17代表用3A4抗KAAG1抗体和抗LAMP1抗体对活的MDA-MB-231细胞进行的免疫荧光数据。与抗KAAG1抗体相关的免疫荧光信号示出在左图中，与LAMP1相关的免疫荧光信号示出在中图中，并且两个图像的合并示出在右图中。这些数据展示了KAAG1与LAMP1(晚期内体/溶酶体的标记)的定位。
发明概述
本发明提供了一种治疗或检测有需要的个体中的癌症或癌细胞(体外或体内)的方法。
根据本发明，治疗或检测方法可以用一种抗体进行，该抗体能够结合至KAAG1或其抗原结合片段。
有需要的个体可以包括例如患有或疑似患癌症的个体。这类个体可以具有源于乳癌的癌症或癌细胞。
癌症或癌细胞可以更具体而言源于其特征在于是三阴性或基底样的乳癌。
因此，可以受益于在此所述的治疗或检测方法的个体可以包括罹患乳癌的那些个体。
乳癌可以包含显示雌激素受体的表达减少或丧失的肿瘤细胞。
乳癌可以包含显示孕酮受体的表达减少或丧失的肿瘤细胞。
乳癌可以包含显示Her2表达减少或丧失的肿瘤细胞。
乳癌可以包含显示Her2过度表达减少或丧失的肿瘤细胞。
更具体而言，乳癌可以包含肿瘤细胞，这些肿瘤细胞显示或者1)雌激素受体和孕酮受体的表达减少或丧失，2)雌激素受体的表达减少或丧失并且Her2过度表达减少或丧失，3)孕酮受体的表达减少或丧失并且Her2过度表达减少或丧失，或者4)雌激素受体的表达减少或丧失，孕酮受体的表达减少或丧失以及Her2过度表达减少或丧失。
甚至更具体而言，乳癌可以包含肿瘤细胞，这些肿瘤细胞显示或者1)雌激素受体和孕酮受体的表达丧失，2)雌激素受体的表达丧失并且Her2表达丧失，3)孕酮受体的表达丧失并且Her2表达丧失，或者4)雌激素受体的表达丧失，孕酮受体的表达丧失以及Her2表达丧失。
根据本发明，该个体可以携带其特征为三阴性的乳癌细胞，或可以具有被分类为三阴性乳癌的肿瘤。
根据本发明，该个体可以携带其特征为基底样的乳癌细胞，或可以具有被分类为基底样乳癌的肿瘤。
将受益于用抗KAAG1治疗的其他个体包括患有癌瘤的那些个体，该癌瘤包含肿瘤细胞，这些肿瘤细胞展现上皮细胞向间叶细胞转化(EMT)表型。
EMT的常用分子标记包括例如E-钙粘素、细胞角蛋白以及β-连环蛋白(在细胞膜中)的表达减少和/或Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2、N-钙粘素、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、基质金属蛋白酶等的表达增加。(参见例如卡卢里(Kalluri)和温伯格(Weinberg)，《临床调查杂志》(The Journal of Clinical Investigation)，119(6)，第1420页到第1428页；2009；法希纳(Fassina)等人，《现代病理学》(Modern Pathology)，25；第86页到第99页；2012；李(Lee)等人，《细胞生物学杂志》(JCB)；172；第973页到第981页；2006)。EMT表型还可以以增加的迁移、侵袭能力或以对失巢凋亡/细胞凋亡的抗性来区分。经历上皮细胞向间叶细胞转化的细胞因此可以通过上皮细胞标记的减少和间叶细胞标记或EMT表型的出现来检测。
根据本发明，该方法因此可以包括例如向有需要的个体给予一种能够特异性地结合至KAAG1的抗体或抗原结合片段。有需要的个体是基于其缺乏ER表达、PgR表达和/或不存在HER2蛋白质过度表达的肿瘤进行优先地选择。这些标记的临床测试通常是使用组织病理学方法(免疫组织化学、FISH等)和/或通过基因表达研究(参见例如登特(Dent)等人，2007；伯恩斯坦(Bernstein)和莱西(Lacey)，2011)来进行。有需要的个体因此可以是已经收到了三阴性乳癌或基底样乳癌的诊断的个体。有需要的个体可以是对激素疗法和/或对曲妥珠单抗疗法(或其他抗Her2抗体)无反应的个体。可替代地，有需要的个体可以是携带肿瘤细胞的个体，这些肿瘤细胞具有经历上皮细胞向间叶细胞转化的能力或已经获得间叶细胞表型。
本发明因此提供一种通过向有需要的个体给予KAAG1活性或表达的抑制剂来治疗三阴性乳癌或基底样乳癌的方法。
根据本发明，该KAAG1抑制剂因此可以包括在此所述的抗体或其抗原结合片段。
同样根据本发明，该KAAG1抑制剂可以包含与SEQ ID NO.:1或与其片段互补的核苷酸序列。更具体而言，该KAAG1抑制剂可以包含与SEQ ID NO.:1的核苷酸738到992(包括端点)或与其片段互补的核苷酸序列。举例来说，该抑制剂可以包含至少10个(至少15个、至少20个)连续核苷酸，这些核苷酸与SEQ ID NO.:1或与SEQ ID NO.:1的核苷酸738到992(包括端点)互补。更具体类型的KAAG1抑制剂包含siRNA，该siRNA 抑制SEQ ID NO.:1的表达。
合适的抗体或抗原结合片段包括能够结合至在肿瘤细胞表面处的KAAG1的那些。这些抗体或其抗原结合片段可以优先地结合被包含在KAAG1的氨基酸30到84(包括端点)内的表位。
可替代地，这些抗体或其抗原结合片段可以结合位于KAAG1的氨基酸36到60(包括端点)内或氨基酸61到84(包括端点)内的表位。
该表位可以特别地位于或包含在氨基酸50到70、50到65、51到65、52到65、53到65、54到65、54到64、54到63、54到62、54到61、54到60、50到62、50到61或50到60(包括端点或不包括端点)内。
根据本发明的一个实施例，该抗体或抗原结合片段可以结合被包含在KAAG1的氨基酸50到70内的表位。
在本发明的又一个实施例中，该抗体或抗原结合片段可以结合被包含在KAAG1的氨基酸50到62内的表位。
在又另一个实施例中，该抗体或抗原结合片段可以结合被包含在KAAG1的氨基酸54到65内的表位。
用于治疗性治疗的合适的抗体包括例如介导抗体依赖性细胞细胞毒性的那些。
用于治疗性治疗的其他甚至更合适的抗体包括与治疗性部分结合的那些。
根据本发明，该抗体可以是例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或其抗原结合片段。
发明详细说明
治疗方法
如在此所表明，本发明涵盖了向患有乳癌的个体给予一种抗体或抗原结合片段，该乳癌的特征在于“三阴性乳癌”或“基底样乳癌”。
乳癌亚型分类为“三阴性乳癌”或“基底样乳癌”是本领域中已知的(参见例如福克斯(Foulkes)等人，《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.)，2010；363:1938-1948)并且包括例如以下定义：
“基底样乳癌”可以包括例如包括一组异质肿瘤的乳癌亚型，这些肿瘤的特征是不存在或低水平的雌激素受体表达，Her2过度表达和通常发现于人类乳房的基底或肌上皮细胞中的基因的表达的极低流行率。这类表达可以通过微阵列分析来测定。
“三阴性乳癌”可以包括例如特征是缺乏雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)以及Her2表达的肿瘤。一些研究者只有当小于1％的细胞对ER或PR表达是阳性的时候才接受肿瘤对ER或PR的表达是阴性的；其他人则认为当最多10％的细胞对表达是阳性的时，肿瘤对ER或PR表达是阴性的。已经使用了HER2-阴性的不同定义。最常用的两个包括免疫组织化学评分是0/1+或2+的肿瘤，这些肿瘤在原位杂交之后缺乏HER2基因扩增。这类表达尤其可以通过免疫组织化学染色来测定。
根据本发明，治疗方法包括向有需要的个体给予一种KAAG1抑制剂。这类KAAG1抑制剂包括例如与KAAG1特异性地结合的抗体或其抗原结合片段。
最强效的抗体或抗原结合片段可能会是对KAAG1具有高亲和力的那些。最强效的抗体或抗原结合片段也可能会是在细胞区室(例如溶酶体或内体)内被内化的那些。
因此，本发明尤其涵盖了对KAAG1具有高亲和力的抗体或抗原结合片段。
合适的抗体或抗原结合片段包括能够以高亲和力结合至在肿瘤细胞表面处的KAAG1的那些。这些高亲和力抗体或其抗原结合片段可以优先地结合被包含在KAAG1的氨基酸30到84(包括端点)内的表位。
可替代地，这些高亲和力抗体或其抗原结合片段可以结合位于KAAG1的氨基酸36到60(包括端点)内或氨基酸61到84(包括端点)内的表位。
这些高亲和力抗体或抗原结合片段可以结合例如表位，该表位可以特别地位于或被包含在氨基酸50到70、50到65、51到65、52到65、53到65、54到65、54到64、54到63、54到62、54到61、54到60、50到62、50到61或50到60内(包括端点或不包括端点)。
根据本发明的一个实施例，该高亲和力抗体或抗原结合片段可以结合被包含在KAAG1的氨基酸50到70内的表位。
在本发明的又一个实施例中，该高亲和力抗体或抗原结合片段可以结合被包含在KAAG1的氨基酸50到62内的表位。
在又另一个实施例中，该高亲和力抗体或抗原结合片段可以结合被包含在KAAG1的氨基酸54到65内的表位。
优选的抗体包括高亲和力抗体，是可以在细胞或细胞区室(例如溶酶体或内体)中被内化的那些。抗体被内化的能力可以通过本领域中已知的方法测定，该方法例如并且不限于类似于在此进行的那些免疫荧光研究的免疫荧光研究。
本发明特别地涵盖具有与3A4抗体的那些CDR一致的CDR的抗体。因此，本发明涵盖了一些抗体，这些抗体所具有的轻链可变区和/或重链可变区共有序列在SEQ ID NO.:186到188和191到193中的任一个中阐明并且特异性序列在SEQ ID No.:46、48、189、190或194到198中阐明。除那些之外，特别地涵盖了一些抗体，这些抗体所具有的轻链可变区和/或重链可变区共有序列在SEQ ID NO.:188和196中的任一个中阐明或特异性序列在SEQ IDNO.:46、48、189、190或194到198中阐明。
抗体或其抗原结合片段可以优选地结合至治疗性部分。
抗体或其抗原结合片段可以具有人恒定区。优选地，这些抗体或其抗原结合片段可以具有人IgG1恒定区。可替代地，这些抗体或其抗原结合片段可以具有IgG2恒定区。
本发明方法还可以包括给予一种KAAG1抑制剂，如抗体(例如结合至治疗性部分)或抗原结合片段；以及抗癌剂，例如小分子药物、结合至除了KAAG1之外的靶标的抗体或抗原结合片段、化学治疗剂或细胞毒性剂。可以与KAAG1抑制剂一起给予的抗癌剂的实例可以包括例如多柔比星、紫杉烷、抗血管生成剂、铂盐、PARP抑制剂。
由本发明所涵盖的其他治疗方法包括给予其他类型的KAAG1抑制剂，如基于反义的治疗剂(siRNA、反义物、核酶等)。
结合至KAAG1的抗体和抗原结合片段
术语“抗体或抗原结合片段”或类似术语，如“抗体和抗原结合片段”涵盖例如“变体抗体或抗原结合片段”，例如“人源化抗体或抗原结合片段”。
术语“抗体”是指完整抗体、单克隆抗体或多克隆抗体。术语“抗体”还涵盖多特异性抗体，如双特异性抗体。人抗体通常是由各自包含可变区和恒定区的两条轻链和两条重链组成。轻链可变区包括3个CDR，在此被鉴定为由框架区侧接的CDRL1、CDRL2以及CDRL3。重链可变区包括3个CDR，在此被鉴定为由框架区侧接的CDRH1、CDRH2以及CDRH3。
如在此所用的术语“抗原结合片段”是指保留结合至抗原(例如，KAAG1、KAAG1的分泌形式或其变体)的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含两个在铰链区由二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(沃德(Ward)等人，(1989)《自然》(Nature)341:544-546)，该片段由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)，例如VHCDR3。此外，虽然Fv片段的两个结构域(VL和VH)是通过分开的基因编码的，但是这两个结构域可以使用重组方法通过合成连接子接合，该连接子能够使其制造成VL和VH区配对以形成单价分子的单多肽链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如伯德(Bird)等人，(1988)《科学》(Science)242:423-426；和休斯顿(Huston)等人，(1988)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883)。这样的单链抗体还旨在被涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”之内。此外，抗原结合片段包括结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，这些结合结构域免疫球蛋白融合蛋白包含(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽(如重链可变区、轻链可变区、或通过接头肽而与轻链可变区融合的重链可变区)，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，以及(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。铰链区可以通过将一个或多个半胱氨酸残基用丝氨酸残基替换而被修饰，从而防止二聚化。这些结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一步披露于US 2003/0118592和US 2003/0133939中。这些抗体片段是使用本领域的普通技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式来就效用对片段进行筛选。
典型的抗原结合位点包含由轻链免疫球蛋白与重链免疫球蛋白配对形成的可变区。抗体可变区的结构是非常一致的并且展现非常相似的结构。这些可变区典型地包含相对同源的框架区(FR)，这些框架区被三个称为互补决定区(CDR)的高变区间隔开。抗原结合片段的整体结合活性常常由CDR的序列决定。FR对于最优的抗原结合而言常常起着CDR的三维上的正确定位和比对的作用。
如在此所用，术语“高亲和力”是指10nM或更低的亲和力。术语“高亲和力”尤其包括具有5nM或更低的亲和力的抗体。术语“高亲和力”甚至更具体而言包括具有1nM或更低，或0.1nM或更低的亲和力的抗体。
本发明的抗体和/或抗原结合片段可以例如源于小鼠、大鼠或任何其他哺乳动物或源于其他来源(如通过重组DNA技术)。
最初将抗KAAG1抗体针对其对感兴趣的抗原的特异性从Fab文库中分离。在此提供了关于如何将Fab转化成全免疫球蛋白的示例性方法。
在此所述的可变区可以与所希望的物种的恒定区融合，由此允许通过所希望的物质的效应细胞识别抗体。恒定区可以例如源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。克隆或合成框内恒定区与可变区在本领域的技术人员的范围之内，并且可以例如通过重组DNA技术来进行。
在本发明的某些实施例中，结合至KAAG1的抗体可以具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。本发明的更具体实施例涉及一种具有IgG1亚型或尤其是人IgG1亚型的抗体。本发明的其他具体实施例涉及一种具有IgG2亚型或尤其是人IgG2亚型的抗体。
该抗体可以是具有IgG1亚型亚型或尤其是人IgG1亚型的人源化抗体。可替代地，该抗体可以是具有IgG2亚型或尤其是人IgG2亚型的人源化抗体。
该抗体可以例如在介导抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CMC)方面具有生物活性或与免疫复合物相关。典型的ADCC涉及自然杀伤(NK)细胞的活化并且依赖于通过NK细胞表面上的Fc受体识别抗体包被的细胞。Fc受体识别抗体的Fc结构域(如存在于IgG1上的)，这些抗体结合至靶细胞、尤其是表达抗原(如KAAG1)的癌细胞的表面。一旦结合至IgG的Fc受体，该NK细胞即释放出细胞因子和细胞毒性颗粒，这些细胞因子和细胞毒性颗粒进入该靶细胞并通过触发细胞凋亡促进细胞死亡。
本发明描述了结合至KAAG1或结合至KAAG1变体的抗体的集合。在某些实施例中，这些抗体可以选自下组，该组由以下各项组成：多克隆抗体、单克隆抗体(如嵌合抗体或人源化抗体)、抗体片段(如抗原结合片段)、单链抗体、结构域抗体以及具有抗原结合区的多肽。
在本发明的一个方面，本发明的分离的抗体或抗原结合片段可以能够诱导表达KAAG1的肿瘤细胞或表达KAAG1变体的肿瘤细胞(例如以一种ADCC依赖性方式)的杀伤(消除、损伤、溶解)。
在本发明的另一个方面，本发明的分离的抗体或抗原结合片段的特征尤其可以是其降低表达KAAG1或KAAG1变体的肿瘤细胞的扩散的能力。
在本发明的一个另外的方面，本发明的分离的抗体或抗原结合片段的特征可以是其减少或削弱表达KAAG1或KAAG1变体的肿瘤的形成的能力。
在本发明的示例性实施例中，该分离的抗体或抗原结合片段可以包含恒定区的氨基酸，该分离的抗体或抗原结合片段可以源于例如人抗体。
在本发明的另一个示例性实施例中，该分离的抗体或抗原结合片段可以包含人抗体的框架氨基酸。
在不限于在此所提出的示例性实施例的情况下，本申请人产生了可以适用于在此所述的目的的特异性抗体和抗原结合片段。
以下是所产生的并且据显示以一种特异性方式结合至KAAG1的抗体的清单：3D3、3A4、3C4、3G10、3A2、3F6、3E8、3E10、3A9、3B1、3G5、3B2、3B8、3G8、3F7、3E9、3G12、3C3、3E12、4A2、3F10、3F4、3B11、3D1、3C2、3E6以及3H3。抗体轻链或重链、可变区或互补决定区(CDR)的序列在2010年6月3日在编号WO2010/060186A8下公布的国际申请第PCT/CA2009/001586号中、在2011年5月12日在编号WO2011/054112A1下公布的国际申请第PCT/CA2010/001795号中或在2012年10月4日在编号WO2012/129668A1下公布的国际申请第PCT/CA2012/000296号中是可获得的。
在大多数情况下，CDR的序列已经分开地提供或以粗体形式示出在此。
在这些抗体中，选择3D3、3A4、3G10以及3C4用于体外和/或体内生物测试。3A4抗体似乎具有最佳特征。基于我们的实验，3A4抗体当与治疗性部分(例如细胞毒性剂)结合时在杀伤癌细胞方面比其非结合形式更有效。
在一个示例性实施例中，抗体或抗原结合片段可以包含轻链可变区的任何单独的CDR或者CDR1、CDR2和/或CDR3的组合。可以更具体地选择CDR3。组合可以包括例如CDRL1和CDRL3，CDRL1和CDRL2，CDRL2和CDRL3以及，CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在另一个示例性实施例中，抗体或抗原结合片段可以包含重链可变区的任何单独的CDR或者CDR1、CDR2和/或CDR3的组合。可以更具体地选择CDR3。组合可以包括例如CDRH1和CDRH3，CDRH1和CDRH2，CDRH2和CDRH3以及，CDRH1、CDRH2和CDRH3。
根据本发明，抗体或抗原结合片段可以包含CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少两个CDR。
同样，根据本发明，抗体或抗原结合片段可以包含一个CDRL1、一个CDRL2和一个CDRL3。
进一步根据本发明，抗体或抗原结合片段可以包含：
a.CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少两个CDR；和
b.CDRH1、一个CDRH2或一个CDRH3中的至少两个CDR。
抗体或抗原结合片段可以更优选地包含一个CDRL1、一个CDRL2和一个CDRL3。
抗体或抗原结合片段也可以更优选地包含一个CDRH1、一个CDRH2和一个CDRH3。
当轻链可变区或重链可变区中仅一个是可获得的时，抗体或抗原结合片段可以通过使用本领域中已知的方法筛选互补可变区的文库进行复原(迫特拉诺(Portolano)等人.《免疫学杂志》(The Journal of Immunology)(1993)150:880-887；克拉克森(Clarkson)等人，《自然》(1991)352:624-628)。
本发明的示例性实施例涵盖具有以下抗体的轻链和/或重链的CDR的抗体或抗原结合片段：3D3、3A4、3C4、3G10、3A2、3F6、3E8、3E10、3A9、3B1、3G5、3B2、3B8、3G8、3F7、3E9、3G12、3C3、3E12、4A2、3F10、3F4、3B11、3D1、3C2、3E6或3H3抗体。本发明的更具体实施例包括具有3D3、3A4、3C4或3G10抗体的轻链和/或重链的CDR的抗体或抗原结合片段。本发明的甚至更具体的实施例包括具有3A4抗体的轻链和/或重链的CDR的抗体或抗原结合片段。本发明因此涵盖包含3A4抗体的一个或多个CDR的任一单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
可以用于本发明方法中的抗体或抗原结合片段包括具有3A4抗体的CDR的那些，并且可以包含例如如SEQ ID NO.:49中所阐明的一个CDRH1、如SEQ ID NO.：50中或SEQ IDNO.:212中所阐明的一个CDRH2、如SEQ ID NO.:51中所阐明的一个CDRH3、如SEQ ID NO.:52中所阐明的一个CDRL1、如SEQ ID NO.:53中所阐明的一个CDRL2以及如SEQ ID NO.:54中所阐明的一个CDRL3。
本发明因此涵盖能够特异性结合至KAAG1并且可以包含选自下组的序列的抗体和抗原结合片段，该组由以下各项组成：
a.SEQ ID NO.:16中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:18中所定义的重链可变区的3CDR；
b.SEQ ID NO.:20中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:22中所定义的重链可变区的3CDR；
c.SEQ ID NO.:24中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:26中所定义的重链可变区的3CDR；
d.SEQ ID NO.:48中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:46中所定义的重链可变区的3CDR；
e.SEQ ID NO.:103中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:126中所定义的重链可变区的3CDR；
f.SEQ ID NO.:104中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:127中所定义的重链可变区的3CDR；
g.SEQ ID NO.:105中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:128中所定义的重链可变区的3CDR；
h.SEQ ID NO.:106中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:145中所定义的重链可变区的3CDR；
i.SEQ ID NO.:107中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:129中所定义的重链可变区的3CDR；
j.SEQ ID NO.:108中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:130中所定义的重链可变区的3CDR；
k.SEQ ID NO.:109中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:141中所定义的重链可变区的3CDR；
l.SEQ ID NO.:110中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:131中所定义的重链可变区的3CDR；
m.SEQ ID NO.:111中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:134中所定义的重链可变区的3CDR；
n.SEQ ID NO.:112中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:135中所定义的重链可变区的3CDR；
o.SEQ ID NO.:113中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:136中所定义的重链可变区的3CDR；
p.SEQ ID NO.:114中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:133中所定义的重链可变区的3CDR；
q.SEQ ID NO.:115中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:140中所定义的重链可变区的3CDR；
r.SEQ ID NO.:116中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:137中所定义的重链可变区的3CDR；
s.SEQ ID NO.:117中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:144中所定义的重链可变区的3CDR；
t.SEQ ID NO.:118中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:139中所定义的重链可变区的3CDR；
u.SEQ ID NO.:119中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:132中所定义的重链可变区的3CDR；
v.SEQ ID NO.:120中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:142中所定义的重链可变区的3CDR；
w.SEQ ID NO.:121中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:138中所定义的重链可变区的3CDR；
x.SEQ ID NO.:122中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:146中所定义的重链可变区的3CDR；
y.SEQ ID NO.:123中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:153中所定义的重链可变区的3CDR；
z.SEQ ID NO.:124中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:143中所定义的重链可变区的3CDR；
aa.SEQ ID NO.:189中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:194中所定义的重链可变区的3CDR；
bb.SEQ ID NO.:189中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:195中所定义的重链可变区的3CDR；
cc.SEQ ID NO.:189中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:196中所定义的重链可变区的3CDR；
dd.SEQ ID NO.:189中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:197中所定义的重链可变区的3CDR；
ee.SEQ ID NO.:190中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:194中所定义的重链可变区的3CDR；
ff.SEQ ID NO.:190中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:195中所定义的重链可变区的3CDR；
gg.SEQ ID NO.:190中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:196中所定义的重链可变区的3CDR；或
hh.SEQ ID NO.:190中所定义的轻链可变区的3CDR和/或SEQ ID NO.:197中所定义的重链可变区的3CDR。
本发明的其他示例性实施例涵盖具有以下抗体的轻链和/或重链的抗体或抗原结合片段：3D3、3A4、3C4、3G10、3A2、3F6、3E8、3E10、3A9、3B1、3G5、3B2、3B8、3G8、3F7、3E9、3G12、3C3、3E12、4A2、3F10、3F4、3B11、3D1、3C2、3E6或3H3抗体。本发明的更具体实施例包括具有3D3、3A4、3C4或3G10抗体的轻链和/或重链的抗体或抗原结合片段。本发明的甚至更具体的实施例包括具有3A4抗体(人源化和非人源化)的轻链和/或重链的抗体或抗原结合片段。
本发明因此涵盖能够特异性结合至KAAG1并且可以包含选自下组的序列的抗体和抗原结合片段，该组由以下各项组成：
a.SEQ ID NO.:16中所定义的轻链可变区(由SEQ ID NO.:15编码)和/或SEQ IDNO.:18中所定义的重链可变区(由SEQ ID NO.:17编码)；
b.SEQ ID NO.:20中所定义的轻链可变区(由SEQ ID NO.:19编码)和/或SEQ IDNO.:22中所定义的重链可变区(由SEQ ID NO.:21编码)；
c.SEQ ID NO.:24中所定义的轻链可变区(由SEQ ID NO.:23编码)和/或SEQ IDNO.:26中所定义的重链可变区(由SEQ ID NO.:25编码)；
d.SEQ ID NO.:48中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:46中所定义的重链可变区；
e.SEQ ID NO.:103中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:126中所定义的重链可变区；
f.SEQ ID NO.:104中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:127中所定义的重链可变区；
g.SEQ ID NO.:105中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:128中所定义的重链可变区；
h.SEQ ID NO.:106中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:145中所定义的重链可变区；
i.SEQ ID NO.:107中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:129中所定义的重链可变区；
j.SEQ ID NO.:108中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:130中所定义的重链可变区；
k.SEQ ID NO.:109中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:141中所定义的重链可变区；
l.SEQ ID NO.:110中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:131中所定义的重链可变区；
m.SEQ ID NO.:111中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:134中所定义的重链可变区；
n.SEQ ID NO.:112中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:135中所定义的重链可变区；
o.SEQ ID NO.:113中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:140中所定义的重链可变区；
p.SEQ ID NO.:114中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:133中所定义的重链可变区；
q.SEQ ID NO.:115中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:140中所定义的重链可变区；
r.SEQ ID NO.:116中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:137中所定义的重链可变区；
s.SEQ ID NO.:117中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:144中所定义的重链可变区；
t.SEQ ID NO.:118中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:139中所定义的重链可变区；
u.SEQ ID NO.:119中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:132中所定义的重链可变区；
v.SEQ ID NO.:120中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:142中所定义的重链可变区；
w.SEQ ID NO.:121中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:138中所定义的重链可变区；
x.SEQ ID NO.:122中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:146中所定义的重链可变区；
y.SEQ ID NO.:123中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:147中所定义的重链可变区；
z.SEQ ID NO.:124中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:144中所定义的重链可变区；
aa.SEQ ID NO.:189中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:194中所定义的重链可变区；
bb.SEQ ID NO.:189中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:195中所定义的重链可变区；
cc.SEQ ID NO.:190中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:194中所定义的重链可变区；
dd.SEQ ID NO.:190中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:195中所定义的重链可变区；
ee.SEQ ID NO.:190中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:196中所定义的重链可变区；或
ff.SEQ ID NO.:190中所定义的轻链可变区和/或SEQ ID NO.:197中所定义的重链可变区。
在此所述的重链和/或轻链的框架区可以源于在此所述的抗体中所示出的框架区中的一个或多个。抗体或抗原结合片段因此可以包含在此所述的CDR(例如选自SEQ IDNO.:72到88的特异性CDR或共有CDR或SEQ ID NO.:89-102的CDR变体)和源于在此所述的那些框架区的框架区中的一个或多个。在SEQ ID No.103-154中，预期的CDR显示为粗体，而框架区不是。
表1是指选择用于生物测试的抗KAAG1抗体中的一些的轻链和重链的全序列。
表1.
