JP2018203755A - 乳癌を治療する方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】１つには、必要とする個体の癌もしくは癌細胞を（ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで）治療または検出する方法を提供すること。【解決手段】ＥＲタンパク質発現、ＰｇＲタンパク質発現が欠乏し、および／またはＨＥＲ２タンパク質過剰発現の非存在を示す乳癌細胞（即ち、トリプルネガティブ癌細胞、基底細胞型）は、抗ＫＡＡＧ１抗体で効率的にターゲティングすることができ、治療部分を送達すると殺傷することができる。従って、ＫＡＡＧ１に特異的に結合する抗体および抗原結合性フラグメントを、上記のマーカの少なくとも１つについて陰性の乳癌の検出および治療的処置のために用いることができる。トリプルネガティブ癌細胞および／または基底細胞型乳癌の治療における抗体複合体の使用も本明細書に開示される。【選択図】図１１

Description

全世界で、毎年百万を超える女性が乳癌と診断されている。乳癌は、多数のタイプからなる非常に異種の疾患であり、これらのタイプは、組織学的分類システムを用いて識別される。大きなサブタイプおよび症例の大部分は、ルミナルＡまたはルミナルＢとして組織学的に同定され、これらは、それぞれ、組織学的に低いグレードまたはより高いグレードで、エストロゲン受容体（ＥＲ）を呈示することを大きな特徴とする（Ｓａｎｔａｎａ−Ｄａｖｉｌａ ａｎｄ Ｐｅｒｅｚ，２０１０）。免疫組織学的方法を用いて、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）の発現を測定するが、これにより、ＥＲ陰性状態と組み合わせて、ホルモン応答性の腫瘍の分類が可能になる。さらに、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）の過剰発現または増幅を免疫組織学または蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のいずれかを用いてモニターすることができる。一般に、乳房腫瘍におけるこれら３つのマーカの発現は、これらのタンパク質を標的とする患者のために利用可能な治療選択が複数存在するため（ｄｅ Ｒｕｉｊｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、より良好な臨床転帰を伴うが、こうした治療選択には、タモキシフェン、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（商標）（アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（商標）（エキセメスタン）、Ｆｅｍａｒａ（商標）（レトロゾール）、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（商標）（フルベストラント）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（トラスツズマブ）またはＴｙｋｅｒｂ（商標）（ラパチニブ）が含まれる。
乳癌の別の組織学的サブタイプは、基底細胞型乳癌からなり、これは、中でも、高い組織学的グレード、分裂指数の増加および高いＫｉ６７発現に関連する（Ｓａｎｔａｎａ−ＤａｖｉｌａおよびＰｅｒｅｚ，２０１０）。基底細胞型乳癌のほとんどは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者からなり、これは、診断される全乳癌患者の１５〜２０％を占める（Ｉｓｍａｉｌ−ＫｈａｎおよびＢｕｉ，２０１０）。ＴＮＢＣは、ＥＲ、ＰｇＲのタンパク質発現の欠失およびＨＥＲ２タンパク質過剰発現の非存在により定義される。全てのＴＮＢＣが基底細胞型乳癌であるわけではなく、また、全ての基底細胞型乳癌がＴＮＢＣであるわけではないことから、基底細胞型乳癌とＴＮＢＣとの間の関係は容易に明瞭化されないが、これらのカテゴリーの患者の約７５％が両方の特徴を有している。ＴＮＢＣは、５年の低い生存率と高い再発率という悪い予後を伴う。
ＴＮＢＣ患者は、他の乳癌サブタイプに比べ生涯の早期に発症し、閉経前の段階で診断されることが多い（Ｃａｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００６）。トリプルネガティブ乳癌は、治療後に再発の増加傾向を示し、基底細胞型乳癌サブタイプのそれと同様に、他の乳癌サブタイプより攻撃的であると考えられる（Ｎｏｆｅｃｈ−Ｍｏｚｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。その結果、ＴＮＢＣ患者の概して５年の生存は、他の乳癌サブタイプと診断されたものより有意に短い。現在のところ、容認されるＴＮＢＣの明確な分子マーカはない。それにもかかわらず、これらの腫瘍は、化学療法に応答する（Ｋｒｉｅｇｅ ｅｔ ａｌ，，２００９）。患者は、５−フルオロウラシル、ドキソルビシンおよびシクロホスファミドなどの薬剤を投与するアジュバント療法ならびにネオアジュバント療法における細胞傷害性剤に対して、より良好な応答を示している（Ｒｏｕｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．２００５）。ある程度の効果を示した他の薬剤として、シスプラチンなどの白金ベースの化合物、およびタキサンなどの抗チューブリン化合物がある（Ｓａｎｔａｎａ−ＤａｖｉｌａおよびＰｅｒｅｚ，２０１０）。
前述のように、ＴＮＢＣの明確な標的はないが、このことが、ポリ［ＡＤＰ−リボース］ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）の阻害などの標的因子の試みを妨げるわけではなかった。ＰＡＲＰ１は、破損したＤＮＡ鎖と結合して、一本鎖破損を修復するのに必要な酵素のリクルートを媒介することによって、ＤＮＡ一本鎖破損の修復に参加する酵素である（ｄｅ Ｒｕｉｊｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。従って、この戦略は、癌細胞がより多くのＤＮＡ一本鎖破壊を蓄積し、これにより最終的に遺伝的不安定性、有糸分裂停止および細胞死を引き起こすようにする手段として、ＰＡＲＰ１活性を阻害することを目的としていた。有望な臨床結果が患者において達成され、これらの患者は、ＢＲＣＡ１および／またはＢＲＣＡ２に突然変異を示したが、これらは、適正な細胞分裂に必要な遺伝的維持および相同組換えの重要なメディエータである。実際に、これらの遺伝的安定性経路が欠損していると思われるＢＲＣＡ１突然変異を有する患者は、ＢＲＣＡ１の野生型のものに比べ、ＰＡＲＰ１阻害剤に対して、より高い応答を示した（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＢＲＣＡ突然変異のキャリアであるＴＮＢＣ患者におけるＰＡＲＰ１のターゲティングは、有望な戦略を提示することが明らかである。ＥＲ／ＰｇＲ／ＨＥＲ２状況とＢＲＣＡ１／２遺伝子の遺伝子プロフィールの状況を組合せることにより、ＴＮＢＣ患者の適正な治療選択を決定するための最良の特性決定が達成されうる。
他の戦略でもまた、ＶＥＧＦをターゲティングするためのモノクローナル抗体もしくは小分子阻害剤または抗血管新生化合物のいずれかとして、ＥＧＦＲ阻害剤の使用が検討された。複数の臨床試験では、これらの化合物の効果を評価したが、そのいずれも、単独で投与した場合、有意な応答を示さなかった。しかし、他の抗がん剤と併用してこれらの阻害剤で治療した患者には穏やかな効果が観察された（Ｓａｎｔａｎａ−ＤａｖｉｌａおよびＰｅｒｅｚ，２０１０）。
近年、乳癌の理解が進み、その治療が進歩したにもかかわらず、化学療法の使用は、例外なく重篤な副作用をもたらし、その使用が限定されてしまっている。結果として、抗原組織特異性とモノクローナル抗体の選択性とを組み合わせるといった具体的戦略が要求されれば、非特異性関連の（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）副作用を有意に低減できるはずである。モノクローナル抗体の治療標的として現在研究中のＴＮＢＣ特異的抗原はない。従って、これら腫瘍に発現するタンパク質の特異的マーカをターゲティングすることができないため、ＴＮＢＣ患者にはほとんど選択肢がない。新たな診断マーカとしての用途および新規の標的療法のために、ＴＮＢＣに発現される新たなタンパク質を同定することが切実に求められている。
腎臓関連抗原１（ＫＡＡＧ１）は元々、細胞障害性Ｔリンパ細胞に提示される抗原性ペプチドとして、組織適合性白血球抗原−Ｂ７腎臓癌細胞系由来のｃＤＮＡライブラリからクローンされた（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＵＢＰ８、ｃＤＮＡ配列は、配列番号１のヌクレオチド７３８〜９９２によって表示される）。ＫＡＡＧ１を含む座位は、逆ストランド上に両方向に転写された２つの遺伝子をコードすることが発見された。センスストランドは、ＤＣＤＣ２と称されるタンパク質をコードする転写産物をコードすることが明らかにされた。これらの著者らによる発現の研究から、ＫＡＡＧ１アンチセンス転写産物が腫瘍特異的であり、正常組織においては発現をほとんど呈さなかったのに対し、ＤＣＤＣ２センス転写産物は偏在的に発現したことが見出された（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。癌（特に、卵巣癌、腎臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌および黒色腫）におけるＫＡＡＧ１転写産物の発現は、国際公開第２００７／１４７２６５号パンフレットの下、２００７年１２月２７日に公開された国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４号明細書において開示されている。また、腎臓癌腫、結腸直腸癌腫、黒色腫、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌腫、食道癌腫、膀胱腫瘍、肺癌腫および頭頸部腫瘍におけるＲＮＡの発現も、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅらによって観測された。近年では、連鎖不平衡研究から得られた有力な遺伝学的証拠により、ＶＭＰ／ＤＣＤＣ２／ＫＡＡＧ１座位が失読症（ｄｙｓｌｅｘｉａ）を伴うことが明らかにされた（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。これらの報告のうちの１つは、患者の失読症を引き起こした原因がＤＣＤＣ２マーカにあることを指摘していた。皮質ニューロン移動においてこのタンパク質の機能は、異常なニューロン移動および成熟をしばしば示すこれらの患者の病徴と一致していたためである（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
本出願人は、ＫＡＡＧ１タンパク質に結合する抗体および抗原結合性フラグメントの集団を取得した。これらの抗体または抗原結合性フラグメントは、タンパク質の３つの領域；アミノ酸１〜３５、アミノ酸３６〜６０、アミノ酸６１〜８４をターゲティングすることが判明した。本出願人は、アミノ酸３０〜８４の領域をターゲティングする抗体が、腫瘍細胞の表面に位置するＫＡＡＧ１を認識することから、治療の目的に最も有利であることをみいだした。本出願人は、これらの抗体および抗原結合性フラグメントのいくつかが、抗体依存性細胞傷害を媒介することができ、および／または腫瘍細胞によって内在化されることから、これらが腫瘍細胞にペイロードを送達する優れた候補になることを明らかにした。本出願人はまた、選択した抗体候補をもとにキメラおよびヒト化抗体を作製し、これらの抗体が、腫瘍細胞の形成および浸潤を阻害しうることを実証した（国際公開第２０１０／０６０１８６号パンフレットとして２０１０年６月３日に公開されたＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６号明細書、ならびに国際公開第２０１１／０５４１１２号パンフレットとして２０１１年５月１２日に公開されたＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１７８５号明細書を参照）。最後に、本出願人は、これらの抗体を卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍および頭頸部腫瘍ならびにこれらの癌の転移形態の治療および診断に用いることができることもみいだした。
本出願人は、ＥＲタンパク質発現、ＰｇＲタンパク質発現が欠乏し、および／またはＨＥＲ２タンパク質過剰発現の非存在を示す乳癌細胞（即ち、トリプルネガティブ癌細胞、基底細胞型）を、ＫＡＡＧ１に特異的に結合する抗体または抗原結合性フラグメントで効率的にターゲティングすることができるという予想外の発見をするに至った。このように、抗ＫＡＡＧ１抗体は、これらのマーカの少なくとも１つについて陰性の乳癌細胞の検出および治療的処置に用いることができる。
ネズミおよびヒト化軽鎖の３Ａ４可変ドメインのアミノ酸配列アライメントである。軽鎖は２つのヒト化変異体（Ｌｈ１およびＬｈ２）を有する。ＣＤＲはボールド体で表示され、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３で指示されている。ヒトフレームワーク領域における復帰突然変異、即ちネズミアミノ酸は、ヒト化配列において下線で示されている。 ネズミおよびヒト化重鎖の３Ａ４可変ドメインのアミノ酸配列アライメントである。重鎖は４つのヒト化変異体（Ｈｈ１〜Ｈｈ４）を有する。ＣＤＲはボールド体で表示され、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３で指示されている。ヒトフレームワーク領域における復帰突然変異、即ちネズミアミノ酸は、ヒト化配列において下線で示されている。 ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）を使用してネズミ３Ａ４軽鎖可変領域（配列番号４）を軽鎖可変領域変異体（配列番号３３）にアライメントした図である。ここで、「＊」（アスタリスク）は、完全に保存された単一の残基を有する位置を示す。ここで、「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックス内でスコアが０．５を上回る著しく類似した特性を持つグループ間の保存を示す。ここで、「．」（ピリオド）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックス内でスコアが０．５以下の類似性の低い特性を持つグループ間の保存を示す。 ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラム（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）を使用してネズミ３Ａ４重鎖可変領域（配列番号２）を軽鎖可変領域変異体（配列番号３８）にアライメントした図である。ここで、「＊」（アスタリスク）は、完全に保存された単一の残基を有する位置を示す。ここで、「：」（コロン）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックス内でスコアが０．５を上回る著しく類似した特性を持つグループ間の保存を示す。ここで、「．」（ピリオド）は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックス内でスコアが０．５以下の類似性の低い特性を持つグループ間の保存を示す。 ｐＫＣＲ５−３Ａ４−ＨＣ−変異体１のプラスミドマップを表す。同様な方法で、ヒト化３Ａ４変異体の重鎖がｐＫ−ＣＲ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローンされた。それゆえに、結果として得られたプラスミドは、重鎖免疫グロブリン可変ドメインの配列を除き、ｐＫＣＲ５−３Ａ４−ＨＣ変異体１と同一である。 ｐＭＰＧ−ＣＲ５−３Ａ４−ＬＣ−変異体１のプラスミドマップを表す。同様な方法で、３Ａ４抗体のヒト化変異体１および２の軽鎖がｐＭＰＧ−ＣＲ５のＢａｍＨＩ部位にクローンされた。それゆえに、結果として得られたプラスミドは、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインの配列を除き、ｐＭＰＧ−ＣＲ５−３Ａ４−ＬＣ−変異体１と同一である。 ＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクション後の抗体産生の分析を表す。ヒト化３Ａ４抗体の軽鎖および重鎖の様々な組み合わせを用いトランスフェクションしたＣＨＯｃＴＡ細胞の上澄み（トランスフェクション後１３日目）を、ウエスタンブロットで分析した。ウエスタンブロットのバンドを公知の標準液（ヒト精製ＩｇＧ抗体）の希釈物に対して走査した後、上澄み中に産生された抗体の量を分子量（Ｍｒ）マーカ（ｋＤａ）で測定した。 Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ７５にかけた組み換えＫＡＡＧ１試料のゲル濾過を示すグラフである。ＫＡＡＧ１をゲル濾過物に注入し、０．４ｍｌ／ｍｉｎで分離させた。最大ピークは画分１５〜画分１９の間である。 ３Ａ４抗体のネズミおよびヒト化変異体の速度および親和性定数を記載した表である。 ヒト化抗体の会合速度（Ｋａ）を図示したヒストグラムである。 ヒト化抗体の解離速度（Ｋｄ）を図示したヒストグラムである。 ヒト化抗体の親和性定数（ＫＤ）を図示したヒストグラムである。 ＥＬＩＳＡにおいてＫＡＡＧ１に結合するヒト化３Ａ４変異体の図である。この図は、３Ａ４ヒト化抗体変異体およびネズミ３Ａ４の結合を比較して示したものである。Ｌｈ１軽鎖変異体とアセンブルされたヒト化重鎖（Ｈｈ１、Ｈｈ２、Ｈｈ３およびＨｈ４）の濃度依存的な結合プロファイルである。 ＥＬＩＳＡにおいてＫＡＡＧ１に結合するヒト化３Ａ４変異体の図である。この図は、３Ａ４ヒト化抗体変異体およびネズミ３Ａ４の結合を比較して示したものである。Ｌｈ２軽鎖変異体とアセンブルされたヒト化重鎖（Ｈｈ１、Ｈｈ２、Ｈｈ３およびＨｈ４）の濃度依存的な結合プロファイルである。 癌細胞の表面上のＫＡＡＧ１に結合するヒト化３Ａ４変異体の図である。この図は、非透過ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞上のヒト化抗体およびネズミ３Ａ４抗体結合活性を比較して示したものである。 乳癌患者から得られた１３９の生検試料を含む組織マイクロアレイのスキャンを示す。試料を３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体でブロットしたところ、乳房腫瘍のほとんどが、非常に高レベルのＫＡＡＧ１抗原を発現したことが判明した。確認されたＴＮＢＣ試料を星印で示す。 対照ＩｇＧ（赤色のバー）と比較した、３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体とインキュベートしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ−２０、ＢＴ−５４９、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ−７および２９３−６Ｅ細胞系（ヒストグラムの青色のバー）を用いて実施したフローサイトメトリーの結果を示す。これは、３回実施した実験からの代表的結果である。ＴＮＢＣ細胞系は星印で示す。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体を用いたフローサイトメトリーによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の表面でのＫＡＡＧ１抗原の検出を示す。細胞を３７℃でインキュベートすると、時間と共に、蛍光シグナルが減少するが、これは、細胞を３Ａ４と一緒にインキュベートすると、インキュベーション中にＫＡＡＧ１／抗体複合体が内在化されたことを示している。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体を用いたフローサイトメトリーによるＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞の表面でのＫＡＡＧ１抗原の検出を示す。細胞を３７℃でインキュベートすると、時間と共に、蛍光シグナルが減少するが、これは、細胞を３Ａ４と一緒にインキュベートすると、インキュベーション中にＫＡＡＧ１／抗体複合体が内在化されたことを示している。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体を用いたフローサイトメトリーによるＢＴ−２０細胞の表面でのＫＡＡＧ１抗原の検出を示す。細胞を３７℃でインキュベートすると、時間と共に、蛍光シグナルが減少するが、これは、細胞を３Ａ４と一緒にインキュベートすると、インキュベーション中にＫＡＡＧ１／抗体複合体が内在化されたことを示している。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体を用いたフローサイトメトリーによるＴ４７Ｄ細胞の表面でのＫＡＡＧ１抗原の検出を示す。細胞を３７℃でインキュベートすると、時間と共に、蛍光シグナルが減少するが、これは、細胞を３Ａ４と一緒にインキュベートすると、インキュベーション中にＫＡＡＧ１／抗体複合体が内在化されたことを示している。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体および抗ＬＡＭＰ１抗体を用いて、生存ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で実施した免疫蛍光データを示す。抗ＫＡＡＧ１抗体に結合した免疫蛍光シグナルを左のパネルに示し、ＬＡＭＰ１に結合した免疫蛍光シグナルを中央のパネルに、また両方の画像をマージしたものを右のパネルに示す。これらのデータは、核周囲領域付近でのＫＡＡＧ１およびＬＡＭＰ１の共局在化を示している。 ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体および抗ＬＡＭＰ１抗体を用いて、生存ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で実施した免疫蛍光データを示す。抗ＫＡＡＧ１抗体に結合した免疫蛍光シグナルを左のパネルに示し、ＬＡＭＰ１に結合した免疫蛍光シグナルを中央のパネルに、また両方の画像をマージしたものを右のパネルに示す。これらのデータは、ＫＡＡＧ１と、後期エンドソーム／リソソームのマーカである、ＬＡＭＰ１との局在化を示している。
本発明は、必要とする個体の癌もしくは癌細胞を（ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで）治療または検出する方法を提供する。
本発明によれば、治療または検出の方法は、ＫＡＡＧ１に結合することができる抗体またはその抗原結合性フラグメントを用いて実施してよい。
治療を必要とする個体は、例えば、癌を有する、または癌を有することが疑われる個体を含みうる。このような個体は、乳癌に由来する癌または癌細胞を有する者でよい。
癌または癌細胞は、さらに具体的には、トリプルネガティブまたは基底細胞型として特徴付けられる乳癌に由来するものであってよい。
ゆえに、本明細書に記載する治療または検出方法から利益を受け得る個体には、乳癌に罹患している者が含まれ得る。
乳癌は、エストロゲン受容体の発現の低減または消失を呈する腫瘍細胞を含み得る。
乳癌は、プロゲステロン受容体の発現の低減または消失を呈する腫瘍細胞を含み得る。
乳癌は、Ｈｅｒ２の発現の低減または消失を呈する腫瘍細胞を含み得る。
乳癌は、Ｈｅｒ２の過剰発現の低減または消失を呈する腫瘍細胞を含み得る。
より具体的には、乳癌は、１）エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体の発現の低減もしくは消失、２）エストロゲン受容体の発現の低減もしくは消失とＨｅｒ２過剰発現の低減もしくは消失、３）プロゲステロン受容体の発現の低減もしくは消失とＨｅｒ２過剰発現の低減もしくは消失、または４）エストロゲン受容体の発現の低減もしくは消失、プロゲステロン受容体の発現の低減もしくは消失、ならびにＨｅｒ２過剰発現の低減もしくは消失のいずれかを呈する腫瘍細胞を含みうる。
さらに具体的には、乳癌は、１）エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体の発現の消失、２）エストロゲン受容体の発現の消失とＨｅｒ２発現の消失、３）プロゲステロン受容体の発現の消失とＨｅｒ２発現の消失、または４）エストロゲン受容体の発現の消失、プロゲステロン受容体の発現の消失、ならびにＨｅｒ２発現の消失のいずれかを呈する腫瘍細胞を含みうる。
本発明によれば、個体は、トリプルネガティブとして特性決定される乳癌細胞を保有する者であっても、またはトリプルネガティブ乳癌として分類される腫瘍を有する者であってもよい。
本発明によれば、個体は、基底細胞型として特性決定される乳癌細胞を保有する者であっても、または基底細胞型乳癌として分類される腫瘍を有する者であってもよい。
抗ＫＡＡＧ１による治療から利益を受けうる他の個体には、上皮間葉転移（ＥＭＴ）表現型を呈する腫瘍細胞を含む癌を有する者が含まれる。
一般に用いられるＥＭＴの分子マーカとしては、例えば、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチンおよびβ−カテニン（膜内）の発現の低減、および／またはＳｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔ、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、Ｎ−カドヘリン、ビメンチン、α−平滑筋アクチン、マトリックスメタロプロテイナーゼなどの発現の増大がある（例えば、ＫａｌｌｕｒｉおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１１９（６），ｐ１４２０−１４２８；２００９；Ｆａｓｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２５；ｐ８６−９９；２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＢ；１７２；ｐ９７３−９８１；２００６）。ＥＭＴ表現型はまた、遊走、浸潤の能力の増大、またはアノイキス／アポトーシスに対する抵抗性によっても識別することができる。上皮間葉転移を被った細胞は、したがって、上皮マーカの低減および間葉マーカまたはＥＭＴ表現型の出現によって検出することができる。
本発明によれば、この方法は、このように、例えば、治療を必要とする個体に、ＫＡＡＧ１に特異的に結合することができる抗体または抗原結合性フラグメントを投与することを含みうる。治療を必要とする個体は、ＥＲ発現、ＰｇＲ発現を欠いたその腫瘍に基づき、および／またはＨＥＲ２タンパク質過剰発現の非存在によって優先的に選択される。これらのマーカについての臨床試験は、通常、組織学的方法（免疫組織化学、ＦＩＳＨなど）および／または遺伝子発現研究（例えば、Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｌａｃｅｙ，２０１１を参照）を用いて実施される。従って、必要とする個体は、トリプルネガティブ乳癌または基底細胞型乳癌の診断を受けた個体であってよい。治療を必要とする個体は、ホルモン療法および／もしくはトランスツズマブ療法（または他の抗Ｈｅｒ２抗体）に対して不応答性の個体であってもよい。あるいは、治療を必要とする個体は、上皮間葉転移を受けることができる能力を有する、または間葉表現型を獲得した腫瘍細胞を保有する個体であってもよい。
従って、本発明は、治療を必要とする個体に、ＫＡＡＧ１活性または発現の阻害剤を投与することにより、トリプルネガティブ乳癌または基底細胞型乳癌を治療する方法を提供する。
本発明によれば、ＫＡＡＧ１阻害剤は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントを含みうる。
また、本発明によれば、ＫＡＡＧ１阻害剤は、配列番号１またはそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含みうる。さらに具体的には、ＫＡＡＧ１阻害剤は、配列番号１のヌクレオチド７３８〜９９２（両端を含む）またはそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含みうる。例えば、阻害剤は、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド７３８〜９９２（両端を含む）に相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチド（少なくとも１５個、少なくとも２０個）を含みうる。より具体的なタイプのＫＡＡＧ１阻害剤は、配列番号１の発現を阻害するｓｉＲＮＡを含む。
好適な抗体または抗原結合性フラグメントは、腫瘍細胞の表面でＫＡＡＧ１に結合することができるものを含む。このような抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３０〜８４（両端の値を含む）の間に含まれるエピトープに優先的に結合し得る。
あるいは、こうした抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３６〜６０（両端の値を含む）またはアミノ酸６１〜８４（両端の値を含む）の間に位置するエピトープに結合しうる。
エピトープは、特に、アミノ酸５０〜７０、５０〜６５、５１〜６５、５２〜６５、５３〜６５、５４〜６５、５４〜６４、５４〜６３、５４〜６２、５４〜６１、５４〜６０、５０〜６２、５０〜６１、または５０〜６０（両端の値を含む）の間に位置するか、または含まれるものでよい。
本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸５０〜７０の間に含まれるエピトープに結合しうる。
本発明の別の実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸５０〜６２の間に含まれるエピトープに結合しうる。
本発明のさらに別の実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸５４〜６５の間に含まれるエピトープに結合しうる。
治療的処置のために好適な抗体として、例えば、抗体依存性細胞傷害を媒介するものがある。
治療的処置のためにさらに好適な他の抗体として、治療部分と結合したものがある。
本発明によれば、抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはその抗原結合性フラグメントであってもよい。
治療方法
本明細書に記載するように、本発明は、「トリプルネガティブ乳癌」または「基底細胞型乳癌」として特徴付けられた乳癌を有する個体に、抗体または抗原結合性フラグメントを投与することを含む。
「トリプルネガティブ乳癌」または「基底細胞型乳癌」としての乳癌サブタイプの分類は、当分野では公知であり（例えば、Ｆｏｕｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２０１０；３６３：１９３８−１９４８を参照）、例えば、以下の定義を含む：
「基底細胞型乳癌」には、例えば、エストロゲン受容体の発現の非存在または低レベルの発現、Ｈｅｒ２過剰発現およびヒト乳房の基底細胞もしくは筋上皮細胞に通常存在する遺伝子の発現の非常に低いレベルを特徴とする腫瘍の異種群を含む乳癌サブタイプが含まれる。このような発現は、マイクロアレイ分析によって決定され得る。
「トリプルネガティブ乳癌」には、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびＨｅｒ２発現の欠失を特徴とする腫瘍が含まれる。研究者の中には、１％未満の細胞がＥＲまたはＰＲ発現について陽性である場合しか、ＥＲまたはＰＲの発現が陰性であるものとして腫瘍を認めない者もいれば、１０％以下の細胞が発現について陽性であれば、腫瘍をＥＲまたはＰＲ発現が陰性であるとみなす者もいる。ＨＥＲ２陰性について様々な定義が用いられている。最も多くの場合に採用されている２つでは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション後にＨＥＲ２遺伝子増幅が欠乏している０／１＋または２＋の免疫組織化学スコアを有する腫瘍を含む。
本発明によれば、治療方法は、治療を必要とする個体に、ＫＡＡＧ１阻害剤を投与することを含む。このようなＫＡＡＧ１阻害剤は、例えば、ＫＡＡＧ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む。
最も効力が高い抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１に対して高い親和性を有するものであると思われる。また、最も効力が高い抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、リソソームまたはエンドソームなどの細胞コンパートメントの内部に内在化されるものであると考えられる。
従って、本発明は、特に、ＫＡＡＧ１に対して高い親和性を有する抗体または抗原結合性フラグメントを包含する。
好適な抗体または抗原結合性フラグメントは、高い親和性で、腫瘍細胞の表面でＫＡＡＧ１に結合することができるものを含む。このような高親和性抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３０〜８４（両端の値を含む）の間に含まれるエピトープに優先的に結合しうる。
あるいは、このような高親和性抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３６〜６０（両端の値を含む）の間またはアミノ酸６１〜８４（両端の値を含む）の間に位置するエピトープに結合しうる。
高親和性抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、アミノ酸５０〜７０、５０〜６５、５１〜６５、５２〜６５、５３〜６５、５４〜６５、５４〜６４、５４〜６３、５４〜６２、５４〜６１、５４〜６０、５０〜６２、５０〜６１、または５０〜６０（両端の値を含む）の間に位置する、または含まれるエピトープに結合するものでよい。
本発明によれば、高親和性抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸５０〜７０の間に含まれるエピトープに結合するものでよい。
本発明の別の実施形態において、高親和性抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸５０〜６２の間に含まれるエピトープに結合するものでよい。
本発明のさらに別の実施形態において、高親和性抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸５４〜６５の間に含まれるエピトープに結合するものでよい。
高親和性抗体を含む好ましい抗体は、細胞または細胞コンパートメント（例えばリソソームまたはエンドソーム）内に内在化されうるものである。抗体が内在化される能力は、当分野では公知の方法、例えば、限定するものではないが、本明細書で実施するものと類似の免疫蛍光試験によって決定することができる。
特に、３Ａ４抗体のそれと同じＣＤＲを有する抗体が、本発明に包含される。従って、配列番号１８６〜１８８および１９１〜１９３のいずれかに示す軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域共通配列、ならびに配列番号４６、４８、１８９、１９０、または１９４〜１９８に示す特定の配列を有する抗体が、本発明に包含される。中でも、配列番号１８８および１９６のいずれかに示す軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域共通配列、または配列番号４６、４８、１８９、１９０、または１９４〜１９８に示す特定の配列を有する抗体が、特に考慮される。
抗体またはその抗原結合性フラグメントは、治療部分と結合させるのが好ましい。
抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト定常領域を含んでもよい。好ましくは、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒトＩｇＧ１定常領域を有しうる。あるいは、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＩｇＧ２定常領域を有してもよい。
本発明の方法はまた、例えば、小分子薬物、ＫＡＡＧ１以外の標的に結合する抗体または抗原結合性フラグメント、化学療法または細胞傷害薬などの抗癌剤と併用して、抗体（例えば、治療部分と結合した）または抗原結合性フラグメントなどのＫＡＡＧ１阻害剤を投与することを含みうる。ＫＡＡＧ１阻害剤と一緒に投与することができる抗がん剤の例として、例えば、ドキソルビシン、タキサン、抗血管新生剤、白金塩、ＰＡＲＰ阻害剤が挙げられる。
本発明に含まれる他の治療方法は、アンチセンスベース（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｂａｓｅｄ）の治療薬（ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイムなど）のような他のタイプのＫＡＡＧ１阻害剤を投与することを含む。
ＫＡＡＧ１に結合する抗体および抗原結合性フラグメント
用語「抗体または抗原結合性フラグメント」あるいは「複数の抗体または抗原結合性フラグメント」などの類似の用語は、例えば、「可変抗体または抗原結合性フラグメント」、例えば、「ヒト化抗体または抗原結合性フラグメント」を包含する。
