DE19904285A1 - Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Analyten in Proben mit Hilfe von RNA-Replikons - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, bei dem man ein Nachweisreagenz verwendet, welches ein RNA-Replikon oder eine für eine solche Sequenz kodierende DNA-Sequenz aufweist, und man den Analyten durch Amplifikation des RNA-Replikons mittels einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase und anschließende Detektion der Amplifikationsprodukte nachweist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Nachweisreagenz kodiert, sowie ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei der Nachweis mit Hilfe eines für den Analyten spezifischen Nachweisreagenzes erfolgt, welches eine Replikonsequenz enthält, wobei das Replikon von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase amplifiziert werden kann. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für ein erfindungsgemäßes Nachweisreagenz kodiert, sowie ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Bekannte Verfahren zum Nachweis von bestimmten Substanzen sind beispielsweise Immunoassays und Nukleinsäure-Hybridisierungsassays, welche heutzutage auf den Gebieten der Diagnostik und der Qualitätskontrolle vielfache Anwendung finden. Diese Verfahren basieren auf dem Prinzip, daß eine nachzuweisende Substanz an eine andere Substanz spezifisch bindet, d. h. mit dieser einen Komplex bildet, wobei mit Hilfe dieser anderen Substanz die Anwesenheit der festzustellenden Substanz nachgewiesen werden kann. Bei Immunoassays wird die hochspezifische Bindung von Antikörpern an bestimmte Antigene ausgenutzt, während man sich bei Nukleinsäurehybridisierungsassays die Tatsache zunutze macht, daß einander komplementäre Einzelstränge von Nukleinsäuren ebenfalls hochspezifisch stabile Doppelstränge bilden.

Ein wichtiger Faktor insbesondere beim Nachweis von pathogenen Organismen ist die Sensitivität der Assays. Aus diesem Grund wurden Methoden entwickelt, um nachzuweisende Substanzen verstärken zu können, beispielsweise durch Amplifikation. Das wichtigste dieser Verfahren auf dem Gebiet der Nukleinsäureanalyse ist die PCR (Polymerase- Kettenreaktion), bei der mit Hilfe von spezifischen Oligonukleo­ tidprimermolekülen sehr geringe Konzentrationen an Nukleinsäuren zu makroskopisch nachweisbaren Mengen amplifiziert werden können. In dieser Reaktion wird die doppelsträngige Nukleinsäure durch Erhitzen in Einzelstränge geschmolzen, und die beiden Einzelstränge werden durch eine DNA-Polymerase und geeignete Primermoleküle bei niedriger Temperatur zum Doppelstrang ergänzt. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis die Amplifikation des gewünschten Nukleinsäureabschnitts für einen Nachweis ausreicht. Dieses Verfahren wurde bereits durch den Einsatz thermostabiler DNA-Polymerasen automatisierbar gemacht.

Eine Reihe von analogen Reaktionen, wie z. B. die Ligationskettenreaktion (LCR) (Backman und Wang, EP-A-0 320 308; Backman et al., EP-A-0 439 182) und die Strangverdrängungsverstärkung (SDA) (Walker et al., Nucleic Acids Res. 20 (1992), 1691-1696), wurden daraufhin entwickelt. Alle diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß sie sehr aufwendig sind. Die Nukleinsäuren, in der Regel DNA, müssen möglichst verlustfrei aus dem biologischen Material isoliert werden, und es muß durch unabhängige Methoden, z. B. gelelektrophoretische Längenbestimmung oder Hybridisierung der verstärkten DNA mit einem spezifischen Oligonukleotid, verifiziert werden, daß das richtige Produkt amplifiziert wurde. Außerdem besteht immer ein hohes Risiko der Amplifikation von nicht spezifischen oder kontaminierenden Sequenzen, was zu falschen positiven Ergebnissen führt.

Außerordentlich sensitiv sind isotherme RNA-Vervielfältigungsverfahren. In einer Methode wird die RNA mittels Reverser Transkription in DNA umgeschrieben. Das entstandene RNA : DNA-Hybrid wird mittels Verdau des RNA-Strangs durch RNaseH und Wiederaufbau durch DNA-Polymerase in einen DNA-Doppelstrang verwandelt, welcher wiederum durch Transkription die Bildung von weiteren RNA-Molekülen ermöglicht. Zwei solcher Verfahren wurden als selbsterhaltende Sequenzvervielfältigung (3SR) und NASBA implementiert (Kwoh et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177; Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 934-938). Es handelt sich jedoch um komplizierte Reaktionen, bei denen Nebenreaktionen auftreten können, die leicht zur Bildung und Selektion von unspezifischen Sequenzen führen (Breaker und Joyce (1993), Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 6093-6097).