表位作图研究显示3D3抗体与横跨氨基酸36到60(包括端点)的KAAG1表位相互作用。3G10和3A4抗体与横跨氨基酸61到84(包括端点)的KAAG1表位相互作用并且3C4抗体与横跨氨基酸1到35的KAAG1表位相互作用。虽然，3G10和3A4结合类似区域，但是3G10抗体不如3A4抗体那般有效地结合KAAG1。
在此应该了解，以上所提供的特定组合的轻链可变区可以换成任何其他轻链可变区。类似地，以上所提供的特定组合的重链可变区可以换成任何其他重链可变区。
所选择的结合至KAAG1的抗体的轻链和重链可变区的序列披露于表2中。
表2
SEQ ID NO.103-154相应于据显示结合KAAG1的其他抗体的轻链和重链可变区。
所选择的结合至KAAG1的抗体的轻链和重链可变区的CDR序列披露于表3中。
表3
Figure BDA0000534869740000231
Figure BDA0000534869740000241
变体抗体和抗原结合片段
本发明还涵盖了在此所述的抗体或抗原结合片段的变体。所包括的变体抗体或抗原结合片段是具有在氨基酸序列中的变异的那些。举例来说，所包括的变体抗体或抗原结合片段是具有至少一个变体CDR(两个、三个、四个、五个或六个变体CDR等或甚至十二个变体CDR)、变体轻链可变区、变体重链可变区、变体轻链和/或变体重链的那些。包括在本发明中的变体抗体或抗原结合片段是具有例如与原始抗体或抗原结合片段相比较类似的或改进的结合亲和力的那些。
如在此所用的术语“变体”适用于在此所述的任何序列，并且包括例如变体CDR(或者CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3)、变体轻链可变区、变体重链可变区、变体轻链、变体重链、变体抗体、变体抗原片段以及KAAG1变体。
用于置换诱变的最感兴趣的位点包括高变区(CDR)，但也考虑了在框架区中或甚至在恒定区中的修饰。CDR变体的示例性实施例提供在SEQID NO.:72-102中。
可以通过将来自以下列出的组(1到6组)中之一的(CDR、可变链、抗体等的)氨基酸用相同组的另一个氨基酸交换而产生保守性置换。
保守性置换的其他示例性实施例示于表1A中“优选的置换”标题之下。如果这样的置换导致所不希望的特性，则可以将在表1A中命名为“示例性置换”的、或如在下文进一步参考氨基酸类别所述的更多实质性改变引入，并且筛选产物。
本领域中已知的是变体可以通过置换诱变而产生，并且保留本发明的多肽的生物活性。这些变体在其氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基被去除并且在其位置中插入一个不同的残基。举例来说，用于置换诱变的感兴趣的一个位点可以包括这样一个位点：在该位点中从不同物种获得的特定残基是相同的。被鉴定为“保守性置换”的置换的实例示于表1A中。如果这样的置换导致所不希望的改变，则可以将在表1A中命名为“示例性置换”的、或如在下文进一步参考氨基酸类别所述的其他类型的置换引入，并且筛选产物。
通过选择置换而完成在功能或免疫身份方面的实质性修饰，这些置换在它们对维持以下各项的作用方面显著不同：(a)在置换区域中的多肽主链的结构，例如，如片层或螺旋构象。(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性将天然存在的残基分组：
(第1组)疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)
(第2组)中性亲水性：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)
(第3组)酸性：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)
(第4组)碱性：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)
(第5组)影响链取向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；以及
(第6组)芳香族：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)
非保守性置换将需要将这些类别之一的一个成员用另一个交换。
表1A.氨基酸置换
变体抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的变异可以包括氨基酸添加、缺失、插入、置换等，一个或多个氨基酸的主链或侧链中的一种或多种修饰，或向一个或多个氨基酸(侧链或主链)中添加一个基团或另一个分子。
与原始抗体或抗原结合片段氨基酸序列相比，变体抗体或抗原结合片段可以在其氨基酸序列中具有实质上的序列相似性和/或序列一致性。在两种序列之间的相似性的程度是基于一致性(一致的氨基酸)和保守性置换的百分比。
总体上，可变链之间的相似性和一致性的程度在此已经使用Blast2序列程序(塔蒂阿娜A.塔图索瓦(Tatiana A.Tatusova)、托马斯L.马登(Thomas L.Madden)(1999)，“Blast2序列——一种用于比较蛋白质和核苷酸序列的新工具(Blast2sequences-a newtool for comparing protein and nucleotide sequences)”，《FEMS微生物学通讯》(FEMSMicrobiolLett.)174:247-250)，使用默认设置，即blastp程序，BLOSUM62矩阵(开放空位11和延伸空位罚分1；空位x减少(gapx dropoff)50，期望10.0，字长3)以及活性过滤器来测定。
一致性百分比因此将指示与原始肽相比是一致的并且可以占据相同或相似位置的氨基酸。相似性百分比将指示与在相同或相似位置的原始肽相比是一致的氨基酸和被保守性氨基酸置换替换的那些。
因此，本发明的变体包括可以具有与原始序列或原始序列的一部分至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性的那些变体。
变体的示例性实施例是具有与在此所述序列的至少81％的序列一致性并且具有与原始序列或原始序列的一部分81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些变体。
变体的其他示例性实施例是具有与在此所述序列的至少82％的序列一致性并且具有与原始序列或原始序列的一部分82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些变体。
变体的进一步的示例性实施例是具有与在此所述序列的至少85％的序列一致性并且具有与原始序列或原始序列的一部分85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些变体。
变体的其他示例性实施例是具有与在此所述序列的至少90％的序列一致性并且具有与原始序列或原始序列的一部分90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些变体。
变体的另外的示例性实施例是具有与在此所述序列的至少95％的序列一致性并且具有与原始序列或原始序列的一部分95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些变体。
变体的又另外的示例性实施例是具有与在此所述序列的至少97％的序列一致性并且具有与原始序列或原始序列的一部分97％、98％、99％或100％的序列相似性的那些变体。
出于简明的目的，本申请人在此提供了表1B，该表展示了被本发明涵盖的并且包含指定的序列一致性％和序列相似性％的单独变体的示例性实施例。每个“X”应理解为定义一种给定的变体。
Figure BDA0000534869740000281
本发明涵盖包含与在此所述的序列的至少70％一致性或至少80％一致性的CDR、轻链可变区、重链可变区、轻链、重链、抗体和/或抗原结合片段。
本发明因此涵盖能够特异性结合至KAAG1并且可以包含选自下组的序列的抗体和抗原结合片段，该组由以下各项组成：
a.具有与SEQ ID NO.:16的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:18的至少70％序列一致性的重链可变区；
b.具有与SEQ ID NO.:20的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:22的至少70％序列一致性的重链可变区；
c.具有与SEQ ID NO.:24的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:26的至少70％序列一致性的重链可变区；
d.具有与SEQ ID NO.:48的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:46的至少70％序列一致性的重链可变区；
e.具有与SEQ ID NO.:103的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:126的至少70％序列一致性的重链可变区；
f.具有与SEQ ID NO.:104的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:127的至少70％序列一致性的重链可变区；
g.具有与SEQ ID NO.:105的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:128的至少70％序列一致性的重链可变区；
h.具有与SEQ ID NO.:106的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:145的至少70％序列一致性的重链可变区；
i.具有与SEQ ID NO.:107的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:128的至少70％序列一致性的重链可变区；
j.具有与SEQ ID NO.:108的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:130的至少70％序列一致性的重链可变区；
k.具有与SEQ ID NO.:109的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:141的至少70％序列一致性的重链可变区；
l.具有与SEQ ID NO.:110的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:131的至少70％序列一致性的重链可变区；
m.具有与SEQ ID NO.:111的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:134的至少70％序列一致性的重链可变区；
n.具有与SEQ ID NO.:112的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:135的至少70％序列一致性的重链可变区；
o.具有与SEQ ID NO.:113的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:136的至少70％序列一致性的重链可变区；
p.具有与SEQ ID NO.:114的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:133的至少70％序列一致性的重链可变区；
q.具有与SEQ ID NO.:115的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:140的至少70％序列一致性的重链可变区；
r.具有与SEQ ID NO.:116的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:137的至少70％序列一致性的重链可变区；
s.具有与SEQ ID NO.:117的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:144的至少70％序列一致性的重链可变区；
t.具有与SEQ ID NO.:118的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:139的至少70％序列一致性的重链可变区；
u.具有与SEQ ID NO.:119的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:132的至少70％序列一致性的重链可变区；
v.具有与SEQ ID NO.:120的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:142的至少70％序列一致性的重链可变区；
w.具有与SEQ ID NO.:121的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:138的至少70％序列一致性的重链可变区；
x.具有与SEQ ID NO.:122的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:146的至少70％序列一致性的重链可变区；
y.具有与SEQ ID NO.:123的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:147的至少70％序列一致性的重链可变区；或
z.具有与SEQ ID NO.:124的至少70％序列一致性的轻链可变区和具有与SEQ IDNO.:143的至少70％序列一致性的重链可变区。
根据本发明，变体抗体或抗原结合片段可以包含与相对应的轻链和/或重链可变区的那些CDR一致的CDR。在其他情况下，变体抗体或抗原结合片段可以包含变体CDR(多个)。
因此，本发明的变体抗体或抗原结合片段的示例性实施例是包含一个轻链可变区的那些，该轻链可变区包含与SEQ ID NO.:16、20、24、103、106或121至少70％、75％、80％一致的序列。这样的变体的CDR可以与相对应的非变体(野生型序列)抗体或抗原结合片段的那些CDR一致或可以变化1-3个氨基酸。
变体抗体轻链可变区的另一个示例性实施例涵盖一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQ ID NO.:16的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:16的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到22个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。SEQ ID NO.:16变体提供在SEQ ID NO.:168中。
变体抗体轻链可变区的一个示例性实施例涵盖一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQ ID NO.:20的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:20的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到22个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。
变体抗体轻链可变区的一个示例性实施例涵盖一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQ ID NO.:24的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:24的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到21个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。SEQ ID NO.:24变体提供在SEQ ID NO.:172中。
变体抗体轻链可变区的一个示例性实施例涵盖一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQ ID NO.:103的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:103的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到22个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。
变体抗体轻链可变区的一个示例性实施例涵盖一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQ ID NO.:106的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:106的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到22个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。
变体抗体轻链可变区的一个示例性实施例涵盖一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQ ID NO.:121的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:121的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到21个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。
在一些情况下，变体抗体轻链可变区可以包含氨基酸缺失或添加(与或不与氨基酸置换组合)。常常可以容许1、2、3、4或5个氨基酸缺失或添加。
本发明的变体抗体或抗原结合片段的其他示例性实施例是包含一个重链可变区的那些，该重链可变区包含与18、22、26、126、138或145至少70％、75％、80％一致的序列。这样的变体的CDR可以与相对应的非变体(野生型序列)抗体或抗原结合片段的那些CDR一致或可以变化1-3个氨基酸。
变体抗体重链可变区的一个示例性实施例涵盖一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:18的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:18的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到22个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。SEQ ID NO.:18变体提供在SEQ ID NO.:169中。
变体抗体重链可变区的一个示例性实施例涵盖一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:22的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:22的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到23个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。
变体抗体重链可变区的一个示例性实施例涵盖一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:26的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:26的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到23个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。SEQ ID NO.:26变体提供在SEQ ID NO.:173中。
变体抗体重链可变区的一个示例性实施例涵盖一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:126的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:126的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到23个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。
变体抗体重链可变区的一个示例性实施例涵盖一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:145的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:145的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到23个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。
变体抗体重链可变区的一个示例性实施例涵盖一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:138的CDR氨基酸序列100％一致的CDR氨基酸序列并且与SEQ ID NO.:138的框架区相比，在其框架区中具有例如从1个到22个氨基酸修饰(例如保守性或非保守性氨基酸置换)。
在一些情况下，变体抗体重链可变区可以包含氨基酸缺失或添加(与或不与氨基酸置换组合)。常常可以容许1、2、3、4或5个氨基酸缺失或添加。
变体CDR
本发明还涵盖了包含可变链的多肽、抗体或抗原结合片段，这些可变链具有于在此所述的CDR中的至少一个中的至少一个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比)。
本发明还涵盖了包含可变链的多肽、抗体或抗原结合片段，这些可变链具有在这些CDR中的至少两个中的至少一个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比)。
本发明还涵盖了包含可变链的多肽、抗体或抗原结合片段，这些可变链具有在3个CDR中的至少一个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比)。
本发明还涵盖了包含可变链的多肽、抗体或抗原结合片段，这些可变链具有在这些CDR中的至少一个中的至少两个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比)。
本发明还涵盖了包含可变链的多肽、抗体或抗原结合片段，这些可变链具有在这些CDR中的至少两个中的至少两个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比)。
本发明还涵盖了包含可变链的多肽、抗体或抗原结合片段，这些可变链具有在3个CDR中的至少两个保守性氨基酸置换(与原始CDR相比)。
显示最大特征的抗体的轻链可变区或重链可变区的氨基酸序列的比较允许我们推导出在这些CDR内和在这些可变区内的共有序列。CDR的共有序列提供在SEQ ID No:72到88中。
本发明因此在一个示例性实施例中提供了包含一个轻链可变区的一种分离的抗体或抗原结合片段，该轻链可变区具有：
a.一个CDRL1序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:72和SEQID NO.:73；
b.一个CDRL2序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:74、SEQID NO.:75以及SEQ ID NO.:76，或；
c.一个CDRL3序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:77、SEQID NO.:78以及SEQ ID NO.:79。
本发明因此在一个示例性实施例中提供了包含一个重链可变区的一种分离的抗体或抗原结合片段，该重链可变区具有：
a.一个CDRH1序列，该序列包含SEQ ID NO.:80；
b.一个CDRH2序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:81、SEQID NO.:82、SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84以及SEQ ID NO.:85，或；
c.一个CDRH3序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:86、SEQID NO.:87以及SEQ ID NO.:88。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRL1序列，该序列包括或其组成为下式：
X1aSSX2aSLLX3aX4aX5aX6aX7aX8aX9aX10aLX11a(SEQ ID NO.:72)
其中X1a可以是一种碱性氨基酸；
其中X2a可以是一种碱性氨基酸；
其中X3a可以是H、Y或N；
其中X4a可以是S、T、N或R；
其中X5a可以是不存在、S或N；
其中X6a可以是D、F或N；
其中X7a可以是G或Q；
其中X8a可以是K、L或N；
其中X9a可以是T或N；
其中X10a可以是一种芳香族氨基酸，以及；
其中X11a可以是A、N、E或Y。
在本发明的一个示例性实施例中，X1a可以是K或R。
在本发明的又一个实施例中，X2a可以是Q或K。
在本发明的又另一个实施例中，X3a可以是N或H。
在本发明的另一个实施例中，X10a可以是Y或F。
本发明的更特定实施例包括SEQ ID NO.:72的CDRL1，其中：X1a是K；X2a是Q；X3a是N；X3a是H；X4a是S；X4a是T；X5a是S；X5a不存在；X6a是N；X7a是Q；X7a是G；X8a是K；X9a是N；X9a是T；X10a是Y；或X11a是A。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRL1序列，该序列包括或其组成为下式：
KASQDX1bX2bX3bX4bX5bX6b(SEQ ID NO.:73)
其中X1b可以是一种疏水性氨基酸；
其中X2b可以是G或H；
其中X3b可以是T、N或R；
其中X4b可以是F、Y或A；
其中X5b可以是一种疏水性氨基酸，以及；
其中X6b可以是N或A。
在本发明的一个示例性实施例中，X1b可以是V或I。
在本发明的另一个示例性实施例中，X5b可以是V或L。
本发明的更特定实施例包括SEQ ID NO.:73的CDRL1，其中X1b是I；X2b是H；X3b是T；X3b是N；X4b是Y；X4b是F；X5b是L或X6b是N。
CDRL1的其他示例性实施例提供在SEQ ID NO.89和90中。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRL2序列，该序列包括或其组成为下式：
FX1cSTX2cX3cS(SEQ ID NO.:74)
其中X1c是A或G；
其中X2c是R或T，以及；
其中X3c是E、K或A。
在本发明的一个示例性实施例中，X1c可以是A并且X2c可以是T。
在本发明的另一个示例性实施例中，X1c可以是A并且X2c可以是R。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:74的CDRL2，其中X1c是A；X2c是R或X3c是E。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRL2序列，该序列包括或其组成为下式：
X1dVSX2dX3dX4dS(SEQ ID NO.:75)
其中X1d可以是L或K；
其中X2d可以是一种碱性氨基酸；
其中X3d可以是L或R，以及；
其中X4d可以是D或F。
在本发明的一个示例性实施例中，X2d可以是K或N。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:75的CDRL2，其中X1d是L；X2d是K；X3d是L或X4d是D。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRL2序列，该序列包括或其组成为下式：
X1eANRLVX2e(SEQ ID NO.:76)
其中X1e可以是一种碱性氨基酸，以及；
其中X2e可以是D或A。
在本发明的一个示例性实施例中，X1e可以是R或H。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:76的CDRL2，其中X1e是R或X2e是D。