用語「抗体」は、無傷抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を指す。用語「抗体」はまた、二重特異的抗体などの多重特異的抗体を包含する。ヒト抗体は、通常、２つの軽鎖と２つの重鎖から成り、それぞれ可変領域および定常領域を含む。軽鎖可変領域は、本明細書においてフレームワーク領域の側面に位置するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３として同定されている３つのＣＤＲを含む。重鎖可変領域は、本明細書においてフレームワーク領域の側面に位置するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３として同定される３つのＣＤＲを含む。
本明細書において用語「抗原結合性フラグメント」は、抗原に結合する能力を保持している１つまたは複数のフラグメント（例えば、ＫＡＡＧ１、ＫＡＡＧ１の分泌形態、またはその変異体）を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体のフラグメントによって実施され得ることが明らかにされてきた。抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含される結合性フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、即ちＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、即ちヒンジ領域におけるジスルフィド架橋を介して連結される２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一群（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＶＨ ＣＤＲ３が挙げられる。更にまた、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、別々の遺伝子によってコードされるが、組み換え方法を用いて、合成リンカーにより、これらを単一ポリペプチド鎖とすることができ、この単一ポリペプチド鎖内でＶＬ領域とＶＨ領域が対合することによって１価分子が形成される（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）を参照のこと）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含されるように意図されたものである。更にまた、抗原結合性フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合された結合ドメインポリペプチド（例えば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはリンカーペプチドを介して軽鎖可変領域に融合された重鎖可変領域）と、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域と、（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合された免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域と、を含んでなる結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を含む。ヒンジ領域は、１つまたは複数のシステイン残基をセリン残基で置換することによって、二量体化が防止されるように修飾してもよい。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は更に、米国特許出願公開第２００３／０１１８５９２号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１３３９３９号明細書に開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を使用して取得され、これらのフラグメントは、無傷抗体と同じ方法で、利用のためにスクリーニングされる。
典型的な抗原結合部位は、軽鎖免疫グロブリンと重鎖免疫グロブリンとを対にして形成された可変領域から構成される。抗体可変領域の構造は非常に整合性がとれており、極めて類似した構造を呈する。これらの可変領域は典型的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのハイパー可変領域で離間された比較的相同的なフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。抗原結合性フラグメントの全般的な結合活性は多くの場合、ＣＤＲの配列によって指令される。ＦＲは、往々にして、最適な抗原結合のために、ＣＤＲの３次元での適切な位置決めおよびアライメントにおいてある役割を果たす。
本明細書で用いる用語「高い親和性」は、１０ｎＭ以下の親和性を指す。用語「高い親和性」は、特に５ｎＭ以下の親和性を有する抗体を含む。さらに具体的には、用語「高い親和性」は、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の親和性を有する抗体を含む。
本発明の抗体および／または抗原結合性フラグメントは、例えば、マウス、ネズミもしくは他のいずれかの哺乳動物、または他の供給源（組み換えＤＮＡ技術によるものなど）に由来するものであってよい。
最初に、ＫＡＡＧ１抗体をＦａｂライブラリから単離し、目的とする抗原に対する抗体の特異性を確認した。どのようにしてＦａｂを完全免疫グロブリンに変換するかについての例示的方法を本明細書に記載する。
本明細書に記載されている可変領域は、所望される種の定常領域と融合させることが可能であり、そうすることにより、所望される種のエフェクター細胞に抗体を認識させることができる。定常領域は、例えば、ＩｇＧ１亜型、ＩｇＧ２亜型、ＩｇＧ３亜型、またはＩｇＧ４亜型に由来し得る。可変領域を用い定常領域をフレーム内でクローニングまたは合成することは、優に当業者の技術範囲内にあり、例えば組み換えＤＮＡ技術を介して実施され得る。
本発明の特定の実施形態において、ＫＡＡＧ１に結合する抗体は、ＩｇＧ１亜型、ＩｇＧ２亜型、ＩｇＧ３亜型、またはＩｇＧ４亜型のものであってよい。本発明のより具体的実施形態は、ＩｇＧ１亜型の抗体、または特にヒトＩｇＧ１亜型の抗体に関する。本発明の他の具体的実施形態は、ＩｇＧ２亜型の抗体、または特にヒトＩｇＧ２亜型の抗体に関する。
抗体は、ＩｇＧ１亜型の、または特にヒトＩｇＧ１亜型のヒト化抗体であってよい。あるいは、抗体は、ＩｇＧ２亜型の、または特にヒトＩｇＧ２亜型のヒト化抗体であってよい。
抗体は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体媒介細胞傷害（ＣＭＣ）の媒介において生物学的に活性であるか、または免疫複合体と結合し得る。典型的ＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を含み、ＮＫ細胞の表面上のＦｃ受容体による抗体被覆細胞の認識に依存する。Ｆｃ受容体は、ＩｇＧ１に存在するような抗体のＦｃドメインを認識するが、これは、標的細胞、特に、ＫＡＡＧ１などの抗原を発現する癌性細胞の表面に結合する。いったんＩｇＧのＦｃ受容体に結合すると、ＮＫ細胞は、サイトカインおよび細胞傷害性顆粒を放出し、これらは、標的細胞に進入して、アポトーシスをトリガーすることにより細胞死を促進する。
本発明は、ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体に結合する抗体のコレクションを記載した。特定の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、キメラまたはヒト化抗体のなどのモノクローナル抗体、抗原結合性フラグメントなどの抗体フラグメント、一本鎖抗体、ドメイン抗体、ならびに抗原結合性領域を含むポリペプチドからなる群から選択される。
本発明の一形態では、本発明の単離抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞またはＫＡＡＧ１変異体発現腫瘍細胞の殺傷（排除、破壊、溶解）を誘導することが可能である（例えば、ＡＤＣＣ依存的様式で）。
本発明の別の形態では、本発明の単離抗体または抗原結合性フラグメントは、とりわけ、ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を発現する腫瘍細胞の広がりを抑制する能力を特徴とし得る。
本発明のさらに別の形態では、本発明の単離抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を発現する腫瘍の形成を低減または阻害する能力を特徴とし得る。
本発明の例示的実施形態では、本発明の単離抗体または抗原結合性フラグメントは、定常領域のアミノ酸を含んでよく、これは、例えば、ヒト抗体に由来するものでよい。
本発明の別の例示的実施形態では、単離抗体または抗原結合性フラグメントは、ヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含み得る。
本明細書に記載の例示的実施形態に限定されることなく、本出願人は、本明細書に記載の目的に有用となり得る具体的抗体および抗原結合性フラグメントを作製した。
以下は、作製され、特定の様式でＫＡＡＧ１に結合することがわかっている抗体のリストである；３Ｄ３、３Ａ４、３Ｃ４、３Ｇ１０、３Ａ２、３Ｆ６、３Ｅ８、３Ｅ１０、３Ａ９、３Ｂ１、３Ｇ５、３Ｂ２、３Ｂ８、３Ｇ８、３Ｆ７、３Ｅ９、３Ｇ１２、３Ｃ３、３Ｅ１２、４Ａ２、３Ｆ１０、３Ｆ４、３Ｂ１１、３Ｄ１、３Ｃ２、３Ｅ６および３Ｈ３。抗体軽鎖または重鎖、可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列は、国際公開第２０１０／０６０１８６Ａ８号パンフレットとして２０１０年６月３日に公開されたＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６号明細書、国際公開第２０１１／０５４１１２Ａ１号パンフレットとして２０１１年５月１２日に公開されたＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１７９５号明細書、または国際公開第２０１２／１２９６６８Ａ１号パンフレットとして２０１２年１０月４日に公開されたＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０００２９６号明細書から得ることができる。
ほとんどの場合、ＣＤＲの配列は、個別に記載されているか、または本明細書では太字で示す。
その中から、３Ｄ３、３Ａ４、３Ｇ１０および３Ｃ４をｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ生物学試験のために選択した。３Ａ４抗体が、最良の特徴を有しているようであった。実験によれば、３Ａ４抗体を治療部分（例えば、細胞傷害剤）と結合させると、その非結合形態より、癌細胞を殺傷する上で有効である。
例証的実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、軽鎖可変領域の任意の独立したＣＤＲ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３の組み合わせを含んでいてもよい。ＣＤＲ３はより具体的に選択され得る。組み合わせとしては、例えば、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ３と、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２と、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と、を挙げることができる。
別の例示的実施形態において、抗体または抗原結合性フラグメントは、重鎖可変領域の任意の独立したＣＤＲ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３の組み合わせを含んでいてもよい。ＣＤＲ３はより具体的に選択され得る。組み合わせとしては、例えば、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ３と、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２と、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と、を挙げることができる。
本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３からなる少なくとも２つのＣＤＲを含んでいてもよい。
また、本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、１つのＣＤＲＬ１と、１つのＣＤＲＬ２と、１つのＣＤＲＬ３と、を含んでいてもよい。
更に、本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、
ａ．ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３からなる少なくとも２つのＣＤＲと、
ｂ．ＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２、または１つのＣＤＲＨ３からなる少なくとも２つのＣＤＲと、
を含んでいてもよい。
抗体または抗原結合性フラグメントは、より好ましくは、１つのＣＤＲＬ１と、１つのＣＤＲＬ２と、１つのＣＤＲＬ３と、を含んでいてもよい。
抗体または抗原結合性フラグメントはまた、より好ましくは１つのＣＤＲＨ１と、１つのＣＤＲＨ２と、１つのＣＤＲＨ３と、を含んでいてもよい。
軽鎖可変領域または重鎖可変領域のどちらか一方のみが利用可能な場合、当該技術分野において公知の方法を使用して、相補可変領域のライブラリをスクリーニングすることによって、抗体または抗原結合性フラグメントを再構成してもよい（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）１５０：８８０−８８７，Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４−６２８）。
本発明の例示的実施形態は、３Ｄ３、３Ａ４、３Ｃ４、３Ｇ１０、３Ａ２、３Ｆ６、３Ｅ８、３Ｅ１０、３Ａ９、３Ｂ１、３Ｇ５、３Ｂ２、３Ｂ８、３Ｇ８、３Ｆ７、３Ｅ９、３Ｇ１２、３Ｃ３、３Ｅ１２、４Ａ２、３Ｆ１０、３Ｆ４、３Ｂ１１、３Ｄ１、３Ｃ２、３Ｅ６または３Ｈ３の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲを有する抗体または抗原結合性フラグメントを包含する。本発明のより具体的実施形態は、３Ｄ３、３Ａ４、３Ｃ４または３Ｇ１０抗体の軽鎖および／もしくは重鎖のＣＤＲを有する抗体または抗原結合性フラグメントを含む。本発明のさらに具体的実施形態は、３Ａ４抗体の軽鎖および／もしくは重鎖のＣＤＲを有する抗体または抗原結合性フラグメントを含む。従って、本発明は、３Ａ４抗体の１つまたは複数のＣＤＲを含む任意のモノクローナル、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体を包含する。
本発明の方法で用いることができる抗体または抗原結合性フラグメントには、３Ａ４抗体のＣＤＲを有するものが含まれ、例えば、配列番号４９に示すＣＤＲＨ１、配列番号５０または配列番号２１２に示すＣＤＲＨ２、配列番号５１に示すＣＤＲＨ３、配列番号５２に示すＣＤＲＬ１、配列番号５３に示すＣＤＲＬ２、および配列番号５４に示すＣＤＲＬ３を含み得る。
ゆえに、本発明は、ＫＡＡＧ１に特異的に結合することができ、以下に挙げるものからなる群から選択される配列を含み得る抗体および抗原結合性フラグメントを包含する：
ａ．配列番号１６に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１８に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｂ．配列番号２０に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号２２に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｃ．配列番号２４に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号２６に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｄ．配列番号４８に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号４６に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｅ．配列番号１０３に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１２６に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｆ．配列番号１０４に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１２７に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｇ．配列番号１０５に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１２８に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｈ．配列番号１０６に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１４５に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｉ．配列番号１０７に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１２９に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｊ．配列番号１０８に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３０に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｋ．配列番号１０９に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１４１に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｌ．配列番号１１０に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３１に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｍ．配列番号１１１に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３４に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｎ．配列番号１１２に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３５に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｏ．配列番号１１３に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３６に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｐ．配列番号１１４に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３３に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｑ．配列番号１１５に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１４０に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｒ．配列番号１１６に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３７に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｓ．配列番号１１７に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１４４に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｔ．配列番号１１８に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３９に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｕ．配列番号１１９に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３２に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｖ．配列番号１２０に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１４２に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｗ．配列番号１２１に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１３８に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｘ．配列番号１２２に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１４６に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｙ．配列番号１２３に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１５３に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｚ．配列番号１２４に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１４３に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ａａ．配列番号１８９に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１９４に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｂｂ．配列番号１８９に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１９５に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｃｃ．配列番号１８９に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１９６に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｄｄ．配列番号１８９に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１９７に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｅｅ．配列番号１９０に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１９４に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｆｆ．配列番号１９０に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１９５に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｇｇ．配列番号１９０に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１９６に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
ｈｈ．配列番号１９０に示す軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ、および／または配列番号１９７に示す重鎖可変領域の３つのＣＤＲ。
本発明の他の例示的実施形態は、３Ｄ３、３Ａ４、３Ｃ４、３Ｇ１０、３Ａ２、３Ｆ６、３Ｅ８、３Ｅ１０、３Ａ９、３Ｂ１、３Ｇ５、３Ｂ２、３Ｂ８、３Ｇ８、３Ｆ７、３Ｅ９、３Ｇ１２、３Ｃ３、３Ｅ１２、４Ａ２、３Ｆ１０、３Ｆ４、３Ｂ１１、３Ｄ１、３Ｃ２、３Ｅ６または３Ｈ３の軽鎖および／もしくは重鎖を有する抗体または抗原結合性フラグメントを包含する。本発明のより具体的実施形態は、３Ｄ３、３Ａ４、３Ｃ４または３Ｇ１０抗体の軽鎖および／もしくは重鎖を有する抗体または抗原結合性フラグメントを含む。本発明のさらに具体的実施形態は、３Ａ４抗体（ヒト化および非ヒト化）の軽鎖および／もしくは重鎖を有する抗体または抗原結合性フラグメントを含む。
ゆえに、本発明は、ＫＡＡＧ１に特異的に結合することができ、以下に挙げるものからなる群から選択される配列を含み得る抗体および抗原結合性フラグメントを包含する：
ａ．配列番号１６に示す軽鎖可変領域（配列番号１５によりコードされている）、および／または配列番号１８に示す重鎖可変領域（配列番号１７によりコードされている）、
ｂ．配列番号２０に示す軽鎖可変領域（配列番号１９によりコードされている）、および／または配列番号２２に示す重鎖可変領域（配列番号２１によりコードされている）、
ｃ．配列番号２４に示す軽鎖可変領域（配列番号２３によりコードされている）、および／または配列番号２６に示す重鎖可変領域（配列番号２５によりコードされている）、
ｄ．配列番号４８に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号４６に示す重鎖可変領域、
ｅ．配列番号１０３に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１２６に示す重鎖可変領域、
ｆ．配列番号１０４に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１２７に示す重鎖可変領域、
ｇ．配列番号１０５に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１２８に示す重鎖可変領域、
ｈ．配列番号１０６に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４５に示す重鎖可変領域、
ｉ．配列番号１０７に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１２９に示す重鎖可変領域、
ｊ．配列番号１０８に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３０に示す重鎖可変領域、
ｋ．配列番号１０９に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４１に示す重鎖可変領域、
ｌ．配列番号１１０に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３１に示す重鎖可変領域、
ｍ．配列番号１１１に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３４に示す重鎖可変領域、
ｎ．配列番号１１２に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３５に示す重鎖可変領域、
ｏ．配列番号１１３に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４０に示す重鎖可変領域、
ｐ．配列番号１１４に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３３に示す重鎖可変領域、
ｑ．配列番号１１５に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４０に示す重鎖可変領域、
ｒ．配列番号１１６に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３７に示す重鎖可変領域、
ｓ．配列番号１１７に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４４に示す重鎖可変領域、
ｔ．配列番号１１８に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３９に示す重鎖可変領域、
ｕ．配列番号１１９に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３２に示す重鎖可変領域、
ｖ．配列番号１２０に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４２に示す重鎖可変領域、
ｗ．配列番号１２１に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１３８に示す重鎖可変領域、
ｘ．配列番号１２２に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４６に示す重鎖可変領域、
ｙ．配列番号１２３に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４７に示す重鎖可変領域、
ｚ．配列番号１２４に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１４４に示す重鎖可変領域、
ａａ．配列番号１８９に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１９４に示す重鎖可変領域、
ｂｂ．配列番号１８９に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１９５に示す重鎖可変領域、
ｃｃ．配列番号１９０に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１９４に示す重鎖可変領域、
ｄｄ．配列番号１９０に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１９５に示す重鎖可変領域、
ｅｅ．配列番号１９０に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１９６に示す重鎖可変領域、
ｆｆ．配列番号１９０に示す軽鎖可変領域、および／または配列番号１９７に示す重鎖可変領域。
本明細書に記載の重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域は、本明細書に記載の抗体において例示するフレームワーク領域の１つまたは複数に由来するものでもよい。抗体または抗原結合性フラグメントは、従って、本明細書に記載するＣＤＲ（例えば、配列番号７２〜８８の特定のＣＤＲもしくは共通ＣＤＲまたは配列番号８９〜１０２のＣＤＲ変異体）ならびに本明細書に記載のものに由来するフレームワーク領域の１つまたは複数を含み得る。配列番号１０３〜１５４において、予想されるＣＤＲを太字で示すが、フレームワーク領域は太字ではない。
表１は、生物学的試験のために選択されたいくつかの抗ＫＡＡＧ１抗体の軽鎖および重鎖の完全配列に関する。
エピトープマッピング研究から、３Ｄ３抗体が、アミノ酸３６〜６０（両端を含む）にわたるＫＡＡＧ１エピトープと相互作用することが判明した。３Ｇ１０および３Ａ４抗体は、アミノ酸６１〜８４（両端を含む）にわたるＫＡＡＧ１エピトープと相互作用し、また、３Ｃ４抗体は、アミノ酸１〜３５（両端を含む）にわたるＫＡＡＧ１エピトープと相互作用する。３Ｇ１０および３Ａ４は、同様の領域に結合するが、３Ｇ１０抗体は、３Ａ４抗体ほど効率的にＫＡＡＧ１に結合しない。
本明細書において、上に挙げた特定の組合せの軽鎖可変領域は、他のいずれかの軽鎖可変領域に変更してもよいことは理解すべきである。同様に、上に挙げた特定の組合せの重鎖可変領域も、他のいずれかの重鎖可変領域に変更してよい。
ＫＡＡＧ１に結合する、選択抗体の軽鎖および重鎖可変領域の配列を表２に記載する。
配列番号１０３〜１５４は、ＫＡＡＧ１に結合することがわかった他の抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域に対応する。
ＫＡＡＧ１に結合する、選択抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲ配列を表３に記載する。
変異体抗体および抗原結合性フラグメント
本発明はまた、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントの変異体を包含する。包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列において変異を有するものである。例えば、包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの変異体ＣＤＲ（２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変異体ＣＤＲ等、または更には１２個の変異体ＣＤＲ）、変異体軽鎖可変領域、変異体重鎖可変領域、変異体軽鎖および／または変異体重鎖を有するものである。本発明に包含される変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、元の抗体または抗原結合性フラグメントと比較して結合親和性が類似しているかまたは改善されているものである。
本明細書において用語「変異体」は、本明細書に記載されているいずれの配列にも適用され、例えば、変異体ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２および／またはＣＤＲＨ３のいずれか）、変異体軽鎖可変領域、変異体重鎖可変領域、変異体軽鎖、変異体重鎖、変異体抗体、変異体抗原結合性フラグメント、ならびにＫＡＡＧ１変異体を包含する。
置換型突然変異誘発に極めて重要な部位としては、ハイパー可変領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、フレームワーク領域内、またはさらには定常領域での修飾改変も考慮される。ＣＤＲ変異体の例示的実施形態を配列番号７２〜１０２に示す。
保存的置換は、下掲の群（１群〜６群）のいずれか１つからの（ＣＤＲ、可変鎖、抗体などの）アミノ酸を同じ群の別のアミノ酸と交換することによって為され得る。
保存的置換の他の例示的実施形態を、表１Ａの「好適な置換（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」という見出しの下に示す。そのような置換の結果、所望されない特性が得られた場合は、表１Ａで「例示的置換」と呼ぶより実質的な変更、またはアミノ酸のクラスに関して更に詳しく後述するような変更を導入して、生成物をスクリーニングすることもできる。
変異体が置換変異によって生成され、かつ本発明のポリペプチドの生物学的活性を保持し得ることは、当該技術分野において公知である。これらの変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されている。例えば、置換型突然変異に重要な部位の１つとして、異なる種から採取される特定の残基どうしが同一である部位を挙げることができる。「保存的置換」と同定される置換の例を表１Ａに示す。そのような置換の結果、望ましくない変更が生じた場合、表１Ａ中で「例示的な置換」と呼ばれる、または、更に本明細書においてアミノ酸クラスを参照して詳述されているような他のタイプの置換を導入し、生成物をスクリーニングする。
機能または免疫学的同一性における実質的な修正は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド主鎖の（例えば、シート立体配座またはヘリックス立体配座としての）構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持する効果に有意な違いのある置換を選択することによって達成される。天然残基は、一般の側鎖特性に基づいて次の群に分類される。
（１群）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）
（２群）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）
（３群）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（４群）塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）
（５群）鎖配向に影響する残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、および
（６群）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
非保存的置換は、これらの部類のメンバーの相互交換を伴う。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列の改変としては、アミノ酸付加、欠失、挿入、置換など、１個または複数個のアミノ酸の骨格または側鎖における１つまたは複数の修飾、または１個または複数個のアミノ酸（側鎖または骨格）への１つの基もしくは別の分子の付加が挙げられる。