CDRL2的其他示例性实施例提供在SEQ ID NO.:91-93中。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRL3序列，该序列包括或其组成为下式：
X1fQX2fX3fX4fX5fPLT(SEQ ID NO.:77)
其中X1f可以是Q或L；
其中X2f可以是一种芳香族氨基酸；
其中X3f可以是D、F或Y；
其中X4f可以是E、A、N或S，以及；
其中X5f可以是I、F或T。
在本发明的一个示例性实施例中，X2f可以是Y或H。
在本发明的另一个示例性实施例中，X3f可以是Y或D。
在本发明的又另一个示例性实施例中，X5f可以是I或T。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:77的CDRL3，其中X1f是Q；X2f是H；X3f是D；X3f是Y；X4f是S；X4f是E；X4f是A；X5f是T，或X5f是I。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRL3序列，该序列包括或其组成为下式：
QQHX1gX2gX3gPLT(SEQ ID NO.:78)
其中X1g可以是一种芳香族氨基酸；
其中X2g可以是N或S，以及；
其中X3g可以是I或T。
在本发明的一个示例性实施例中，X1g可以是F或Y。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:78的CDRL3，其中X2g是S或X3g是T。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRL3序列，该序列包括或其组成为下式：
X1hQGX2hHX3hPX4hT(SEQ ID NO.:79)
其中X1h可以是一种芳香族氨基酸；
其中X2h可以是一种中性亲水性氨基酸；
其中X3h可以是F或V，以及；
其中X4h可以是R或L。
在本发明的一个示例性实施例中，X1h可以是W或F。
在本发明的又另一个示例性实施例中，X2h可以是S或T。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:79的CDRL3，其中X1h是W；X2h是T；X3h是F，或X4h是R。
CDRL3的其他示例性实施例提供在SEQ ID NO.94和95中。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH1序列，该序列包括或其组成为下式：
GYX1iFX2iX3iYX4iX5iH(SEQ ID NO.:80)
其中X1i可以是T、I或K；
其中X2i可以是一种中性亲水性氨基酸；
其中X3i可以是一种酸性氨基酸；
其中X4i可以是E、N或D，以及；
其中X5i可以是疏水性氨基酸。
在本发明的一个示例性实施例中，X2i可以是T或S。
在本发明的另一个示例性实施例中，X3i可以是D或E。
在本发明的又另一个示例性实施例中，X4i可以是N或E。
在本发明的另一个示例性实施例中，X5i可以是M、I或v。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:80的CDRH1，其中X2i是T；X3i是D；X4i是E；X5i是I或X5i是M。
CDRH1的其他示例性实施例提供在SEQ ID NO.:96和97中。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH2序列，该序列包括或其组成为下式：
X1jX2jDPX3jTGX4jTX5j(SEQ ID NO.:81)
其中X1j可以是V或G；
其中X2j可以是一种疏水性氨基酸；
其中X3j可以是A、G或E；
其中X4j可以是R、G、D、A、S、N或V，以及；
其中X5j可以是一种疏水性氨基酸。
在本发明的一个示例性实施例中，X2j可以是I或L。
在本发明的另一个示例性实施例中，X5j可以是A或V。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:81的CDRH2，其中X1j是V；X2j是I；X3j是E；X4j是D或X5j是A。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH2序列，该序列包括或其组成为下式：
VX1kDPX2kTGX3kTA(SEQ ID NO.:82)
其中X1k可以是一种疏水性氨基酸；
其中X2k可以是A、E或G；
其中X3k可以是R、G、A、S、N V或D。
在本发明的一个示例性实施例中，X1k可以是L或I。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:82的CDRH2，其中X1k是I；X2k是E，或X3k是D。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH2序列，该序列包括或其组成为下式：
YIX1lX2lX3lGX4lX5lX6l(SEQ ID NO.:83)
其中X1l可以是S或N；
其中X2l可以是一种芳香族氨基酸；
其中X3l可以是D、E或N；
其中X4l可以是D或H；
其中X5l可以是Y、S或N；
其中X6l可以是D、E或N。
在本发明的一个示例性实施例中，X3l可以是D或N。
在本发明的另一个示例性实施例中，X6l可以是D或N。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:83的CDRH2，其中X2l是F或Y，X3l是N，X4l是D或X6l是N。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH2序列，该序列包括或其组成为下式：
X1mINPYNX2mVTE(SEQ ID NO.:84)
其中X1m可以是N或Y，以及；
其中X2m可以是E、D或N。
在本发明的一个示例性实施例中，X2m可以是D或N。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:84的CDRH2，其中X1m是N或X2m是D。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH2序列，该序列包括或其组成为下式：
DINPX1nYGX2nX3nT(SEQ ID NO.:85)
其中X1n可以是N或Y；
其中X2n可以是G或T，以及；
其中X3n可以是I或T。
CDRH2的其他示例性实施例提供在SEQ ID NO.98和99中。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH3序列，该序列包括或其组成为下式：
MX1oX2oX3oDY(SEQ ID NO.:86)
其中X1o可以是G或S；
其中X2o可以是Y或H，以及；
其中X3o可以是A或S。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:86的CDRH3，其中X1o是G；X2o是Y或X3o是S。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH3序列，该序列包括或其组成为下式：
IX1pYAX2pDY(SEQ ID NO.:87)
其中X1p可以是G或S，以及；
其中X2p可以是不存在或M。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:87的CDRH3，其中X1p是S或X2p是M。
根据本发明，该抗体可以包含一个CDRH3序列，该序列包括或其组成为下式：
AX1qX2qGLRX3q(SEQ ID NO.:88)
其中X1q可以是R或W；
其中X2q可以是一种芳香族氨基酸，以及；
其中X3q可以是一种碱性氨基酸。
在本发明的一个示例性实施例中，X2q可以是W或F。
在本发明的另一个示例性实施例中，X3q可以是Q或N。
本发明的其他特定实施例包括SEQ ID NO.:88的CDRH3，其中X1q是R；X2q是W或X3q是N。
由本发明所涵盖的变体抗体或抗原结合片段包括可以包含一种插入、一种缺失或一种氨基酸置换(保守性或非保守性)的那些。这些变体在其氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基可以被去除并且在其位置中插入一个不同的残基。
人源化抗体
本发明的变体抗体和抗原结合片段的示例性实施例是一组能够结合至KAAG1并且在此其特征在于人源化的抗体和抗原结合片段。
本发明的人源化抗体和抗原结合片段更具体而言包括人源化3D3、3A4 或3C4抗体和抗原结合片段。与单克隆3D3、3A4或3C4抗体相比，这些人源化3D3、3A4或3C4抗体在框架区中具有至少一个氨基酸差异。
产生并测试具有与单克隆3A4抗体(VL：SEQ ID NO.:48，VH：SEQ ID NO.:46)的那些CDR一致的CDR的人源化3A4抗体。与单克隆3A4抗体相比，这些人源化抗体包含在可变轻链框架区中的最多11个氨基酸置换(从一个到十一个)和在可变重链框架区中的最多23个氨基酸置换(从一个到二十三个)。本申请人已经展示，这些人源化3A4抗体如单克隆3A4抗体般有效地结合至KAAG1。
变体抗体或抗原结合片段的示例性实施例包括具有如SEQ ID NO.:186中所阐明的轻链可变区的那些：
SEQ ID NO.:186
DXVMTQTPLSLXVXXGXXASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXLLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXGVYYCFQGSHVPLTFGXGTXLEXK，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:48中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。氨基酸置换可以是例如发现于天然人抗体或人抗体共有序列的相对应的位置处的氨基酸。氨基酸置换可以是例如保守性的。
变体抗体或抗原结合片段的另一个示例性实施例包括具有如SEQ ID NO.:187中所阐明的轻链可变区的那些：
SEQ ID NO.:187
DXe1VMTQTPLSLXe2VXe3Xe4GXe5Xe6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXe7LLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXe8GVYYCFQGSHVPLTFGXe9GTXe10LEXe11K，
其中Xe1可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xe2可以是A或P；
其中Xe3可以是中性亲水性氨基酸；
其中Xe4可以是L或P；
其中Xe5可以是一种酸性氨基酸；
其中Xe6可以是Q或P；
其中Xe7可以是一种碱性氨基酸；
其中Xe8可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xe9可以是A或Q；
其中Xe10可以是一种碱性氨基酸；或
其中Xe11可以是一种疏水性氨基酸，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:48中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。
变体抗体或抗原结合片段的一个另外的示例性实施例包括具有如SEQID NO.:188中所阐明的轻链可变区的那些：
SEQ ID NO.:188
DXE1VMTQTPLSLXE2VXE3XE4GXE5XE6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXE7LLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXE8GVYYCFQGSHVPLTFGXE9GTXE10LEXE11K
其中XE1可以是V或I
其中XE2可以是A或P
其中XE3可以是S或T
其中XE4可以是L或P
其中XE5可以是D或E
其中XE6可以是Q或P
其中XE7可以是K或Q
其中XE8可以是L或V
其中XE9可以是A或Q
其中XE10可以是R或K或
其中XE11可以是L或I，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:48中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。
根据一个实施例，轻链可变结构域变体可以具有如SEQ ID NO.:189或190中所阐明的序列：
SEQ ID NO.:189
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK。
SEQ ID NO.:190
DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK。
变体抗体或抗原结合片段的示例性实施例包括具有如SEQ ID NO.:191中所阐明的重链可变区的那些：
SEQ ID NO.:191
QXQLVQSGXEXXKPGASVKXSCKASGYTFTDDYMSWVXQXXGXXLEWXGDINPYNGDTNYNQKFKGXXXXTXDXSXSTAYMXLXSLXSEDXAVYYCARDPGAMDYWGQGTXVTVSS，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:46中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。氨基酸置换可以是例如发现于天然人抗体或人抗体共有序列的相对应的位置处的氨基酸。氨基酸置换可以是例如保守性的。
变体抗体或抗原结合片段的另一个示例性实施例包括具有如SEQ IDNO.:192中所阐明的重链可变区的那些：
SEQ ID NO.:192
QXf1QLVQSGXf2EXf3Xbf4KPGASVKXf5SCKASGYTFTDDYMSWVXf6QXf7Xf8GXf9Xf10LEWXf11GDINPYNGDTNYNQKFKGXf12Xf13Xb14Xf15TXf16DXf17SXf18STAYMXf19LXf20SLXf21SEDXf22AVYYCARDPGAMDYWGQGTXf23VTVSS，
其中Xf1可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xbf2可以是P或A；
其中Xf3可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xf4可以是V或K；
其中Xf5可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xf6可以是一种碱性氨基酸；
其中Xf7可以是S或A；
其中Xf8可以是H或P；
其中Xf9可以是一种碱性氨基酸；
其中Xf10可以是S或G；
其中Xf11可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xf12可以是一种碱性氨基酸；
其中Xf13可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xf14可以是I或T；
其中Xf15可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xf16可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xf17可以是K或T；
其中Xf18可以是一种中性亲水性氨基酸；
其中Xf19可以是Q或E；
其中Xf20可以是N或S；
其中Xf21可以是T或R；
其中Xf22可以是一种中性亲水性氨基酸；或
其中Xf23可以是S或L，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:46中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。
变体抗体或抗原结合片段的一个另外的示例性实施例包括具有如SEQID NO.:193中所阐明的重链可变区的那些：
SEQ ID NO.:193
QXF1QLVQSGXF2EXF3XF4KPGASVKXF5SCKASGYTFTDDYMSWVXF6QXF7XF8GXF9XF10LEWXF11GDINPYNGDTNYNQKFKGXF12XF13XF14XF15TXF16DXF17SXF18STAYMXF19LXF20SLXF21SEDXF22AVYYCARDPGAMDYWGQGTXF23VTVSS
其中XF1可以是I或V；
其中XF2可以是P或A；
其中XF3可以是M或V；
其中XF4可以是V或K；
其中XF5可以是M或V；
其中XF6可以是K或R；
其中XF7可以是S或A；
其中XF8可以是H或P；
其中XF9可以是K或Q；
其中XF10可以是S或G；
其中XF11可以是I或M；
其中XF12可以是K或R；
其中XF13可以是A或V；
其中XF14可以是I或T；
其中XF15可以是L或I；
其中XF16可以是V或A；
其中XF17可以是K或T；
其中XF18可以是S或T；
其中XF19可以是Q或E；
其中XF20可以是N或S；
其中XF21可以是T或R；
其中XF22可以是S或T；或
其中XF23是S或L，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:46中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。
根据一个实施例，重链可变结构域变体可以具有如SEQ ID NO.194到197中的任一个中所阐明的序列：
SEQ ID NO.:194
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS。
SEQ ID NO.:195
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS。
SEQ ID NO.:196
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS。
SEQ ID NO.:197
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA RDPGAMDYWGQGTLVTVSS。
根据本发明的一个实施例，人源化3D3抗体可以具有下式的轻链可变区：
DIVMTQSPXSLAVSXGXXXTXNCKSSQSLLNSNFQKNFLAWYQQKPGQXPKLLIYFASTRESSXPDRFXGSGSGTDFTLTISSXQAEDXAXYXCQQHYSTPLTFGXGTKLEXK(SEQ ID NO.:174)；
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:16中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。氨基酸置换可以是例如保守性的。
根据一个更特定的实施例，人源化3D3抗体可以具有下式的轻链可变区：
DIVMTQSPXA1SLAVSXA2GXA3XA4XA5TXA6NCKSSQSLLNSNFQKNFLAWYQQKPGQXA7PKLLIYFASTRESSXA8PDRFXA9GSGSGTDFTLTISSXA10QAEDXA11AXA12YXA13CQQHYSTPLTFGXA14GTKLEXA15K(SEQ IDNO.:175)；
其中XA1可以是例如D或S；
其中XA2可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是L或I；
其中XA3可以是例如E或Q；
其中XA4可以是例如一种碱性氨基酸或更具体而言是R或K；
其中XA5可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是A或V；
其中XA6可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是I或M；
其中XA7可以是例如P或S；
其中XA8可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是V或I；
其中XA9可以是例如S或I；
其中XA10可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是L或V；
其中XA11可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是V或L；
其中XA12可以是例如V或D；
其中XA13可以是例如一种芳香族氨基酸或更具体而言是Y或F；
其中XA14可以是例如Q或A，以及；
其中XA15可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是I或L。
根据一个甚至更特定的实施例，人源化3D3抗体可以具有下式的轻链可变区：
DIVMTQSPXa1SLAVSXa2GXa3Xa4Xa5TXa6NCKSSQSLLNSNFQKNFLAWYQQKPGQXa7PKLLIYFASTRESSXa8PDRFXa9GSGSGTDFTLTISSXa10QAEDXa11AXa12YXa13CQQHYSTPLTFGXa14GTKLEXa15K(SEQ IDNO.:176)；
其中Xa1可以是例如D或S；
其中Xa2可以是例如L或I；
其中Xa3可以是例如E或Q；
其中Xa4可以是例如R或K；
其中Xa5可以是例如A或V；
其中Xa6可以是例如I或M；
其中Xa7可以是例如P或S；
其中Xa8可以是例如V或I；
其中Xa9可以是例如S或I；
其中Xa10可以是例如L或V；
其中Xa11可以是例如V或L；
其中Xa12可以是例如V或D；
其中Xa13可以是例如Y或F；
其中Xa14可以是例如Q或A，以及；
其中Xa15是例如I或L。
根据本发明的一个实施例，人源化3D3抗体可以具有下式的重链可变区：
EVQLXQSXAEXXXPGASVXXSCKASGYIFTDYEIHWVXQXPXXGLEWXGVIDPETGNTAFNQKFKGXXTXTADXSXSTAYMELSSLTSEDXAVYYCMGYSDYWGQGTXXTVSS(SEQ ID NO.:177)；其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:18中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。氨基酸置换可以是例如保守性的。
根据一个更特定的实施例，人源化3D3抗体可以具有下式的重链可变区：
EVQLXB1QSXB2AEXB3XB4XB5PGASVXB6XB7SCKASGYIFTDYEIHWVXB8QXB9PXB10XB11GLEWXB12GVIDPETGNTAFNQKFKGXB13XB14TXB15TADXB16SXB17STAYMELSSLTSEDXB18AVYYCMGYSDYWGQGTXB19XB20TVSS(SEQ ID NO.:178)，
其中XB1可以是例如V或Q；
其中XB2可以是例如G或V；
其中XB3可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是V或L；
其中XB4可以是例如K或V；
其中XB5可以是例如一种碱性氨基酸或更具体而言是K或R；
其中XB6可以是例如K或T；
其中XB7可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是V或L；
其中XB8可以是例如一种碱性氨基酸或更具体而言是R或K；
其中XB9可以是例如A或T；
其中XB10可以是例如G或V；
其中XB11可以是例如Q或H；
其中XB12可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是M或I；
其中XB13可以是例如一种碱性氨基酸或更具体而言是R或K；
其中XB14可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是V或A；
其中XB15可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是I或L；
其中XB16可以是例如T或I；
其中XB17可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是T或S；
其中XB18可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是T或S；
其中XB19可以是例如L或T，以及；
其中XB20可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是V或L。
根据一个更特定的实施例，人源化3D3抗体可以具有下式的重链可变区：
EVQLXb1QSXb2AEXb3Xb4Xb5PGASVXb6Xb7SCKASGYIFTDYEIHWVXb8QXb9PXb10Xb11GLEWXb12GVIDPETGNTAFNQKFKGXb13Xb14TXb15TADXb16SXb17STAYMELSSLTSEDXb18AVYYCMGYSDYWGQGTXb19Xb20TVSS(SEQ ID NO.:179)；
其中Xb1可以是例如V或Q；
其中Xb2可以是例如G或V；
其中Xb3可以是例如V或L；
其中Xb4可以是例如K或V；
其中Xb5可以是例如K或R；
其中Xb6可以是例如K或T；
其中Xb7可以是例如V或L；
其中Xb8可以是例如R或K；
其中Xb9可以是例如A或T；
其中Xb10可以是例如G或V；
其中Xb11可以是例如Q或H；
其中Xb12可以是例如M或I；
其中Xb13可以是例如R或K；
其中Xb14可以是例如V或A；
其中Xb15可以是例如I或L；
其中Xb16可以是例如T或I；
其中Xb17可以是例如T或S；
其中Xb18可以是例如T或S；
其中Xb19可以是例如L或T；
其中Xb20可以是例如V或L。
根据本发明的一个实施例，人源化3C4抗体可以具有下式的轻链可变区：
DIVMXQSPSSXXASXGXRVTITCKASQDIHNFLNWFQQKPGKXPKTLIFRANRLVDGVPSRFSGSGSGXDYXLTISSLXXEDXXXYSCLQYDEIPLTFGXGTKLEXX(SEQ ID NO.:180)；其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:24中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。氨基酸置换可以是例如保守性的。
根据一个更特定的实施例，人源化3C4抗体可以具有下式的轻链可变区：
DIVMXC1QSPSSXC2XC3ASXC4GXC5RVTITCKASQDIHNFLNWFQQKPGKXC6PKTLIFRANRLVDGVPSRFSGSGSGXC7DYXC8LTISSLXC9XC10EDXC11XC12XC13YSCLQYDEIPLTFGXC14GTKLEXC15XC16(SEQ ID NO.:181)；
其中XC1可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是T或S；
其中XC2可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是L或M；
其中XC3可以是例如S或Y；
其中XC4可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是V或L；
其中XC5可以是例如一种酸性氨基酸或更具体而言是D或E；
其中XC6可以是例如A或S；
其中XC7可以是例如T或Q；
其中XC8可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是T或S；
其中XC9可以是例如Q或E；
其中XC10可以是例如P或F；
其中XC11可以是例如F或L；
其中XC12可以是例如A或G；
其中XC13可以是例如T或I；
其中XC14可以是例如Q或A；
其中XC15可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是I或L，以及；其中XC16可以是例如一种碱性氨基酸或更具体而言是K或R。
根据一个更特定的实施例，人源化3C4抗体可以具有下式的轻链可变区：
DIVMXc1QSPSSXc2Xc3ASXc4GXc5RVTITCKASQDIHNFLNWFQQKPGKXc6PKTLIFRANRLVDGVPSRFSGSGSGXc7DYXc8LTISSLXc9Xc10EDXc11Xc12Xc13YSCLQYDEIPLTFGXc14GTKLEXc15Xc16(SEQ ID NO.:182)；
其中Xc1可以是例如T或S；
其中Xc2可以是例如L或M；
其中Xc3可以是例如S或Y；
其中Xc4可以是例如V或L；
其中Xc5可以是例如D或E；
其中Xc6可以是例如A或S；
其中Xc7可以是例如T或Q；
其中Xc8可以是例如T或S；
其中Xc9可以是例如Q或E；