元の抗体または抗原結合性フラグメントのアミノ酸配列と比べて、変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、そのアミノ酸配列において実質的な配列類似性および／または配列同一性を有し得る。２つの配列間の類似性の度合いは、同一性（同一のアミノ酸）および保存的置換のパーセンテージに基づく。
本明細書において可変鎖間の類似性および同一性の度合いは一般的に、Ｂｌａｓｔ２配列プログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）、「Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ − ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）を用い、既定の設定を使用して、即ち、ｂｌａｓｔｐプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（開始ギャップ１１およびギャップ伸張のペナルティ１；ｇａｐｘドロップオフ５０、期待値１０．０、ワードサイズ３）および活性化フィルタを使用して、定量されてきた。
ゆえに、同一性パーセントは、元のペプチドと比較して同一なアミノ酸であり、かつ同じまたは類似する位置を占有し得るアミノ酸を示す。類似性パーセントは、同じ位置または類似の位置にある元のペプチドと比較して同一なアミノ酸であり、かつ保存的なアミノ酸置換で置換されるアミノ酸を示す。
ゆえに、本発明の変異体は、元の配列または元の配列の一部分に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得るものを含む。
変異体の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８１％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８２％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の更なる例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の付加的な例示的実施態様は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
変異体の更なる付加的な例示的実施態様は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し、元の配列または元の配列の一部分に対して９７％、９８％、９９％または１００％の配列類似性を有するものである。
簡潔にするために、本出願者は本発明に包含される個々の変異体の例示的実施形態を示した表１Ｂを提供している。この表１Ｂには、特定の配列同一性（％）および配列類似性（％）が含まれている。各「Ｘ」は所定の変異体を定義するものと解釈すべきである。
本発明は、本明細書に記載されている配列に対して少なくとも７０％の同一性または少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖、抗体および／または抗原結合性フラグメントを包含する。
ゆえに、本発明は、ＫＡＡＧ１に特異的に結合することができ、以下に挙げるものからなる群から選択される配列を含み得る抗体および抗原結合性フラグメントを包含する：
ａ．配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１８と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｂ．配列番号２０と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号２２と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｃ．配列番号２４と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号２６と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｄ．配列番号４８と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号４６と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｅ．配列番号１０３と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１２６と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｆ．配列番号１０４と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１２７と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｇ．配列番号１０５と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１２８と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｈ．配列番号１０６と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１４５と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｉ．配列番号１０７と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１２８と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｊ．配列番号１０８と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３０と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｋ．配列番号１０９と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１４１と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｌ．配列番号１１０と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３１と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｍ．配列番号１１１と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３４と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｎ．配列番号１１２と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３５と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｏ．配列番号１１３と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３６と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｐ．配列番号１１４と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３３と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｑ．配列番号１１５と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１４０と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｒ．配列番号１１６と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３７と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｓ．配列番号１１７と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１４４と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｔ．配列番号１１８と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３９と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｕ．配列番号１１９と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３２と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｖ．配列番号１２０と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１４２と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｗ．配列番号１２１と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１３８と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｘ．配列番号１２２と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１４６と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｙ．配列番号１２３と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１４７と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域、
ｚ．配列番号１２４と少なくとも７０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、および配列番号１４３と少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖可変領域。
本発明によれば、変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、対応する軽鎖および／または重鎖可変領域のそれと同一のＣＤＲを含んでもよい。別の例では、変異体抗体または抗原結合性フラグメントは、変異体ＣＤＲを含んでもよい。
ゆえに、本発明の変異体抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態は、配列番号１６、２０、２４、１０３、１０６または１２１と少なくとも７０％、７５％、８０％同一の配列を含む軽鎖可変領域を含むものである。このような変異体のＣＤＲは、対応する非変異体（野生型配列）抗体または抗原結合性フラグメントのそれと同一であっても、または１〜３個のアミノ酸が異なっていてもよい。
変異体抗体軽鎖可変領域の別の例示的実施形態は、配列番号１６のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１６のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２２のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を包含する。配列番号１６変異体は、配列番号１６８に示される。
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２０のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２０のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２２のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を包含する。
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２４のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２４のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２１のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を包含する。配列番号２４変異体は、配列番号１７２に示される。
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１０３のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１０３のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２２のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を包含する。
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１０６のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１０６のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２２のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を包含する。
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１２１のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１２１のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２１のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を包含する。
場合によっては、変異体抗体の重鎖可変領域は、（アミノ酸置換と組み合わせた、またはアミノ酸置換を含まない）アミノ酸欠失または付加を含んでいてもよい。多くの場合、１、２、３、４または５個のアミノ酸欠失または付加が許容され得る。
ゆえに、本発明の変異体抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態は、配列番号１８、２２、２６、１２６、１３８または１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％同一の配列を含む重鎖可変領域を含むものである。このような変異体のＣＤＲは、対応する非変異体（野生型配列）抗体または抗原結合性フラグメントのそれと同一であっても、または１〜３個のアミノ酸が異なっていてもよい。
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１８のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１８のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２２のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を包含する。配列番号１８変異体は、配列番号１６９に示される。
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２２のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２２のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２３のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を包含する。
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２６のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号２６のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２３のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を包含する。配列番号２６変異体は、配列番号１７３に示される。
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１２６のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１２６のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２３のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を包含する。
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１４５のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１４５のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２３のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を包含する。
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１３８のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一のＣＤＲアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１３８のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域に例えば１〜２２のアミノ酸修飾（例えば、保存的または非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を包含する。
場合により、変異体抗体重鎖可変領域は、アミノ酸欠失または付加（アミノ酸置換と組み合わせて、または組み合わせずに）を含み得る。往々にして、１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸欠失または付加が許容され得る。
変異体ＣＤＲ
また本発明には、本発明に記載されている（元のＣＤＲと比較して）少なくとも１つのＣＤＲに少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド、抗体または抗原結合性フラグメントも含まれる。
本発明はさらに、（元のＣＤＲと比較して）少なくとも２つのＣＤＲの少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド、抗体または抗原結合性フラグメントも含む。
本発明はさらに、（元のＣＤＲと比較して）少なくとも３つのＣＤＲに少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド、抗体または抗原結合性フラグメントも含む。
本発明はさらに、（元のＣＤＲと比較して）少なくとも１つのＣＤＲに少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド、抗体または抗原結合性フラグメントも含む。
本発明はさらに、（元のＣＤＲと比較して）少なくとも２つのＣＤＲに少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド、抗体または抗原結合性フラグメントも含む。
本発明はさらに、（元のＣＤＲと比較して）少なくとも２つのＣＤＲに少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド、抗体または抗原結合性フラグメントも含む。
最も優れた特徴を示す軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列の比較によって、ＣＤＲ内および可変領域内の共通配列を取得することができた。ＣＤＲの共通配列は、配列番号７２〜８８に記載する。
ゆえに、例示的実施形態において、本発明は、以下：
ａ．配列番号７２および配列番号７３からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列、
ｂ．配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、
ｃ．配列番号７７、配列番号７８および配列番号７９からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
を有する軽鎖可変領域を含む、単離抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
ゆえに、例示的実施形態において、本発明は、以下：
ａ．配列番号８０を含むＣＤＲＨ１配列、
ｂ．配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４および配列番号８５からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、
ｃ．配列番号８６、配列番号８７および配列番号８８からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を有する軽鎖可変領域を含む、単離抗体または抗原結合性フラグメントを提供する。
本発明によれば、抗体は、下記式：
Ｘ１ａＳＳＸ２ａＳＬＬＸ３ａＸ４ａＸ５ａＸ６ａＸ７ａＸ８ａＸ９ａＸ１０ａＬＸ１１ａ（配列番号７２）
（式中、
Ｘ１ａは、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘ２ａは、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘ３ａは、Ｈ、ＹもしくはＮであってよく、
Ｘ４ａは、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＲであってよく、
Ｘ５ａは、非存在、ＳもしくはＮであってよく、
Ｘ６ａは、Ｄ、ＦもしくはＮであってよく、
Ｘ７ａは、ＧもしくはＱであってよく、
Ｘ８ａは、Ｋ、ＬもしくはＮであってよく、
Ｘ９ａは、ＴもしくはＮであってよく、
Ｘ１０ａは、芳香族アミノ酸であってよく、
Ｘ１１ａは、Ａ、Ｎ、ＥもしくはＹであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ１配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ａはＫまたはＲであってよい。
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ２ａはＱまたはＫであってよい。
本発明のさらに別の例示的実施形態において、Ｘ３ａはＮまたはＨであってよい。
本発明の別の実施形態において、Ｘ１０ａはＹまたはＦであってよい。
本発明のより具体的実施形態は、配列番号７２のＣＤＲＬ１を含み、ここで、Ｘ１ａはＫ、Ｘ２ａはＱ、Ｘ３ａはＮ、Ｘ３ａはＨ、Ｘ４ａはＳ、Ｘ４ａはＴ、Ｘ５ａはＳ、Ｘ５ａは非存在、Ｘ６ａはＮ、Ｘ７ａはＱ、Ｘ７ａはＧ、Ｘ８ａはＫ、Ｘ９ａはＮ、Ｘ９ａはＴ、Ｘ１０ａはＹ、またはＸ１１ａはＡである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＫＡＳＱＤＸ１ｂＸ２ｂＸ３ｂＸ４ｂＸ５ｂＸ６ｂ（配列番号７３）
（式中、
Ｘ１ｂは、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘ２ｂは、ＧもしくはＨであってよく、
Ｘ３ｂは、Ｔ、ＮもしくはＲであってよく、
Ｘ４ｂは、Ｆ、ＹもしくはＡであってよく、
Ｘ５ｂは、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘ６ｂは、ＮもしくはＡであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ１配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｂはＶまたはＩであってよい。
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ５ｂはＶまたはＬであってよい。
本発明のより具体的実施形態は、配列番号７３のＣＤＲＬ１を含み、ここで、Ｘ１ｂはＩ、Ｘ２ｂはＨ、Ｘ３ｂはＴ、Ｘ３ｂはＮ、Ｘ４ｂはＹ、Ｘ４ｂはＦ、Ｘ５ｂはＬ、またはＸ６ｂはＮである。
ＣＤＲＬ１の他の例示的実施形態を配列番号８９および９０に示す。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＦＸ１ｃＳＴＸ２ｃＸ３ｃＳ（配列番号７４）
（式中、
Ｘ１ｃは、ＡもしくはＧであり、
Ｘ２ｃは、ＲもしくはＴであり、
Ｘ３ｃは、Ｅ、ＫもしくはＡである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｃはＡであってよく、Ｘ２ｃはＴであってよい。
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ１ｃはＡであってよく、Ｘ２ｃはＲであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号７４のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｃはＡ、Ｘ２ｃはＲ、またはＸ３ｃはＥである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
Ｘ１ｄＶＳＸ２ｄＸ３ｄＸ４ｄＳ（配列番号７５）
（式中、
Ｘ１ｄは、ＬもしくはＫであってよく、
Ｘ２ｄは、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘ３ｄは、ＬもしくはＲであってよく、
Ｘ４ｄは、ＤもしくはＦであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｄはＫもしくはＮであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号７５のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｄはＬ、Ｘ２ｄはＫ、Ｘ３ｄはＬまたはＸ４ｄはＤである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
Ｘ１ｅＡＮＲＬＶＸ２ｅ（配列番号７６）
（式中、
Ｘ１ｅは、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘ２ｅは、ＤもしくはＡであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｅはＲまたはＨであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号７６のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｅはＲ、またはＸ２ｅはＤである。
ＣＤＲＬ２の他の具体的実施形態を配列番号９１〜９３に示す。
本発明によれば、抗体は、下記式：
Ｘ１ｆＱＸ２ｆＸ３ｆＸ４ｆＸ５ｆＰＬＴ（配列番号７７）
（式中、
Ｘ１ｆは、ＱもしくはＬであってよく、
Ｘ２ｆは、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘ３ｆは、Ｄ、ＦもしくはＹであってよく、
Ｘ４ｆは、Ｅ、Ａ、ＮもしくはＳであってよく、
Ｘ５ｆは、Ｉ、ＦもしくはＴであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｆはＹもしくはＨであってよい。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ３ｆはＹもしくはＤであってよい。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ５ｆはＩもしくはＴであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号７７のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ１ｆはＱ、Ｘ２ｆはＨ、Ｘ３ｆはＤ、Ｘ３ｆはＹ、Ｘ４ｆはＳ、Ｘ４ｆはＥ、Ｘ４ｆはＡ、Ｘ５ｆはＴ、またはＸ５ｆはＩである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＱＱＨＸ１ｇＸ２ｇＸ３ｇＰＬＴ（配列番号７８）
（式中、
Ｘ１ｇは、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘ２ｇは、ＮもしくはＳであってよく、
Ｘ３ｇは、ＩもしくはＳであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｇはＦまたはＹであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号７８のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ２ｇはＳ、またはＸ３ｇはＴである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
Ｘ１ｈＱＧＸ２ｈＨＸ３ｈＰＸ４ｈＴ（配列番号７９）
（式中、
Ｘ１ｈは、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘ２ｈは、中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘ３ｈは、ＦもしくはＶであってよく、
Ｘ４ｈは、ＲもしくはＬであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｈはＷまたはＦであってよい。
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ２ｈはＳまたはＴであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号７９のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ１ｈはＷ、Ｘ２ｈはＴ、Ｘ３ｈはＦ、またはＸ４ｈはＲである。
ＣＤＲＬ３の他の具体的実施形態を配列番号９４および９５に示す。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＧＹＸ１ｉＦＸ２ｉＸ３ｉＹＸ４ｉＸ５ｉＨ（配列番号８０）
（式中、
Ｘ１ｉは、Ｔ、ＩもしくはＫであってよく、
Ｘ２ｉは、中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘ３ｉは、酸性アミノ酸であってよく、
Ｘ４ｉは、Ｅ、ＮもしくはＤであってよく、
Ｘ５ｉは、疎水性アミノ酸であってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ１配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｉはＴもしくはＳであってよい。
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ３ｉはＤもしくはＥであってよい。
本発明のまた別の例示的実施形態において、Ｘ４ｉはＮもしくはＥであってよい。
本発明のさらに別の例示的実施形態において、Ｘ５ｉはＭ、Ｉもしくはｖであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号８０のＣＤＲＨ１を含み、ここで、Ｘ２ｉはＴ、Ｘ３ｉはＤ、Ｘ４ｉはＥ、またはＸ５ｉはＭである。
ＣＤＲＨ１の他の例示的実施形態を配列番号９６および９７に示す。
本発明によれば、抗体は、下記式：
Ｘ１ｊＸ２ｊＤＰＸ３ｊＴＧＸ４ｊＴＸ５ｊ（配列番号８１）
（式中、
Ｘ１ｊは、ＶもしくはＧであってよく、
Ｘ２ｊは、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘ３ｊは、Ａ、ＧもしくはＥであってよく、
Ｘ４ｊは、Ｒ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｓ、ＮもしくはＶであってよく、
Ｘ５ｊは、疎水性アミノ酸であってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｊはＩまたはＬであってよい。
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ５ｊはＡまたはＶであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号８１のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｊはＶであり、Ｘ２ｊはＩであり、Ｘ３ｊはＥであり、Ｘ４ｊはＤであり、またはＸ５ｊはＡである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＶＸ１ｋＤＰＸ２ｋＴＧＸ３ｋＴＡ（配列番号８２）
（式中、
Ｘ１ｋは、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘ２ｋは、Ａ、ＥもしくはＧであってよく、
Ｘ３ｋは、Ｒ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｎ、ＶもしくはＤであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｋはＬまたはＩであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号８２のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｋはＩであり、Ｘ２ｋはＥであり、Ｘ３ｋはＤである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＹＩＸ１ｌＸ２ｌＸ３ｌＧＸ４ｌＸ５ｌＸ６ｌ（配列番号８３）
（式中、
Ｘ１ｌは、ＳもしくはＮであってよく、
Ｘ２ｌは、芳香族アミノ酸であってよく、
Ｘ３ｌは、Ｄ、ＥもしくはＮであってよく、
Ｘ４ｌは、ＤもしくはＨであってよく、
Ｘ５ｌは、Ｙ、ＳもしくはＮであってよく、
Ｘ６ｌは、Ｄ、ＥもしくはＮであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ３ｌはＤまたはＮであってよい。
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ６ｌはＤまたはＮであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号８３のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ２ｌはＦもしくはＹ、Ｘ３ｌはＮ、Ｘ４ｌはＤ、またはＸ６ｌはＮである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
Ｘ１ｍＩＮＰＹＮＸ２ｍＶＴＥ（配列番号８４）
（式中、
Ｘ１ｍは、ＮもしくはＹであってよく、
Ｘ２ｍは、Ｅ、ＤもしくはＮであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｍはＤまたはＮであってよい。
本発明の他の具体的実施形態において、配列番号８４のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｍはＮ、またはＸ２ｍはＤである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＤＩＮＰＸ１ｎＹＧＸ２ｎＸ３ｎＴ（配列番号８５）
（式中、
Ｘ１ｎは、ＮもしくはＹであってよく、
Ｘ２ｎは、ＧもしくはＴであってよく、
Ｘ３ｎは、ＩもしくはＴであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
ＣＤＲＨ２の他の例示的実施形態を配列番号９８および９９に示す。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＭＸ１ｏＸ２ｏＸ３ｏＤＹ（配列番号８６）
（式中、
Ｘ１ｏは、ＧもしくはＳであってよく、
Ｘ２ｏは、ＹもしくはＨであってよく、
Ｘ３ｏは、ＡもしくはＳであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号８６のＣＤＲＨ３を含み、ここで、Ｘ１ｏはＧ、Ｘ２ｏはＹ、またはＸ３ｏはＳである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＩＸ１ｐＹＡＸ２ｐＤＹ（配列番号８７）
（式中、
Ｘ１ｐは、ＧもしくはＳであってよく、
Ｘ２ｐは、非存在もしくはＭであってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号８７のＣＤＲＨ３を含み、ここで、Ｘ１ｐはＳ、またはＸ２ｐはＭである。
本発明によれば、抗体は、下記式：
ＡＸ１ｑＸ２ｑＧＬＲＸ３ｑ（配列番号８８）
（式中、
Ｘ１ｑは、ＲもしくはＷであってよく、
Ｘ２ｑは、芳香族アミノ酸であってよく、
Ｘ３ｑは、塩基性アミノ酸であってよい）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｑはＷまたはＦであってよい。
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ３ｑはＱまたはＮであってよい。
本発明の他の具体的実施形態は、配列番号８８のＣＤＲＨ３を含み、ここで、Ｘ１ｑはＲ、Ｘ２ｑはＷ、またはＸ３ｑはＮである。
本発明に包含される変異体または抗原結合性フラグメントとしては、挿入、欠失、またはアミノ酸置換（保存的または非保存的）を含み得るものがある。これらの変異体は、そのアミノ酸配列中の少なくとも１種のアミノ酸残基が除去され、その代わりに別の残基が挿入されていてもよい。
ヒト化抗体
本発明の変異体抗体および抗原結合性フラグメントの例示的実施形態は、ＫＡＡＧ１に結合することができ、本明細書においてヒト化されているものとして特徴付けられる抗体および抗原結合性フラグメントの一群である。
本発明のヒト化抗体および抗原結合性フラグメントとして、より具体的には、ヒト化３Ｄ３、３Ｄ４または３Ｃ４抗体および抗原結合性フラグメントがある。ヒト化３Ｄ３、３Ｄ４または３Ｃ４抗体は、モノクローナル３Ｄ３、３Ａ４または３Ｃ４抗体と比較して、フレームワーク領域内に少なくとも１個のアミノ酸の違いを有する。
モノクローナル３Ａ４抗体のそれ（ＶＬ：配列番号４８、ＶＨ：配列番号４６）と同じＣＤＲを有するヒト化３Ａ４抗体を作製して、試験した。これらのヒト化抗体は、モノクローナル３Ａ４抗体と比較して、可変軽鎖フレームワーク領域内の１１以下（１〜１１）のアミノ酸置換と、可変重鎖フレームワーク領域内の２３以下（１〜２３）のアミノ酸置換を含む。本出願人は、上記のヒト化３Ａ４抗体が、モノクローナル３Ａ４抗体と同じくらい効率的にＫＡＡＧ１に結合することを明らかにした。
本発明の変異体抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態には、配列番号１８６に示す軽鎖可変領域を有するものが包含される。
配列番号１８６
ＤＸＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸＶＸＸＧＸＸＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸＧＴＸＬＥＸＫ（配列中、Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４８に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。アミノ酸置換は、例えば、天然ヒト抗体またはヒト抗体コンセンサスの対応する位置に見出されるアミノ酸であってもよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的であり得る。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントの別の例示的実施形態には、配列番号１８７に示す軽鎖可変領域を有するものが包含される。
配列番号１８７
ＤＸｅ１ＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸｅ２ＶＸｅ３Ｘｅ４ＧＸｅ５Ｘｅ６ＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸｅ７ＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸｅ８ＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸｅ９ＧＴＸｅ１０ＬＥＸｅ１１Ｋ
（配列中、
Ｘｅ１は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｅ２は、ＡもしくはＰであってよく、
Ｘｅ３は、中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘｅ４は、ＬもしくはＰであってよく、
Ｘｅ５は、酸性アミノ酸であってよく、
Ｘｅ６は、ＱもしくはＰであってよく、
Ｘｅ７は、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｅ８は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｅ９は、ＡもしくはＱであってよく、
Ｘｅ１０は、塩基性アミノ酸であってよく、または
Ｘｅ１１は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘにより同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４８に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントの付加的な例示的実施形態には、配列番号１８８に示す軽鎖可変領域を有するものが含まれる：
配列番号１８８
ＤＸＥ１ＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸＥ２ＶＸＥ３ＸＥ４ＧＸＥ５ＸＥ６ＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸＥ７ＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸＥ８ＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸＥ９ＧＴＸＥ１０ＬＥＸＥ１１Ｋ
（配列中、
ＸＥ１は、ＶもしくはＩであってよく、
ＸＥ２は、ＡもしくはＰであってよく、
ＸＥ３は、ＳもしくはＴであってよく、
ＸＥ４は、ＬもしくはＰであってよく、
ＸＥ５は、ＤもしくはＥであってよく、
ＸＥ６は、ＱもしくはＰであってよく、
ＸＥ７は、ＫもしくはＱであってよく、
ＸＥ８は、ＬもしくはＶであってよく、
ＸＥ９は、ＡもしくはＱであってよく、
ＸＥ１０は、ＲもしくはＫであってよく、または
ＸＥ１１は、ＬもしくはＩであってよく、
Ｘにより同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４８に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
一実施形態によれば、軽鎖可変ドメイン変異体は、配列番号１８９または１９０に示す配列を有していてもよい。
配列番号１８９
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
配列番号１９０
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
本発明の変異体抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態には、配列番号１９１に示す重鎖可変領域を有するものが包含される。
配列番号１９１
ＱＸＱＬＶＱＳＧＸＥＸＸＫＰＧＡＳＶＫＸＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸＱＸＸＧＸＸＬＥＷＸＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸＸＸＸＴＸＤＸＳＸＳＴＡＹＭＸＬＸＳＬＸＳＥＤＸＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸＶＴＶＳＳ
（配列中、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４６に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。アミノ酸置換は、例えば、天然ヒト抗体またはヒト抗体コンセンサスの対応する位置に見出されるアミノ酸であってもよい。アミノ酸置換は、例えば、保存的であり得る。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントの別の例示的実施形態は、配列番号１９２に示す重鎖可変領域を有するものを含む。
配列番号１９２
ＱＸｆ１ＱＬＶＱＳＧＸｆ２ＥＸｆ３Ｘｂｆ４ＫＰＧＡＳＶＫＸｆ５ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸｆ６ＱＸｆ７Ｘｆ８ＧＸｆ９Ｘｆ１０ＬＥＷＸｆ１１ＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸｆ１２Ｘｆ１３Ｘｂ１４Ｘｆ１５ＴＸｆ１６ＤＸｆ１７ＳＸｆ１８ＳＴＡＹＭＸｆ１９ＬＸｆ２０ＳＬＸｆ２１ＳＥＤＸｆ２２ＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸｆ２３ＶＴＶＳＳ
（配列中、
Ｘｆ１は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ２は、ＰもしくはＡであってよく、
Ｘｆ３は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ４は、ＶもしくはＫであってよく、
Ｘｆ５は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ６は、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ７は、ＳもしくはＡであってよく、
Ｘｆ８は、ＨもしくはＰであってよく、
Ｘｆ９は、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ１０は、ＳもしくはＧであってよく、
Ｘｆ１１は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ１２は、塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ１３は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ１４は、ＩもしくはＴであってよく、
Ｘｆ１５は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ１６は、疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ１７は、ＫもしくはＴであってよく、
Ｘｆ１８は、中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘｆ１９は、ＱもしくはＥであってよく、
Ｘｆ２０は、ＮもしくはＳであってよく、
Ｘｆ２１は、ＴもしくはＲであってよく、
Ｘｆ２２は、中性親水性アミノ酸であってよく、または
Ｘｆ２３は、ＳもしくはＬであってよく、
Ｘにより同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４６に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
変異体抗体または抗原結合性フラグメントの付加的な例示的実施形態には、配列番号１９３に示す重鎖可変領域を有するものが含まれる：
配列番号１９３
ＱＸＦ１ＱＬＶＱＳＧＸＦ２ＥＸＦ３ＸＦ４ＫＰＧＡＳＶＫＸＦ５ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸＦ６ＱＸＦ７ＸＦ８ＧＸＦ９ＸＦ１０ＬＥＷＸＦ１１ＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸＦ１２ＸＦ１３ＸＦ１４ＸＦ１５ＴＸＦ１６ＤＸＦ１７ＳＸＦ１８ＳＴＡＹＭＸＦ１９ＬＸＦ２０ＳＬＸＦ２１ＳＥＤＸＦ２２ＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸＦ２３ＶＴＶＳＳ
（配列中、
ＸＦ１は、ＩもしくはＶであってよく、
ＸＦ２は、ＰもしくはＡであってよく、
ＸＦ３は、ＭもしくはＶであってよく、
ＸＦ４は、ＶもしくはＫであってよく、
ＸＦ５は、ＭもしくはＶであってよく、
ＸＦ６は、ＫもしくはＲであってよく、
ＸＦ７は、ＳもしくはＡであってよく、
ＸＦ８は、ＨもしくはＰであってよく、
ＸＦ９は、ＫもしくはＱであってよく、
ＸＦ１０は、ＳもしくはＧであってよく、
ＸＦ１１は、ＩもしくはＭであってよく、
ＸＦ１２は、ＫもしくはＲであってよく、
ＸＦ１３は、ＡもしくはＶであってよく、
ＸＦ１４は、ＩもしくはＴであってよく、
ＸＦ１５は、ＬもしくはＩであってよく、
ＸＦ１６は、ＶもしくはＡであってよく、
ＸＦ１７は、ＫもしくはＴであってよく、
ＸＦ１８は、ＳもしくはＴであってよく、
ＸＦ１９は、ＱもしくはＥであってよく、
ＸＦ２０は、ＮもしくはＳであってよく、
ＸＦ２１は、ＴもしくはＲであってよく、
ＸＦ２２は、ＳもしくはＴであってよく、または
ＸＦ２３は、ＳもしくはＬであり、
Ｘにより同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４６に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
実施形態によれば、重鎖可変ドメイン変異体は、配列番号１９４〜１９７のいずれか１つに示す配列を有し得る。
配列番号１９４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
配列番号１９５
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
配列番号１９６
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
配列番号１９７
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
本発明の実施形態によれば、ヒト化３Ｄ３抗体は、下記式：
（ここで、Ｘにより同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号１６に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）
の軽鎖可変領域を含み得る。アミノ酸置換は、例えば、保存的であってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｄ３抗体は、下記式：
（配列中、
ＸＡ１は、例えばＤもしくはＳであってよく、
ＸＡ２は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＬもしくはＩであってよく、
ＸＡ３は、例えばＥもしくはＱであってよく、
ＸＡ４は、例えば塩基性アミノ酸、またはより具体的にはＲもしくはＫであってよく、
ＸＡ５は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＡもしくはＶであってよく、
ＸＡ６は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＩもしくはＭであってよく、
ＸＡ７は、例えばＰもしくはＳであってよく、
ＸＡ８は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＶもしくはＩであってよく、
ＸＡ９は、例えばＳもしくはＩであってよく、
ＸＡ１０は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＬもしくはＶであってよく、
ＸＡ１１は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＶもしくはＬであってよく、
ＸＡ１２は、例えばＶもしくはＤであってよく、
ＸＡ１３は、例えば芳香族アミノ酸、またはより具体的にはＹもしくはＦであってよく、
ＸＡ１４は、例えばＱもしくはＡであってよく、
ＸＡ１５は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＩもしくはＬであってよい）
の軽鎖可変領域を含み得る。
本発明のさらにまた具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｄ３抗体は、下記式：
（配列中、
Ｘａ１は、例えばＤもしくはＳであってよく、
Ｘａ２は、例えばＬもしくはＩであってよく、
Ｘａ３は、例えばＥもしくはＱであってよく、
Ｘａ４は、例えばＲもしくはＫであってよく、
Ｘａ５は、例えばＡもしくはＶであってよく、
Ｘａ６は、例えばＩもしくはＭであってよく、
Ｘａ７は、例えばＰもしくはＳであってよく、
Ｘａ８は、例えばＶもしくはＩであってよく、
Ｘａ９は、例えばＳもしくはＩであってよく、
Ｘａ１０は、例えばＬもしくはＶであってよく、
Ｘａ１１は、例えばＶもしくはＬであってよく、
Ｘａ１２は、例えばＶもしくはＤであってよく、
Ｘａ１３は、例えばＹもしくはＦであってよく、
Ｘａ１４は、例えばＱもしくはＡであってよく、
Ｘａ１５は、例えばＩもしくはＬであってよい）
の軽鎖可変領域を含み得る。
本発明の実施形態によれば、ヒト化３Ｄ３抗体は、下記式：
（ここで、Ｘにより同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号１８に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）
の重鎖可変領域を含み得る。アミノ酸置換は、例えば、保存的であってよい。
本発明のさらにまた具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｄ３抗体は、下記式：
（配列中、
ＸＢ１は、例えばＶもしくはＱであってよく、
ＸＢ２は、例えばＧもしくはＶであってよく、
ＸＢ３は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＶもしくはＬであってよく、
ＸＢ４は、例えばＫもしくＶであってよく、
ＸＢ５は、例えば塩基性アミノ酸、またはより具体的にはＫもしくはＲであってよく、
ＸＢ６は、例えばＫもしくはＴであってよく、
ＸＢ７は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＶもしくはＬであってよく、
ＸＢ８は、例えば塩基性アミノ酸、またはより具体的にはＲもしくはＫであってよく、
ＸＢ９は、例えばＡもしくはＴであってよく、
ＸＢ１０は、例えばＧもしくはＶであってよく、
ＸＢ１１は、例えばＱもしくはＨであってよく、
ＸＢ１２は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＭもしくはＩであってよく、
ＸＢ１３は、例えば塩基性アミノ酸、またはより具体的にはＲもしくはＫであってよく、
ＸＢ１４は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＶもしくはＡであってよく、
ＸＢ１５は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＩもしくはＬであってよく、
ＸＢ１６は、例えばＴもしくはＩであってよく、
ＸＢ１７は、例えば中性親水性アミノ酸、またはより具体的にはＴもしくはＳであってよく、
ＸＢ１８は、例えば中性親水性アミノ酸、またはより具体的にはＴもしくはＳであってよく、
ＸＢ１９は、例えばＬもしくはＴであってよく、
ＸＢ２０は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＶもしくはＬであってよい）
の重鎖可変領域を含み得る。
本発明のさらにまた具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｄ３抗体は、下記式：
（配列中、
Ｘｂ１は、例えばＶもしくはＱであってよく、
Ｘｂ２は、例えばＧもしくはＶであってよく、
Ｘｂ３は、例えばＶもしくはＬであってよく、
Ｘｂ４は、例えばＫもしくＶであってよく、
Ｘｂ５は、例えばＫもしくはＲであってよく、
Ｘｂ６は、例えばＫもしくはＴであってよく、
Ｘｂ７は、例えばＶもしくはＬであってよく、
Ｘｂ８は、例えばＲもしくはＫであってよく、
Ｘｂ９は、例えばＡもしくはＴであってよく、
Ｘｂ１０は、例えばＧもしくはＶであってよく、
Ｘｂ１１は、例えばＱもしくはＨであってよく、
Ｘｂ１２は、例えばＭもしくはＩであってよく、
Ｘｂ１３は、例えばＲもしくはＫであってよく、
Ｘｂ１４は、例えばＶもしくはＡであってよく、
Ｘｂ１５は、例えばＩもしくはＬであってよく、
Ｘｂ１６は、例えばＴもしくはＩであってよく、
Ｘｂ１７は、例えばＴもしくはＳであってよく、
Ｘｂ１８は、例えばＴもしくはＳであってよく、
Ｘｂ１９は、例えばＬもしくはＴであってよく、
Ｘｂ２０は、例えばＶもしくはＬであってよい）
の重鎖可変領域を含み得る。
本発明の実施形態によれば、ヒト化３Ｃ４抗体は、下記式：
（ここで、Ｘにより同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号２４に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）
の軽鎖可変領域を含み得る。アミノ酸置換は、例えば、保存的であってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｃ４抗体は、下記式：
（配列中、
ＸＣ１は、例えば中性疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＴもしくはＳであってよく、
ＸＣ２は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＬもしくはＭであってよく、
ＸＣ３は、例えばＳもしくはＹであってよく、
ＸＣ４は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＶもしくＬであってよく、
ＸＣ５は、例えば酸性アミノ酸、またはより具体的にはＤもしくはＥであってよく、
ＸＣ６は、例えばＡもしくはＳであってよく、
ＸＣ７は、例えばＴもしくはＱであってよく、
ＸＣ８は、例えば中性疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＴもしくはＳであってよく、
ＸＣ９は、例えばＱもしくはＥであってよく、
ＸＣ１０は、例えばＰもしくはＦであってよく、
ＸＣ１１は、例えばＦもしくはＬであってよく、
ＸＣ１２は、例えばＡもしくはＧであってよく、
ＸＣ１３は、例えばＴもしくはＩであってよく、
ＸＣ１４は、例えばＱもしくはＡであってよく、
ＸＣ１５は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＩもしくはＬであってよく、
Ｘｃ１６は、例えば塩基性アミノ酸、またはより具体的にはＫもしくはＲであってよい）
の軽鎖可変領域を含み得る。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｃ４抗体は、下記式：
（配列中、
Ｘｃ１は、例えばＴもしくはＳであってよく、
Ｘｃ２は、例えばＬもしくはＭであってよく、
Ｘｃ３は、例えばＳもしくはＹであってよく、
Ｘｃ４は、例えばＶもしくＬであってよく、
Ｘｃ５は、例えばＤもしくはＥであってよく、
Ｘｃ６は、例えばＡもしくはＳであってよく、
Ｘｃ７は、例えばＴもしくはＱであってよく、
Ｘｃ８は、例えばＴもしくはＳであってよく、
Ｘｃ９は、例えばＱもしくはＥであってよく、
Ｘｃ１０は、例えばＰもしくはＦであってよく、
Ｘｃ１１は、例えばＦもしくはＬであってよく、
Ｘｃ１２は、例えばＡもしくはＧであってよく、
Ｘｃ１３は、例えばＴもしくはＩであってよく、
Ｘｃ１４は、例えばＱもしくはＡであってよく、
Ｘｃ１５は、例えばＩもしくはＬであってよく、
Ｘｃ１６は、例えばＫもしくはＲであってよい）
の軽鎖可変領域を含み得る。
本発明の具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｃ４抗体は、下記式：
（ここで、Ｘにより同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号２６に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）
の重鎖可変領域を含み得る。アミノ酸置換は、例えば保存的であってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｃ４抗体は、下記式：
（配列中、
ＸＤ１は、例えばＧもしくはＤであってよく、
ＸＤ２は、例えば中性疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＴもしくはＳであってよく、
ＸＤ３は、例えば中性疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＳもしくはＴであってよく、
ＸＤ４は、例えばＨもしくＦであってよく、
ＸＤ５は、例えばＫもしくはＮであってよく、
ＸＤ６は、例えばＧもしくはＫであってよく、
ＸＤ７は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＩもしくはＭであってよく、
ＸＤ８は、例えば疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＶもしくはＩであってよく、
ＸＤ９は、例えば中性疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＴもしくはＳであってよく、
ＸＤ１０は、例えば中性疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＳもしくはＴであってよく、
ＸＤ１１は、例えば中性疎水性アミノ酸、またはより具体的にはＳもしくはＦであってよく、
ＸＤ１２は、例えば塩基性アミノ酸、またはより具体的にはＫもしくはＱであってよく、
ＸＤ１３は、例えばＳもしくはＮであってよく、
ＸＤ１４は、例えばＡもしくはＴであってよく、
ＸＤ１５は、例えばＡもしくはＥであってよく、
ＸＤ１６は、例えばＶもしくはＴであってよく、
ＸＤ１７は、例えばＡもしくは非存在であってよい）
の重鎖可変領域を含み得る。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、ヒト化３Ｃ４抗体は、下記式：
（配列中、
Ｘｄ１は、例えばＧもしくはＤであってよく、
Ｘｄ２は、例えばＴもしくはＳであってよく、
Ｘｄ３は、例えばＳもしくはＴであってよく、
Ｘｄ４は、例えばＨもしくＦであってよく、
Ｘｄ５は、例えばＫもしくはＮであってよく、
Ｘｄ６は、例えばＧもしくはＫであってよく、
Ｘｄ７は、例えばＩもしくはＭであってよく、
Ｘｄ８は、例えばＶもしくはＩであってよく、
Ｘｄ９は、例えばＴもしくはＳであってよく、
Ｘｄ１０は、例えばＳもしくはＴであってよく、
Ｘｄ１１は、例えばＳもしくはＦであってよく、
Ｘｄ１２は、例えばＫもしくはＱであってよく、
Ｘｄ１３は、例えばＳもしくはＮであってよく、
Ｘｄ１４は、例えばＡもしくはＴであってよく、
Ｘｄ１５は、例えばＡもしくはＥであってよく、
Ｘｄ１６は、例えばＶもしくはＴであってよく、
Ｘｄ１７は、例えばＡもしくは非存在であってよい）
の重鎖可変領域を含み得る。
従って、本発明は、一形態において、配列番号１６に対して少なくとも７０％同一である軽鎖可変領域および／または配列番号１８に対して少なくとも７０％同一である重鎖可変領域を有し得る腎臓関連抗原１（ＫＡＡＧ１）に特異的に結合する能力がある、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。前記抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１６または配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
本発明は、別の形態において、配列番号２４に対して少なくとも７０％同一である軽鎖可変領域および／または配列番号２６に対して少なくとも７０％同一である重鎖可変領域を有し得る、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。前記抗体またはその抗原結合性フラグメントはまた、配列番号２４または配列番号２６と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
本発明は、別の形態において、配列番号４８に対して少なくとも７０％同一である軽鎖可変領域および／または配列番号４６に対して少なくとも７０％同一である重鎖可変領域を有し得る、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。抗体またはその抗原結合性フラグメントはまた、配列番号４８または配列番号４６と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。
本発明の一実施形態によれば、アミノ酸置換は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の外部にあってもよい。このようなアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば、ヒト化抗体または抗原結合性フラグメントを包含する。
本明細書で用いる「１〜２５」という用語は、すべての個々の値を含み、例えば、１、２、３、及び２５まで；１〜２５；１〜２４、１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９；１〜１８；１〜１７；１〜１６；１〜１５等々；２〜２５、２〜２４、２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０；２〜１９；２〜１８；２〜１７等々；３〜２５、３〜２４、３〜２３、３〜２２、３〜２１、３〜２０；３〜１９；３〜１８等々；４〜２５、４〜２４、４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９；４〜１８；４〜１７；４〜１６等々；５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０；５〜１９；５〜１８；５〜１７等々の範囲である。
本明細書で用いる「１〜２３」という用語は、すべての個々の値を含み、例えば、１、２、３、及び２３まで；１〜２３、１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９；１〜１８；１〜１７、１〜１６；１〜１５等々；２〜２３、２〜２２、２〜２１、２〜２０；２〜１９；２〜１８；２〜１７等々；３〜２３、３〜２２、３〜２１、３〜２０；３〜１９；３〜１８等々；４〜２３、４〜２２、４〜２１、４〜２０；４〜１９；４〜１８；４〜１７；４〜１６等々；５〜２５、５〜２４、５〜２３、５〜２２、５〜２１、５〜２０；５〜１９；５〜１８；５〜１７等々の範囲である。
本明細書で用いる「１〜２０」という用語は、すべての個々の値を含み、例えば、１、２、３、及び２０まで；１〜２０；１〜１９；１〜１８；１〜１７；１〜１６；１〜１５等々；２〜２０；２〜１９；２〜１８；２〜１７等々；３〜２０；３〜１９；３〜１８等々；４〜２０；４〜１９；４〜１８；４〜１７；４〜１６等々；５〜２０；５〜１９；５〜１８；５〜１７等々の範囲である。
本明細書で用いる「１〜１５」という用語は、すべての個々の値を含み、例えば、１、２、３、及び１５まで；１〜１５；１〜１４；１〜１３；１〜１２；１〜１１；１〜１０等々；２〜１５；２〜１４；２〜１３；２〜１２等々；３〜１５；３〜１４；３〜１３等々；４〜１５；４〜１４；４〜１３；４〜１２；４〜１１等々；５〜１５；５〜１４；５〜１３；５〜１２等々の範囲である。
本明細書で用いる「１〜１１」という用語は、すべての個々の値を含み、例えば、１、２、３、及び１１まで；１〜１１；１〜１０；１〜９；１〜８；１〜７等々；２〜１１；２〜１０；２〜９；２〜８等々；３〜１１；３〜１０；３〜９等々；４〜１１；４〜１０；４〜９；４〜８；４〜７等々；５〜１１；５〜１０；５〜９；５〜８等々の範囲である。
本発明のより具体的実施形態では、配列番号１６に由来するヒト化軽鎖可変領域に適合しうるアミノ酸置換の数は、例えば、１〜１５のアミノ酸置換であってよい。
本発明のさらに具体的実施形態では、配列番号１８に由来するヒト化重鎖可変領域に適合しうるアミノ酸置換の数は、例えば、１〜２０のアミノ酸置換であってよい。いくつかの例では、配列番号１８のヒト化形態を考慮する場合、少なくとも３つのアミノ酸置換を有するのが有用でありうる。
本発明のさらにまた具体的実施形態では、配列番号２４に由来するヒト化軽鎖可変領域に適合しうるアミノ酸置換の数は、例えば、１〜１６のアミノ酸置換であってよい。
本発明のさらにまた具体的実施形態では、配列番号２６のヒト化重鎖可変領域に適合しうるアミノ酸置換の数は、例えば、１〜１７のアミノ酸置換であってよい。
本発明のさらにまた具体的実施形態では、配列番号４８に由来するヒト化軽鎖可変領域に適合しうるアミノ酸置換の数は、例えば、１〜１１のアミノ酸置換であってよい。
本発明のさらにまた具体的実施形態では、配列番号４６のヒト化重鎖可変領域に適合しうるアミノ酸置換の数は、例えば、１〜２３のアミノ酸置換であってよい。
本発明の一実施形態によれば、１〜２０のアミノ酸置換は、例えば、軽鎖可変領域において存在し得る。
本発明の一実施形態によれば、１〜２０のアミノ酸置換は、例えば、重鎖可変領域において存在し得る。
ゆえに、ヒト化抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号１６または配列番号２４と比べて２０以下のアミノ酸置換を有する軽鎖可変領域を含み得ると共に、配列番号１８または配列番号２６と比べて２０以下のアミノ酸置換を有する重鎖可変領域を含み得る。ゆえに、ヒト化抗体または抗原結合性フラグメントは、配列番号４８と比べて２５以下のアミノ酸置換を有する軽鎖可変領域を含み得ると共に、配列番号４６と比べて２５以下のアミノ酸置換を有する重鎖可変領域を含み得る。
本明細書において、ヒト化抗体または抗原結合性フラグメントが２つの軽鎖可変領域と２つの重鎖可変領域を有する場合、軽鎖可変領域の各々は、独立に２５以下、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１つのアミノ酸置換を含み得ると共に、重鎖可変領域の各々は、２５以下、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１つのアミノ酸置換を含み得ることを理解すべきである。
本明細書に記載するように、アミノ酸置換は、保存的または非保存的のいずれであってもよい。例示的実施形態では、アミノ酸置換は保存的であってよい。
本明細書において、本発明のヒト化抗体または抗原結合性フラグメントはまた、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号２４および／または配列番号２６と比べて、欠失を示す軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を有し得る。このような欠失は、例えば、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のアミノ基またはカルボキシ基に存在してよい。
本発明のヒト化抗体または抗原結合性フラグメントの別の例示的実施形態は、例えば、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９または配列番号１９０のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域を有する抗体または抗原結合性フラグメントを包含する。
本明細書において、「配列番号１８６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、または少なくとも１１２個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１８６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１８６に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、特に、配列番号１８６の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１８６のアミノ酸６〜１０８、５〜１０９、１３〜１０３、１４〜１１１等々を含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号１８７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、または少なくとも１１２個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１８７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１８７に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、特に、配列番号１８７の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１８７のアミノ酸７〜１０９、１２〜１０４、２２〜１１３、１８〜１１２等々を含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号１８８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、「配列番号１８９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」または「配列番号１９０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１８９または１９０に示す軽鎖可変領域を有していてもよい。
本発明のヒト化抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６または１９７のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域を含む（または、さらに含む）。