其中Xc10可以是例如P或F；
其中Xc11可以是例如F或L；
其中Xc12可以是例如A或G；
其中Xc13可以是例如T或I；
其中Xc14可以是例如Q或A；
其中Xc15可以是例如I或L，以及；
其中Xc16可以是例如K或R。
根据本发明的一个实施例，人源化3C4抗体可以具有下式的重链可变区：
EVQLQESGPXLVKPSQXLSLTCTVXGFSITSGYGWHWIRQXPGXXLEWXGYINYDGHNDYNPSLKSRXXIXQDTSKNQFXLXLXSVTXXDTAXYYCASSYDGLFAYWGQGTLVTVSX(SEQ ID NO.:183)；其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.:26中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。氨基酸置换可以是例如保守性的。
根据一个更特定的实施例，人源化3C4抗体可以具有下式的重链可变区：
EVQLQESGPXD1LVKPSQXD2LSLTCTVXD3GFSITSGYGWHWIRQXD4PGXD5XD6LEWXD7GYINYDGHNDYNPSLKSRXD8XD9IXD10QDTSKNQFXD11LXD12LXD13SVTXD14XD15DTAXD16YYCASSYDGLFAYWGQGTLVTVSXD17(SEQ ID NO.:184)；
其中XD1可以是例如G或D；
其中XD2可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是T或S；
其中XD3可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是S或T；
其中XD4可以是例如H或F；
其中XD5可以是例如K或N；
其中XD6可以是例如G或K；
其中XD7可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是I或M；
其中XD8可以是例如一种疏水性氨基酸或更具体而言是V或I；
其中XD9可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是T或S；
其中XD10可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是S或T；
其中XD11可以是例如一种中性亲水性氨基酸或更具体而言是S或F；
其中XD12可以是例如一种碱性氨基酸或更具体而言是K或Q；
其中XD13可以是例如S或N；
其中XD14可以是例如A或T；
其中XD15可以是例如A或E；
其中XD16可以是例如V或T，以及；
其中XD17可以是任一氨基酸、A或不存在。
根据一个更特定的实施例，人源化3C4抗体可以具有下式的重链可变区：
EVQLQESGPXd1LVKPSQXd2LSLTCTVXd3GFSITSGYGWHWIRQXd4PGXd5Xd6LEWXd7GYINYDGHNDYNPSLKSRXd8Xd9IXd10QDTSKNQFXd11LXd12LXd13SVTXd14Xd15DTAXd16YYCASSYDGLFAYWGQGTLVTVSXd17(SEQ ID NO.:185)；
其中Xd1可以是例如G或D；
其中Xd2可以是例如T或S；
其中Xd3可以是例如S或T；
其中Xd4可以是例如H或F；
其中Xd5可以是例如K或N；
其中Xd6可以是例如G或K；
其中Xd7可以是例如I或M；
其中Xd8可以是例如V或I；
其中Xd9可以是例如T或S；
其中Xd10可以是例如S或T；
其中Xd11可以是例如S或F；
其中Xd12可以是例如K或Q；
其中Xd13可以是例如S或N；
其中Xd14可以是例如A或T；
其中Xd15可以是例如A或E；
其中Xd16可以是例如V或T，以及；
其中Xd17，A或不存在。
因此，在一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合至肾相关抗原1(KAAG1)的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段可以具有与SEQ ID NO.:16至少70％一致的轻链可变区和/或与SEQ ID NO.:18至少70％一致的重链可变区。该抗体或其抗原结合片段也可以包括与SEQ ID NO.:16或SEQ ID NO.:18相比的至少一个氨基酸置换。
在另一个方面，本发明也提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段可以具有与SEQ ID NO.:24至少70％一致的轻链可变区和/或与SEQ ID NO.:26至少70％一致的重链可变区。该抗体或其抗原结合片段也可以包括与SEQ ID NO.:24或SEQ IDNO.:26相比的至少一个氨基酸置换。
在另一个方面，本发明也提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段可以具有与SEQ ID NO.:48至少70％一致的轻链可变区和/或与SEQ ID NO.:46至少70％一致的重链可变区。该抗体或其抗原结合片段也可以包括与SEQ ID NO.:48或SEQ IDNO.:46相比的至少一个氨基酸置换。
根据本发明的一个实施例，氨基酸置换可以是在互补决定区(CDR)之外。具有这样的氨基酸序列的抗体或抗原结合片段涵盖例如人源化抗体或抗原结合片段。
如在此所用，术语“从一个到二十五个”包括每一个单独的值和范围，例如1、2、3并且直到25；1到25、1到24、1到23、1到22、1到21、1到20、1到19、1到18、1到17、1到16、1到15等等；2到25、2到24、2到23、2到22、2到21、2到20、2到19、2到18、2到17等等；3到25、3到24、3到23、3到22、3到21、3到20、3到19、3到18等等；4到25、4到24、4到23、4到22、4到21、4到20、4到19、4到18、4到17、4到16等等；5到25、5到24、5到23、5到22、5到21、5到20、5到19、5到18、5到17等等；等。
如在此所用，术语“从一个到二十三个”包括每一个单独的值和范围，例如1、2、3并且直到23；1到23、1到22、1到21、1到20、1到19、1到18、1到17、1到16、1到15等等；2到23、2到22、2到21、2到20、2到19、2到18、2到17等等；3到23、3到22、3到21、3到20、3到19、3到18等等；4到23、4到22、4到21、4到20、4到19、4到18、4到17、4到16等等；5到25、5到24、5到23、5到22、5到21、5到20、5到19、5到18、5到17等等；等。
如在此所用，术语“从一个到二十个”包括每一个单独的值和范围，例如1、2、3并且直到20；1到20、1到19、1到18、1到17、1到16、1到15等等；2到20、2到19、2到18、2到17等等；3到20、3到19、3到18等等；4到20、4到19、4到18、4到17、4到16等等；5到20、5到19、5到18、5到17等等；等。
同样地，术语“从一个到十五个”包括每一个单独的值和范围，例如1、2、3并且直到15；1到15、1到14、1到13、1到12、1到11、1到10等等；2到15、2到14、2到13、2到12等等；3到15、3到14、3到13等等；4到15、4到14、4到13、4到12、4到11等等；5到15、5到14、5到13、5到12等等；等。
同样地，术语“从一个到十一个”包括每一个单独的值和范围，例如1、2、3并且直到11；1到11、1到10、1到9、1到8、1到7等等；2到11、2到10、2到9、2到8等等；3到11、3到10、3到9等等；4到11、4到10、4到9、4到8、4到7等等；5到11、5到10、5到9、5到8等等；等。
在本发明的一个更特定实施例中，在源于SEQ ID NO.:16的人源化轻链可变区中可以容纳的氨基酸置换的数量可以是例如从1个到15个氨基酸置换。
在本发明的又一个更特定实施例中，在源于SEQ ID NO.:18的人源化重链可变区中可以容纳的氨基酸置换的数量可以是例如从1个到20个氨基酸置换。在一些情况下，当考虑人源化形式SEQ ID NO.:18时，具有至少三个氨基酸置换可以是适用的。
在本发明的另一个更特定实施例中，在源于SEQ ID NO.:24的人源化轻链可变区中可以容纳的氨基酸置换的数量可以是例如从1个到16个氨基酸置换。
在本发明的又另一个更特定实施例中，在源于SEQ ID NO.:26的人源化重链可变区中可以容纳的氨基酸置换的数量可以是例如从1个到17个氨基酸置换。
在本发明的另一个更特定实施例中，在源于SEQ ID NO.:48的人源化轻链可变区中可以容纳的氨基酸置换的数量可以是例如从1个到11个氨基酸置换。
在本发明的又另一个更特定实施例中，在源于SEQ ID NO.:46的人源化重链可变区中可以容纳的氨基酸置换的数量可以是例如从1个到23个氨基酸置换。
根据本发明的一个实施例，一个到二十个氨基酸置换可以是例如在轻链可变区中。
根据本发明的一个实施例，一个到二十个氨基酸置换可以是例如在重链可变区中。
人源化抗体或抗原结合片段因此可以具有一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQ ID NO.:16或SEQ ID NO.:24相比的最多二十个氨基酸置换；并且可以具有一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:26相比的最多二十个氨基酸置换。人源化抗体或抗原结合片段因此可以具有一个轻链可变区，该轻链可变区具有与SEQID NO.:48相比的最多二十五个氨基酸置换；并且可以具有一个重链可变区，该重链可变区具有与SEQ ID NO.:46相比的最多二十五个氨基酸置换。
在此应该了解，当人源化抗体或抗原结合片段具有两个轻链可变区和两个重链可变区时，轻链可变区中的每一个可以独立地具有最多二十五、二十四、二十三、二十二、二十一、二十、十九、十八、十七、十六、十五、十四、十三、十二、十一、十、九、八、七、六、五、四、三、二、一个氨基酸置换，并且重链可变区中的每一个可以具有最多二十五、二十四、二十三、二十二、二十一、二十、十九、十八、十七、十六、十五、十四、十三、十二、十一、十、九、八、七、六、五、四、三、二、一个氨基酸置换。
如在此所论述，氨基酸置换可以是保守性的或非保守性的。在一个示例性实施例中，氨基酸置换可以是保守性的。
在此应该了解，本发明的人源化抗体或抗原结合片段也可以具有与以下各项相比显示一个缺失的轻链可变区和/或重链可变区：SEQ ID NO.:16、SEQ ID NO.:18、SEQ IDNO.:189、SEQ ID NO.:190、SEQ ID NO.:194、SEQ ID NO.:195、SEQ ID NO.:196、SEQ IDNO.:197、SEQ ID NO.:24和/或SEQ ID NO.:26。这样的缺失可以发现于例如轻链可变区和/或重链可变区的氨基或羧基末端。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段的另一个示例性实施例包括例如具有一个轻链可变区的抗体或抗原结合片段，该轻链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:186、SEQ ID NO.:187、SEQ ID NO.:188、SEQ ID NO.:189或SEQID NO.:190。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:186的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少112个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:186的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有在SEQ IDNO.:186中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ ID NO.:186的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:186的氨基酸6到108、5到109、13到103、14到111的序列等等。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:187的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或至少112个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:187的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有在SEQ IDNO.:187中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ ID NO.:187的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:187的氨基酸7到109、12到104、22到113、18到112的序列等等。
术语“SEQ ID NO.:188的至少90个连续氨基酸”、“SEQ ID NO.:189的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:190的至少90个连续氨基酸”具有一个相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可以具有例如如SEQ ID NO.:189或190中所阐明的轻链可变区。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段包含(或进一步包含)例如一个重链可变区，该重链可变区可以包含SEQ ID NO.:191、192、193、194、195、196或197中的任一个的至少90个连续氨基酸。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:191的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115或至少116个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:191的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有在SEQ ID NO.:191中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ ID NO.:191的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:191的氨基酸1到106、2到112、11到113、7到102的序列等等。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:192的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115或至少116个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:192的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有在SEQ ID NO.:192中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ ID NO.:192的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:192的氨基酸6到109、8到113、1到102、2到105的序列等等。
术语“SEQ ID NO.:193的至少90个连续氨基酸”、“SEQ ID NO.:194的至少90个连续氨基酸”、“SEQ ID NO.:195的至少90个连续氨基酸”、“SEQ ID NO.:196的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:197的至少90个连续氨基酸”具有一个相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可以具有例如如SEQ IDNO.:194、195、196或197中所阐明的重链可变区。
根据本发明，该抗体或抗原结合片段可以包含例如
a)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:186的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:191、SEQ ID NO.:192、SEQ ID NO.:193、SEQ ID NO.:194、SEQ ID NO.:195、SEQ ID NO.:196或SEQ ID NO.:197；
b)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:187的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:191、SEQ ID NO.:192、SEQ ID NO.:193、SEQ ID NO.:194、SEQ ID NO.:195、SEQ ID NO.:196或SEQ ID NO.:197；
c)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:188的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:191、SEQ ID NO.:192、SEQ ID NO.:193、SEQ ID NO.:194、SEQ ID NO.:195、SEQ ID NO.:196或SEQ ID NO.:197；
d)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:189的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:191、SEQ ID NO.:192、SEQ ID NO.:193、SEQ ID NO.:194、SEQ ID NO.:195、SEQ ID NO.:196或SEQ ID NO.:197；或
e)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:190的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:191、SEQ ID NO.:192、SEQ ID NO.:193、SEQ ID NO.:194、SEQ ID NO.:195、SEQ ID NO.:196或SEQ ID NO.:197。
根据本发明的一个更特定实施例，轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:189或190的至少90个连续氨基酸并且重链可变区可以包含SEQ ID NO.:194、195、196或197的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:189中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:194中所阐明。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:189中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:195中所阐明。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:189中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:196中所阐明。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:189中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:197中所阐明。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:190中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:194中所阐明。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:190中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:195中所阐明。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:190中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:196中所阐明。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:190中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:197中所阐明。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段的另一个示例性实施例包括例如具有一个轻链可变区的抗体或抗原结合片段，该轻链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:174、SEQ ID NO.:175、SEQ ID NO.:176或SEQ ID NO.:168。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:174的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或至少113个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:174的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有在SEQID NO.:174中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ IDNO.:174的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:174的氨基酸6到108、5到109、13到103、14到111的序列等等。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:175的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或至少113个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:175的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有在SEQID NO.:175中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ IDNO.:175的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:175的氨基酸7到109、12到104、22到113、18到112的序列等等。
术语“SEQ ID NO.:176的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:168的至少90个连续氨基酸”具有一个相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可以具有例如如SEQ ID NO.:168中所阐明的轻链可变区。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段包含(或进一步包含)例如一个重链可变区，该重链可变区可以包含SEQ ID NO.:177、178、179或169中的任一个的至少90个连续氨基酸。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:177的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或至少113个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:177的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有在SEQID NO.:177中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ IDNO.:177的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:177的氨基酸1到106、2到112、11到113、7到102的序列等等。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:178的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112或至少113个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:178的至少90个连续氨基酸”涵盖了具有在SEQID NO.:178中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ IDNO.:178的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:178的氨基酸6到109、8到113、1到102、2到105的序列等等。
术语“SEQ ID NO.:179的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:169的至少90个连续氨基酸”具有一个相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可以具有例如如SEQ ID NO.:169中所阐明的重链可变区。
根据本发明，该抗体或抗原结合片段可以包含例如
f)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:174的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:177、SEQ ID NO.:178、SEQ ID NO.:179或SEQ ID NO.:169；
g)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:175的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:177、SEQ ID NO.:178、SEQ ID NO.:179或SEQ ID NO.:169；
h)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:176的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:177、SEQ ID NO.:178、SEQ ID NO.:179或SEQ ID NO.:169，或；
i)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:168的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:177、SEQ ID NO.:178、SEQ ID NO.:179或SEQ ID NO.:169。