本明細書において、「配列番号１９１の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５または少なくとも１１６個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１９１の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１９１に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、特に、配列番号１９１の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１９１のアミノ酸１〜１０６、２〜１１２、１１〜１１３、７〜１０２等々を含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号１９２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５または少なくとも１１６個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１９２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１９２に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、特に、配列番号１９２の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１９２のアミノ酸６〜１０９、８〜１１３、１〜１０２、２〜１０５等々を含む配列を包含する。
「配列番号１９３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、「配列番号１９４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、「配列番号１９５の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、「配列番号１９６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」、または「配列番号１９７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１９４、１９５、１９６または１９７に示す重鎖可変領域を有していてもよい。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、以下のものを含み得る：
ａ）配列番号１８６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６または配列番号１９７のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｂ）配列番号１８７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６または配列番号１９７のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｃ）配列番号１８８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６または配列番号１９７のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｄ）配列番号１８９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６または配列番号１９７のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｅ）配列番号１９０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６または配列番号１９７のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域。
本発明のより具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１８９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含んでよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９４、１９５、１９６または１９７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含んでよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１８９に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９４に示す通りであってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１８９に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９５に示す通りであってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１８９に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９６に示す通りであってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１８９に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９７に示す通りであってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１９０に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９４に示す通りであってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１９０に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９５に示す通りであってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１９０に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９６に示す通りであってよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１９０に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１９７に示す通りであってよい。
本発明のヒト化抗体または抗原結合性フラグメントの別の例示的実施形態は、例えば、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、または配列番号１６８のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域を有する抗体または抗原結合性フラグメントを包含する。
本明細書において、「配列番号１７４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２または少なくとも１１３個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１７４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１７４に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号１７４の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１７４のアミノ酸６〜１０８、５〜１０９、１３〜１０３、１４〜１１１等々を含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号１７５の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２または少なくとも１１３個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１７５の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１７５に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号１７５の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１７５のアミノ酸７〜１０９、１２〜１０４、２２〜１１３、１８〜１１２等々を含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号１７６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」または「配列番号１６８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１６８に示す軽鎖可変領域を有していてもよい。
本発明のヒト化抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１７７、１７８、１７９または１６９のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域を含む（または、さらに含む）。
本明細書において、「配列番号１７７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２または少なくとも１１３個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１７７の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１７７に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号１７７の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１７７のアミノ酸１〜１０６、２〜１１２、１１〜１１３、７〜１０２等々を含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号１７８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２または少なくとも１１３個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１７８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１７８に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号１７８の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１７８のアミノ酸６〜１０９、８〜１１３、１〜１０２、２〜１０５等々を含む配列を包含する。
「配列番号１７９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」または「配列番号１６９の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１６９に示す重鎖可変領域を有していてもよい。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、以下のものを含み得る：
ｆ）配列番号１７４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９または配列番号１６９のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｇ）配列番号１７５の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９または配列番号１６９のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｈ）配列番号１７６の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９または配列番号１６９のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｉ）配列番号１６８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９または配列番号１６９のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域。
本発明のより具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１６８の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含んでよく、重鎖可変領域は、配列番号１６９のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含んでよい。
本発明のさらに具体的な実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１６８に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１６９に示す通りであってよい。
本発明のヒト化抗体または抗原結合性フラグメントの他の例示的実施形態は、配列番号１８０、１８１、１８２または１７２のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域を含み得るものである。
本明細書において、「配列番号１８０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６または少なくとも１０７個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１８０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１８０に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号１８０の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１８０のアミノ酸６〜１０２、１１〜１０６、１〜１０６、３〜９５、５〜９５等々を含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号１８１の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６または少なくとも１０７個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１８１の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１８１に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号１８１の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１８１のアミノ酸９〜１０６、１０〜１０１、１〜９８、３〜９９、７〜１０７等々を含む配列を包含する。
「配列番号１８２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」または「配列番号１７２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１７２に示す軽鎖可変領域を有していてもよい。
本発明のヒト化抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１８３、１８４、１８５または１７３のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域を含む（または、さらに含む）。
本明細書において、「配列番号１８３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５または少なくとも１１６個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１８３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１８３に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号１８３の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１８３のアミノ酸６〜１１１、１〜１０６、２〜１０４、５〜１０６、１０〜１０７等々を含む配列を包含する。
本明細書において、「配列番号１８５の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語には、「少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５または少なくとも１１６個の連続したアミノ酸」という用語も包含される。「配列番号１８５の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」という用語は、配列番号１８５に存在する少なくとも９０個の連続したアミノ酸の考えられるあらゆる配列、ならびに特に、配列番号１８５の３つのＣＤＲを含む配列、例えば、配列番号１８５のアミノ酸３〜１０７、１〜１１５、１〜１１０、２２〜１１６、２０〜１１５等々を含む配列を包含する。
「配列番号１８４の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」または「配列番号１７３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸」といった用語も同様の意味を有する。
本発明によれば、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、配列番号１７３に示す重鎖可変領域を有していてもよい。
本発明によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、以下のものを含み得る：
ａ）配列番号１８０の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、または配列番号１７３のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｂ）配列番号１８１の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、または配列番号１７３のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｃ）配列番号１８２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、または配列番号１７３のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域、
ｄ）配列番号１７２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る軽鎖可変領域と、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、または配列番号１７３のいずれかの少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含み得る重鎖可変領域。
本発明のより具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１７２の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含んでよく、また重鎖可変領域は、配列番号１７３の少なくとも９０個の連続したアミノ酸を含んでよい。
本発明のさらに具体的実施形態によれば、軽鎖可変領域は、配列番号１７２に示す通りであってよく、また重鎖可変領域は、配列番号１７３に示す通りであってよい。
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、上に記載した軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含んでよく、また、定常領域のアミノ酸、例えばヒト抗体の定常領域のアミノ酸をさらに含んでもよい。
例示的実施形態において、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を含んでよい。
別の例示的実施形態によれば、抗体または抗原結合性フラグメントは、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくは（Ｆａｂ’）２であってもよい。
細胞における抗体の産生
本明細書において開示されている抗ＫＡＡＧ１抗体は、ハイブリドーマ技術または組み換えＤＮＡ法などの、当業者によく知られている様々な方法で製造することができる。
本発明の例示的実施形態において抗ＫＡＡＧ１抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって生成することが可能であり、このハイブリドーマ技術においては、マウスを抗原で免疫化し、脾臓細胞を単離し、ＨＧＰＲＴ発現が欠失した骨髄腫細胞、ならびにヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミン（ＨＡＴ）含有培地によって選択されるハイブリッド細胞と融合する。
本発明の付加的な例示的実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体は、組み換えＤＮＡ方法によって生成され得る。
抗ＫＡＡＧ１抗体を発現させるために、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つまたはその他をコードできるヌクレオチド配列を、発現ベクター（即ち、特定の宿主に挿入されたコーディング配列の転写用および翻訳制御用のエレメントを含むベクター）に挿入してもよい。これらのエレメントは、エンハンサー、構成プロモータ、誘導性プロモータ、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域などの調節配列を含んでいてもよい。当業者に周知の方法を使用すれば、この種の発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが挙げられる。
本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列由来のポリペプチドまたはＲＮＡを発現させる目的に利用可能な発現ベクター／宿主細胞系としては、当業者に公知の様々なものがあり得る。これらには、組み換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミッドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；バクロウイルスベクターに感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクターもしくは細菌発現ベクターで形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるが、これらに限定されない。哺乳類系における組み換えタンパク質の長期産生のために、細胞系における安定な発現を実施できる。例えば、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列は、同じかまたは別のベクター上にウイルス性複製起点および／または内因性発現エレメント、ならびに選択可能遺伝子または可視マーカ遺伝子を含み得る発現ベクターを使用して細胞系中に形質転換され得る。本発明は、使用されるベクターまたは宿主細胞に制限されない。本発明の或る実施形態において、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を、それぞれ別の発現ベクター中にリゲートさせて、各鎖を別々に発現させ得る。別の実施形態において、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできる軽鎖および重鎖の両方を、１つの発現ベクター中にリゲートさせて、同時に発現させ得る。
別法として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系またはカップリングしたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系をそれぞれ使用して、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を含むベクターから、ＲＮＡおよび／またはポリペプチドを発現させてもよい。
一般的に、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を含有する宿主細胞、ならびに／または本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を介してコードされるポリペプチドを発現する宿主細胞もしくはその一部は、当業者に公知の様々な手順で同定され得る。これらの手順としては、ＤＮＡ／ＤＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、ならびに核酸もしくはアミノ酸配列の検出、および／または定量を目的とする膜ベース、溶液ベースもしくはチップベースの技術を包含するタンパク質バイオアッセイ、または免疫測定技術が挙げられるが、これらに限定されない。特異的ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用してポリペプチドの発現を検出し測定するための免疫学的方法は、当該技術分野において公知である。そのような技術の例としては、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光性活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。当業者であれば、これらの方法論を本発明に容易に適合させることができるであろう。
したがって、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、対応するＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ＳｉＲＮＡ、ＳｈＲＮＡなど）を転写させるための条件下で、および／または細胞培養物からポリペプチドを発現させるための条件下で培養できる。細胞が産生したポリペプチドは、配列および／または使用されたベクターに応じて分泌されることもあれば、細胞内に保持されることもあり得る。例示的実施形態において、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を含有する発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜経由でのポリペプチド分泌を指図するシグナル配列を含むように設計できる。
遺伝コードに固有の縮重のため、同じであるか実質的に同じあるかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を産生でき、そのＤＮＡ配列を使用して、例えば、本明細書に記載されている軽および重免疫グロブリン鎖のいずれか１つをコードできるヌクレオチド配列を介してコードされるポリペプチドを発現させることができる。本発明のヌクレオチド配列を、当該技術分野において一般的に公知の方法を使用してエンジニアリングすることによって、限定はされないが、遺伝子産物のクローニング、プロセッシングおよび／または発現の修飾を含む様々な目的に対応するようにヌクレオチド配列を改変できる。ヌクレオチド配列をエンジニアリングする場合、遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドをランダムにフラグメント化しＰＣＲで再アセンブリすることによる、ＤＮＡシャフリングを利用してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド媒介性の部位特異的突然変異誘発を使用して、制限部位の新規作製、グリコシル化パターンの改変、コドン優先度の変更、スプライス変異体の産生などの突然変異を導入できる。
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力、または発現したポリペプチドを処理する能力に関して、所望の様式で選択できる。そのようなポリペプチドの修飾としては、限定はされないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。例証的実施形態においては、特定のグリコシル化構造またはパターンを含む抗ＫＡＡＧ１抗体が所望され得る。また、ポリペプチドの「プレプロ」形態を開裂する翻訳後プロセッシングを使用して、タンパク質のターゲティング、フォールディング、および／または活性を規定することもできる。特異的な細胞機構、および翻訳後活性に特有の機構を有する様々な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷ１３８）が市販されており、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である。また、これらの宿主細胞を選択することによって、発現したポリペプチドの適正な修飾およびプロセッシングが保証され得る。
天然、修飾、または組み換え核酸配列を異種配列とリゲートさせると、結果として、上記の宿主系のいずれにおいても、異種ポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドが翻訳される。このことは、当業者であれば容易に理解するであろう。市販の親和性マトリックスを使用すれば、そのような異種ポリペプチド部分を介して融合ポリペプチドの精製を促し得る。そのような部分としては、限定はされないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド、６−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、およびモノクローナル抗体エピトープなどの抗体エピトープが挙げられる。
他の更なる態様において本発明は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得るポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質は、本明細書に記載されているポリペプチド（例えば、完全軽鎖、完全重鎖、可変領域、ＣＤＲなど）に融合された融合パートナー（例えば、ＨＡ、Ｆｃなど）を含んでいてもよい。
また、当該技術分野において周知の化学的または酵素的方法を用いて、全体としてまたは部分的に、核酸およびポリペプチド配列を合成できることも、当業者であれば容易に理解するであろう。例えば、ペプチド合成は様々な固相技術を利用して実施でき、ＡＢＩ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの機械を使用して合成を自動化できる。所望により、アミノ酸配列を合成中に改変し、かつ／または他のタンパク質由来の配列と組み合わせて、変異体タンパク質を産生できる。
抗体複合体
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントは、検出可能部分（即ち、検出もしくは診断目的に対応）または治療部分（治療目的に対応）と結合させ得る。
「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、および／または他の物理的手段を介して検出できる部分である。検出可能部分は、直接的および／または間接的のいずれかで（例えば、限定はされないが、ＤＯＴＡ結合またはＮＨＳ結合などの結合を介し）、当該技術分野において周知の方法を使用して、本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントとカップリングされ得る。使用され得る検出可能部分は多岐にわたっており、その選択肢は、要求される感度、結合容易性、安定性要件、および利用可能な計装に依存する。好適な検出可能部分としては、限定はされないが、蛍光標識、放射性標識（例えば、限定はされないが、１２５Ｉ、Ｉｎ１１１、Ｔｃ９９、Ｉ１３１、ＰＥＴスキャナー用の陽電子放出アイソトープなどを含む）、核磁気共鳴活性標識、発光標識、化学発光標識、発色団標識、酵素標識（例えば、限定はされないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、量子ドットおよび／またはナノ粒子が挙げられる。検出可能部分は、検出可能なシグナルを誘発しかつ／または生成でき、それにより検出可能部分からのシグナルが検出可能になる。
本発明の別の例示的実施形態において、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、治療部分（例えば、薬剤、細胞傷害性部分）とカップリング（修飾）され得る。
例証的実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体および抗原結合性フラグメントは、阻害剤、化学療法剤または細胞傷害性剤を含んでもよい。例えば、抗体および抗原結合性フラグメントを化学療法剤または細胞傷害性剤にコンジュゲートしてもよい。そのような化学療法剤または細胞傷害性剤としては、限定はされないが、イットリウム９０、スカンジウム４７、レニウム１８６、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、および当業者に認知されているその他多くのもの、例えば、ルテチウム（例えば、Ｌｕ１７７）、ビスマス（例えば、Ｂｉ２１３）、銅（例えば、Ｃｕ６７）が挙げられる。他の例においては、化学療法剤または細胞傷害性剤は、限定するものではないが、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、イリノテカン、白金系化合物、例えば、シスプラチンおよび抗チューブリン、または有糸分裂阻害化合物、例えば、タキサン、ドキソルビシンおよびシクロホスファミド、シュードモナスエンドトキシン、リシン、ならびに他の毒素を含み得る。好適な抗体薬物複合体は、０．００１ｎＭ〜１５０ｎＭ、０．００１ｎＭ〜１００ｎＭ、０．００１ｎＭ〜５０ｎＭ、０．００１ｎＭ〜２０ｎＭまたは０．００１ｎＭ〜１０ｎＭ（両端の値を含む）の範囲のＩＣ５０を有するものの中から選択する。従って、コンジュゲーションに用いる細胞傷害性剤は、これらの基準に基づいて選択する。
別法として、本発明の方法および当該技術分野において公知の方法を実施するために、本発明の抗体または抗原結合性フラグメント（結合または非結合）を本発明の抗体または抗原結合性フラグメントに特異的に結合でき、かつ所望される検出可能部分、診断部分または治療部分を有し得る第２の分子（例えば、二次抗体など）と組み合わせて使用できる。
抗体の医薬組成物およびその使用
抗ＫＡＡＧ１抗体または抗原結合性フラグメント（結合または非結合）の医薬組成物もまた、本発明に包含される。医薬組成物は抗ＫＡＡＧ１抗体または抗原結合性フラグメントを含んでもよく、また薬学的に許容可能な担体も含んでいてよい。
本発明の他の態様は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントと、担体と、を含み得る組成物に関する。
本発明はまた、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントと薬学的に許容可能な担体とを含み得る、医薬組成物に関する。
活性成分に加えて、医薬組成物は、水、ＰＢＳ、生理食塩水、ゼラチン、油、アルコール類、ならびに活性化合物を薬学的に使用してもよい調製物に加工し易くする他の賦形剤および助剤を含んでなる薬学的に許容可能な担体を含み得る。他の例においては、この種の調製物を滅菌してもよい。
本明細書において「医薬組成物」は、薬学的に許容可能な希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と合わせた治療有効量の薬剤を意味する。本明細書において「治療有効量」とは、所与の状態および投与レジメンに関して治療効果が得られる量を指す。そのような組成物は、液体であるか、または凍結乾燥もしくは他の方法で乾燥された配合物であり、様々なバッファー内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤、表面への吸着防止のためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）を含む。可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質または等張性改良剤（例えば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーのタンパク質に対する共有結合、金属イオンとの錯体形成、またはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の粒子状調製物中へのもしくはその粒子状調製物上への、或いはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層もしくは多重層ベシクル、赤血球ゴースト、またはスフェロプラスト上への物質の移入。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出の速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランスの速度に影響する。制御放出組成物または持続放出組成物には、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の配合物が包含される。また、ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）でコーティングされた粒子状組成物も、本発明に包含されている。本発明の組成物の他の実施形態は、粒子状形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害物質、または非経口、肺、鼻、経口、膣、直腸経路を含めた様々な投与経路に対応した透過促進剤を取り入れている。一実施形態において、医薬組成物は、非経口、癌近傍、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内および腫瘍内投与される。
更に、本明細書において「薬学的に許容可能な担体」または「医薬担体」は当該技術分野において公知であり、０．０１〜０．１Ｍもしくは０．０５Ｍのリン酸バッファー、または０．８％生理食塩水を包含するが、これらに限定されない。加えて、そのような薬学的に許容可能な担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンガーデキストロース系、およびこれらに類するものが挙げられる。保存料および他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、照合剤、不活性ガス、およびこれらに類するものもまた、存在し得る。
どのような化合物についても治療有効量は、細胞培養アッセイ、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌもしくはブタなどの動物モデルのどちらかで推定できる。動物モデルはまた、濃度範囲および投与経路を決める場合に使用され得る。それゆえ、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決める場合にも使用され得る。これらの技術は当業者に周知であり、治療有効量とは、病徴または症状を改善する活性成分の量を指す。治療効果および毒性は、細胞培養においてまたは実験動物を用い、標準の薬剤的手順で、例えばＥＤ５０（母集団の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的な用量）統計を計算して比較対照することによって定量できる。上述した治療組成物はいずれも、この種の治療を必要とするあらゆる被検対象（限定はされないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルおよびヒトなどの哺乳動物を含む）に適用できる。
本発明において使用される医薬組成物は、限定はされないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、または直腸手段を含めた任意の数の経路によって投与できる。
使用方法
本開示の目的ための用語「治療」は、治療的処置と予防または防止的処置の両方を指し、ここで、目的は標的化された病的状態または障害を予防もしくは減速（軽減）させることにある。治療を必要としている人としては、既に障害を有する人、障害を有しがちな人、または障害を予防すべき人が挙げられる。
本発明は、その一態様において、ＫＡＡＧ１に特異的に結合することができる抗体または抗原結合性フラグメントを用いて、乳癌を有するか、または乳癌を有することが疑われる個体を治療する方法を提供する。
本発明によれば、個体は、エストロゲン受容体発現、プロゲステロン受容体発現および／またはＨｅｒ２発現（もしくは過剰発現）が陰性である乳癌を有する者でよい。
また本発明によれば、個体は、エストロゲン受容体発現、プロゲステロン受容体発現および／またはＨｅｒ２の少なくとも１つの発現が低い乳癌を有する者でよい。
例えば、腫瘍は、エストロゲン受容体発現およびプロゲステロン受容体発現の両方が陰性である（またはその発現が低い）ものでよい。
本発明によれば、個体は、トリプルネガティブまたは基底細胞型として特徴付けられる乳癌を有する者でよい。
本発明のまた別の態様は、エストロゲン受容体発現、プロゲステロン受容体発現および／もしくはＨｅｒ２過剰発現の欠乏またはこれら３つのマーカの少なくとも１つの低い発現を特徴とする乳癌の治療または診断における、本明細書に記載の単離抗体または抗原結合性フラグメントの使用に関する。
本発明によれば、上記方法は、例えば、治療を必要とする個体に、ＫＡＡＧ１に特異的に結合することができる抗体または抗原結合性フラグメントを投与することを含み得る。治療を必要とする個体は、ＥＲ発現、ＰｇＲ発現の欠乏に基づき、および／またはＨＥＲ２タンパク質過剰発現の非存在によって、優先的に選択される。これらのマーカについての臨床試験は、通常、組織病理学的方法（免疫組織化学、ＦＩＳＨなど）を用いて、および／または発現試験（例えば、Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｌａｃｅｙ，２０１１を参照）により実施する。従って、治療を必要とする個体は、トリプルネガティブ乳癌または基底細胞型乳癌の診断を受けた個体であってよい。
このように本発明は、特に、抗ＫＡＡＧ１抗体を用いた、トリプルネガティブ乳癌または基底細胞型乳癌を有する個体の治療的処置に関する。
好適な抗体または抗原結合性フラグメントは、腫瘍細胞の表面で、ＫＡＡＧ１に特異的に結合することができるものを含む。このような抗体は、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３０〜８４（両端を含む）の間（例えば、アミノ酸３６〜６０（両端を含む）の間またはアミノ酸６１〜８４（両端を含む）の間）に含まれるエピトープに優先的に結合し得る。
好適な抗体は、抗体依存性細胞傷害を媒介するもの、および治療部分とコンジュゲートしたものであってよい。
本発明によれば、抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体もしくはヒト化抗体またはそれらの抗原結合性フラグメントであってよい。
本発明の方法は、阻害剤、化学療法剤または細胞傷害性剤と併用して、抗体または抗原結合性フラグメントを投与することを含み得る。
本発明に包含される他の治療方法は、アンチセンス治療薬（ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイムなど）のような他のタイプのＫＡＡＧ１阻害剤を投与することを含む。
従って、本発明の方法は、治療を必要とする個体に、ＫＡＡＧ１活性または発現の阻害剤を投与することによって、トリプルネガティブ乳癌または基底細胞型乳癌を治療する方法を提供する。
阻害剤は、配列番号１またはそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含んでよい。さらに具体的には、阻害剤は、配列番号１のヌクレオチド７３８〜９９２（両端を含む）またはそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含んでよい。例えば、阻害剤は、配列番号１または配列番号１のヌクレオチド７３８〜９９２（両端を含む）に相補的な少なくとも１０（少なくとも１５、少なくとも２０）個の連続したヌクレオチドを含んでよい。
場合により、抗ＫＡＡＧ１抗体およびフラグメントは、ＫＡＡＧ１を発現する癌細胞と相互作用して、ＡＤＣＣを媒介することによって免疫反応を誘導してもよい。別の例では、抗ＫＡＡＧ１抗体およびフラグメントは、ＫＡＡＧ１とそのタンパク質パートナーとの相互作用をブロックし得る。
場合により、抗ＫＡＡＧ１抗体およびその抗原結合性フラグメントは、同じ病状のために投与される他の治療薬（阻害剤、化学療法剤または細胞傷害性剤）と同時に投与してもよい。従って、抗体は、ＰＡＲＰ１阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、有糸分裂阻害剤（例えば、タキサン）、白金製剤（例えば、シスプラチン）、ＤＮＡ損傷剤（例えば、ドキソルビシン）、ならびに当分野では公知の他の抗癌治療薬と一緒に投与してよい。他の例では、抗ＫＡＡＧ１抗体およびその抗原結合性フラグメントを他の治療抗体と一緒に投与してもよい。これらの抗体として、限定するものではないが、ＥＧＦＲ、ＣＤ−２０、およびＨｅｒ２をターゲティングする抗体が挙げられる。
本発明は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰｇＲ−）であり、および／またはＨｅｒ２過剰発現が欠乏した（Ｈｅｒ２−）ＫＡＡＧ１発現細胞の増殖を阻害する方法に関し、本方法は、有効量の本発明に記載する抗体または抗原結合性フラグメントと細胞を接触させることを含み得る。
本発明はまた、癌を治療する、または、哺乳動物において、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰｇＲ−）であり、および／もしくはＨｅｒ２過剰発現が欠乏した（Ｈｅｒ２−）ＫＡＡＧ１発現細胞の増殖を阻害する方法も包含し、本方法は、本発明に記載する抗体または抗原結合性フラグメントを、治療が必要な哺乳動物に投与することを含み得る。
更なる態様において本発明は、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを使用した治療方法、診断方法および検出方法を提供すると共に、そのような目的に対応した医薬組成物もしくは薬物の製造における、これらの抗体または抗原結合性フラグメントの使用を提供する。
本発明が包含する治療方法は、治療が必要な哺乳動物、特に、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰｇＲ−）であり、および／もしくはＨｅｒ２過剰発現が欠乏している（Ｈｅｒ２−）ものとして特徴付けられる癌を有するか、またはこのような癌に罹患しやすい患者に、本発明に記載する抗体または抗原結合性フラグメントを投与することを含む。
本発明はまた、別の形態において、腫瘍の広がり、腫瘍の浸潤、腫瘍の形成を抑制するか、または腫瘍の溶解を誘導するための方法も提供し、これは、必要とする哺乳動物に、単離抗体または抗原結合性フラグメントを投与することを含む。
ゆえに、本発明は、癌の治療、腫瘍の広がり、腫瘍浸潤、腫瘍形成の抑制（そのための医薬組成物の製造）における、またはエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰｇＲ−）であり、および／もしくはＨｅｒ２過剰発現が欠乏している（Ｈｅｒ２−）ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の腫瘍溶解を誘導するための、本明細書に記載する単離抗体または抗原結合性フラグメントの使用に関する。
抗体または抗原結合性フラグメントは、より具体的には、例えば、転移能力を有する悪性腫瘍、および／または足場非依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ）で特徴づけられる腫瘍細胞を含めた悪性腫瘍に適用可能であり得る。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントはまた、癌の診断にも使用し得る。癌の診断癌の診断は、癌を有するかもしくは癌を有する疑いのある哺乳動物に対して本発明の抗体または抗原結合性フラグメントを投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで実施できる。診断はまた、哺乳動物から採取された試料を抗体または抗原結合性フラグメントに接触させ、ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞（腫瘍細胞）の有無を判別することによって、ｅｘ ｖｉｖｏで実施され得る。
本発明はまた、哺乳動物において、癌を検出する、または、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰｇＲ−）であり、および／もしくはＨｅｒ２過剰発現が欠乏している（Ｈｅｒ２−）ＫＡＡＧ１発現細胞を検出する方法も包含し、この方法は、本明細書に記載の抗体または抗原結合性フラグメントを、必要とする哺乳動物に投与することを含み得る。
本発明は、その別の態様において、ＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞を検出する方法に関し、この方法は、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントに細胞を接触させる工程と、抗体およびＫＡＡＧ１発現細胞またはＫＡＡＧ１変異体発現細胞によって形成される複合体を検出する工程と、を含み得る。検出方法に使用される抗体または抗原結合性フラグメントの例示的実施形態は、ＫＡＡＧ１の細胞外領域と結合され得るものである。
検出方法で用いられる抗体または抗原結合性フラグメントの他の例示的実施形態は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰｇＲ−）であり、および／もしくはＨｅｒ２過剰発現が欠乏している（Ｈｅｒ２−）腫瘍細胞の表面に発現したＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体に結合するものである。
本発明の別の形態は、ＫＡＡＧ１（配列番号２）、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫＡＡＧ１変異体、またはＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体の分泌形態もしくは循環形態を検出する方法に関し、この方法は、ＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞、またはＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体を含むか、または含むことが疑われる試料（生検、血清、血漿、尿など）を、本明細書に記載の抗体または抗原結合性フラグメントと接触させるステップと、結合を測定するステップを含んでもよい。試料は、癌（例えば、基底細胞型乳癌またはトリプルネガティブ乳癌などの、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰｇＲ−）であり、および／もしくはＨｅｒ２過剰発現が欠乏している（Ｈｅｒ２−）ものとして特徴付けられる乳癌）を有するか、あるいは、癌を有することが疑われる哺乳動物（例えば、ヒト）に由来するものでよい。試料は、哺乳動物または細胞培養上澄みから取得した組織試料であってもよい。
本発明によれば、試料は、哺乳動物から採取される血清試料、血漿試料、血液試料または腹水であり得る。本明細書に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントは、ＫＡＡＧ１の分泌形態または循環（血中で循環する）形態を有利に検出できる。
この方法は、ＫＡＡＧ１またはＫＡＡＧ１変異体に結合する抗体または抗原結合性フラグメントによって形成される複合体を定量する工程を含み得る。
抗体が抗原に結合すると、抗原の予想分子量が増大する。ゆえに、抗体または抗原結合性フラグメントが抗原と特異的に結合すると、物理的変化が起こる。
そのような変化は、例えば、電気泳動の後に、ウエスタンブロット、およびゲルまたはブロットの着色、質量分析法、コンピュータとＨＰＬＣとの接続などを利用することにより検出できる。分子量におけるシフトを計算できる他の装置は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（商標）が挙げられる。
抗体が、例えば検出可能な標識を含む場合、抗原−抗体複合体は、標識によって放出される蛍光、標識の放射線放出、その基質を用いて得られる標識の酵素活性などにより検出できる。
抗体または抗原結合性フラグメントと抗原との間の結合の検出および／または測定は、当該技術分野において公知の様々な方法によって実施できる。抗体または抗原結合性フラグメントと抗原との間の結合は、検出可能な標識（放射線放出、蛍光、変色など）を介し、放出されたシグナルを検出できる装置を使用すれば、モニタリングできる。そのような装置は、発生時点の結合を示すデータを提供し、抗原に結合した抗体の量に関する指標も提供し得る。（通常、コンピュータに接続した）装置によって、バックグラウンドシグナル（例えば、抗原−抗体結合の不在下で得られるシグナル）またはバックグラウンドノイズと、特異的抗体−抗原結合によって得られるシグナルと、の差を計算することもできる。ゆえに、そのような装置は、抗原が検出されたかどうかに関する指標および結論をユーザーに提供し得る。
本発明の更なる態様は、本明細書に記載されている１種以上の抗体または抗原結合性フラグメントを含む１種以上の容器を具備し得るキットに関する。
核酸、ベクターおよび細胞
通常は抗体が細胞内で生成され、軽鎖および重鎖をコードする核酸配列を含むベクターから発現される軽鎖および重鎖の発現を可能にする。
ゆえに、本明細書に記載されているＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖のいずれかをコードできる核酸は、本発明に包含される。
ゆえに、更なる態様において本発明は、ＫＡＡＧ１に特異的に結合できる抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域をコードする核酸に関する。
本発明に含まれる核酸の例示的実施形態としては、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、４５および４７、そのフラグメント（例えば、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個の連続したヌクレオチド）およびその補体と少なくとも７０％の配列同一性（即ち、少なくとも７５％、少なくとも８０％の配列同一性）を有する核酸からなる群から選択される核酸を含む。
本発明の実施形態によれば、核酸は、中でも、ＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体発現腫瘍細胞の殺傷（排除、破壊、溶解）を誘導することができる抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域をコードするものでよい。
本発明の別の実施形態によれば、核酸は、中でも、ＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体発現腫瘍細胞の広がりを抑制することができる抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域をコードするものでよい。
本発明のさらに別の実施形態によれば、核酸は、特に、ＫＡＡＧ１もしくはＫＡＡＧ１変異体発現腫瘍細胞の形成を低減または阻害することができる抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域をコードするものでよい。
本発明の核酸の例示的実施形態は、以下：
ａ．配列番号７２および配列番号７３からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列、
ｂ．配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、または
ｃ．配列番号７７、配列番号７８および配列番号７９からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
を含む軽鎖可変領域をコードする核酸を含む。
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る軽鎖可変領域をコードし得る。
また、本発明によれば、核酸は、１つのＣＤＲＬ１と、１つのＣＤＲＬ２と、１つのＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域をコードし得る。
本発明はまた、以下：
ａ．配列番号８０を含むＣＤＲＨ１配列、
ｂ．配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４および配列番号８５からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、または
ｃ．配列番号８６、配列番号８７および配列番号８８からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を含む重鎖可変領域をコードする核酸にも関する。
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２またはＣＤＲＨ３からなる少なくとも２つのＣＤＲを含み得る重鎖可変領域をコードし得る。
本発明によれば、核酸は、１つのＣＤＲＨ１と、１つのＣＤＲＨ２と、１つのＣＤＲＨ３と、を含み得る重鎖可変領域をコードし得る。
少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する抗体変異体をコードする核酸もまた、本発明に包含される。
本発明によれば、核酸は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が少なくとも２つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が３つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも２つの保存的アミノ酸置換が少なくとも１つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも２つの保存的アミノ酸置換が少なくとも２つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明によれば、核酸は、少なくとも２つの保存的アミノ酸置換が３つのＣＤＲに含まれるＣＤＲをコードし得る。
本発明の他の形態は、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４および配列番号１２５からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域をコードする核酸に関する。
本発明の他の形態は、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域をコードする核酸に関する。
更に別の態様において本発明は、本明細書に記載されている核酸を含むベクターに関する。
本発明によれば、ベクターは発現ベクターであり得る。
特定の宿主に挿入されたコーディング配列の転写用および翻訳制御用のエレメントを含むベクターは、当該技術分野において公知である。これらのエレメントは、エンハンサー、構成プロモータ、誘導性プロモータ、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域などの調節配列を含んでいてもよい。この種の発現ベクターを構築する目的に使用できる方法は、当業者に周知である。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換えが挙げられる。
別の態様において本発明は、本明細書に記載されている核酸を含み得る単離された細胞に関する。
単離された細胞は、軽鎖可変領域をコードする核酸および重鎖可変領域をコードする核酸を、別個のベクター上または同じベクター上のいずれかに含んでいてもよい。単離された細胞はまた、軽鎖をコードする核酸および重鎖をコードする核酸を、別個のベクター上または同じベクター上のいずれかに含んでいてもよい。
本発明によれば、細胞は抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現、アセンブル、および／または分泌できる。
別の態様において本発明は、本明細書に記載されている抗体を含有し得るかつ／または発現し得る細胞を提供する。
本発明によれば、細胞は、軽鎖可変領域をコードする核酸と重鎖可変領域をコードする核酸とを含み得る。
細胞は抗体またはその抗原結合性フラグメントを発現させる、アセンブルする、および／または分泌する能力を有し得る。
以下の実施例は、本発明の詳細を更に概説するために提示してある。
実施例１
この実施例は、Ｆａｂを完全ＩｇＧ１キメラモノクローナル抗体に変換するために用いる方法を開示する。
ＦａｂモノクローナルとＫＡＡＧ１タンパク質との間の相互作用の研究が実施される可能性はさておき、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究の有意義な実施に関して、Ｆａｂの用途は、抗原の生物学的機能の検証に限定されてもよい。ゆえに、Ｆａｂに含まれる軽鎖可変領域および重鎖可変領域を完全抗体スカフォールドに転移させて、マウス−ヒトキメラＩｇＧ１を生成させる必要があった。軽および重免疫グロブリン鎖の両方の発現ベクターを、ｉ）Ｆａｂ発現ベクターの上流の元の細菌シグナルペプチド配列が哺乳類シグナルペプチドおよびｉｉ）マウス抗体中の軽定常領域および重鎖定常領域がヒト定常領域で置換されるように構築した。この転移を実施するための方法には、当業者に周知の標準的分子生物学技術が使用された。
軽鎖発現ベクター − ２９３Ｅ一過性トランスフェクション系において使用されるように設計された、ｐＴＴＶＨ８Ｇ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）と呼ばれる既存の哺乳類発現プラスミドを、マウス軽鎖可変領域に適合するように修飾した。結果として得られたマウス−ヒトキメラ軽鎖は、マウス可変領域とそれに続くヒトカッパ定常ドメインとを含んでいた。ヒトカッパ定常ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を、プライマーＯＧＳ１７７３およびＯＧＳ１７７４（それぞれ配列番号５５および５６）を使用してＰＣＲにより増幅した。ヒトカッパ定常領域のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５７および５８に示す。結果として得られる３２１塩基対ＰＣＲ産物を、ヒトＶＥＧＦ Ａ（ＮＭ＿００３３７６）のシグナルペプチド配列のすぐ下流のｐＴＴＶＨ８Ｇ中にリゲートさせた。このクローニング工程ではまた、マウス軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの正確な位置決定を可能にする独自の制限エンドヌクレアーゼ部位の位置決定も行った。ｐＴＴＶＫ１と呼ばれる最終発現プラスミドの配列を配列番号５９に示す。表２に開示する配列に基づいて、その５’末端で、ＶＥＧＦ Ａシグナルペプチドの最後の２０塩基対と同一の配列を組み入れた、抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、３Ｃ４および３Ａ４（それぞれ、配列番号１５、１９、２３および４７）の軽鎖可変領域に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーの配列を配列番号６０、６１、６２および２１３に示す。３’最末端が同一であったため、３Ｄ３、３Ｇ１０および３Ｃ４の３つすべての軽鎖可変領域を増幅するのに、同じ逆方向プライマーを用いた。このプライマー（配列番号６３）は、その３’末端で、ヒトカッパ定常ドメインの最初の２０塩基対と同一の配列を組み込んでいた。プライマー配列番号２１４を用いて、３Ａ４軽鎖可変領域を増幅した。ＰＣＲフラグメントおよび消化されたｐＴＴＶＫ１の両方をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で処理した結果、相補的末端が得られ、これらの相補的末端同士をアニーリングによって結合した。アニーリング反応物をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換し、マウス軽鎖可変領域が、ｐＴＴＶＫ１発現ベクター中に適切に挿入されることを確実にするため、シーケンシングによって発現プラスミドを確認した。当業者であれば、軽鎖発現プラスミドの構築のために用いられる方法が、元のＦａｂライブラリに含まれるすべての抗ＫＡＡＧ１抗体に適用されることを容易に認識されよう。
重鎖発現ベクター − ３Ａ４の重鎖免疫グロブリンを産生した発現ベクターを、軽鎖免疫グロブリンの産生について前述したｐＴＴＶＫ１と同様の方法で設計した。ヒトＩｇＧＫシグナルペプチド配列だけでなくＩｇＧ１のヒトＦｃドメインのＣＨ２領域およびＣＨ３領域も含むプラスミドｐＹＤ１１（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）を、ヒト定常ＣＨ１領域をコードするｃＤＮＡ配列をリゲートさせることによって修飾した。独自の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計されたＰＣＲプライマーＯＧＳ１７６９およびＯＧＳ１７７０（配列番号６４および６５）を使用して、配列番号６６および６７に示すヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域を増幅した。ＩｇＧＫシグナルペプチド配列のすぐ下流のヒトＣＨ１の３０９塩基対フラグメントをリゲートした後、修飾されたプラスミド（配列番号６８）をｐＹＤ１５と指定した。選択された重鎖可変領域をこのベクター中にリゲートした場合、結果として得られたプラスミドは、ヒト定常領域を有する完全ＩｇＧ１重鎖免疫グロブリンをコードする。表２に開示する配列に基づいて、その５’末端で、ＩｇＧＫシグナルペプチドの最後の２０塩基対と同一の配列を組み入れた、抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、３Ｃ４および３Ａ４（それぞれ、配列番号１７、２１、２５および４５）の重鎖可変領域に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーの配列を配列番号６９（３Ｄ３および３Ｇ１０は同じ５’末端配列を有する）、配列番号７０または配列番号２１５（３Ａ４の場合）に示す。３’最末端が同一であったため、３Ｄ３、３Ｃ４および３Ｇ１０の３つすべての重鎖可変領域を増幅するのに、同じ逆方向プライマーを用いた。このプライマー（配列番号７１）は、その３’末端で、ヒトＣＨ１定常ドメインの最初の２０塩基対と同一の配列を組み込んでいた。３Ａ４重鎖可変領域には、配列番号２１６を用いた。ＰＣＲフラグメントおよび消化されたｐＹＤ１５の両方をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で処理した結果、相補的末端が得られ、これらの相補的末端同士をアニーリングによって結合した。アニーリング反応物をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換し、マウス重鎖可変領域が、ｐＹＤ１５発現ベクター中に適切に挿入されることを確実にするため、シーケンシングによって発現プラスミドを確認した。当業者であれば、重鎖発現プラスミドの構築のために用いられる方法が、元のＦａｂライブラリに含まれるすべての抗ＫＡＡＧ１抗体に適用されることを容易に認識されよう。
２９３Ｅ細胞におけるヒトＩｇＧ１の発現 − 軽鎖および重鎖免疫グロブリンをコードした、上で調製した発現ベクターを、一過性トランスフェクション系を用いて２９３Ｅ細胞において発現した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。一過性または安定性発現の他の方法を用いてもよい。組織培養培地中で抗体の最高収率を達成するために軽鎖：重鎖の比を最適化したところ、９：１（Ｌ：Ｈ）であることが判明した。抗ＫＡＡＧ１抗体（モノクローナル、キメラもしくはヒト化）が組換えＦｃ−ＫＡＡＧ１に結合する能力を、ＥＬＩＳＡにより測定し、元のマウスＦａｂと比較した。
他のＦａｂを完全ＩｇＧ（３Ａ４を含む）に変換するため、ならびに抗体の発現のために用いるスキームは、国際出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０００２９６明細書により詳細に記載されている。尚、この文献の全内容は、参照として本明細書に組み込む。
実施例２
３Ａ４マウスモノクローナル抗体のヒト化
国際特許番号ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６明細書、ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１７９５明細書およびＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０００２９６明細書は、ヒト化軽鎖および重鎖可変領域を作製するために用いられる例示的方法を記載している。
３Ａ４抗体軽鎖可変領域のヒト化は、１００％フレームワークヒト化のためにその提案されたヒト化フレームワークに対し１１の突然変異を含んだ。３Ａ４抗体重鎖可変領域のヒト化は、１００％フレームワークヒト化のためにその提案されたヒト化フレームワークに対し２３の突然変異を含んだ。これらの１００％ヒト化可変領域配列は、それぞれＬｖｈ１およびＨｖｈ１と名付けた（配列番号１８９および１９４）。追加のヒト化配列も設計したが、これらの配列では、当該位置に突然変異を導入ししようとする場合、抗原結合親和性を改変する高い確率を示す入念な構造および比較配列分析に基づいて、３Ａ４マウス配列由来の複数の残基を保持した。可変領域のこれらの配列は、Ｌｖｈ２、Ｈｖｈ２、Ｈｖｈ３およびＨｖｈ４と名付けた（配列番号１９０、１９５、１９６および１９７）。
２つのヒト化軽鎖変異体（定常領域を含む）は、本明細書においてＬｈ１（配列番号１９９）およびＬｈ２（配列番号２００）として同定される。４つのヒト化重鎖変異体（定常領域を含む）は、本明細書においてＨｈ１（配列番号２０２）、Ｈｈ２（配列番号２０３）、Ｈｈ３（配列番号２０４）およびＨｈ４（配列番号２０５）として同定される。２つのヒト化軽鎖および４つのヒト化重鎖は、８つのヒト化抗体（Ｌｈ１Ｈｈ１、Ｌｈ１Ｈｈ２、Ｌｈ１Ｈｈ３、Ｌｈ１Ｈｈ４、Ｌｈ２Ｈｈ１、Ｌｈ２Ｈｈ２、Ｌｈ２Ｈｈ３、およびＬｈ２Ｈｈ４）にアセンブルすることができる。
３Ａ４軽鎖ヒト化配列Ｌｖｈ２（配列番号１９０）の場合、マウス配列由来のフレームワーク残基Ｖａｌ−Ｌ２およびＬｙｓ−Ｌ４５を保持した。これらを保持した理由は、残基Ｌ２が半埋設されていて、ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３の両方に接触し、かつ抗原に接触する傾向を有する一方、残基Ｌ４５が重鎖に接近しているためである。発明者らは、これらのネズミ残基が両方ともヒトフレームワークにおいて発生し得ることに言及している。３Ａ４重鎖ヒト化配列Ｈｖｈ２（配列番号１９５）の場合、マウス配列からのフレームワーク残基Ｉｌｅ−Ｈ２およびＬｙｓ−Ｌ７３が保持された。これらが保持された理由は、残基Ｈ２が半埋設されていて、ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ３の両方に接触し、かつ抗原に接触する傾向を有する一方、残基Ｈ７３がＣＤＲ−Ｈ２を支持しているバーニアゾーンに属しているためであり、またこれらのネズミ残基が両方ともヒトフレームワークにおいて発生し得るためでもあった。３Ａ４重鎖ヒト化配列Ｈｖｈ３（配列番号１９６）の場合、これらマウス配列由来のフレームワーク残基Ｉｌｅ−Ｈ４８、Ａｌａ−Ｈ６７、Ｌｅｕ−Ｈ６９およびＶａｌ−Ｈ７１に加えて、Ｉｌｅ−Ｈ２およびＬｙｓ−Ｌ７３復帰突然変異が保持された。これらを保持した理由は、これら全ての付加的なネズミ残基が、埋設された残基であり、ＣＤＲ−Ｈ２を支持しているバーニアゾーンに属するためであり、またネズミ残基Ｈ７１がヒトフレームワークにおいて発生し得るためでもある。３Ａ４重鎖ヒト化配列Ｈｖｈ４（配列番号１９７）の場合、Ｈｖｈ３ヒト化変異体の復帰突然変異が６つとも全て組み入れられたのに加えて、付加的な２つのマウスフレームワーク残基Ｌｙｓ−Ｈ３８およびＬｙｓ−Ｈ６６も組み入れられた。これらは、ＣＤＲ−Ｈ２に近接している半埋設残基を表しているためである。結果として得られた、ネズミ鎖およびヒト化鎖のアミノ酸配列の一覧を、表１に示す。ネズミおよびヒト化軽鎖可変領域のアライメントを図１ａに示し、ネズミおよびヒト化重鎖可変領域のアライメントを図１ｂに示す。
図２ａおよび図２ｂはそれぞれ、ネズミ軽鎖可変領域を１００％ヒト化軽鎖可変領域にアライメントしたもの、およびネズミ重鎖可変領域を１００％ヒト化重鎖可変領域にアライメントしたものである。この図は、保持されているアミノ酸、および置換用に選択されたアミノ酸を図示したものである。
実施例３
３Ａ４ヒト化変異体抗体のアセンブリおよび発現
これらの調査の目的は、抗クラステリン抗体の動態パラメータを決定することにある。特に、３Ａ４抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体のヒト化によって、そのモノクローナル抗体がヒトＫＡＡＧ１に結合している動態パラメータに影響が及ぶかどうか突き止めることを目的としている。この目的を果たすために、ＢｉｏＲａｄ社製のＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６計器を使用して動態分析方法を策定した。ヒトＫＡＡＧ１をセンサーチップ上に固定した。全長抗体またはＦａｂフラグメントを注入し、固定されたＫＡＡＧ１と相互作用させた。
３Ａ４のキメラ（ネズミ）重鎖および軽鎖をコードするプラスミドの構築
元のネズミ免疫グロブリン鎖からのキメラ抗体重鎖および軽鎖をＰＣＲで増幅した。その際に使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、次のとおりである：重鎖、配列番号２０６でコードされた５’オリゴ、および配列番号２０７；軽鎖でコードされた３’オリゴ、配列番号２０８でコードされた５’オリゴ、および配列番号２０９でコードされた３’オリゴ。結果として得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで先に消化しておいたｐＫ−ＣＲ５（配列番号２１０）にクローンした。
ヒト化重鎖３Ａ４変異体１、２、３および４をコードするプラスミドの構築