根据本发明的一个更特定实施例，轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:168的至少90个连续氨基酸并且重链可变区可以包含SEQ ID NO.:169的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:168中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:169中所阐明。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段的其他示例性实施例是可以包含一个轻链可变区的那些，该轻链可变区可以包含SEQ ID No.180、181、182或172中的任一个的至少90个连续氨基酸。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:180的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或至少107个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:180的至少90个连续氨基酸”涵盖具有在SEQ ID NO.:180中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ ID NO.:180的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:180的氨基酸6到102、11到106、1到106、3到95、5到95的序列等等。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:181的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或至少107个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:181的至少90个连续氨基酸”涵盖在具有SEQ ID NO.:181中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ ID NO.:181的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:181的氨基酸9到106、10到101、1到98、3到99、7到107的序列等等。
术语“SEQ ID NO.:182的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:172的至少90个连续氨基酸”具有一个相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可以具有例如如SEQ ID NO.:172中所阐明的轻链可变区。
本发明的人源化抗体或抗原结合片段包含(或进一步包含)例如一个重链可变区，该重链可变区可以包含SEQ ID NO.:183、184、185或173中的任一个的至少90个连续氨基酸。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:183的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115或至少116个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:183的至少90个连续氨基酸”涵盖具有在SEQ ID NO.:183中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ ID NO.:183的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:183的氨基酸6到111、1到106、2到104、5到106、10到107的序列等等。
如在此所用，术语“SEQ ID NO.:185的至少90个连续氨基酸”也包括术语“至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115或至少116个连续氨基酸”。术语“SEQ ID NO.:185的至少90个连续氨基酸”涵盖具有在SEQ ID NO.:185中所发现的至少90个连续氨基酸的任一可能序列，并且尤其是包含SEQ ID NO.:185的3个CDR的那些序列，例如包含SEQ ID NO.:185的氨基酸3到107、1到115、1到110、22到116、20到115的序列等等。
术语“SEQ ID NO.:184的至少90个连续氨基酸”或“SEQ ID NO.:173的至少90个连续氨基酸”具有一个相似的含义。
根据本发明，本发明的抗体或抗原结合片段可以具有例如如SEQ ID NO.:173中所阐明的重链可变区。
根据本发明，该抗体或抗原结合片段可以包含例如
a)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:180的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:183、SEQ ID NO.:184、SEQ ID NO.:185或SEQ ID NO.:173；
b)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:181的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:183、SEQ ID NO.:184、SEQ ID NO.:185或SEQ ID NO.:173；
c)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:182的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:183、SEQ ID NO.:184、SEQ ID NO.:185或SEQ ID NO.:173，或；
d)一个轻链可变区，该轻链可变区可以包含SEQ ID NO.:172的至少90个连续氨基酸；和一个重链可变区，该重链可变区可以包含以下各项中的任一个的至少90个连续氨基酸：SEQ ID NO.:183、SEQ ID NO.:184、SEQ ID NO.:185或SEQ ID NO.:173。
根据本发明的一个更特定实施例，轻链可变区可以具有SEQ ID NO.:172的至少90个连续氨基酸并且重链可变区可以具有SEQ ID NO.:173的至少90个连续氨基酸。
根据本发明的一个甚至更特定实施例，轻链可变区可以如在SEQ ID NO.:172中所阐明并且重链可变区可以如在SEQ ID NO.:173中所阐明。
本发明的抗体或抗原结合片段可以具有如上所述的轻链可变区和/或重链可变区，并且可以进一步包含恒定区的氨基酸，例如人抗体恒定区的氨基酸。
在一个示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段可以包含例如人IgG1恒定区。
根据本发明的另一个示例性实施例，抗原结合片段可以是例如scFv、Fab、Fab'或(Fab')2。
抗体在细胞中的产生
可以通过对于本领域的技术人员熟悉的多种方法制造在此披露的抗KAAG1抗体，例如，杂交瘤方法或通过重组DNA方法。
在本发明的一个示例性实施例中，可以通过常规的杂交瘤技术产生抗KAAG1抗体，其中用抗原对小鼠进行免疫，分离脾细胞并与缺乏HGPRT 表达的骨髓瘤细胞融合，并且通过含有次黄嘌呤、氨基喋呤以及胸腺嘧啶(HAT)的培养基选择杂交细胞。
在本发明的一个另外的示例性实施例中，可以通过重组DNA方法产生抗KAAG1抗体。
为了表达抗KAAG1抗体，可以将能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链的任何一者的核苷酸序列或任何其他核苷酸序列插入表达载体(即，含有用于在特定宿主中的插入编码序列的转录和翻译控制的元件的载体)中。这些元件可以包括调节序列，如增强子、组成型和诱导型启动子、以及5'和3'非翻译区。可以使用本领域的技术人员熟知的方法来构建这样的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。
可以利用本领域的技术人员已知的多种表达载体/宿主细胞系统来表达源于能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链中的任何一者的核苷酸序列的多肽或RNA。这些包括但不限于微生物，如用重组噬菌体、质粒、或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用杆状病毒载体感染的昆虫细胞系统；用病毒或细菌表达载体转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。为了重组蛋白在哺乳动物系统中的长期产生，在细胞系中稳定的表达会受到影响。举例来说，可以使用表达载体(这些表达载体可以含有病毒复制起点和/或内源性表达元件、以及在相同或分开的载体上的可选择或可见的标记基因)将能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链的任何一者的核苷酸序列转化到细胞系中。本发明并不限于所采用的载体或宿主细胞。在本发明的某些实施例中，可以将能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链的任何一者的核苷酸序列各自连接到分开的表达载体中，并且将每个链分开地表达。在另一个实施例中，可以将能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链的任何一者的轻和重链两者连接到单一表达载体中，并且将它们同时表达。
可替代地，RNA和/或多肽可以对应地使用体外转录系统或耦合的体外转录/翻译系统从一个载体表达，该载体包含能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链中的任何一者的核苷酸序列。
总体而言，包含能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链中的任何一者的核苷酸序列和/或表达由能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链中的任何一者的核苷酸序列编码的多肽或其一部分的宿主细胞可以通过本领域的普通技术人员已知的多种程序鉴定。这些程序包括但不限于DNA/DNA或DNA/RNA杂交、PCR扩增以及蛋白质生物测定或免疫测定技术，这些技术包括用于检测和/或定量核酸或氨基酸序列的基于膜、溶液或芯片的技术。使用或者特异性多克隆或者单克隆抗体来检测和测量多肽的表达的免疫方法是本领域中已知的。这些技术的实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)以及荧光激活细胞分选术(FACS)。本领域的技术人员可以容易地使这些方法适应于本发明。
包含能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链中的任何一者的核苷酸序列的宿主细胞因此可以在用于从细胞培养物转录相对应的RNA(mRNA、siRNA、shRNA等)和/或表达多肽的条件下培养。取决于所使用的序列和/或载体，由细胞产生的多肽可以分泌或可以保留在细胞内。在一个示例性实施例中，可以将包含能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链的任何一者的核苷酸序列的表达载体设计为包含信号序列，这些信号序列指导多肽穿过原核或真核细胞膜的分泌。
由于遗传密码的固有的简并性，可以产生并使用编码相同的、基本上相同的或功能相当的氨基酸序列的其他DNA序列，例如，以便表达由能够编码在此所述的轻和重免疫球蛋白链的任何一者的核苷酸序列所编码的多肽。可以使用本领域中通常已知的方法将本发明的核苷酸序列工程化，以便出于多种目的而更改核苷酸序列，这些目的包括但不限于基因产物的克隆、加工、和/或表达的修饰。可以使用通过随机断裂以及基因片段和合成寡核苷酸的再组装PCR的DNA改组而将核苷酸序列工程化。举例来说，寡核苷酸介导的定点诱变可以用于引入突变，这些突变创造新的限制位点、更改糖基化模式、改变密码子偏爱性、产生剪接变体，等等。
另外，可以针对其调节插入序列的表达或以所希望的方式加工所表达的多肽的能力而选择宿主细胞株。这样的多肽修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化以及酰化。在一个示例性实施例中，包含特定糖基化结构或模式的抗KAAG1抗体可以是所希望的。切割多肽的“前体原”(“prepro”)形式的翻译后加工还可以用于指定蛋白质靶向、折叠和/或活性。具有用于翻译后活性的特定细胞机器和特征性机理的不同宿主细胞(例如，CHO、海拉细胞(HeLa)、MDCK、HEK293以及W138)是可商购的，并且来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且可以被选择为确保所表达多肽的正确修饰和加工。
本领域的技术人员将易于理解的是，可以将天然的、修饰的或重组的核酸序列连接到异源序列，导致含有在以上提及的任何宿主系统中的异源多肽部分的融合多肽的翻译。这样的异源多肽部分可以通过使用可商购的亲和基质而促进融合多肽的纯化。这样的部分包括但不限于谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、钙调蛋白结合肽、6-His(His)、FLAG、c-myc、血球凝集素(HA)以及抗体表位(如单克隆抗体表位)。
在又一个另外的方面，本发明涉及一种可以包含编码融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸。融合蛋白可以包含融合伴侣(例如，HA、Fc等等)，该融合伴侣与在此所述的多肽(例如，完整轻链、完整重链、可变区、CDR等等)融合。
本领域的普通技术人员也将容易地认识到，可以使用在本领域中众所周知的化学或酶促方法完全或部分地合成核酸和多肽序列。举例来说，肽合成可以使用不同的固相技术和机器进行，如可以使用ABI431A肽合成器(PE生物系统(PE Biosystems))进行自动合成。如果希望的话，可以在合成期间更改氨基酸序列和/或将氨基酸序列与来自其他蛋白质的序列结合，从而产生变体蛋白质。
抗体结合物
本发明的抗体或抗原结合片段可以与一个可检测部分(即为了检测或诊断目的)或与一个治疗性部分(为了治疗目的)结合。
“可检测部分”是通过光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、化学的和/或其他物理学手段可检测的部分。可检测部分可以使用在本领域中众所周知的方法与本发明的抗体和其抗原结合片段或者直接地和/或间接地(例如通过连接物，如不限于DOTA或NHS连接物)偶联。可以使用多种多样的可检测部分，并且该选择取决于所需要的灵敏度、结合简易性、稳定性需求以及可获得的仪器。合适的可检测部分包括但不限于荧光标记、放射性标记(例如不限于125I、In111、Tc99、I131以及包括用于PET扫描仪的正电子发射同位素等)、核磁共振活性标记、发光标记、化学发光标记、发色团标记、酶标记(例如并且不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、量子点和/或纳米颗粒。可检测部分可以引起和/或产生可检测信号，由此允许来自可检测部分的信号被检测到。
在本发明的另一个示例性实施例中，抗体或其抗原结合片段可以与治疗性部分(例如药物、细胞毒性部分)偶联(修饰)。
在一个示例性实施例中，抗KAAG1抗体和抗原结合片段可以包括抑制剂、化学治疗剂或细胞毒性剂。举例来说，抗体和抗原结合片段可以与化学治疗剂或细胞毒性剂结合。这样的化学治疗剂或细胞毒性剂包括但不限于钇-90、钪-47、铼-186、碘-131、碘-125以及本领域的普通技术人员所认可的许多其他化学治疗剂或细胞毒性剂(例如镥(例如Lu177)、铋(例如Bi213)、铜(例如Cu67))。在其他情况下，化学治疗剂或细胞毒性剂可以包括不限于5-氟尿嘧啶、阿霉素、伊立替康、基于铂的化合物(如顺铂)和抗微管蛋白或抗有丝分裂化合物(如紫杉烷)、多柔比星以及环磷酰胺、假单胞菌内毒素、蓖麻毒素以及其他毒素。在具有在0.001nM到150nM、0.001nM到100nM、0.001nM到50nM、0.001nM到20nM或0.001nM到10nM(包括端点)范围内的IC50的那些当中选择合适的抗体药物结合物。用于结合的细胞毒性药物因此基于这些准则选择。
可替代地，为了进行本发明的方法，并且如在本领域中已知的，可以将本发明的抗体或抗原结合片段(结合的或未结合的)与一种第二分子(例如，第二抗体，等等)组合使用，该第二分子能够特异性地结合至本发明的抗体或抗原结合片段并且可以携带一个所希望的可检测的、诊断性或治疗性的部分。
抗体的药物组合物和其用途
本发明还涵盖了抗KAAG1抗体或抗原结合片段(结合的或未结合的)的药物组合物。该药物组合物可以包含抗KAAG1抗体或抗原结合片段，并且还可以包含药学上可接受的载体。
本发明的其他方面涉及一种组合物，该组合物可以包含在此所述的抗体或抗原结合片段以及一种载体。
本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物可以包含在此所述的抗体或抗原结合片段以及一种药学上可接受的载体。
除了活性成分之外，药物组合物还可以包含药学上可接受的载体(这些载体包括水、PBS、盐溶液、明胶、油、醇类以及其他赋形剂)以及促进将活性化合物加工为药学上可使用的制剂的助剂。在其他情况下，这样的制剂可以是灭菌的。
如在此所用，“药物组合物”意指治疗有效量的药剂连同药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。如在此使用的“治疗有效量”是指对于给定病状和给药方案而言提供治疗效果的量。这样的组合物是液体或冻干的或另外地是干燥的制剂，并且包含：具有不同的缓冲内容物(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂，添加剂(如白蛋白或明胶，以预防吸附至表面)，洗涤剂(例如，吐温(Tween)20、吐温80、普朗尼克(Pluronic)F68、胆汁酸盐)。增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、増量物质或张度调节剂(例如乳糖、甘露醇)、聚合物(例如聚乙二醇)与蛋白质的共价附接、与金属离子的络合、或材料的结合(该材料结合在聚合化合物，如聚乳酸、聚乙醇酸、水溶胶等的微粒制剂中或微粒制剂上或结合在脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上)。这样的组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。控制释放或持续释放组合物包括在亲脂性储库(例如，脂肪酸、蜡、油)中的制剂。还被本发明涵盖的是用聚合物(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)包被的微粒组合物。本发明的组合物的其他实施例结合微粒形式保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂，以用于不同的给药途径，包括经肠胃外、肺、鼻、口、阴道、直肠的途径。在一个实施例中，药物组合物是经肠胃外、癌旁、经粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内以及瘤内给予的。
另外，如在此使用的“药学上可接受的载体”或“药用载体”在本领域中是已知的，并且包括但不限于0.01-0.1M或0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。另外，这样的药学上可接受的载体可以是水性的或非水性的溶液、悬浮液以及乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)以及可注射的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些，等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如，例如抗微生物剂、抗氧化剂、整理剂(collating agent)、惰性气体，等等。
对于任何化合物，可以或者在细胞培养测定中或者在动物模型(如小鼠、大鼠、兔、狗或猪)中初步估算治疗有效剂量。还可以使用动物模型来确定浓度范围和给药途径。这种信息可以进而用来确定对于在人类中给药有用的剂量和途径。这些技术对于本领域的技术人员是熟知的，并且治疗有效剂量是指改善症状或病状的活性成分的量。治疗效果和毒性可以通过标准药物程序在细胞培养物中或用实验性动物，如通过计算并对比ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％的群体具杀伤性的剂量)统计来测定。可以将以上所述的任何治疗组合物应用至对这种治疗有需要的任何受试者，包括但不限于哺乳动物，如狗、猫、牛、马、兔、猴子以及人。
可以通过任何数目的途径给予在此发明中利用的药物组合物，这些途径包括但不局限于：口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下或直肠的方式。
使用方法
出于本披露的目的，术语“治疗”是指治疗性治疗和防治性或预防性测量两者，其中目的是为了预防或减缓(减轻)目标病理性病状或病症。需要治疗的那些包括已经患有该病症的那些以及倾向于患有该病症的那些或要预防该病症的那些。
本发明在其一个方面提供了一种用能够特异性结合至KAAG1的抗体或抗原结合片段来治疗患有或疑似患有乳癌的个体的方法。
根据本发明，该个体可以患有对雌激素受体表达、孕酮受体表达和/或Her2表达(或过度表达)是阴性的乳癌。
同样根据本发明，该个体可以患有针对雌激素受体、孕酮受体和/或Her2中的至少一个具有低表达的乳癌。
举例来说，该肿瘤可以是针对雌激素受体表达和孕酮受体表达两者阴性的(或具有其低表达)。
根据本发明，该个体可以患有特征在于是三阴性或基底样的乳癌。
本发明的又其他方面涉及使用在此所述的分离的抗体或抗原结合片段来治疗或诊断乳癌，该乳癌的特征是缺乏雌激素受体表达、孕酮受体表达和/或Her2过度表达或其特征是这三种标记中的至少一个的低表达。
根据本发明，该方法可以包括例如向有需要的个体给予一种能够特异性结合至KAAG1的抗体或抗原结合片段。有需要的个体是基于缺乏ER表达、PgR表达和/或通过不存在HER2蛋白质过度表达进行优先地选择。这些标记的临床测试通常是使用组织病理学方法(免疫组织化学、FISH等)和/或通过基因表达研究(参见例如登特等人，2007；伯恩斯坦和莱西，2011)来进行。有需要的个体因此可以是已经收到了三阴性乳癌或基底样乳癌的诊断的个体。
本发明因此特别地涉及用抗KAAG1抗体治疗性治疗患有三阴性乳癌或基底样癌症的个体。
合适的抗体或抗原结合片段包括能够特异性结合至在肿瘤细胞表面处的KAAG1的那些。这样的抗体可以优先地结合被包含在KAAG1的氨基酸30到84(包括端点)内(例如在KAAG1的氨基酸36到60(包括端点)内或在氨基酸61到84(包括端点)内)的表位。
合适的抗体可以是介导抗体依赖性细胞细胞毒性的那些和与治疗性部分结合的那些。
根据本发明，该抗体可以是例如一种单克隆抗体、一种嵌合抗体或一种人源化抗体或其一种抗原结合片段。
本发明方法可以包括给予该抗体或抗原结合片段与抑制剂、化学治疗剂或细胞毒性剂的组合。
由本发明所涵盖的其他治疗方法包括给予其他类型的KAAG1抑制剂，如基于反义的治疗剂(siRNA、反义物、核酶等)。
本发明因此提供一种通过向有需要的个体给予KAAG1活性或表达的抑制剂来治疗三阴性乳癌或基底样乳癌的方法。
抑制剂可以包含与SEQ ID NO.:1或与其片段互补的核苷酸序列。更具体而言，该抑制剂可以包含与SEQ ID No.:1的核苷酸738到992(包括端点)或与其片段互补的核苷酸序列。举例来说，该抑制剂可以包含至少10个(至少15个、至少20个)连续核苷酸，这些核苷酸与SEQ ID No.:1或与SEQ ID No.:1的核苷酸738到992(包括端点)互补。
在某些情况下，抗KAAG1抗体和片段可以与表达KAAG1的癌细胞相互作用，并且通过介导ADCC诱导免疫反应。在其他情况下，抗KAAG1抗体和片段可以阻断KAAG1与其蛋白质伴侣的相互相用。
在某些情况下，抗KAAG1抗体和其抗原结合片段可以与针对相同病状给定的其他治疗剂(抑制剂、化学治疗剂或细胞毒性剂)并行地给予。因此，这些抗体可以与以下各项一起给予：PARP1抑制剂、EGFR抑制剂、抗有丝分裂剂(例如紫杉烷)、基于铂的药剂(例如顺铂)、DNA损伤剂(例如多柔比星)以及本领域的普通技术人员已知的其他抗癌疗法。在其他情况下，抗KAAG1抗体和其抗原结合片段可以与其他治疗性抗体一起给予。这些包括但不限于靶向EGFR、CD-20以及Her2的抗体。
本发明在其另一个方面涉及一种用于抑制雌激素受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PgR-)和/或缺乏Her2过度表达(Her2-)的表达KAAG1的细胞的生长的方法，该方法可以包括使该细胞与有效量的在此所述的抗体或抗原结合片段接触。
本发明还涵盖了治疗哺乳动物中的癌症或抑制雌激素受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PgR-)和/或缺乏Her2过度表达(Her2-)的表达KAAG1的细胞的生长的方法，该方法可以包括向有需要的哺乳动物给予在此所述的抗体或抗原结合片段。
在另外的方面，本发明提供了使用本发明的抗体或抗原结合片段的治疗方法、诊断方法以及检测方法，以及这些抗体或抗原结合片段在用于这种目的的药物组合物或药物的制造中的用途。
本发明所涵盖的治疗方法包括向有需要的哺乳动物，并且尤其是向患有或易患其特征在于雌激素受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PgR-)和/或缺乏Her2过度表达(Her2-)的癌症的患者给予在此所述的抗体或抗原结合片段。
本发明在其他方面还提供了用于减少肿瘤扩散、肿瘤侵袭、肿瘤形成或用于诱导肿瘤溶解的方法，这些方法可以包括向有需要的哺乳动物给予分离的抗体或抗原结合片段。
本发明因此涉及使用在此所述的分离的抗体或抗原结合片段来(制造药物组合物，该药物组合物用于)治疗癌症、减少肿瘤扩散、肿瘤侵袭、肿瘤形成或用于诱导雌激素受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PgR-)和/或缺乏Her2过度表达(Her2-)的表达KAAG1的肿瘤细胞的肿瘤溶解。
抗体或抗原结合片段可以更具体而言适用于恶性肿瘤，包括例如具有转移能力的恶性肿瘤和/或特征是锚定非依赖性生长的肿瘤细胞。本发明的抗体或抗原结合片段还可以用于癌症的诊断中。癌症的诊断可以通过向患有或疑似患有癌症的哺乳动物给予本发明的抗体或抗原结合片段体内进行。该诊断也可以通过使从哺乳动物获得的样品与抗体或抗原结合片段接触并确定表达KAAG1或KAAG1变体的细胞(肿瘤细胞)的存在或不存在离体进行。
本发明还涵盖了检测哺乳动物中的癌症或检测雌激素受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PgR-)和/或缺乏Her2过度表达(Her2-)的表达KAAG1的细胞的方法，该方法可以包括向有需要的哺乳动物给予在此所述的抗体或抗原结合片段。
本发明在其另一个方面涉及一种用于检测表达KAAG1或KAAG1变体的细胞的方法，该方法可以包括使该细胞与在此所述的抗体或抗原结合片段接触，并且检测由抗体和表达KAAG1或KAAG1变体的细胞形成的复合物。在检测方法中使用的抗体或抗原结合片段的示例性实施例是能够结合至KAAG1的细胞外区的那些。
在检测方法中使用的抗体或抗原结合片段的其他示例性实施例是结合到在肿瘤细胞表面表达的KAAG1或KAAG1变体的那些，这些肿瘤细胞是雌激素受体阴性的(ER-)、孕酮受体阴性的(PgR-)和/或缺乏Her2过度表达(Her2-)。
本发明的另一个方面涉及一种用于检测KAAG1(SEQ ID NO.:2)、具有与SEQ IDNO.:2的至少80％序列一致性的KAAG1变体、或KAAG1或KAAG1变体的循环形式的分泌形式的方法，该方法可以包括使表达KAAG1或KAAG1变体的细胞或包含或疑似包含KAAG1或KAAG1变体的样品(生检、血清、血浆、尿液等)与在此所述的抗体或抗原结合片段接触并且测量结合。该样品可以源于哺乳动物(例如人)，该哺乳动物可以患有癌症(例如特征在于是雌激素受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PgR-)和/或缺乏Her2过度表达(Her2-)的乳癌，如基底样乳癌或三阴性乳癌)或可以疑似患有癌症。该样品可以是从哺乳动物或细胞培养上清液获得的组织样品。
根据本发明，该样品可以是从哺乳动物获得的血清样品、血浆样品、血液样品或腹水液。在此所述的抗体或抗原结合片段可以有利地检测KAAG1的分泌或循环形式(在血液中循环)。
该方法可以包括将结合至KAAG1或KAAG1变体的抗体或抗原结合片段所形成的复合物进行定量。
抗体结合至抗原将引起预期的抗原的分子量的增加。因此，在抗体或抗原结合片段与抗原特异性结合后发生物理变化。
这样的变化可以使用例如电泳，接着蛋白质印迹和凝胶或印迹着色、质谱、与计算机连接的HPLC或其他方法来检测。能够计算分子量变化的装置是本领域中已知的并且包括例如PhosphorimagerTM。
当抗体包括例如可检测标记时，可以通过由标记发射的荧光、标记的辐射发射、与其底物一起提供的标记的酶活性或其他方式来检测抗原-抗体复合物。