抗体３Ａ４（Ｈｈ１、Ｈｈ２、Ｈｈ３およびＨｈ４）のヒト化重鎖領域をコードするフラグメントは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）から注文されたものである。Ｋｏｚａｋ配列および終止コドン配列を含んだＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、仔ウシの腸ホスファターゼ（ＮＥＢ）で先に脱リン酸化しておいたプラスミドｐＫ−ＣＲ５のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローンして、再環状化を防いだ。図３ａに、プラスミドｐＫ−ＣＲ５−３Ａ４−ＨＣ−変異体１のマップを示す。ヒト化３Ａ４の全ての重鎖変異体を同様な方法で構築した。
ヒト化軽鎖３Ａ４変異体１および２をコードするプラスミドの構築
抗体３Ａ４（Ｌｈ１およびＬｈ２）ヒト軽鎖領域をコードするフラグメントは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから注文されたものである。Ｋｏｚａｋ配列および終止コドン配列を含んだＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、仔ウシの腸ホスファターゼ（ＮＥＢ）で先に脱リン酸化しておいたプラスミドｐＭＰＧ−ＣＲ５（配列番号２１１）のＢａｍＨＩ部位にクローンして、再環状化を防いだ。図３ｂに、プラスミドｐＭＰＧ−ＣＲ５−３Ａ４−ＬＣ−変異体１のマップを示す。ヒト化３Ａ４の全ての軽鎖変異体を同様の方法で構築した。
一過性トランスフェクションの研究
メーカーの推奨事項に従い、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して、プラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の小培養物から単離した。概括して言えば、リゲーションおよびトランスフォーメーションの後に、単一コロニーを選択して、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有のＬＢ培地２ｍｌを接種した。培養物を激しく（２５０ＲＰＭで）振盪して３７℃にて一晩インキュベートした。その後、キットに付属しているプロトコル、バッファーおよびカラムを使用して、１．５ｍｌの培養物からプラスミドを単離した。滅菌水５０μＬを使用してＤＮＡを溶出させた。メーカーの推奨事項に従い、Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の大培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培養物２００ｍＬを新鮮な単一の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーと共に播種し、激しく（２５０ＲＰＭで）振盪して３７℃にて一晩インキュベートした。細菌（重鎖については１３０ｍＬの培養物、および軽鎖については１８０ｍＬの培養物）を６０００×ｇで遠心分離して４℃で１５分間ペレット化し、キットに付属しているプロトコル、バッファーおよびカラムを使用して、プラスミドを単離した。滅菌した５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）中に精製済みプラスミドを再懸濁して、光学密度２６０ｎｍにて定量した。トランスフェクションに先立ち、精製済みプラスミドをフェノール／クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿により滅菌した。そのプラスミドを滅菌した５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）中に再懸濁して、光学密度２６０ｎｍにて定量した。
トランスフェクションに先立ち、細胞（ＣＨＯ−ｃＴＡ）をＰＢＳで洗浄し、デキストラン硫酸を含まない成長培地（ＣＤ−ＣＨＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に４．０×１０６細胞／ｍｌの濃度で３時間懸濁培養液の形で再懸濁させた。プラスミドの組み合わせごとに、ＣＤＣＨＯ培地５ｍｌに各プラスミド１０μｇ／ｍｌおよびポリエチレンイミン５０μｇ／ｍｌ（ＰＥＩ Ｍａｘ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補給したものを徐々に添加して、細胞４５ｍｌをトランスフェクションした。終濃度は各プラスミドが１μｇ／ｍｌで、ＰＥＩが５μｇ／ｍ１であった。２時間後、細胞を３０℃でトランスフェクションした。翌日、デキストラン硫酸５０μｇ／ｍＬおよび各補助剤３．７５ｍｌ（ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ Ａ ａｎｄ Ｂ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を細胞に添加し、３０℃で１３日間インキュベートした。４日目、６日目、８日目および１１日目にＦｅｅｄ Ａ２．５ｍｌとＦｅｅｄ Ｂ２．５ｍｌとを添加した。１３日目に、上澄みを遠心分離で澄ませて、０．２２μＭフィルタで濾過した。
ＣＲ５プロモータで調節された３Ａ４抗体のヒト化重鎖および軽鎖の種々の変異体をコードするプラスミドを用いて、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯｃＴＡ）をトランスフェクションした。軽鎖および重鎖の様々な組み合わせを用い、トランスフェクションを行った。対照としての細胞も、キメラ／ネズミ抗体をコードするプラスミドを用いて、同様にトランスフェクションした。
抗体の精製
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｕｌｔａｃｅｌｌ−５０ｋ）カセットを使用して、ＣＨＯ細胞トランスフェクションからの上澄み１５ｍｌを遠心分離で１５００ｒｐｍにて濃縮した。メーカーの推奨事項に従い、Ｎａｂ ｓｐｉｎ ｋｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、濃縮された抗体（５５０μｌ）を精製した。その後、精製された抗体を、ＰＢＳを使用して脱塩し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ）カセットを使用して、２５００ｒｐｍにて濃縮して最終体積２５０μｌにした。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して、精製された抗体をＯＤ２８０値の読み取りにより定量し、−２０℃で凍結させた状態に維持した。精製された抗体のアリコートを当量のＬａｅｍｍｌｉ ２Ｘ中に再懸濁し、９５℃で５分間加熱してから、氷冷した。標準曲線は、既知量のヒト骨髄腫血漿由来の精製ヒトＩｇＧ１カッパ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して作成された。試料をポリアクリルアミドＮｏｖｅｘ１０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）上で分離させ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅｅ，ＱＣ）上に２７５ｍＡで１時間転移させた。膜を０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０、５％スキムミルク含有ＰＢＳ中で１時間ブロックし、Ｃｙ５と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃａｔ＃ １０９−１７６−０９９）と共に１時間インキュベートした。Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ＋スキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｃａｒｅ）でスキャンすることによって、シグナルを露出して定量した。図４に示すように、ＣＨＯ細胞内において３Ａ４ヒト化抗体変異体の全ての組み合わせが発現した。
実施例４
ネズミおよびヒト化３Ａ４抗体の動力学解析
補用品
ＧＬＭセンサーチップ、Ｂｉｏｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎアミンカップリングキット（ＥＤＣ、ｓＮＨＳ、およびエタノールアミン）、ならびに１０ｍＭナトリウム酢酸塩バッファーはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入された。ＨＥＰＥＳバッファー、ＥＤＴＡ、およびＮａＣｌはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から購入された。１０％のＴｗｅｅｎ２０溶液はＴｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入された。ヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的抗体はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入された。ゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入された。
ゲル濾過
濃度３．１１４ｍｇ／ｍｌのＫＡＡＧ１タンパク質（容量２２０μＬ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ７５カラムに注入した。Ｔｗｅｅｎ２０を含まないＨＢＳＴ泳動用バッファー（下記参照）中で０．４ｍｌ／ｍｉｎにて分離を行った。収集された画分の容量は５００μＬであった。拡張係数を５５００とし、ＭＷを８９６９として、各画分におけるＫＡＡＧ１の濃度をＯＤ２８０で定量した。図５は、ＫＡＡＧ１のゲル濾過のプロファイルを表す。潜在的集合体（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の小ピークは、１１ｍｌ付近で溶出している。ＳＰＲアッセイ用の検体として使用されたタンパク質は、１３ｍｌで溶出したタンパク質（画分１５〜１９）であった。
ＳＰＲバイオセンサーアッセイ
全ての表面プラスモン共鳴アッセイは、ＢｉｏＲａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６計器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））を使用し、ＨＢＳＴ泳動用バッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４））で２５℃の温度にて実施された。標準ＢｉｏＲａｄ ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：５希釈物を検体（水平）方向へ３０μＬ／ｍｉｎにて３００秒間注入することで活性化されたＧＬＭセンサーチップを使用して、抗マウスＦｃ捕捉表面を生成した。活性化の直後に、抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的抗体の溶液１３μｇ／ｍＬを１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）に溶かしたものを、約８０００共鳴単位（ＲＵ）が不動化されるまで、検体方向へ２５μＬ／ｍｉｎの流速にて注入した。１Ｍエタノールアミンを検体方向へ３０μＬ／ｍｉｎで３００秒間注入することによって残りの活性基を急冷した。これにより、ブランク参照（ｂｌａｎｋ ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ）用のモック活性化インタースポットが確実に作成される。ＫＡＡＧ１に結合する３Ａ４変異体のスクリーニングは、２つの工程で発生した。３Ａ４変異体を細胞上澄みから抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的表面上にリガンド方向（垂直）へ間接的に捕捉し、続いて検体方向へＫＡＡＧ１を注入した。最初に、検体方向へバッファーを１００ｕＬ／ｍｉｎで３０秒間１回注入することによって、ベースラインを安定させた。３Ａ４の捕捉時に毎回、未精製３Ａ４変異体を含む細胞培養培地をＨＢＳＴで４％に希釈するか、または約１．２５μｇ／ｍＬの精製３Ａ４含有ＨＢＳＴを使用した。野生型３Ａ４と一緒に４〜５個の３Ａ４変異体を同時に、個々のリガンドチャネルに２５μＬ／ｍｉｎの流速で２４０秒間注入した。この結果、抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的表面に約４００〜７００ＲＵの飽和３Ａ４が捕捉された。第１のリガンドチャネルは、必要に応じてブランク対照として使用できるよう、ブランクのままにした。この３Ａ４捕捉工程の直後に、２種類のバッファーを検体方向へ注入してベースラインを安定させ、その後、ゲル濾過精製されたＫＡＡＧ１を注入した。典型的なスクリーニングで、５とおりのＫＡＡＧ１濃度（８、２．６６、０．８９、０．２９、および０．０９８ｎＭ）およびバッファー対照を同時に個々の検体チャネル内に５０μＬ／ｍｉｎにて１２０秒間注入し、６００秒の解離フェーズをおいて、結果として、捕捉された３Ａ４変異体ごとに、バッファー参照（ｂｕｆｆｅｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）によって一連の結合センサーグラムが得られた。抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的３Ａ４複合体を０．８５％リン酸の１８秒間隔のパルスで１００μＬ／ｍｉｎにて１８秒間再生成し、次の注入サイクル用に抗ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント特異的表面を調製した。バッファーのブランク注入およびインタースポットを使用して、センサーグラムをアラインし二重参照してから、結果として得られたセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアｖ３．０を使用して分析した。ローカルＲｍａｘを使用し、参照されたセンサーグラムを１：１のラングミュア結合モデルに適合させることによって、動態値および親和性値を定量してから、結果として得られた速度定数（ｋｄ ｓ−１／ｋａ Ｍ−１ｓ−１）から親和性定数（ＫＤ Ｍ）を導き出した。
速度および親和性定数の定量
図６は、ＫＡＡＧ１と精製ネズミ３Ａ４との相互作用、キメラとして一過性に発現したネズミ３Ａ４および一過性に発現したヒト化変異体に関する、会合（ｋａ、１／Ｍｓ）および解離（ｋｄ、１／ｓ）速度定数のほか、親和性（ＫＤ、Ｍ）定数の要約である。これらの定数を図７ａ〜ｃにグラフで表す。純粋な親、キメラおよびヒト化３Ａ４変異体については、会合速度定数が極めて類似している（図７ａ）。一過性に発現するキメラ３Ａ４は、純粋な親３Ａ４と比べて解離速度定数が類似しており、このことは、ＫＡＡＧ１と抗体との間の相互作用のパラメータが変更されなかったことを示唆している（図７ｂ）。一方、全てのヒト化変異体は、オフ速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）が僅かに変わった（即ち、解離速度が迅速化した）と考えられ（図７ｂ）、これは親和性定数に反映されている（図７ｃ）。要約すると、ヒト化変異体の結合親和性（ｌｏｇＫＤ）と親抗体（ＬｃＨｃ）において生じた復帰突然変異の数との間には線形の相関が存在しており、突然変異の数が増加するにつれて結合親和性が減少する。しかしながら、マウス残基が全く保持されない最悪の変異体（Ｈ１Ｌ１、０．４７ｎＭ）と１０個のマウス残基が保持される最良の変異体（Ｈ４Ｌ２、０．１ｎＭ）とでは、結合親和性にたった４倍の差しかない。最後に、ＫＡＡＧ１に対する全ての変異体の結合親和性がサブナノモルであることが見出され、最良の変異体（Ｈ４Ｌ２、０．１ｎＭ）が示した親和性はネズミ（ＬｃＨｃ、０．０５７ｎＭ）の約６倍弱かった。全般的に、これらの結果は、全ての変異体がＫＡＡＧ１に対して高い親和性を示すことを示唆しており、よって、ヒト化が成功したことがわかった。
実施例５
ＥＬＩＳＡにおけるＫＡＡＧ１に対する３Ａ４ヒト化変異体の結合
ＥＬＩＳＡ方法はまた、ヒト化３Ａ４変異体の結合活性をネズミ３Ａ４抗体と比較する目的にも使用された。組み換えヒトＫＡＡＧ１を９６ウェルプレート中で一晩コーティングし、洗浄して、室温で１時間インキュベートした結果、ネズミまたはヒト化３Ａ４変異体の量が増加した。別途の洗浄工程に続いて、ＨＲＰに結合した抗ヒト抗体をウェルに添加し、結合された３Ａ４抗体をＡｂｓ４５０にて熱量測定によって測定した。図８ａに示すように、ヒト化変異体（Ｌｈ１Ｈｈ１、Ｌｈ１Ｈｈ２、Ｌｈ１Ｈｈ３およびＬｈ１Ｈｈ４）は、０．０１６ｎＭの高い親和性を有するネズミ３Ａ４（ＬｃＨｃ）と比較して、ＫＡＡＧ１との結合が極めて類似していることを示した。この結果から、ヒト化重鎖変異体が４つとも全て、ヒト化軽鎖のＬ１変異体とアセンブルしたときに、元のｈ３Ａ４重鎖と同等であったことがわかった。図８ａは、重鎖変異体を３Ａ４ヒト化軽鎖のＬｈ２変異体とアセンブルしたときの結果を示す。この例では、変異体の結合に差異があった。例えば、Ｌｈ２ｈｈ４は、ネズミ３Ａ４と比較して最も近いプロファイルを持つ変異体であった。これはＳＰＲデータと一致しており、重鎖の変異体４がＫＡＡＧ１に対して最も高い親和性を有することを示した。これらの結合の結果を考え合わせると、このアッセイにおいては全てのヒト化変異体がヒトＫＡＡＧ１と相互作用することが明らかである。多少は微妙な差異があるが、ＥＬＩＳＡにおける結合はＳＰＲ結果と一致していた。
実施例６
癌細胞の表面上での３Ａ４ヒト化変異体の結合
癌細胞の表面上に発現したＫＡＡＧ１に対してヒト化３Ａ４変異体が相互作用する能力を、フローサイトメトリーを使用して評価した。このために、先に述べたようにフローサイトメトリーで３Ａ４と効率的に結合したＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、８個のヒト化変異体および元のネズミ抗体と共にインキュベートした。手短に言うと、ＳＫＯＶ−３細胞をＥＤＴＡでプレートから分離させ、氷上で３．０ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌまたは０．３ｍｇ／ｍｌの抗体と共に１時間インキュベートした。３回の洗浄工程の後、細胞を二次抗体（ＦＩＴＣと結合した抗ヒトＩｇＧ）と共に氷上で１時間インキュベートした。フローサイトメータで細胞表面の蛍光を測定した。その値を、図１８のヒストグラムに示す。図示するように、透過化処理された表面上のＫＡＡＧ１が全ての変異体によって検出できた。最も強い信号は３Ａ４抗体の最高濃度で（３ｍｇ／ｍｌ）で得られ、抗体の濃度が減少するにつれて減衰した。種々の変異体のなかでもネズミ復帰突然変異が最多のもの（図１８のＬｈ１Ｈｈ４およびＬｈ２Ｈｈ４を参照）は、細胞表面上のＫＡＡＧ１と相互作用し、最も高い活性を呈している。実際、Ｌｈ１Ｈｈ４およびＬｈ２ｈｈ４は、ネズミ３Ａ４抗体（ＬｃＨｃ）と比較して、ＫＡＡＧ１に対する細胞表面の結合の改善は僅かであったと考えられた。
実施例７
この実施例では、ＴＮＢＣにおけるＫＡＡＧ１の発現を検出するための抗ＫＡＡＧ１抗体の使用を説明する。
ＴＮＢＣ試料中にＫＡＡＧ１抗原が存在するか否かを決定する手段として、免疫組織化学を実施した。患者生検から作製した１３９の乳房腫瘍試料を含む組織マイクロアレイを取得した。パラフィン包埋上皮乳房腫瘍試料をスライドグラスに載せて、５０℃で１５分固定した。キシレンで２回処理することにより脱パラフィンを実施した後、１００％、８０％、および７０％エタノールを用いて５分の脱水を順次実施した。スライドをＰＢＳで５分３回洗浄した後、抗原性賦活化溶液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で処理することにより、抗原をアンマスキングした。スライドをＨ２Ｏ２と一緒にメタノール中でインキュベートすることにより内在性過酸化物反応種を除去してから、スライドを無血清ブロック溶液（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一緒に５分室温でインキュベートすることにより、ブロッキングを実施した。一次抗体（抗ＫＡＡＧ１ ３Ａ４）を室温で１時間にわたり添加した。ビオチン結合マウス抗κと一緒に、次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ三次抗体（ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と一緒にインキュベートすることにより、ＫＡＡＧ１反応性抗原を検出した。スライドをＤＡＢ−過酸化水素基質で５分弱処理した後、ヘマトキシリンで対比染色することにより、陽性染色が判明した。乳房腫瘍試料のほとんどにおいて、ＫＡＡＧ１タンパク質が非常に高いレベルで発現されることがわかった。１３９の腫瘍を含む代表的アレイを図１０に示す。特に、ＴＮＢＣであることが確認された１５／２０生検試料（図１０、星印で示す試料）は、３Ａ４抗体によりＫＡＡＧ１発現について強度に染色された。これらを考え合わせると、上記の免疫組織化学的試験は、モノクローナル抗体を用いて、乳癌、特にＴＮＢＣにおけるＫＡＡＧ１を検出することの有用性を示している。
実施例８
この実施例では、ＴＮＢＣ細胞系におけるＫＡＡＧ１の発現を検出するための抗ＫＡＡＧ１抗体の使用を説明する。
ＫＡＡＧ１をコードするｃＤＮＡの一次構造の生物情報科学的分析、生物化学的試験、ならびに上皮細胞のタンパク質の免疫組織化学検出から、ＫＡＡＧ１抗原が、細胞表面に位置することが示された。しかし、ＫＡＡＧ１が、実際にＴＮＢＣ細胞の表面で発現されることを証明するためにはより直接的なエビデンスが必要であった。この分析を実施するために、乳癌細胞系を販売業者（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、フローサイトメトリー実験に用いた。ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ発現分析によって、特定の乳癌細胞系が、ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡを発現したことが既にわかっている（ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１３４を参照）。従って、これらの細胞系のいくつかを選択して、その表面にＫＡＡＧ１抗原の存在を決定した。これを確認するために、３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体を用いて、トリプルネガティブＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ−２０およびＢＴ−５４９細胞系を試験した。さらに、トリプルネガティブではない乳癌細胞、即ちＴ４７ＤおよびＭＣＦ−７も分析に加えた。最後に、検出不可能なレベルのＫＡＡＧ１抗原発現を呈する対照細胞系、即ち２９３−６Ｅをフローサイトメトリー実験（ＦＣＭ）の陰性対照として加えた。ＦＣＭ分析を目的として、５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を回収し、血球計で計数した後、２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度でＦＣＭバッファー（１×ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．０１％ヤギ血清）中に再懸濁させた。キメラ３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体または対照ＩｇＧを、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度で１００μｌの細胞に添加してから、氷上で１時間インキュベートした。細胞を低温ＦＣＭバッファーで洗浄することにより、非結合抗体を除去し、ＦＩＴＣ二次抗体に結合した抗ヒトＩｇＧを含有する１００μｌＦＣＭバッファー（１：２００希釈）中で再懸濁させた後、氷上で４５分間インキュベートした。低温ＦＣＭバッファーでもう１回洗浄した後、細胞を３００μｌのＦＣＭバッファー中に再懸濁させた後、フローサイトメータで分析した。１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを各試料に添加することにより、死細胞のゲーティングを可能にした。３つの独立した実験からの結果を図１１に示すが、ここでは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）誘導倍率は、ネガティブヒトＩｇＧ対照の幾何平均値（任意で１に設定した）に対する、３Ａ４抗体と一緒に細胞をインキュベートしたとき得られたシグナルの幾何平均値を表している。抗体と対照２９３−６ＥＨＥＫ−２９３細胞とのインキュベーションの結果、一次抗体の非存在下で細胞をインキュベートしたときに得られたシグナルと同様の蛍光シグナルが得られた。さらに、対照ＩｇＧと比較して、３Ａ４を用いて得られたシグナルとの間に有意な差はなかった。さらに、対照ＩｇＧを乳癌細胞系と一緒にインキュベートしたところ、シグナルは、対照２９３−６Ｅ細胞を用いて得られたものと非常に類似していた。対照的に、３Ａ４抗体をすべての乳癌細胞系と一緒にインキュベートしたところ、検出可能な蛍光シグナルが観察された。まちまちの蛍光量が観察されたが、ＫＡＡＧ１の最大量は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＴ−２０細胞系、２つのＴＮＢＣ細胞系の表面上に検出された（図１１を参照、ＴＮＢＣ細胞系は星印で示す）。実際、５つのＴＮＢＣ細胞系はすべて、これらの条件下でＫＡＡＧ１発現について陽性であった。また、Ｔ４ＤおよびＭＣＦ−７細胞もＫＡＡＧ１を発現した。これらを考え合わせると、上記のフローサイトメトリー分析から、ＴＮＢＣ細胞系が、その細胞表面上に高レベルのＫＡＡＧ１を発現することがわかる。
実施例９
抗体コンジュゲートとしての３Ａ４抗ＫＡＡＧ１抗体の使用方法
上に実証したように、フローサイトメトリーを用いて、癌細胞の表面上の３Ａ４によりＫＡＡＧ１抗原が検出された。抗体が細胞表面上のその標的と結合した時点で、起こる可能性がある異なる分子イベントが複数存在する。これらには以下のものが含まれる：ｉ）別の細胞表面抗原／受容体またはリガンドへのアクセシビリティがブロックされること、ｉｉ）比較的安定な抗体−抗原複合体の形成によって、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを介して細胞の標的化が可能になること、ｉｉｉ）アゴニスト抗体によって例証されるように、シグナリングイベントが起こり得ること、ｉｖ）複合体が内在化され得ること、またはｖ）複合体が細胞表面から除去され得ること。この論点に取り組むため、発明者らは、細胞表面の３Ａ４抗体−ＫＡＡＧ１複合体の挙動を調べた。この実験において、以前の内在化実験（ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６を参照）での使用が成功しているため、卵巣癌細胞系であるＳＫＯＶ３を陽性対照として用いた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＴＮＢＣ細胞系を平板培養して、洗浄した後、実施例３に記載の０．５μｇ／ｍｌのキメラ３Ａ４抗体と一緒にインキュベートした。洗浄後、完全培地を添加し、細胞を３７℃で最大６０分放置した。表示の時間に（図１２参照）細胞を取り出し、急速に冷却して、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧを用いてフローサイトメトリー用に調製し、その結果は、時間０分のシグナルと比較した、細胞表面に存続する平均蛍光強度のパーセンテージとして表した（図１２を参照、表面シグナル（０分で％存続））。図１２に示すように、蛍光シグナルは、３Ａ４をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と一緒にインキュベートした場合、急速に減少し（図１２、図ではＭＤＡ−２３１によって示す黒色のバー）、３０分〜４５分までにシグナルの最大消失に達するようであった。シグナルの消失は、３Ａ４をＳＫＯＶ３細胞と一緒にインキュベートした場合に得られたものと同等であった（図１２、グレーのバー）。この結果は、３Ａ４／ＫＡＡＧ１複合体が、細胞から消失したことを示しており、これにより、複合体の内在化が起こった可能性が高いことが示された。こうした細胞表面蛍光の減少の原因である機序を明らかにするための予備研究によって、複合体が内在化されたらしいことが判明した。
同様の結果が、２つの別のＴＮＢＣ細胞系、即ちＭＤＡ−ＭＢ−４３６（図１３）およびＢＴ−２０（図１４）において観察され、これにより、複数のＴＮＢＣ細胞系の表面上の３Ａ４／ＫＡＡＧ１複合体の内在化を確認した。対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６およびＴ４７Ｄの表面への３Ａ４結合のＭＦＩレベルが同様である（図１１）にもかかわらず、細胞表面でのシグナルの消失は、３Ａ４をＴ４７Ｄ細胞系とインキュベートした際には観察されなかった。この観察結果は、３Ａ４／ＫＡＡＧ１複合体の内在化が、トリプルネガティブではない細胞に比べ、ＴＮＢＣ細胞においてより高度に起こり得る（図１５）ことを示唆している。
これらの調査結果は、この内在化を顕微鏡で観察することができるかどうかを知るために、生細胞に対して免疫蛍光検査を実施することによってさらに確認された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をカバーグラス上に播種し、いったん細胞が正しく付着したら、３Ａ４抗ＫＡＡＧ１キメラ抗体を含む新鮮な培地を１０ｕｇ／ｍｌにて添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中で）２０分間固定した。細胞を洗浄した後、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で５分間透過化処理した。ＰＢＳ中の１．５％粉ミルクを用い、１時間ブロッキングを行った。抗ＬＡＭＰ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１８８２１、１：１００希釈）と共に１．５％ミルク含有ＰＢＳ中で２時間インキュベートして、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１，Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、２００２）を検出した。ＰＢＳ中で洗浄した後、二次抗体を１．５％ミルク中に一緒に添加し、１時間インキュベートした。抗ＫＡＡＧ１キメラ抗体の場合、二次抗体は、１：３００に希釈したＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ結合ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）であった。抗ＬＡＭＰ１抗体の場合、二次抗体は、１：３００に希釈したＤｙＬｉｇｈｔ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）であった。いずれの二次抗体もＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製であった。カバーグラスをＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬中で取り付けた。図７に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌細胞の存在下にて３７℃で４時間インキュベートした後、主に核周囲領域付近の複合体中に３Ａ４抗体を検出することができた（矢印で指した、図１６の左パネルの赤い染色を参照）。これは、エンドソーム−リソソームベースの内在化経路に典型的なものであった。この観測は、リソソームマーカ（即ち、ＬＡＭＰ１）を視覚化して、これらの領域内においても発現していることが見出されたときに、更に確証された（矢印で指した、図１６の中央パネルの緑色の染色を参照）。重要なことには、２つの画像をマージすると、その結果、黄橙色の構造の外観から、３Ａ４抗体および抗ＬＡＭＰ１抗体が同一構造内に存在していることが判明した（矢印で指した、図１６の右パネルの黄色の染色を参照）。癌細胞の表面上のＫＡＡＧ１に結合する３Ａ４と、ＬＡＭＰ１（即ち、後期エンドソーム／リソソームのマーカ）との共局在は、抗体／抗原複合体が内在化されたことを示し、また、この複合体がペイロードの放出に敏感に反応する経路を追従し、３Ａ４抗体に結合されるであろうことも示している。別の細胞系であるＢＴ−２０においても、同一の結果が観測された（図１７を参照）。
以上を考え合わせると、これらの研究によって、ＫＡＡＧ１に特異的な抗体（例えば、３Ａ４）が、抗体複合体、特に、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）としての用途を有し得ることが実証された。ゆえに、ＫＡＡＧ１の高レベルのＴＮＢＣ特異性と、この標的が細胞内で内在化される能力との組み合わせによって、ＡＤＣとして用途の開発が支持される。
実施例１０
抗ＫＡＡＧ１抗体が、ＥＲタンパク質発現、ＰｇＲタンパク質発現が欠乏した、および／またはＨＥＲ２タンパク質過剰発現の非存在を示す細胞を効率的にターゲティングし、殺傷することができることを証明するために、２つの抗体薬物複合体（ＡＤＣ）：３Ａ４−ＡＤＣ１および３Ａ４−ＡＤＣ２を作製した。
このために、発明者らは、キメラ３Ａ４抗体を用いて、内在化後にリソソーム酵素により選択的に切断される高度に安定したペプチドリンカーを介して細胞傷害性剤を結合させる（３Ａ４−ＡＤＣ１）か、または非切断性リンカーを介して別の有糸分裂阻害剤と結合させた（３Ａ４−ＡＤＣ２）。細胞傷害性剤は、いったん細胞内に内在化されると、活性となり得る。
３Ａ４−ＡＤＣが、ＴＮＢＣ細胞の表面にＫＡＡＧ１を検出する能力を、本明細書に記載する方法を用いたフローサイトメトリーを用いて決定した。手短には、結合されていない３Ａ４、３Ａ４−ＡＤＣ１、３Ａ４−ＡＤＣ２および対照ＩｇＧを、ＫＡＡＧ１陽性であるＭＤＡ−２３１ＴＮＢＣ細胞の存在下でインキュベートした。結果から、３Ａ４といずれの薬物との結合も、ＭＤＡ−２３１などのトリプルネガティブ乳癌細胞との結合に影響しないことがわかった（データは示してない）。
３Ａ４ ＡＤＣが、ＴＮＢＣ細胞の表面上に発現したＫＡＡＧ１に結合することができることを確認した後、これらの細胞に対するその細胞傷害性を細胞増殖アッセイで評価した。ＭＤＡ−２３１またはＴＯＶ−１１２Ｄ細胞を前記実施例で既述したように培養した。ウェル当たり２００μｌの培地を含む９６ウェルプレートに、５％ＣＯ２中で、３７℃にて３０００細胞／ウェルで細胞を一晩播種した。翌日、０．１２２ｎＭ〜５００ｎＭの濃度で、抗体を含有する新鮮な培地と、培地を取り替えた。すべての条件を３回ウェルで実施した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、細胞増殖アッセイを実施することにより、生存細胞の数を決定した。生データの収集後、結果は、ＰＢＳで処理したウェルの細胞数（１００％に設定した）に対する生存率（％）として表した。結果から、非結合の３Ａ４は、試験したすべての濃度で、ＭＤＡ−２３１細胞の増殖に影響しないことがわかった。対照的に、３Ａ４ ＡＤＣは、有意な細胞傷害性を示した。
これらの結果は、トリプルネガティブ乳癌細胞または基底細胞型乳癌を有する患者についての代替療法として、３Ａ４抗体が用いられうることを示している。同様の結果が、ヒト化３Ａ４抗体を基材とするコンジュゲートにも期待される。
本明細書は、多数の文献を参照にするが、それらの内容は、その全体が本明細書において参照により援用されている。
本明細書において参照される配列
配列番号１
配列番号２
ＭＤＤＤＡＡＰＲＶＥＧＶＰＶＡＶＨＫＨＡＬＨＤＧＬＲＱＶＡＧＰＧＡＡＡＡＨＬＰＲＷＰＰＰＱＬＡＡＳＲＲＥＡＰＰＬＳＱＲＰＨＲＴＱＧＡＧＳＰＰＥＴＮＥＫＬＴＮＰＱＶＫＥＫ
配列番号３
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配列番号４
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配列番号５
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配列番号６
ＥＶＱＬＱＱＳＶＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＤＹＥＩＨＷＶＫＱＴＰＶＨＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＥＴＧＮＴＡＦＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＩＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＭＧＹＳＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＥＦＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号７
ＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＣＧＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＴＴＡＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＡＧＡＡＴＧＧＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＣＣＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
配列番号８
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配列番号９
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配列番号２７
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配列番号２８
ＦＡＳＴＲＥＳ
配列番号２９
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配列番号３０
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ＶＩＤＰＥＴＧＮＴＡ
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配列番号３３
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配列番号３４
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配列番号３５
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ＧＹＴＦＴＤＮＹＭＮ
配列番号３７
ＤＩＮＰＹＹＧＴＴＴ
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配列番号３９
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配列番号４０
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配列番号４１
ＬＱＹＤＥＩＰＬＴ
配列番号４２
ＧＦＳＩＴＳＧＹＧＷＨ
配列番号４３
ＹＩＮＹＤＧＨＮＤ
配列番号４４
ＡＳＳＹＤＧＬＦＡＹ
配列番号４５−３Ａ４重鎖可変領域ヌクレオチド配列
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配列番号４６−３Ａ４重鎖可変領域ポリペプチド配列
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配列番号４７−３Ａ４軽鎖可変領域ヌクレオチド配列
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配列番号４８−３Ａ４軽鎖可変領域ポリペプチド配列
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配列番号４９−３Ａ４重鎖ＣＤＲ１ポリペプチド配列
ＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳ
配列番号５０−３Ａ４重鎖ＣＤＲ２ポリペプチド配列
ＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧ
配列番号５１−３Ａ４重鎖ＣＤＲ３ポリペプチド配列
ＤＰＧＡＭＤＹ
配列番号５２−３Ａ４軽鎖ＣＤＲ１ポリペプチド配列
ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥ
配列番号５３−３Ａ４軽鎖ＣＤＲ２ポリペプチド配列
ＴＶＳＮＲＦＳ
配列番号５４−３Ａ４軽鎖ＣＤＲ３ポリペプチド配列
ＦＱＧＳＨＶＰＬＴ
配列番号５５
ＧＴＡＡＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣ
配列番号５６
ＧＴＡＡＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ
配列番号５７
ＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧ
配列番号５８
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配列番号５９
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配列番号６０
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配列番号６１
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配列番号６６
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配列番号６７
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配列番号６９
ＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＴ
配列番号７０
ＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧ
配列番号７１
ＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴＧＡＧＧＣ
配列番号８９：ＣＤＲＬ１の例示的実施形態
Ｋ−Ｓ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｎ／Ｈ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｎ／Ｄ−Ｎ／Ｇ−Ｑ／Ｎ／Ｋ−Ｋ／Ｌ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ａ
配列番号９０：ＣＤＲＬ１の例示的実施形態
Ｋ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｄ−Ｉ−Ｈ−Ｎ／Ｔ−Ｙ／Ｆ−Ｌ−Ｎ
配列番号９１：ＣＤＲＬ２の例示的実施形態
Ｆ−Ａ−Ｓ−Ｔ−Ｒ−Ｅ−Ｓ
配列番号９２：ＣＤＲＬ２の例示的実施形態
Ｌ−Ｖ−Ｓ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｓ
配列番号９３：ＣＤＲＬ２の例示的実施形態
Ｒ−Ａ−Ｎ−Ｒ−Ｌ−Ｖ−Ｄ
配列番号９４：ＣＤＲＬ３の例示的実施形態
Ｑ−Ｑ−Ｈ−Ｙ−Ｓ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｔ
配列番号９５：ＣＤＲＬ３の例示的実施形態
Ｗ／Ｌ−Ｑ−Ｙ／Ｇ−Ｄ／Ｔ−Ａ／Ｅ／Ｈ−Ｆ−Ｐ−Ｒ−Ｔ
配列番号９６：ＣＤＲＨ１ １の例示的実施形態
Ｇ−Ｙ−Ｔ／Ｉ−Ｆ−Ｔ−Ｄ／Ｅ−Ｙ−Ｅ／Ｎ−Ｍ／Ｉ／Ｖ−Ｈ
配列番号９７：ＣＤＲＨ１の例示的実施形態
Ｇ−Ｆ−Ｔ／Ｓ−Ｉ−Ｔ−Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｗ−Ｈ
配列番号９８：ＣＤＲＨ２の例示的実施形態
Ｖ／Ｎ／Ｇ−Ｉ／Ｌ−Ｄ−Ｐ−Ｅ／Ａ／Ｇ−Ｔ／Ｙ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ａ
配列番号９９：ＣＤＲＨ２の例示的実施形態
Ｙ−Ｉ−Ｎ／Ｓ−Ｆ／Ｙ−Ｎ／Ｄ−Ｇ
配列番号１００：ＣＤＲＨ３の例示的実施形態
Ｍ−Ｇ−Ｙ−Ｓ／Ａ−Ｄ−Ｙ
配列番号１０１：ＣＤＲＨ３の例示的実施形態
Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｄ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ａ−Ｙ
配列番号１０２：ＣＤＲＨ３の例示的実施形態
Ａ−Ｒ／Ｗ−Ｗ／Ｆ−Ｇ−Ｌ−Ｒ−Ｑ／Ｎ
配列番号１０３−３Ａ２軽鎖可変領域
配列番号１０４−３Ｆ６軽鎖可変領域
配列番号１０５−３Ｅ８軽鎖可変領域
配列番号１０６−３Ｅ１０軽鎖可変領域
配列番号１０７−３Ａ９軽鎖可変領域
配列番号１０８−３Ｂ１軽鎖可変領域
配列番号１０９−３Ｇ５軽鎖可変領域
配列番号１１０−３Ｂ２軽鎖可変領域
配列番号１１１−３Ｂ８軽鎖可変領域
配列番号１１２−３Ｇ８軽鎖可変領域
配列番号１１３−３Ｆ７軽鎖可変領域
配列番号１１４−３Ｅ９軽鎖可変領域
配列番号１１５−３Ｃ３軽鎖可変領域
配列番号１１６−３Ｅ１２軽鎖可変領域
配列番号１１７−４Ａ２軽鎖可変領域
配列番号１１８−３Ｆ１０軽鎖可変領域
配列番号１１９−３Ｆ４軽鎖可変領域
配列番号１２０−３Ｂ１１軽鎖可変領域
配列番号１２１−３Ｇ１２軽鎖可変領域
配列番号１２２−３Ｄ１軽鎖可変領域
配列番号１２３−３Ｃ２軽鎖可変領域
配列番号１２４−３Ｅ６軽鎖可変領域
配列番号１２５−３Ｈ３軽鎖可変領域
配列番号１２６−３Ａ２重鎖可変領域
配列番号１２７−３Ｆ６重鎖可変領域
配列番号１２８−３Ｅ８重鎖可変領域
配列番号１２９−３Ａ９重鎖可変領域
配列番号１３０−３Ｂ１重鎖可変領域
配列番号１３１−３Ｂ２重鎖可変領域
配列番号１３２−３Ｆ４重鎖可変領域
配列番号１３３−３Ｅ９重鎖可変領域
配列番号１３４−３Ｂ８重鎖可変領域
配列番号１３５−３Ｇ８重鎖可変領域
配列番号１３６−３Ｆ７重鎖可変領域
配列番号１３７−３Ｅ１２重鎖可変領域
配列番号１３８−３Ｇ１２重鎖可変領域
配列番号１３９−３Ｆ１０重鎖可変領域
配列番号１４０−３Ｃ３重鎖可変領域
配列番号１４１−３Ｇ５重鎖可変領域
配列番号１４２−３Ｂ１１重鎖可変領域
配列番号１４３−３Ｅ６重鎖可変領域
配列番号１４４−４Ａ２重鎖可変領域
配列番号１４５−３Ｅ１０重鎖可変領域
配列番号１４６−３Ｄ１重鎖可変領域
配列番号１４７−３Ｃ２重鎖可変領域
Ａ
配列番号１４８
ＫＳＳＱＳＬＬＨＳＤＧＫＴＹＬＮ
配列番号１４９
ＬＶＳＫＬＤＳ
配列番号１５０
ＷＱＧＴＨＦＰＲＴ
配列番号１５１
ＧＹＴＦＴＤ ＹＮＭＨ
配列番号１５２
ＹＩＮＰＹＮＤＶＴＥ
配列番号１５３
ＡＷＦＧＬ ＲＱ
配列番号１５４
ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮ ＴＹＬＹ
配列番号１５５
ＲＭＳＮＬＡＳ
配列番号１５６
ＭＱＨＬＥＹＰＹＴ
配列番号１５７
ＧＤＴＦＴＤ ＹＹＭＮ
配列番号１５８
ＤＩＮＰＮＹＧＧＩＴ
配列番号１５９
ＱＡＹＹＲＮＳ ＤＹ
配列番号１６０
ＫＡＳＱＤＶＧＴＡＶＡ
配列番号１６１
ＷＴＳＴＲＨＴ
配列番号１６２
ＱＱＨＹＳＩＰＬＴ
配列番号１６３
ＧＹＩＦＴＤＹＥＩＨ
配列番号１６４
ＶＩＤＰＥＴＧＮＴＡ
配列番号１６５
ＭＧＹＳＤＹ
配列番号１６６
ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＮＦＱＫＮＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＳＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１６７
ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＴＨＡＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＤＹＥＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＤＰＥＴＧＮＴＡＦＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＭＧＹＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１６８
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＮＦＱＫＮＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＦＡＳＴＲＥＳＳＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１６９
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＤＹＥＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＶＩＤＰＥＴＧＮＴＡＦＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＭＧＹＳＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１７０
ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＨＮＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＦＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＳＣＬＱＹＤＥＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１７１
ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＴＨＡＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＴＳＧＹＧＷＨＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＹＤＧＨＮＤＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＱＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＹＤＧＬＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１７２
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＨＮＦＬＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＴＬＩＦＲＡＮＲＬＶＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＳＣＬＱＹＤＥＩＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１７３
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＴＳＧＹＧＷＨＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＹＤＧＨＮＤＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＱＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＹＤＧＬＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳ
配列番号１８６（３Ａ４変異体軽鎖可変領域コンセンサス１）
ＤＸＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸＶＸＸＧＸＸＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸＧＴＸＬＥＸＫ
（配列中、Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４８に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比較して、アミノ酸置換（保存的または非保存的）である。アミノ酸置換は、例えば、保存的であり得る）。
配列番号１８７（３Ａ４変異体軽鎖可変領域コンセンサス２）
ＤＸａ１ＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸａ２ＶＸａ３Ｘａ４ＧＸａ５Ｘａ６ＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸａ７ＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸａ８ＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸａ９ＧＴＸａ１０ＬＥＸａ１１Ｋ
（配列中、
Ｘａ１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ２はＡもしくはＰであってよく、
Ｘａ３は中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ４はＬもしくはＰであってよく、
Ｘａ５は酸性アミノ酸であってよく、
Ｘａ６はＱもしくはＰであってよく、
Ｘａ７は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘａ８は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘａ９はＡもしくはＱであってよく、
Ｘａ１０は塩基性アミノ酸であってよく、または
Ｘａ１１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は配列番号４８に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
配列番号１８８（３Ａ４変異体軽鎖可変領域コンセンサス３）
ＤＸＡ１ＶＭＴＱＴＰＬＳＬＸＡ２ＶＸＡ３ＸＡ４ＧＸＡ５ＸＡ６ＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＸＡ７ＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＸＡ８ＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＸＡ９ＧＴＸＡ１０ＬＥＸＡ１１Ｋ
（配列中、
ＸＡ１はＶもしくはＩであってよく、
ＸＡ２はＡもしくはＰであってよく、
ＸＡ３はＳもしくはＴであってよく、
ＸＡ４はＬもしくはＰであってよく、
ＸＡ５はＤもしくはＥであってよく、
ＸＡ６はＱもしくはＰであってよく、
ＸＡ７はＫもしくはＱであってよく、
ＸＡ８はＬもしくはＶであってよく、
ＸＡ９はＡもしくはＱであってよく、
ＸＡ１０はＲもしくはＫであってよく、または
ＸＡ１１はＬもしくはＩであってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４８に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
配列番号１８９（３Ａ４変異体１軽鎖可変領域：Ｌｖｈ１）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１９０（３Ａ４変異体２軽鎖可変領域：Ｌｖｈ２）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１９１（３Ａ４変異体重鎖可変領域コンセンサス１）
ＱＸＱＬＶＱＳＧＸＥＸＸＫＰＧＡＳＶＫＸＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸＱＸＸＧＸＸＬＥＷＸＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸＸＸＸＴＸＤＸＳＸＳＴＡＹＭＸＬＸＳＬＸＳＥＤＸＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸＶＴＶＳＳ
（配列中、Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４６に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、例えば、保存的であり得る）。
配列番号１９２（３Ａ４変異体重鎖可変領域コンセンサス２）
ＱＸｂ１ＱＬＶＱＳＧＸｂ２ＥＸｂ３Ｘｂ４ＫＰＧＡＳＶＫＸｂ５ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸｂ６ＱＸｂ７Ｘｂ８ＧＸｂ９Ｘｂ１０ＬＥＷＸｂ１１ＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸｂ１２Ｘｂ１３Ｘｂ１４Ｘｂ１５ＴＸｂ１６ＤＸｂ１７ＳＸｂ１８ＳＴＡＹＭＸｂ１９ＬＸｂ２０ＳＬＸｂ２１ＳＥＤＸｂ２２ＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸｂ２３ＶＴＶＳＳ
（配列中、
Ｘｂ１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ２はＰもしくはＡであってよく、
Ｘｂ３は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ４はＶもしくはＫであってよく、
Ｘｂ５は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ６は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ７はＳもしくはＡであってよく、
Ｘｂ８はＨもしくはＰであってよく、
Ｘｂ９は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１０はＳもしくはＧであってよく、
Ｘｂ１１は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１２は塩基性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１３は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１４はＩもしくはＴであってよく、
Ｘｂ１５は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１６は疎水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１７はＫもしくはＴであってよく、
Ｘｂ１８は中性親水性アミノ酸であってよく、
Ｘｂ１９はＱもしくはＥであってよく、
Ｘｂ２０はＮもしくはＳであってよく、
Ｘｂ２１はＴもしくはＲであってよく、
Ｘｂ２２は中性親水性アミノ酸であってよく、または
Ｘｂ２３はＳもしくはＬであってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４６に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
配列番号１９３（３Ａ４変異体重鎖可変領域コンセンサス３）
ＱＸＢ１ＱＬＶＱＳＧＸＢ２ＥＸＢ３ＸＢ４ＫＰＧＡＳＶＫＸＢ５ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＸＢ６ＱＸＢ７ＸＢ８ＧＸＢ９ＸＢ１０ＬＥＷＸＢ１１ＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＸＢ１２ＸＢ１３ＸＢ１４ＸＢ１５ＴＸＢ１６ＤＸＢ１７ＳＸＢ１８ＳＴＡＹＭＸＢ１９ＬＸＢ２０ＳＬＸＢ２１ＳＥＤＸＢ２２ＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＸＢ２３ＶＴＶＳＳ
（配列中、
ＸＢ１はＩもしくはＶであってよく、
ＸＢ２はＰもしくはＡであってよく、
ＸＢ３はＭもしくはＶであってよく、
ＸＢ４はＶもしくはＫであってよく、
ＸＢ５はＭもしくはＶであってよく、
ＸＢ６はＫもしくはＲであってよく、
ＸＢ７はＳもしくはＡであってよく、
ＸＢ８はＨもしくはＰであってよく、
ＸＢ９はＫもしくはＱであってよく、
ＸＢ１０はＳもしくはＧであってよく、
ＸＢ１１はＩもしくはＭであってよく、
ＸＢ１２はＫもしくはＲであってよく、
ＸＢ１３はＡもしくはＶであってよく、
ＸＢ１４はＩもしくはＴであってよく、
ＸＢ１５はＬもしくはＩであってよく、
ＸＢ１６はＶもしくはＡであってよく、
ＸＢ１７はＫもしくはＴであってよく、
ＸＢ１８はＳもしくはＴであってよく、
ＸＢ１９はＱもしくはＥであってよく、
ＸＢ２０はＮもしくはＳであってよく、
ＸＢ２１はＴもしくはＲであってよく、
ＸＢ２２はＳもしくはＴであってよく、または
ＸＢ２３はＳもしくはＬであってよく、
Ｘで同定される少なくとも１種のアミノ酸は、配列番号４６に示すポリペプチド内の対応するアミノ酸と比べて（保存的または非保存的な）アミノ酸置換である）。
配列番号１９４（３Ａ４変異体１重鎖可変領域：Ｈｖｈ１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９５（３Ａ４変異体２重鎖可変領域：Ｈｖｈ２）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９６（３Ａ４変異体３重鎖可変領域：Ｈｖｈ３）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９７（３Ａ４変異体４重鎖可変領域：Ｈｖｈ４）
ＱＩＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１９８ ３Ａ４ネズミ軽（カッパ）鎖
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＡＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＡＧＴＲＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号１９９ ３Ａ４ヒト化軽（カッパ）鎖変異体１；Ｌｈ１
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２００ ３Ａ４ヒト化軽（カッパ）鎖変異体２；Ｌｈ２
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＴＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２０１ ３Ａ４ネズミ重（Ｉｇｇ１）鎖
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＭＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２０２ ３Ａ４ヒト化重（Ｉｇｇ１）鎖変異体１；Ｈｈ１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＤＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２０３ ３Ａ４ヒト化重（Ｉｇｇ１）鎖変異体２；Ｈｈ２
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配列番号２０４ ３Ａ４ヒト化重（Ｉｇｇ１）鎖変異体３；Ｈｈ３
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配列番号２０５ ３Ａ４ヒト化重（Ｉｇｇ１）鎖変異体４：Ｈｈ４
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配列番号２０６
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配列番号２０７
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配列番号２０８
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配列番号２０９
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配列番号２１０ ｐＫ−ＣＲ５
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配列番号２１１ ｐＭＰＧ−ＣＲ５
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配列番号２１２−３Ａ４ヒト化重鎖ＣＤＲ２ポリペプチド配列
ＤＩＮＰＹＮＧＤＴＮ
配列番号２１３−ＯＧＳ１８５００
ＡＴＧＣＣＡＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣ
配列番号２１４−ＯＧＳ２０８４
ＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＣＣＧ
配列番号２１５−ＯＧＳ１８７９
ＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧ
配列番号２１６−ＯＧＳ１８１０
ＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＧＴＴＧＡＧＧＣ
参照文献
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Claims (39)

  1. 乳癌を治療する方法であって、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）および／またはＨｅｒ２の発現が低い乳癌を有する個体に、腎臓関連抗原１阻害剤（ＫＡＡＧ１阻害剤）を投与することを含む方法。
  2. 前記ＫＡＡＧ１阻害剤が、腎臓関連抗原１（ＫＡＡＧ１；配列番号２）に特異的に結合することができる抗体または抗原結合性フラグメントである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記個体が、エストロゲン受容体（ＥＲ）発現、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）発現および／またはＨｅｒ２の発現について陰性であるものとして特徴付けられる乳癌を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. トリプルネガティブ乳癌または基底細胞型乳癌を治療する方法であって、必要とする個体に、腎臓関連抗原１阻害剤（ＫＡＡＧ１阻害剤）を投与することを含む方法。
  5. 前記ＫＡＡＧ１阻害剤が、ＫＡＡＧ１に結合することができる抗体または抗原結合性フラグメントである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記抗体または抗原結合性フラグメントを治療部分と結合させる、請求項２、３または５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、癌細胞の表面に結合する、請求項２、３、５または６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３０〜８４の間に含まれるエピトープに結合する、請求項２、３、または５〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである、請求項２、３、または５〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＫＡＡＧ１阻害剤を化学療法薬または細胞傷害性剤と併用して投与する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号４９に示すＣＤＲＨ１、配列番号５０または配列番号２１２に示すＣＤＲＨ２、配列番号５１に示すＣＤＲＨ３、配列番号５２に示すＣＤＲＬ１、配列番号５３に示すＣＤＲＬ２、および配列番号５４に示すＣＤＲＬ３を含む、請求項２、３、または５〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号４８に示す軽鎖可変領域と、配列番号４６に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、または５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１８６に示す軽鎖可変領域であって、Ｘにより同定されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号４８に示すポリペプチドの対応するアミノ酸と比べてアミノ酸置換である軽鎖可変領域と、配列番号１９１に示す重鎖可変領域であって、Ｘにより同定されるアミノ酸の少なくとも１つは、配列番号４６に示すポリペプチドの対応するアミノ酸と比べてアミノ酸置換である重鎖可変領域と、を含む、請求項２、３、または５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記軽鎖可変領域が、配列番号１８７に示す通りであり、前記重鎖可変領域が、配列番号１９２に示す通りである、請求項２、３、５〜１１または１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記軽鎖可変領域が、配列番号１８８に記載の通りであり、前記重鎖可変領域が、配列番号１９３に記載の通りである、請求項２、３、５〜１１、１３または１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１８９または配列番号１９０に示す軽鎖可変領域と、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６または配列番号１９７に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１８９に示す軽鎖可変領域と、配列番号１９４に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１８９に示す軽鎖可変領域と、配列番号１９５に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１８９に示す軽鎖可変領域と、配列番号１９６に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１８９に示す軽鎖可変領域と、配列番号１９７に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１９０に示す軽鎖可変領域と、配列番号１９４に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１９０に示す軽鎖可変領域と、配列番号１９５に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１９９または配列番号２００に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４または配列番号２０５に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１９９に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０２に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１９９に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０３に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１９９に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０４に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号１９９に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０５に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号２００に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０２に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号２００に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０３に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号２００に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０４に示す重鎖可変領域を含む、請求項２、３、５〜１１、または１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号２００に示す軽鎖可変領域と、配列番号２０５に示す重鎖可変領域を含む、請求項２２、３、５〜１１、または１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記抗体または抗原結合性フラグメントが、治療部分と結合している、請求項２、３、５〜３２のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記治療部分が、細胞傷害性剤である、請求項３３に記載の方法。
  34. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＫＡＡＧ１に対して高い親和性を有する、請求項２、３、５〜１１、１４〜１７、または３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ＫＡＡＧ１に対して高い親和性を有する、請求項２２、３、５〜１１、１４〜１７、または３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記抗体またはその抗原結合性フラグメントが、細胞内部に内在化される、請求項２、３、５〜１１、１４〜１７、または３２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記ＫＡＡＧ１阻害剤が、配列番号１またはそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１、３または４のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記ＫＡＡＧ１阻害剤が、配列番号１のヌクレオチド７３８〜９９２（両端の値を含む）またはそのフラグメントに相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  39. 抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
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