抗体或抗原结合片段与抗原之间的结合的检测和/或测量可以通过本领域中已知的不同的方法进行。抗体或抗原结合片段与抗原之间的结合可以用一种能够检测由可检测标记所发射的信号(辐射发射、荧光、颜色变化等)的装置来监测。这样的装置提供了指示如所发生的结合的数据，并且还提供了关于结合至抗原的抗体的量的指示。装置(通常与计算机连接)可能还能够计算在背景信号(例如，在不存在抗原-抗体结合的情况下获得的信号)或背景噪声与在特异性的抗体-抗原结合后获得的信号之间的差。因此这样的装置可以给用户提供关于抗原是否已经被检测的指示和结论。
本发明的另外的方面涉及试剂盒，这些试剂盒可以包括一个或多个含有在此所述的一个或多个抗体或抗原结合片段的容器。
核酸、载体以及细胞
抗体通常是在允许表达轻链和重链的细胞中产生的，该轻链和重链是从一种包含编码轻链和/或重链的核酸序列的载体(多种)表达的。
因此本发明涵盖能够编码在此所述的CDR、轻链可变区、重链可变区、轻链、重链中任何一个的核酸。
因此本发明在一个另外的方面涉及一种编码能够特异性结合至KAAG1的抗体的轻链可变区和/或重链可变区的核酸。
由本发明所涵盖的核酸的示例性实施例包括一种选自下组的核酸，该组由以下各项组成：具有与SEQ ID NO.:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、45以及47、其片段(例如具有至少10个、至少15个、至少20个连续核苷酸的片段)以及互补序列中的任何一个的至少70％序列一致性(即至少75％、至少80％序列一致性)的核酸。
根据本发明的一个实施例，该核酸尤其可以编码可以能够诱导表达KAAG1或KAAG1变体的肿瘤细胞的杀伤(消除、损伤、溶解)的抗体的轻链可变区和/或重链可变区。
根据本发明的另一个实施例，该核酸尤其可以编码可以能够降低表达KAAG1或KAAG1变体的肿瘤细胞的扩散的抗体的轻链可变区和/或重链可变区。
根据本发明的又另一个实施例，该核酸可以特别地编码可以能够减少或削弱表达KAAG1或KAAG1变体的肿瘤的形成的抗体的轻链可变区和/或重链可变区。
本发明的核酸的示例性实施例包括编码轻链可变区的核酸，该轻链可变区包含：
a.一个CDRL1序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:72和SEQID NO.:73；
b.一个CDRL2序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:74、SEQID NO.:75以及SEQ ID NO.:76，或；
c.一个CDRL3序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:77、SEQID NO.:78以及SEQ ID NO.:79。
根据本发明，该核酸可以编码可以包含CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少两个CDR的轻链可变区。
同样根据本发明，该核酸可以编码可以包含一个CDRL1、一个CDRL2以及一个CDRL3的轻链可变区。
本发明还涉及一种编码重链可变区的核酸，该重链可变区包含：
a.一个CDRH1序列，该序列包含SEQ ID NO.:80；
b.一个CDRH2序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:81、SEQID NO.:82、SEQ ID NO.:83、SEQ ID NO.:84以及SEQ ID NO.:85，或；
c.一个CDRH3序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:86、SEQID NO.:87以及SEQ ID NO.:88。
根据本发明，该核酸可以编码可以包含CDRH1、CDRH2或CDRH3中的至少两个CDR的重链可变区。
根据本发明，该核酸可以编码可以包含一个CDRH1、一个CDRH2以及一个CDRH3的重链可变区。
还被本发明涵盖的是编码具有至少一个保守性氨基酸置换的抗体变体的核酸。
根据本发明，该核酸可以编码包含至少一个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，该核酸可以编码包含在这些CDR的至少两个中的至少一个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，该核酸可以编码包含在3个CDR中的至少一个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，该核酸可以编码包含在至少一个CDR中的至少两个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，该核酸可以编码包含在这些CDR中的至少两个中的至少两个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，该核酸可以编码包含在3个CDR中的至少两个保守性氨基酸置换的CDR。
本发明的其他方面涉及一种编码轻链可变区的核酸，该轻链可变区具有与选自下组的序列的至少70％、75％、80％序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:16、SEQID NO.:20、SEQ ID NO.:24、SEQ ID NO.:103、SEQ ID NO.:104、SEQ ID NO.:105、SEQ IDNO.:106、SEQ ID NO.:107、SEQ ID NO.:108、SEQ ID NO.:109、SEQ ID NO.:110、SEQ IDNO.:111、SEQ ID NO.:112、SEQ ID NO.:113、SEQ ID NO.:114、SEQ ID NO.:115、SEQ IDNO.:116、SEQ ID NO.:117、SEQ ID NO.:118、SEQ ID NO.:119、SEQ ID NO.:120、SEQ IDNO.:121、SEQ ID NO.:122、SEQ ID NO.:123、SEQ ID NO.:124以及SEQ ID NO.:125。
本发明的又其他方面涉及一种编码重链可变区的核酸，该重链可变区具有与选自下组的序列的至少70％、75％、80％序列一致性，该组由以下各项组成：SEQ ID NO.:18、SEQID NO.:22、SEQ ID NO.:26、SEQ ID NO.:126、SEQ ID NO.:127、SEQ ID NO.:128、SEQ IDNO.:129、SEQ ID NO.:130、SEQ ID NO.:131、SEQ ID NO.:132、SEQ ID NO.:133、SEQ IDNO.:134、SEQ ID NO.:135、SEQ ID NO.:136、SEQ ID NO.:137、SEQ ID NO.:138、SEQ IDNO.:139、SEQ ID NO.:140、SEQ ID NO.:141、SEQ ID NO.:142、SEQ ID NO.:143、SEQ IDNO.:144、SEQ ID NO.:145、SEQ ID NO.:146以及SEQ ID NO.:147。
在又另一个方面，本发明涉及一种包含在此所述的核酸的载体。
根据本发明，该载体可以是表达载体。
含有用于在特定宿主中的插入编码序列的转录和翻译控制的元件的载体是本领域中已知的。这些元件可以包括调节序列，如增强子、组成型和诱导型启动子、以及5'和3'非翻译区。可以使用本领域的技术人员熟知的方法来构建这样的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。
在另一个方面，本发明涉及一种分离的细胞，该细胞可以包含在此所述的核酸。
该分离的细胞可以包含或者在分开的载体上或者在相同的载体上编码轻链可变区的核酸和编码重链可变区的核酸。该分离的细胞还可以包含或者在分开的载体上或者在相同的载体上编码轻链的核酸和编码重链的核酸。
根据本发明，该细胞可以能够表达、组装和/或分泌一种抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种可以包含和/或可以表达在此所述的抗体的细胞。
根据本发明，该细胞可以包含编码轻链可变区的核酸和编码重链可变区的核酸。
该细胞可以能够表达、组装和/或分泌一种抗体或其抗原结合片段。
呈现了以下实例以进一步概述本发明的细节。
实例
实例1
此实例披露了用于将Fab转化到全IgG1嵌合单克隆抗体中的方法。
除了执行Fab单克隆抗体与KAAG1蛋白质之间的相互相用研究的可能性以外，Fab的使用还可以相对于执行用于验证抗原的生物功能的有意义的体外和体内研究而受到限制。因此，必需将Fab中所包含的轻链和重链可变区转移到全抗体支架，从而产生小鼠-人嵌合IgG1。构建用于轻和重免疫球蛋白链两者的表达载体，使得i)Fab表达载体的原始细菌信号肽序列上游被替换为哺乳动物信号肽，并且ii)在小鼠抗体中的轻链和重链恒定区被替换为人恒定区。完成这个转移的方法利用了本领域的技术人员熟悉的标准分子生物学技术。
轻链表达载体——一种现有的哺乳动物表达质粒，称作pTTVH8G(迪罗谢(Durocher)等人，2002)，被设计用于293E瞬时转染系统中，被修饰以容纳小鼠轻链可变区。所得小鼠-人嵌合轻链包含小鼠可变区、之后为人κ恒定结构域。编码人κ恒定结构域的cDNA序列通过PCR，用引物OGS1773和OGS1774(对应地是SEQ ID NO:55和56)扩增。用于人κ恒定区的核苷酸序列和一种相对应的氨基酸序列对应地示出在SEQ ID NO:57 和58中。将所得321个碱基对的PCR产物连接到pTTVH8G中，使其刚好在人VEGF A(NM_003376)的信号肽序列的下游。这个克隆步骤还定位了独特的限制性核酸内切酶位点，这些限制性核酸内切酶位点容许编码小鼠轻链可变区的cDNA的精确定位。称作pTTVK1的最终表达质粒的序列示出在SEQ ID NO.:59中。基于表2中所披露的序列，设计了对抗体3D3、3G10、3C4以及3A4的轻链可变区(对应地是SEQ ID NO:15、19、23以及47)具有特异性的PCR引物，这些PCR引物在其5'末端结合有一个与VEGF A信号肽的后20个碱基对一致的序列。这些引物的序列示出在SEQIDNO:60、61、62以及213中。使用相同的反向引物来扩增3D3、3G10以及3C4的所有三个轻链可变区，因为远端3'末端是一致的。此引物(SEQID NO.:63)在其3'末端结合有一个与人κ恒定结构域的前20个碱基对一致的序列。引物SE ID NO.:214被用于扩增3A4轻链可变区。将PCR片段和消化的pTTVK1两者用T4DNA聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性处理，产生通过退火连接的互补末端。将退火反应转化到感受态大肠杆菌中并且通过测序验证表达质粒，从而确保小鼠轻链可变区被正确地插入到pTTVK1表达载体中。本领域的普通技术人员将容易地认识到，用于构建轻链表达质粒的方法适用于原始Fab文库中所包含的所有抗KAAG1抗体。
重链表达载体——产生重链免疫球蛋白的表达载体，以与上文所述的pTTVK1类似的方式设计用于产生轻链免疫球蛋白。通过连接编码人恒定CH1区的cDNA序列将包含人IgGK信号肽序列以及IgG1的人Fc结构域的CH2和CH3区的质粒pYD11(迪罗谢等人，2002)进行修饰。PCR引物OGS1769和OGS1770(SEQ ID NO:64和65)被设计成包含独特的限制性核酸内切酶位点，被用于扩增含有在SEQ ID NO:66和67中所示的核苷酸序列和一种相对应的氨基酸序列的人IgG1CH1区。在将人CH1的309个碱基对片段连接到刚好在IgGK信号肽序列的下游之后，所修饰的质粒(SEQID NO.:68)被命名为pYD15。当将选择的重链可变区连接到这个载体时，所得的质粒编码具有人恒定区的全IgG1重链免疫球蛋白。基于表2中所披露的序列，设计了对抗体3D3、3G10、3C4以及3A4的重链可变区(对应地是SEQ ID NO:17、21、25以及45)具有特异性的PCR引物，这些PCR引物在其5'末端结合有一个与IgGK信号肽的后20个碱基对一致的序列。关于3A4，这些引物的序列示出在SEQ ID NO:69(3D3和3G10具有相同的5'末端序列)、SEQ ID NO.:70或SEQ ID NO.:215中。使用相同的反向引物来扩增3D3、3G10以及3C4的所有三个重链可变区，因为远端3'末端是一致的。此引物(SEQ ID NO.:71)在其3'末端结合有一个与人CH1恒定结构域的前20个碱基对一致的序列。关于3A4重链可变区，使用SEQ ID NO.:216。将PCR片段和消化的pYD15两者用T4DNA聚合酶的3'-5'核酸外切酶活性处理，产生通过退火连接的互补末端。将退火反应转化到感受态大肠杆菌中并且通过测序验证表达质粒，从而确保小鼠重链可变区被正确地插入到pYD15表达载体中。本领域的普通技术人员将容易地认识到，用于构建重链表达质粒的方法适用于原始Fab文库中所包含的所有抗KAAG1抗体。
人IgG1在293E细胞中的表达——以上所制备的编码轻和重链免疫球蛋白的表达载体是在293E细胞中使用瞬时转染系统表达的(迪罗谢等人，2002)。可以使用瞬时或稳定表达的其他方法。将轻链与重链的比率进行优化以便实现在组织培养基中抗体的最大产率，并且发现它是9:1(L:H)。抗KAAG1抗体(单克隆的、嵌合的或人源化的)结合至重组Fc-KAAG1的能力通过ELISA来测量并且与原始小鼠Fab相比较。
用于将其他Fab转化到完整IgG(包括3A4)中并且用于表达这些抗体的方案更详细地描述在国际申请第PCT/CA2012/000296号中，该申请的全部内容通过引用结合在此。
实例2
3A4小鼠单克隆抗体的人源化
国际专利第PCT/CA2009/001586号、PCT/CA2010/001795以及第PCT/CA2012/000296号描述了用于产生人源化轻链和重链可变区的示例性方法。
为了100％框架人源化，3A4抗体轻链可变区的人源化涉及对其所提出的人源化框架的11种突变。为了100％框架人源化，3A4抗体重链可变区的人源化涉及对其所提出的人源化框架的23种突变。这些100％人源化可变区序列对应地被标记为Lvh1和Hvh1(SEQ IDNO:189和194)。另外的人源化序列还被设计为：其中将若干来自3A4小鼠序列的残基基于谨慎的结构和比较序列分析而保留，这些分析指示如果在这些位置将突变引入则有高的更改抗原结合亲和力的概率。可变区的这些序列被标记为Lvh2、Hvh2、Hvh3以及Hvh4(SEQ IDNO:190、195、196以及197)。
二种人源化轻链变体(包括恒定区)在此被鉴定为Lh1(SEQ ID NO.:199)和Lh2(SEQ ID NO.:200)。四种人源化重链变体(包括恒定区)在此被鉴定为Hh1(SEQ ID NO.:202)、Hh2(SEQ ID NO.:203)、Hh3(SEQ ID NO.:204)以及Hh4(SEQ ID NO.:205)。两种人源化轻链和4种人源化重链可以组装为8种人源化抗体(Lh1Hh1、Lh1Hh2、Lh1Hh3、Lh1Hh4、Lh2Hh1、Lh2Hh2、Lh2Hh3以及Lh2Hh4)。
在3A4轻链人源化序列Lvh2(SEQ ID NO:190)的情况下，框架残基Val-L2和Lys-L45从小鼠序列保留，因为残基L2是半隐蔽的，接触CDR-L1和CDR-L3两者，并具有抗原接触倾向，而残基L45接近重链。我们注意到这些鼠残基两者均可以出现在人框架中。在3A4重链人源化序列Hvh2(SEQ ID NO:195)的情况下，框架残基Ile-H2和Lys-L73从小鼠序列保留，因为残基H2是半隐蔽的，接触CDR-H1和CDR-H3两者，并具有抗原接触倾向，而残基H73属于支撑CDR-H2的游标区，并且这些鼠残基两者均可以出现在人构架中。在3A4重链人源化序列Hvh3(SEQ ID NO:196)的情况下，Ile-H2和Lys-L73回复突变被保留并且除了这些之外，框架残基Ile-H48、Ala-H67、Leu-H69以及Val-H71也从小鼠序列保留，因为所有这些另外的鼠残基都是隐蔽残基并且属于支撑CDR-H2的游标区，以及鼠残基H71可以出现在人构架中。在3A4重链人源化序列Hvh4(SEQ ID NO:197)的情况下，包括Hvh3人源化变体的所有6种回复突变外加另外的两个小鼠框架残基Lys-H38和Lys-H66，因为它们表示靠近CDR-H2的半隐蔽式残基。鼠和人源化链的所得氨基酸序列被列举在表1中。鼠和人源化轻链可变区的比对示出在图1a中并且鼠和人源化重链可变区的比对示出在图1b中。
图2a和2b对应地是鼠轻链可变区与100％人源化轻链可变区以及鼠重链可变区与100％人源化重链可变区的比对。这个图展示了保留的氨基酸以及已经被选择用于置换的那些氨基酸。
实例3.
3A4人源化变体抗体的组装和表达
这些研究的目的是确定抗凝聚素抗体的动力学参数。具体而言，是为了确定3A4抗KAAG1单克隆抗体的人源化是否影响它与人KAAG1结合的动力学参数。为此，使用来自伯乐(BioRad)的ProteOn XPR36仪器开发动力学分析方法。将人KAAG1固定在传感器芯片上。注射全长抗体或Fab片段并且允许其与固定的KAAG1相互作用。
编码3A4的嵌合(鼠)重链和轻链的质粒的构建
嵌合抗体的重链和轻链通过PCR，从原始的鼠免疫球蛋白链，使用以下寡核苷酸引物对扩增：重链，由SEQ ID NO:206编码的5'-寡核苷酸和由SEQ ID NO:207编码的3'-寡核苷酸；轻链，由SEQ ID NO:208编码的5'-寡核苷酸和由SEQ ID NO:209编码的3'-寡核苷酸。所得PCR产物通过Hind III消化并被克隆到预先用Hind III消化的pK-CR5(SEQ ID NO:210)中。
编码人源化重链3A4变体1、2、3和4的质粒的构建
编码抗体3A4的人源化重链区(Hh1、Hh2、Hh3和Hh4)的片段订购自GenScript(皮斯卡塔韦(Piscataway)，美国)。将包含kozak序列和终止密码子序列的DNA片段用HindIII消化，并且克隆到质粒pK-CR5的HindIII位点中，该质粒被预先用小牛肠磷酸酶(NEB)脱磷酸化以防止重新环化。图3a示出了质粒pK-CR5-3A4-HC-变体1的图谱。将人源化3A4的所有重链变体以一种相似的方式进行构建。
编码人源化轻链3A4变体1和2的质粒的构建
编码抗体3A4的人轻链区(Lh1和Lh2)的片段订购自GenScript。将包含kozak序列和终止密码子序列的DNA片段用BamHI消化，并且克隆到质粒pMPG-CR5(SEQ ID NO:211)的BamHI位点中，该质粒被预先用小牛肠磷酸酶(NEB)脱磷酸化以防止重新环化。图3b示出了质粒pMPG-CR5-3A4-LC-变体1的图谱。将人源化3A4的所有轻链变体以一种相似的方式进行构建。
瞬时转染研究
根据制造商的建议，使用小量制备试剂盒(安大略省米西索加的凯杰公司(QiagenInc,Mississauga,ON))，从大肠杆菌的少量培养物中分离出质粒DNA。简单来说，将含有100μg/ml氨苄西林的2ml LB培养基用在连接和转化之后采集单一菌落接种。将培养物在37℃在剧烈震荡(250RPM)下孵育过夜。然后使用由试剂盒提供的方案、缓冲液以及柱子将质粒从1.5ml的培养物分离。使用50μl无菌水洗脱DNA。根据制造商的建议，使用Plasmid PlusMaxi试剂盒(安大略省米西索加的凯杰公司)，从大肠杆菌的大量培养物中分离质粒DNA。将含有100μg/mL氨苄西林的200mL LB培养基用大肠杆菌的单一新鲜菌落接种，并且在37℃在剧烈震荡(250RPM)下孵育过夜。使细菌(针对重链为130mL培养物，而针对轻链为180mL培养物)通过在6000×g、在4℃离心持续15分钟而沉淀，并且使用由试剂盒提供的方案、缓冲液和柱子将质粒分离。将纯质粒再悬浮于无菌的50mM Tris(pH8)中，并通过在260nm下测量光学密度进行定量。在转染之前，将纯化的质粒通过用苯酚/氯仿萃取而灭菌，随后进行乙醇沉淀。将质粒再悬浮于无菌的50mM Tris(pH8)中，并通过在260nm下的光学密度来定量。
在转染之前，细胞(CHO-cTA)用PBS洗涤并以4.0×106个细胞/毫升的浓度再悬浮于不含硫酸葡聚糖的生长培养基(CD-CHO，茵维特罗根(Invitrogen))中，在悬浮液培养物中持续3小时。关于每种质粒组合，通过缓慢地添加5ml补充有10μg/ml每种质粒和50μg/ml聚乙烯亚胺(PEI Max；波利塞斯公司(Polysciences))的CDCHO培养基来转染45ml细胞。最终浓度是：每种质粒为1μg/ml，并且PEI为5μg/m1。2小时后，在30℃下转移细胞。接下来的几天，向细胞中添加50μg/mL硫酸葡聚糖和3.75ml每种补充剂(茵维特罗根的高效饲料A和B)，并使其在30℃下孵育13天。在第4天、第6天、第8天和第11天添加2.5ml饲料A和2.5ml饲料B。在第13天，上清液通过离心澄清并通过0.22μM过滤器过滤。
CHO细胞(CHOcTA)用编码通过CR5启动子调节的3A4抗体的人源化重链和轻链的不同变体的质粒转染。进行用轻链和重链的不同组合的转染。作为对照，还用编码嵌合/鼠抗体的质粒转染细胞。
抗体的纯化
通过在1500rpm下使用Amicon Ultra(Ultacell-50k)盒离心，将来自CHO细胞转染的15ml上清液浓缩。根据制造商的建议，使用Nab spin试剂盒蛋白A加(赛默科学(ThermoScientific))，将浓缩抗体(550μl)纯化。然后使用PBS以及浓缩Amicon Ultra(Ultracel-10K)盒在2500rpm 下将纯化抗体脱盐至250μl的最终体积。纯化抗体通过使用Nanodrop分光光度计读出OD280定量并保持冷冻在-20℃下。将纯化抗体的等分试样再悬浮到相同体积的Laemmli2×中并在95℃下加热5分钟，并且在冰上冷却。使用已知量的从人骨髓瘤血浆纯化的人IgG1κ(Athens Research)制作标准曲线。在聚丙烯酰胺诺维克斯(Novex)10％Tris-甘氨酸凝胶(安大略省伯林顿的茵维特罗根加拿大公司(Invitrogen Canada Inc.,Burlington,ON)上分离样品并将其转移到Hybond-N硝酸纤维膜(魁北克省Baied'Urfée的安玛西亚生物科学公司(Amersham Bioscience Corp.,Baied'Urfée,QC)上，在275mA下持续1小时。将膜在PBS中的0.15％吐温20、5％脱脂乳中封闭1小时，并且用结合至Cy5的山羊抗-人IgG(H+L)(杰克逊公司(Jackson)，目录号109-176-099)孵育1小时。通过用TyphoonTrio+扫描仪(通用医疗(GE Healthcare))扫描来对信号进行揭示和定量。如图4中所示，3A4人源化抗体变体的所有组合都在CHO细胞中表达。
实例4.
鼠和人源化3A4抗体的动力学分析
辅助材料
GLM传感器芯片、伯乐ProteOn氨基偶联试剂盒(EDC、sNHS和乙醇胺)以及10mM乙酸钠缓冲液是从伯乐实验室(安大略省米西索加)购买的。HEPES缓冲液、EDTA以及NaCl是从西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)(安大略省奥克维尔(Oakville,ON))购买的。10％的吐温20溶液是从Teknova(加利福尼亚州霍利斯特(Hollister,CA))购买的。山羊抗-人IgG Fc片段特异性抗体是从杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)购买的。凝胶过滤柱Superdex7510/300GL是从通用医疗购买的。
凝胶过滤
将浓度为3.114mg/ml并且体积为220μL的KAAG1蛋白质注射到Superdex G75柱上。在不含吐温20的HBST运行缓冲液(参见以下)中，以0.4ml/min进行分离。所收集的部分的体积是500μL。每个部分中KAAG1的浓度使用5500的延伸系数和8969的MW，通过OD280来测定。图5代表KAAG1的凝胶过滤的曲线。潜在聚集体的小峰是在11ml左右处洗脱出。将在13ml处洗脱的蛋白质用作SPR测定的分析物(部分15-19)。
SPR生物传感器测定
使用伯乐ProteOn XPR36仪器(安大略省米西索加的伯乐实验室有限公司)，用HBST运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、3.4mM EDTA以及0.05％吐温20，pH7.4)，在25℃的温度下进行所有表面等离子共振测定。使用GLM传感器芯片产生抗小鼠Fc捕获表面，通过在分析物(水平)方向上以30μL/min注射标准伯乐sNHS/EDC溶液的1:5稀释液持续300秒进行活化。在活化之后立即在分析物方向上以25μL/min的流速注射抗人IgG Fc特异性片段于10mM NaOAc(pH4.5)中的13μg/mL溶液直到约8000个共振单位(RU)被固定为止。将剩余的活性基团通过在分析物方向上以30μL/min注射1M乙醇胺(持续300秒)进行淬灭，并且这还确保产生用于空白参照的模拟活化的中间点(mock-activated interspot)。结合至KAAG1的3A4变体的筛选发生在两个步骤中：在配体方向(垂直)上将3A4变体从细胞上清液间接捕获到抗人IgG Fc片段特异性表面上，接着在分析物方向上注射KAAG1。首先，在配体方向上，将一种缓冲液以100μL/min注射持续30秒，用于稳定基线。对于每个3A4捕获物，将在细胞培养基中未纯化的3A4变体在HBST中稀释至4％，或使用在HBST中的约1.25μg/mL的纯化3A4。在单独的配体通道中，以25μL/min的流速同时注射四到五种3A4变体连同野生型3A4一起，持续240秒。这使得约400-700个RU的饱和3A4捕获到抗人IgG Fc片段特异性表面上。将第一配体通道留空以用作空白对照(如果需要的话)。这个3A4捕获步骤之后立即进行在分析物方向上的两次缓冲液注射，以稳定基线，并且然后注射凝胶过滤纯化的KAAG1。关于一个典型的筛选，在单独的分析物通道中，以50μL/min同时注射五种KAAG1浓度(8、2.66、0.89、0.29和0.098nM)和缓冲液对照，持续120秒，其中有600秒解离阶段，产生一组结合传感图，其中以缓冲液作为捕获3A4变体中的每一个的参照。抗人IgG Fc片段特异性-3A4复合物通过0.85％磷酸的18秒脉冲以100μL/min持续18秒再生，用以制备抗人IgG Fc片段特异性表面，用于下一个注射周期。使用缓冲液空白注射和中间点对传感图进行对准和双重参照，并且使用ProteOn Manager软件3.0版分析所得传感图。通过使用局部Rmax，将参照传感图与1:1朗缪尔(Langmuir)结合模型进行拟合来确定动力学和亲和力值，并且亲和常数(KD M)源于所得速率常数(kd s-1/ka M-1s-1)。
速率常数和亲和常数的确定
图6概述了KAAG1与纯化的鼠3A4、瞬时表达为嵌合变体和瞬时表达为人源化变体的鼠3A4的相互相用的缔合(ka，1/Ms)和解离(kd，1/s)速率常数以及亲和(KD，M)常数。这些常数以图形方式展现在图7a-c中。缔合速率常数对于纯亲本的、嵌合的以及人源化的3A4变体来说是非常相似的(图7a)。解离速率常数对于瞬时表达的嵌合体与纯亲本3A4相比是相似的，表明转染程序并未更改KAAG1与抗体的相互相用的参数(图7b)。然而，所有人源化变体似乎具有略微地更改的解离速率，即更快的解离速率(图7b)。这反映在亲和常数中(图7c)。总之，在人源化变体的结合亲和力(logKD)与在亲本抗体(LcHc)中进行的回复突变的数量之间存在线性相关性，其中结合亲和力随着突变数量增加而减少。然而，在没有保留小鼠残基的较差的变体(H1L1，0.47nM)与保留了10个小鼠残基的最佳变体(H4L2，0.1nM)之间在结合亲和力方面的差异仅差4倍。最后，发现所有变体针对KAAG1的结合亲和力是纳摩尔之下的，并且最佳变体(H4L2，0.1nM)展现出比鼠(LcHc，0.057nM)大约弱6倍的亲和力。总的来说，这些结果表明人源化是成功的，因为所有变体都展现出针对KAAG1的高亲和力。
实例5.
在ELISA中3A4人源化变体结合至KAAG1
还使用ELISA方法来比较人源化3A4变体的结合活性与鼠3A4抗体的结合活性。将重组人KAAG1隔夜(O/N)包被在96-孔板中，洗涤，并且在室温下与渐增量的鼠的或人源化的3A4变体孵育1小时。在另一轮洗涤步骤之后，向各孔中添加结合到HRP的抗人抗体并且在Abs450下用测热量的方式测量所结合的3A4抗体。如图8a中所示，当与具有0.016nM的高亲和力的鼠3A4(LcHc)相比时，人源化变体(Lh1Hh1、Lh1Hh2、Lh1Hh3和Lh1Hh4)展现出非常相似的结合至KAAG1。这个结果表明，当与人源化轻链的L1变体组装时，所有四种人源化重链变体相对原始的h3A4重链而言是相当的。图8a示出了当重链变体与3A4人源化轻链的Lh2变体组装时的结果。在这种情况下，变体的结合有差异。举例来说，Lh2hh4是与鼠3A4相比较具有最接近的曲线的变体。这与SPR数据一致，SPR数据显示重链的变体4具有针对KAAG1的最高亲和力。综上所述，这些结合结果显示，在这个测定中，所有人源化变体均与人KAAG1相互作用。虽然有细微差异，但ELISA的结合与SPR结果相符。
实例6.
在癌细胞表面上3A4人源化变体的结合
使用流式细胞术来评估人源化3A4变体与在癌细胞表面上表达的KAAG1相互作用的能力。为此，将SKOV-3卵巢癌细胞(先前我们已经通过流式细胞术显示这些卵巢癌细胞有效地被3A4结合)与八种人源化变体以及原始鼠抗体孵育。简单来说，用EDTA从板分离SKOV-3细胞并在冰上与或者3.0mg/ml、0.3mg/ml或者0.3mg/ml的抗体孵育1小时。在三次洗涤步骤之后，将细胞与第二抗体(结合至FITC的抗人IgG)在冰上孵育1小时。在流式细胞仪中测量细胞表面荧光并且值示出在图9的直方图中。如所描绘，所有变体可以检测在未透性化的表面上的KAAG1并且在3A4抗体的最高浓度(3mg/ml)下获得最强信号并且最强信号随着抗体浓度减小而减小。在不同变体中，具有最多鼠回复突变的变体(图9，参见Lh1Hh4和Lh2Hh4)以最高的活性与细胞表面上的KAAG1相互作用。事实上，与鼠3A4抗体(LcHc)相比较，Lh1Hh4和Lh2hh4表现为略微改进的与KAAG1的细胞表面结合。
实例7
这个实例描述了使用抗KAAG1抗体来检测KAAG1在TNBC中的表达。
作为确定TNBC样品中是否存在KAAG1抗原的一种手段，进行免疫组织化学。获得包含139个从患者活检产生的乳房肿瘤样品的组织微阵列。将石蜡包埋的上皮细胞乳房肿瘤样品放在载玻片上并且在50℃下固定15分钟。通过用二甲苯处理2次，接着在100％、80％和70％乙醇中连续洗涤5分钟脱水，进行去石蜡化。在PBS中洗涤载片3次，持续5分钟并用抗原修复溶液(1mM EDTA，pH8.0)处理以揭露抗原。通过在甲醇中与H2O2孵育载片去除内源性过氧化氢反应性物质，并通过载片与不含血清的封闭溶液(圣克鲁兹生物技术(Santa CruzBiotech))在室温下孵育5分钟进行封闭。在室温下添加初级抗体(抗KAAG13A4)，持续1小时。KAAG1反应性抗原通过相继与结合有生物素的小鼠抗κ、链霉亲和素-HRP三级抗体孵育来检测。通过用DAB-过氧化氢底物处理载片不到5分钟并接着用苏木素复染来显示阳性染色。发现KAAG1蛋白质在绝大部分乳房肿瘤样品中以非常高的水平表达。含有139个肿瘤的代表性阵列描绘在图10中。具体来说，为了KAAG1表达与3A4抗体，对15/20个确诊是TNBC的生检样品(图10，由星号标识的样品)进行强烈地染色。综上所述，这些免疫组织化学研究说明了用单克隆抗体检测乳癌、特别是TNBC中的KAAG1的效用。
实例8
这个实例描述了使用抗KAAG1抗体来检测KAAG1在TNBC细胞系中的表达。
来自编码KAAG1的cDNA的一级结构的生物信息学分析、生物化学研究以及上皮细胞中的蛋白质的免疫组织化学检测的组合结果表明KAAG1抗原位于细胞表面处。然而，需要更直接的证据来证明KAAG1的确是在TNBC细胞的表面上表达的。为了执行这个分析，从一个商业供应商(弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC(ATCC,Manassas,VA))获得乳癌细胞系并将其用于流式细胞术实验。先前使用KAAG1mRNA特异性引物的RT-PCR表达分析显示某些乳癌细胞系表达KAAG1mRNA(参见PCT/CA2007/001134)。因此，选择这些细胞系中的一些来确定在其表面的KAAG1抗原的存在。为了验证这个，使用3A4抗KAAG1抗体针对KAAG1的表面表达对三阴性MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468、BT-20以及BT-549细胞系进行测试。另外，不是三阴性的乳癌细胞系，即T47D和MCF-7也包括在该分析中。最后，包括一个展现不可检测的KAAG1抗原表达水平的对照细胞系293-6E作为流式细胞术实验(FCM)的阴性对照。出于FCM分析的目的，使用5mM EDTA收集细胞，用血细胞计数器计数，并且以2×106个细胞/毫升的一个细胞密度再悬浮于FCM缓冲液(含0.5％BSA、0.01％山羊血清的1×PBS)中。向100μl最终浓度是0.5μg/ml的细胞中添加嵌合的3A4抗KAAG1抗体或对照IgG并且在冰上孵育1小时。在冷FCM缓冲液中洗涤细胞以去除未结合的抗体，将这些细胞再悬浮于含有结合到FITC二级抗体(以1:200稀释)的抗人IgG的100μl FCM缓冲液中并在冰上孵育45分钟。在冷FCM缓冲液中的另一个洗涤步骤之后，将细胞再悬浮于300μl FCM缓冲液中，并用流式细胞仪分析。向每个样品中添加10μg/ml碘化丙啶以允许选通死细胞。来自三个独立实验的结果示出在图11中，其中平均荧光强度(MFI)倍数诱导代表当这些细胞与3A4抗体一起孵育时获得的信号高出阴性人IgG对照的信号的几何平均值，将阴性人IgG对照的信号任意地设定成1。抗体与对照293-6EHEK-293细胞的孵育产生了类似于当在不存在初级抗体的情况下孵育细胞时获得的信号的荧光信号。此外，用3A4获得的信号与对照IgG相比不存在显著差异。此外，当对照IgG是与乳癌细胞系孵育时，信号非常类似于用对照293-6E细胞获得的那些。相比之下，当3A4抗体是与所有乳癌细胞系孵育时，观察到了可检测的荧光信号。虽然观察到了可变量的荧光，但是最高量的KAAG1是在两个TNBC细胞系(参见图11，TNBC细胞系用星号表示)MDA-MB-231和BT-20细胞系的表面上检测到的。实际上，在这些条件下，所有五个TNBC细胞系针对KAAG1表达都是阳性的。T47D和MCF-7细胞也表达KAAG1。综上所述，这个流式细胞术分析显示，TNBC细胞系在其细胞表面上表达了高水平的KAAG1。
实例9
用于使用3A4抗KAAG1抗体作为抗体结合物的方法
如上所证明，使用流式细胞术在癌细胞表面上通过3A4检测KAAG1抗原。有一些不同的分子事件，这些事件可以在抗体结合至其在细胞表面上的靶标后发生。这些包括i)阻断对另一个细胞表面抗原/受体或配体的可及性，ii)形成相对稳定的抗体-抗原复合物，从而允许细胞通过ADCC或CDC而被靶向，iii)信号转导事件可以如由激动性抗体所例示而发生，iv)该复合物可以被内化，或v)该复合物可以从细胞表面脱落。为了解决这个问题，我们检查了3A4抗体-KAAG1复合物在细胞表面上的行为。使用卵巢癌细胞系SKOV3作为这个实验中的阳性对照，因为它被成功地用于先前的内化实验中(参见PCT/CA2009/001586)。涂布MDA-MB-231TNBC细胞，洗涤，并与0.5μg/ml如实例3中所述的嵌合的3A4抗体一起孵育。洗涤之后，添加完全培养基并将细胞放在37℃，持续长达60分钟。在指定的时间下移出细胞(参见图12)，快速地冷却，准备好用FITC结合的抗人IgG进行流式细胞术，并且结果表示为相比于在时间0分钟时的信号，细胞表面上所剩余的平均荧光强度的百分比(参见图12，表面信号(在0分钟时的剩余％)。如图12中所示，当3A4与MDA-MB-231细胞一起孵育时荧光信号快速地减小(图12，黑色条，在该图中表示MDA-231)并且似乎通过30-45分钟获得了最大信号丢失。该信号丢失与当3A4与SKOV3细胞一起孵育时观察到的信号丢失(图12，灰色条)相当。这个结果表明，3A4/KAAG1复合物从细胞中消失，这表明该复合物可能发生了内化。解释造成在细胞表面荧光中这个降低的机理的初级研究已经揭示该复合物似乎被内化了。人源化3A4抗体预期有类似结果。
在两个另外的TNBC细胞系，即MDA-MB-436(图13)和BT-20(图14)中观察到了类似的结果，证实了3A4/KAAG1复合物在多个TNBC细胞系表面上的内化。相比之下，不管在MDA-MB-436和T47D的表面上3A4结合的MFI水平有多类似(图11)，当3A4与T47D细胞系一起孵育时，在细胞表面处没有观察到信号丢失。这个发现表明以下可能性：3A4/KAAG1复合物可能在TNBC细胞(图15)相比于不是三阴性的细胞中发生了更高程度的内化。
通过在活细胞上进行免疫荧光法以判断这种内化是否可以用显微镜观察而进一步证实了这些发现。将MDA-MB-231细胞接种于盖玻片上，并且一旦细胞恰当地粘附之后，即添加10μg/ml含有3A4抗KAAG1嵌合抗体的新鲜培养基，并且在37℃下孵育4小时。将这些细胞在PBS中洗涤，然后固定在4％多聚甲醛(在PBS中)中，持续20分钟。洗涤之后，用含0.1％Triton X-100的PBS对细胞进行透性化，持续5分钟。用含1.5％奶粉的PBS进行封闭，持续1小时。通过在含1.5％奶的PBS中与抗LAMP1(圣克鲁兹(Santa Cruz)，sc-18821，以1:100稀释)一起孵育2小时来检测溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1，常(Chang)等人，2002)。在PBS中洗涤之后，将二级抗体一起添加在1.5％的奶中，并且孵育1小时。关于抗KAAG1嵌合抗体，二级抗体是一种若丹明红色-X结合的驴抗-人IgG(H+L)，以1:300稀释。关于抗LAMP1抗体，二级抗体是一种DyLight488结合的山羊抗-小鼠IgG(H+L)，以1:300稀释。两种二级抗体均是来自杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch)。将盖玻片在PBS中洗涤，并且封固在具有DAPI的ProLong Gold抗荧光衰减封片剂(antifade reagent)中。如图7中所见，在37℃下在MDA-MB-231癌细胞的存在下孵育4小时之后，能够在主要在核周区域附近的复合物中检测到3A4抗体(箭头，参见图16左图中的红色染色)，这是典型的基于内体-溶酶体的内化路径。当溶酶体标记LAMP1被观测到并发现也在这些区域中表达时，这个观察结果得到进一步验证(箭头，参见图16中图中的绿色染色)。重要地，这两个图像的合并产生了黄橙色结构的外观，表明3A4和抗LAMP1抗体存在于相同结构中(箭头，参见图16右图中的黄色染色)。3A4(与癌细胞表面上的KAAG1结合)与LAMP1(晚期内体/溶酶体的标记)的共定位显示抗体/抗原复合物被内化，并且它遵循适合于将要结合至3A4抗体上的有效载荷的释放的一种途径。在另一个细胞系BT-20中观察到了一致的结果(参见图17)。
综上所述，这些研究表明对KAAG1具有特异性的抗体(如3A4)可以具有作为一种抗体结合物，尤其是作为一种抗体-药物结合物(ADC)的用途。因此，KAAG1的TNBC特异性的高水平以及这个靶标在细胞中被内化的能力支持作为一种ADC的应用的发展。
实例10
为了证明抗KAAG1抗体可以有效地靶向并杀死缺乏ER蛋白质表达、PgR蛋白质表达和/或显示不存在HER2蛋白质过度表达的细胞，我们产生了两种抗体药物结合物(ADC)：3A4-ADC1和3A4-ADC2。
为了那种效果，我们使用嵌合的3A4抗体并通过一个高度稳定的肽连接子结合至细胞毒性药物，该肽连接子在内化之后被溶酶体酶选择性地裂解(3A4-ADC1)；或通过一个不可裂解的连接子与另一种抗有丝分裂药物结合(3A4-ADC2)。细胞毒性药物可以在细胞中被内化之后即变成活性的。
3A4ADC检测TNBC细胞表面上的KAAG1的能力是使用流式细胞术，使用在此所描述的方法来测定。简单来说，未结合的3A4、3A4- ADC1、3A4-ADC2以及对照IgG在MDA-231TNBC细胞(这些细胞是KAAG1阳性的)存在下孵育。结果表明，3A4与任一种药物的结合不会影响其结合至三阴性乳癌细胞，如MDA-231(数据未显示)。
已经证实了3A4ADC可以结合至在TNBC细胞表面上表达的KAAG1，在细胞增殖测定中评估其抵抗这些细胞的细胞毒性。如在上文的前述实例中所述培养MDA-231或TOV-112D细胞。在37℃下，在5％CO2中，将这些细胞以3000个细胞/孔接种于96孔板中每孔200μl培养基中，过夜。第二天，用含有抗体(浓度是在从0.122nM到500nM的范围内)的新鲜培养基替换培养基，并在37℃下孵育72小时。在一式三份的孔中进行所有条件。通过使用CellTiter96Aqueous One Solution(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格(Promega,Madison,WI))，遵循制造商的方案，进行细胞增殖分析，测定存活细胞的数量。在原始数据的收集之后，结果表示为与用PBS处理的孔中的细胞数量(把它设定成100％)相比的百分比存活率。结果表明，未结合的3A4不会影响MDA-231细胞在所有测试浓度下的增殖。相比之下，所测试的3A4ADC显示出显著的细胞毒性。
这些结果表明，3A4抗体结合物可以被用作用于患有三阴性乳癌或基底样乳癌的患者的一种可替代的治疗方法。关于基于人源化3A4抗体的结合物预期类似的结果。
本发明说明书涉及多个文献，这些文献的内容通过引用以其全文结合在此。
在说明书中引用的序列
SEQ ID NO.:1
GAGGGGCATCAATCACACCGAGAAGTCACAGCCCCTCAACCACTGAGGTGTGGGGGGGTAGGGATCTGCATTTCTTCATATCAACCCCACACTATAGGGCACCTAAATGGGTGGGCGGTGGGGGAGACCGACTCACTTGAGTTTCTTGAAGGCTTCCTGGCCTCCAGCCACGTAATTGCCCCCGCTCTGGATCTGGTCTAGCTTCCGGATTCGGTGGCCAGTCCGCGGGGTGTAGATGTTCCTGACGGCCCCAAAGGGTGCCTGAACGCCGCCGGTCACCTCCTTCAGGAAGACTTCGAAGCTGGACACCTTCTTCTCATGGATGACGACGCGGCGCCCCGCGTAGAAGGGGTCCCCGTTGCGGTACACAAGCACGCTCTTCACGACGGGCTGAGACAGGTGGCTGGACCTGGCGCTGCTGCCGCTCATCTTCCCCGCTGGCCGCCGCCTCAGCTCGCTGCTTCGCGTCGGGAGGCACCTCCGCTGTCCCAGCGGCCTCACCGCACCCAGGGCGCGGGATCGCCTCCTGAAACGAACGAGAAACTGACGAATCCACAGGTGAAAGAGAAGTAACGGCCGTGCGCCTAGGCGTCCACCCAGAGGAGACACTAGGAGCTTGCAGGACTCGGAGTAGACGCTCAAGTTTTTCACCGTGGCGTGCACAGCCAATCAGGACCCGCAGTGCGCGCACCACACCAGGTTCACCTGCTACGGGCAGAATCAAGGTGGACAGCTTCTGAGCAGGAGCCGGAAACGCGCGGGGCCTTCAAACAGGCACGCCTAGTGAGGGCAGGAGAGAGGAGGACGCACACACACACACACACACAAATATGGTGAAACCCAATTTCTTACATCATATCTGTGCTACCCTTTCCAAACAGCCTA
SEQ ID NO.:2
MDDDAAPRVEGVPVAVHKHALHDGLRQVAGPGAAAAHLPRWPPPQLAASRREAPPLSQRPHRTQGAGSPPETNEKLTNPQVKEK
SEQ ID NO.:3
GACATTGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAATAGGACAGAAGGTCACTATGAACTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGTAACTTTCAAAAGAACTTTTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCTAAACTTCTGATATACTTTGCATCCACTCGGGAATCTAGTATCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO.:4
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SEQ ID NO.:5
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTAGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACATATTTACTGACTATGAGATACACTGGGTGAAGCAGACTCCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGGGTTATTGATCCTGAAACTGGTAATACTGCCTTCAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACATATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGTTTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTATGGGTTATTCTGATTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCTCAACGAAGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAATTCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAA
SEQ ID NO.:6
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SEQ ID NO.:7
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACGCTCCCTGTCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGTAGATCGAGTCAGAGCCTTTTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTATTTGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCGGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO.:8
DVLMTQTPRSLSVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQPPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKAVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.:9
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGTTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACAACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTTACTATGGTACTACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCCGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCGGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGATGACTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCTCAACGAAGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAATTCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAA
SEQ ID NO.:10
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SEQ ID NO.:11
GACATCGTTATGTCTCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTCATAACTTTTTAAACTGGTTCCAGCAGAAACCAGGAAAATCTCCAAAGACCCTGATCTTTCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTTTGAAGATTTGGGAATTTATTCTTGTCTACAGTATGATGAGATTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAGAGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO.:12
DIVMSQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIHNFLNWFQQKPGKSPKTLIFRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEFEDLGIYSCLQYDEIPLTFGAGTKLELRAVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.:13
GAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTTCTCCATCACCAGTGGTTATGGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAACTACGATGGTCACAATGACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCAAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGCAGTTACGACGGCTTATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCTCAACGAAGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAATTCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAA
SEQ ID NO.:14
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SEQ ID NO.:15
GACATTGTGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAATAGGACAGAAGGTCACTATGAACTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGTAACTTTCAAAAGAACTTTTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCTAAACTTCTGATATACTTTGCATCCACTCGGGAATCTAGTATCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO.:16
DIVMTQSPSSLAVSIGQKVTMNCKSSQSLLNSNFQKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYFASTRESSIPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.:17
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGTAGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGACGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGCTACATATTTACTGACTATGAGATACACTGGGTGAAGCAGACTCCTGTGCATGGCCTGGAATGGATTGGGGTTATTGATCCTGAAACTGGTAATACTGCCTTCAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACATATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAACTCAGCAGTTTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTATGGGTTATTCTGATTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO.:18
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SEQ ID NO.:19
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACGCTCCCTGTCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGTAGATCGAGTCAGAGCCTTTTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTATTTGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCGGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO.:20
DVLMTQTPRSLSVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQPPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISGVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.:21
GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGTTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTGACAACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTTACTATGGTACTACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCCGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCGGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGATGACTGGTTTGATTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO.:22
EIQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDNYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPYYGTTTYNQKFKGKATLTVDKSSRTAYMELRGLTSEDSAVYYCARDDWFDYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.:23
GACATCGTTATGTCTCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTCATAACTTTTTAAACTGGTTCCAGCAGAAACCAGGAAAATCTCCAAAGACCCTGATCTTTCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTTTGAAGATTTGGGAATTTATTCTTGTCTACAGTATGATGAGATTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAGA
SEQ ID NO.:24
DIVMSQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIHNFLNWFQQKPGKSPKTLIFRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEFEDLGIYSCLQYDEIPLTFGAGTKLELR
SEQ ID NO.:25
GAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTTCTCCATCACCAGTGGTTATGGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAACTACGATGGTCACAATGACTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCAAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGCAGTTACGACGGCTTATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
SEQ ID NO.:26
EVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSGYGWHWIRQFPGNKLEWMGYINYDGHNDYNPSLKSRISITQDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCASSYDGLFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.:27
KSSQSLLNSNFQKNFLA
SEQ ID NO.:28
FASTRES
SEQ ID NO.:29
QQHYSTPLT
SEQ ID NO.:30
GYIFTDYEIH
SEQ ID NO.:31
VIDPETGNTA
SEQ ID NO.:32
MGYSDY
SEQ ID NO.:33
RSSQSLLHSNGNTYLE
SEQ ID NO.:34
KVSNRFS
SEQ ID NO.:35
FQGSHVPLT
SEQ ID NO.:36
GYTFTDNYMN
SEQ ID NO.:37
DINPYYGTTT
SEQ ID NO.:38
ARDDWFDY
SEQ ID NO.:39
KASQDIHNFLN
SEQ ID NO.:40
RANRLVD
SEQ ID NO.:41
LQYDEIPLT
SEQ ID NO.:42
GFSITSGYGWH
SEQ ID NO.:43
YINYDGHND
SEQ ID NO.:44
ASSYDGLFAY
SEQ ID NO.:45-3A4重链可变区核苷酸序列
CAGATCCAGTTGGTGCAATCTGGACCTGAGATGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACGACTACATGAGCTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTTACAACGGTGATACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCATATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCGGAAGACTCAGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGACCCGGGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO.:46-3A4重链可变区多肽序列
QIQLVQSGPEMVKPGASVKMSCKASGYTFTDDYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKAILTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDPGAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.:47-3A4轻链可变区核苷酸序列
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGGCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTCTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTTCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCCACACAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAGGCTGGAGCTGAAA
SEQ ID NO.：48-3A4轻链可变区多肽序列
DVVMTQTPLSLAVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTRLELK
SEQ ID NO.：49-3A4重链CDR1多肽序列
GYTFTDDYMS
SEQ ID NO.：50-3A4重链CDR2多肽序列
DINPYNGDTNYNQKFKG
SEQ ID NO.：51-3A4重链CDR3多肽序列
DPGAMDY
SEQ ID NO.：52-3A4轻链CDR1多肽序列
RSSQSLLHSNGNTYLE
SEQ ID NO.：53-3A4轻链CDR2多肽序列
TVSNRFS
SEQ ID NO.：54-3A4轻链CDR3多肽序列
FQGSHVPLT
SEQ ID NO.：55
GTAAGCAGCGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC
SEQ ID NO.：56
GTAAGCGCTAGCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC
SEQ ID NO.：57
GCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO.：58
AVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.：59
CTTGAGCCGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTAAACGGATCTCTAGCGAATTCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTTGAGACGGAGCTTACAGCGCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGT ACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGGTACCGCGGCCGCTTCGAATGAGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGCCCCGCCGCCGGACGAACTAAACCTGACTACGGCATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCACGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGT GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCTAGAGGTCGACCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGCAGATCCGGGCAACGTTGTTGCATTGCTGCAGGCGCAGAACTGGTAGGTATGGCAGATCTATACATTGAATCAATATTGGCAATTAGCCATATTAGTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGT
SEQ DI NO.：60
ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCC
SEQ ID NO.：61
ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGATGTTTTGATGACCCAAACTCC
SEQ ID NO.：62
ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGACATCGTTATGTCTCAGTCTCC
SEQ ID NO.：63
GGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGC
SEQ ID NO.：64
GTAAGCGCTAGCGCCTCAACGAAGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCC
SEQ ID NO.：65
GTAAGCGAATTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTG
SEQ ID NO.：66
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCAGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGT
SEQ ID NO.：67
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
SEQ ID NO.：68
CTTGAGCCGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGCGGAGACGGAGCTTACGGGCCCATCTGTCTTTCCCCTGGCCCCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGAATTCACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGCCCCGCCGCCGGACGAACTAAACCTGACTACGGCATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCACGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGT
SEQ ID NO.：69
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGT
SEQ ID NO.：70
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCAGG
SEQ ID NO.：71
GGGGCCAGGGGAAAGACAGATGGGCCCTTCGTTGAGGC
SEQ ID NO.：89：CDRL1的示例性实施例
K-S-S-Q-S-L-L-N/H-S/T-S/N/D-N/G-Q/N/K-K/L-N-Y-L-A
SEQ ID NO.：90：CDRL1的示例性实施例
K-A-S-Q-D-I-H-N/T-Y/F-L-N
SEQ ID NO.：91：CDRL2的示例性实施例
F-A-S-T-R-E-S
SEQ ID NO.：92：CDRL2的示例性实施例
L-V-S-K-L-D-S
SEQ ID NO.：93：CDRL2的示例性实施例
R-A-N-R-L-V-D
SEQ ID NO.：94：CDRL3的示例性实施例
Q-Q-H-Y-S-T-P-L-T
SEQ ID NO.：95：CDRL3的示例性实施例
W/L-Q-Y/G-D/T-A/E/H-F-P-R-T
SEQ ID NO.：96：CDRH11的示例性实施例
G-Y-T/I-F-T-D/E-Y-E/N-M/I/V-H
SEQ ID NO.：97：CDRH1的示例性实施例
G-F-T/S-I-T-S-G-Y-G-W-H
SEQ ID NO.：98：CDRH2的示例性实施例
V/N/G-I/L-D-P-E/A/G-T/Y-G-X-T-A
SEQ ID NO.：99：CDRH2的示例性实施例
Y-I-N/S-F/Y-N/D-G
SEQ ID NO.：100：CDRH3的示例性实施例
M-G-Y-S/A-D-Y
SEQ ID NO.：101：CDRH3的示例性实施例
A-S-S-Y-D-G-F-L-A-Y
SEQ ID NO.：102：CDRH33的示例性实施例
A-R/W-W/F-G-L-R-Q/N
SEQ ID NO.103-3A2轻链可变区
DAVMTQIPLTLSVTIGQPASLSCKSSQSLLHSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYYCWQGTHFPRTFAGGTNLEIK
SEQ ID NO.104-3F6轻链可变区
SIVMTQTPLTLSVTIGQPASITCKSSQSLLYSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLISLVSKLDSGVPDGFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.105-3E8轻链可变区
DAVMTQIPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.106-3E10轻链可变区
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO.107-3A9轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSLGQKVTMSCKSSQSLLNSNNQLNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRKSGVPDRFIGSGSGTDFTLTITSVQAEDLADYFCQQHFNTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.108-3B1轻链可变区
DIVMTQSPSSLAISVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVFFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.109-3G5轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVFFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTITSVQAEDLADYFCQQHYSIPLTFGSGTKLELK
SEQ ID NO.110-3B2轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.111-3B8轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.112-3G8轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.113-3F7轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.114-3E9轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTEFTLTITSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.115-3C3轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFGSTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISGVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.116-3E12轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLNRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.117-4A2轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMNCKSSQSLLNNSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLLYFASTRESGVPDRFIGSGSGTYFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLDLK
SEQ ID NO.118-3F10轻链可变区
DIVMTQSPSSLTMSVGQKVTMSCKSSQSLLNTSNQLNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTTESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.119-3F4轻链可变区
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNTSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRASGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.120-3B11轻链可变区
DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.121-3G12轻链可变区
DIVMTQSPKFMSTSVGDRVSITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPELLIYWTSTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPLTFGAGTKLELR
SEQ ID NO.122-3D1轻链可变区
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIHTYLNWFQQKPGKSPETLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.123-3C2轻链可变区
DIQMTQSPSSMYASLGERVTLTCKASQDIHNYLNWFQQKPGKSPKTLIHRANRLVAGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDLGIYYCLQYDAFPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.124-3E6轻链可变区
DIQMTQSPSSMYASLGERVTLTCKASQDIHNYLNWFQQKPGKSPKTLIHRANRLVAGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDLGIYYCLQYDAFPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.125-3H3轻链可变区
DIVMSQSPSSMYASLGERVTITCKASQDIHRFLNWFQQKPGKSPKTLIFHANRLVDGVPSRFSGSGSGLDYSLTISSLEYEDMGIYFCLQYDAFPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO.126-3A2重链可变区
HEIQLQQSGPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTDYNMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTEYNEKFKGRATLTSDKSSSTAYMDLSSLTSDDSAVYFCAWFGLRQWGQGTLVTVST
SEQ ID NO.127-3F6重链可变区
HEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYIFTEYNIHWVKQKPGQGPEWIGNINPYNDVTEYNEKFKGKATLTSDKASSTAYMDLSSLTSEDSAVYYCARWGLRNWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.128-3E8重链可变区
HEVQLQQSVPELVKPGASVKMSCKTSGYTFTEYNMHWVKQKPGQGPEWIGNINPYNNVTEYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYLDLSSLTSEDSAVYYCARWGLRNWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.129-3A9重链可变区
HQVQVQQPGAELVRPGASVTLSCKASGYIFTDYEVHWVRQRPVHGLEWIGVIDPETGDTAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTAEDSAVYYCIGYADYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.130-3B1重链可变区
HQVQLQQPGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGGTAYNQKFKGKATLTTDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCMGYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.131-3B2重链可变区
HEVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGATAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCMGYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.132-3F4重链可变区
HEVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGSTAYNQKFKGKATLTADKASSTAYMELSSLTSEDSAVYYCMGYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.133-3E9重链可变区
HEVQLQQSGAELVRPGASATLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGSTAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCMGYADYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.134-3B8重链可变区
HEVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGDTAYNQNFTGKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCMGYADYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.1 35-3G8重链可变区
HQVQLKQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEVHWVKQTPVHGLEWIGVIDPATGDTAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCMGYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.136-3F7重链可变区
HQAYLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGDTAYNQKFKDKATLTADKASSTAYMELSSLTSEDSAVYYCMGYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.137-3E12重链可变区
HQVQLQQSEAELVKPGASVKLSCKASGYTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGDTAYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSRLTSEDSAVYYCMGHSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.138-3G12重链可变区
HEVQLQQSVAELVRPGASVTVSCKASGYIFTDYEIHWVKQTPAHGLEWIGVIDPETGNTAFNQKFKGKATLTADISSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCMGYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.139-3F10重链可变区
HEVQLQQSVAELVRPGAPVTLSCKASGYTFTDYEVHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGATAYNQKFKGKATLTADKSSSAAYMELSRLTSEDSAVYYCMSYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.140-3C3重链可变区
HEVQLQQSVAEVVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGVIDPETGVTAYNQRFRDKATLTTDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYFCMGYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.141-3G5重链可变区
HQVQLQQPGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGVLDPGTGRTAYNQKFKDKATLSADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCMSYSDYWGPGTTLTVSS
SEQ ID NO.142-3B11重链可变区
HEVQLQQSVAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVRGLEWIGVIDPATGDTAYNQKFKGKATLTADKSSSAAFMELSSLTSEDSAVYYCMGYSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.143-3E6重链可变区
HQVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFSDYEMHWVKQTPVHGLEWIGGIDPETGDTVYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCISYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.144-4A2重链可变区
HQVKLQQSGTELVRPGASVTLSCKASGYKFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGGIDPETGGTAYNQKFKGKAILTADKSSTTAYMELRSLTSEDSAVYYCISYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.145-3E10重链可变区
HEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGDTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNYGGITYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMELRGLTSEDSAVYYCQAYYRNSDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO.146-3D1重链可变区
HEVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSGYGWHWIRQFPGDKLEWMGYISFNGDYNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLSSVTTEDTATYYCASSYDGLFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO.147-3C2重链可变区
HDVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGFSITSGYGWHWIRQFPGNKLEWMGYISFNGDSNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTSEDTATYYCASSYDGLFAYWGQGPLVTVSA
A
SEQ ID NO.：148
KSSQSLLHSDGKTYLN
SEQ ID NO.：149
LVSKLDS
SEQ ID NO.：150
WQGTHFPRT
SEQ ID NO.：151
GYTFTD YNMH
SEQ ID NO.：152
YINPYNDVTE
SEQ ID NO.：153
AWFGL RQ
SEQ ID NO.：154
RSSKSLLHSNGN TYLY
SEQ ID NO.：155
RMSNLAS
SEQ ID NO.：156
MQHLEYPYT
SEQ ID NO.：157
GDTFTD YYMN
SEQ ID NO.：158
DINPNYGGIT
SEQ ID NO.：159
QAYYRNS DY
SEQ ID NO.：160
KASQDVGTAVA
SEQ ID NO.：161
WTSTRHT
SEQ ID NO.：162
QQHYSIPLT
SEQ ID NO.：163
GYIFTDYEIH
SEQ ID NO.：164
VIDPETGNTA
SEQ ID NO.：165
MGYSDY
SEQ ID NO.：166
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSNFQKNFLAWYQQKPGQPPKLLIYFASTRESSVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.：167
MDWTWRILFLVAAATGTHAEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTDYEIHWVRQAPGQGLEWMGVIDPETGNTAFNQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCMGYSDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N：168
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSNFQKNFLAWYQQKPGQPPKLLIYFASTRESSVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.：169
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTDYEIHWVRQAPGQGLEWMGVIDPETGNTAFNQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLTSEDTAVYYCMGYSDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.：170
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIHNFLNWFQQKPGKAPKTLIFRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYSCLQYDEIPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.：171
MDWTWRILFLVAAATGTHAEVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSITSGYGWHWIRQHPGKGLEWIGYINYDGHNDYNPSLKSRVTISQDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASSYDGLFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID No.：172
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDIHNFLNWFQQKPGKAPKTLIFRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYSCLQYDEIPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.：173
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSITSGYGWHWIRQHPGKGLEWIGYINYDGHNDYNPSLKSRVTISQDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASSYDGLFAYWGQGTLVTVS
SEQ ID NO.：186(3A4变体轻链可变区共有序列1)
DXVMTQTPLSLXVXXGXXASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXLLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXGVYYCFQGSHVPLTFGXGTXLEXK
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.：48中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。氨基酸置换可以是例如保守性的。
SEQ ID NO.：187(3A4变体轻链可变区共有序列2)
DXa1VMTQTPLSLXa2VXa3Xa4GXa5Xa6ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXa7LLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXa8GVYYCFQGSHVPLTFGXa9GTXa10LEXa11K
其中Xa1可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xa2可以是A或P；
其中Xa3可以是中性亲水性氨基酸；
其中Xa4可以是L或P；
其中Xa5可以是一种酸性氨基酸；
其中Xa6可以是Q或P；
其中Xa7可以是一种碱性氨基酸；
其中Xa8可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xa9可以是A或Q；
其中Xa10可以是一种碱性氨基酸；或
其中Xa11可以是一种疏水性氨基酸，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.：48中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。
SEQ ID NO.：188(3A4变体轻链可变区共有序列3)
DXA1VMTQTPLSLXA2VXA3XA4GXA5XA66ASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPXA7LLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDXA8GVYYCFQGSHVPLTFGXA9GTXA10LEXA11K
其中XA1可以是V或I
其中XA2可以是A或P
其中XA3可以是S或T
其中XA4可以是L或P
其中XA5可以是D或E
其中XA6可以是Q或P
其中XA7可以是K或Q
其中XA8可以是L或V
其中XA9可以是A或Q
其中XA10可以是R或K或
其中XA11可以是L或I，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.：48中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。
SEQ ID NO.：189(3A4变体1轻链可变区：Lvh1)
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.：190(3A4变体2轻链可变区：Lvh2)
DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEVVYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.：191(3A4变体重链可变区共有序列1)
QXQLVQSGXEXXKPGASVKXSCKASGYTFTDDYMSWVXQXXGXXLEWXGDINPYNGDTNYNQKFKGXXXXTXDXSXSTAYMXLXSLXSEDXAVYYCARDPGAMDYWGQGTXVTVSS
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.：46中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。氨基酸置换可以是例如保守性的。
SEQ ID NO.：192(3A4变体重链可变区共有序列2)
QXb1QLVQSGXb2EXb3Xb4KPGASVKXb5SCKASGYTFTDDYMSWVXb6QXb7Xb8GXb9Xb10LEWXb11GDINPYNGDTNYNQKFKGXb12XD13Xb14XD15TXb16DXb17SXD18STAYMXb19LXb20SLXb21SEDXD22AVYYCARDPGAMDYWGQGTXb23VTVSS
其中Xb1可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xb2可以是P或A；
其中Xb3可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xb4可以是V或K；
其中Xb5可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xb6可以是一种碱性氨基酸；
其中Xb7可以是S或A；
其中Xb8可以是H或P；
其中Xb9可以是一种碱性氨基酸；
其中Xb10可以是S或G；
其中Xb11可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xb12可以是一种碱性氨基酸；
其中Xb13可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xb14可以是I或T；
其中Xb15可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xb16可以是一种疏水性氨基酸；
其中Xb17可以是K或T；
其中Xb18可以是一种中性亲水性氨基酸；
其中Xb19可以是Q或E；
其中Xb20可以是N或S；
其中Xb21可以是T或R；
其中Xb22可以是一种中性亲水性氨基酸；或
其中Xb23可以是S或L，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.：46中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。
SEQ ID NO.：193(3A4变体重链可变区共有序列3)
QXB1QLVQSGXB2EXB3XB4KPGASVKXB5SCKASGYTFTDDYMSWVXB6QXB7XB8GXB9XB10LEWXB11GDINPYNGDTNYNQKFKGXB12XB13XB14XB15TXB16DXB17SXB18STAYMXB19LXB20SLXB21SEDXB22AVYYCARDPGAMDYWGQGTXB23VTVSS
其中XB1可以是I或V；
其中XB2可以是P或A；
其中XB3可以是M或V；
其中XB4可以是V或K；
其中XB5可以是M或V；
其中XB6可以是K或R；
其中XB7可以是S或A；
其中XB8可以是H或P；
其中XB9可以是K或Q；
其中XB10可以是S或G；
其中XB11可以是I或M；
其中XB12可以是K或R；
其中XB13可以是A或V；
其中XB14可以是I或T；
其中XB15可以是L或I；
其中XB16可以是V或A；
其中XB17可以是K或T；
其中XB18可以是S或T；
其中XB19可以是Q或E；
其中XB20可以是N或S；
其中XB21可以是T或R；
其中XB22可以是S或T；或
其中XB23可以是S或L，
其中由X标识的氨基酸中的至少一个是与SEQ ID NO.：46中所阐明的多肽中的一种相对应的氨基酸相比的一个氨基酸置换(保守性或非保守性)。
SEQ ID NO.：194(3A4变体1重链可变区：Hvh1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.：195(3A4变体2重链可变区：Hvh2)
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.：196(3A4变体3重链可变区：Hvh3)
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.：197(3A4变体4重链可变区：Hvh4)
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：1983A4鼠轻(κ)链
DWMTQTPLSLAVSLGDQASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIHTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTRLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：1993A4人源化轻(κ)链变体1；Lh1
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：2003A4人源化轻(κ)链变体2；Lh2
DWMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYTVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：2013A4鼠重(Igg1)链
QIQLVQSGPEMVKPGASVKMSCKASGYTFTDDYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKAILTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARDPGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:2023A4人源化重(Igg1)链变体1；Hh1
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:2033A4人源化重(Igg1)链变体2；Hh2
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWMGDINPYNGDTNYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ IDNO:2043A4人源化重(Igg1)链变体3；Hh3
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVRQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ IDNO:2053A4人源化重(Igg1)链变体4：Hh4
QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDDYMSWVKQAPGQGLEWIGDINPYNGDTNYNQKFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:206
ATACCCAAGCTTGCCACCATGGAGACAGACACAC
SEQ ID NO:207
ATACCCAAGCTTCATTTCCCGGGAGACAGGGAG
SEQ ID NO:208
ATACCCAAGCTTGGGCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGG
SEQ ID NO:209
ATACCCAAGCTTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAG
SEQ ID NO:210pK-CR5
CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATC GGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACC GAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCACATCGGCGCGCCAAATGATTTGCCCTCCCATATGTCCTTC CGAGTGAGAGACACAAAAAATTCCAACACACTATTGCAATGAAAATAAATTTCCTTTATTAGCCAGAGGTCGAGATTTAAATAAGCTTGCTAGCAGATCTTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTCATTGTCACTCAAGTGTATGGCCAGATCGGGCCAGGTGAATATCAAATCCTCCTCGTTTTTGGAAACTGACAATCTTAGCGCAGAAGTAATGCCCGCTTTTGAGAGGGAGTACTCACCCCAACAGCTGGATCTCAAGCCTGCCACACCTCACCTCGACCATCCGCCGTCTCAAGACCGCCTACTTTAATTACATCATCAGCAGCACCTCCGCCAGAAACAACCCCGACCGCCACCCGCTGCCGCCCGCCACGGTGCTCAGCCTACCTTGCGACTGTGACTGGTTAGACGCCTTTCTCGAGAGGTTTTCCGATCCGGTCGATGCGGACTCGCTCAGGTCCCTCGGTGGCGGAGTACCGTTCGGAGGCCGACGGGTTTCCGATCCAAGAGTACTGGAAAGACCGCGAAGAGTTTGTCCTCAACCGCGAGCCCAACAGCTGGCCCTCGCAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGACCGCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCTACCTCGACCCGGGTACCAATCTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTAAGGTTGTCGAGTGAAGACGAAAGGGTTCATTAAGGCGCGCCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGC TCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCCCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC
SEQ ID NO:211pMPG-CR5
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GGAGTACCGTTCGGAGGCCGACGGGTTTCCGATCCAAGAGTACTGGAAAGACCGCGAAGAGTTTGTCCTCAACCGCGAGCCCAACAGCTGGCCCTCGCAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGACCGCGGAGGCTGGATCGGTCCCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAACAGCGTGGATGGCGTCTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCTACCTCGACCCGGGTACCAATCTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTATAATACAAACAGACCAGATTGTCTGTTTGTTAAGGTTGTCGAGTGAAGACGAAAGGGTTAATTAAGGCGCGCCGTCGACTAGCTTGGCACGCCAGAAATCCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCGGTGTTCGTGTCGCGCCAGTACATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCAGTCGTGGACCAGACCCCACGCAACGCCCAAAATAATAACCCCCACGAACCATAAACCATTCCCCATGGGGGACCCCGTCCCTAACCCACGGGGCCAGTGGCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGGTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGCCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCATTGCCCGGGATCTGCGGCACGCTGTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGCTGCAGGGTCGCTCGGTGTTCGAGGCCACACGCGTCACCTTAATATGCGAAGTGGACCTGGGACCGCGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAA 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CTCTTCTCTTGTAATATCAAGAATACATTTCCCCATGCATATATTATATTTCATCCTTGAAAAAGTATACATACTTATCTCAGAATCCAGCCTTTCCTTCCATTCAACAATTCTAGAAGTTAAAACTGGGGTAGATGCTATTACAGAGGTAGAATGCTTCCTAAACCCAGAAATGGGGGATCTGC
SEQ ID NO.：212-3A4人源化重链CDR2多肽序列
DINPYNGDTN
SEQ ID NO.：213-OGS18500
ATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGATGTTGTGATGACCCAAACTCC
SEQ ID NO：.214-OGS2084
GGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTCCG
SEQ IDNO.：215-OGS1879
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCCAGATCCAGTTGGTGCAATCTGG
EQ ID NO.：216-OGS1810
GGGGCCAGGGGAAAGACAGATGGGCCCTTCGTTGAGGC
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Claims (5)

1.能够特异性结合至肾相关抗原1即KAAG1的抗体或其抗原结合片段在制造药物中的用途，所述药物用于治疗三阴性乳癌，其中该抗体或其抗原结合片段选自：
a.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:48中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:46中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
b.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:189中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:194中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
c.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:189中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:195中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
d.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:189中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:196中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
e.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:189中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:197中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
f.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:190中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:194中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
g.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:190中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:195中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
h.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:190中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:196中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
i.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:190中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO.:197中所示的氨基酸序列组成的重链可变区；
j.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:199中所示的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO.:202中所示的氨基酸序列组成的重链；
k.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:199中所示的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO.:203中所示的氨基酸序列组成的重链；
l.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:199中所示的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO.:204中所示的氨基酸序列组成的重链；
m.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:199中所示的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO.:205中所示的氨基酸序列组成的重链；
n.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:200中所示的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO.:202中所示的氨基酸序列组成的重链；
o.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:200中所示的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO.:203中所示的氨基酸序列组成的重链；
p.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:200中所示的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO.:204中所示的氨基酸序列组成的重链；和
q.抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.:200中所示的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO.:205中所示的氨基酸序列组成的重链。
2.如权利要求1所述的用途，其中该抗体或其抗原结合片段与治疗性部分相缀合。
3.如权利要求2所述的用途，其中该治疗性部分包含细胞毒性剂。
4.如权利要求1所述的用途，其中该抗体或其抗原结合片段与抗有丝分裂药物相缀合。
5.如权利要求1所述的用途，其中该抗体或其抗原结合片段与抗癌剂、化学治疗剂或细胞毒性剂组合使用。
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