Die oben genannten enzymatischen Vervielfältigungsmethoden sind sehr störanfällig gegenüber Verunreinigungen. Es kann daher nicht mit Rohmaterial gearbeitet werden, wie etwa einer Blut- oder Lebensmittelprobe ohne Extraktion des Nukleinsäurematerials. Nur bei einer aufwendigen und verlustarmen Isolierung kleinster Mengen von Nukleinsäuren in hoher Reinheit können derartige Methoden erfolgreich angewandt werden.

Eine weitere Methode zur Amplifikation von RNA ist die Replikation durch RNA-abhängige RNA-Polymerasen. Das Paradebeispiel einer solchen Polymerase ist die RNA-Polymerase des Bakteriophagen Qβ, auch Qβ- Replikase genannt. Deren Funktion in vivo ist, das RNA-Genom des Qβ- Phagen zu replizieren. Als Matrize dient die genomische einzelsträngige RNA aus dem Qβ-Virion, welche als Plus-Strang bezeichnet wird. Die Qβ- Replikase stellt eine Minus-Strang-RNA-Kopie des Plus-Stranges her, welche ebenso wie Plus-Stränge als Matrize fungieren kann. Auf diese Weise kann eine exponentielle Vervielfältigung erreicht werden im Gegensatz zur Transkription, welche zu einer linearen Vervielfältigung der Matrize führt. Aus diesem Grunde wurde das Qβ-System bereits vielfach zum Nachweis von Analyten, wie etwa Nukleinsäuren, verwendet (Chu et al. (1986), Nucleic Acids Research 14, 5591-5603; Lizardi et al. (1988), Biotechnology 6, 1197-1202).

Ein Beispiel eines Wildtyp-Qβ-RNA-Replikons ist die "Midivariant"- oder MDV-Sequenz. Bei einem herkömmlichen Qβ-Amplifikationsassay wird eine Sonde mit einer Oligonukleotidsequenz, die spezifisch mit einer Zielnukleinsäure hybridisiert, und zusätzlich eine Qβ-Replikonsequenz, z. B. MDV, verwendet. Theoretisch genügt ein einziges als Matrize geeignetes RNA-Molekül zur Auslösung einer Vervielfältigungslawine, aber in praktischen Versuchen waren diese Empfindlichkeiten nicht zu erreichen. Von großem Nachteil ist weiterhin, daß die Reaktion sehr störanfällig ist.

Problematisch ist außerdem, daß Qβ-Replikase aus Qβ-Phagen-infizierten E.coli Zellen isoliert werden muß. Dabei ist es unvermeidlich, daß replizierbare RNA-Moleküle mitisoliert werden. Bei Einsatz der Qβ-Replikase als Amplifikationsenzym in einem Nachweisverfahren stehen diese RNA- Moleküle - selbst wenn sie anfänglich nur in kleinen Mengen vorliegen - im Wettbewerb mit der als Sonde verwendeten replizierbaren Nukleinsäure. Somit wird einerseits die Testsensitivität des Assays durch ein hohes Hintergrundsignal verringert und zum anderen werden oft falsche positive Ergebnisse erhalten. Außerdem ist die Qβ-Replikation sehr sequenzspezifisch. Es gelingt zwar in einigen Fällen, eine Zielsequenz in ein replizierbares RNA-Molekül einzusetzen (Miele et al. (1983), J. Mol. Biol. 171, 281-285), diese Manipulation beeinträchtigt jedoch die Replikationsgeschwindigkeit. In einer raschen Evolution wird durch Mutation die eingesetzte RNA modifiziert oder herausgeschnitten, und die entstandenen Produkte werden bevorzugt amplifiziert. Eine Verifizierung des Testresultats durch unabhängige Methoden ist daher unabdingbar, jedoch wesentlich schwieriger als bei der PCR, da die Hybridisierung durch die rasche Doppelstrangbildung zwischen den beiden bei der Replikation gebildeten komplementären Strängen erschwert wird.

Im Stand der Technik wurde versucht, einige dieser Nachteile auszuräumen oder zumindest zu verringern. So offenbart EP-A-0 454 461 ein Qβ- Replikase-Nachweisverfahren, bei deminhibitorische Chemikalien eingesetzt werden, um die Replikation von Wildtyp-MDV zu unterdrücken. Gleichzeitig wird eine Sonde eingesetzt, die mit einer rekombinanten MDV-Sequenz verknüpft ist, welche gegen den Inhibitor resistent ist.

In WO 90/06376 wird vorgeschlagen, Qβ-Replikase als primerabhängige RNA-abhängige RNA-Polymerase zur Amplifikation einer Zielsequenz einzusetzen. Dabei werden zwei Oligonukleotidsequenzen verwendet. Eine erste enthält in 3'-5'-Richtung eine Sequenz, die mit der Zielnukleinsäure spezifisch hybridisiert, und eine Qβ-replizierbare Sequenz. Diese erste Oligonukleotidsequenzfungiert als Primer für RNA-Templat-gesteuerte RNA- Primer-initiierte Kettenverlängerung. Anschließend wird der Doppelstrang in Einzelstränge aufgetrennt, und eine zweite Oligonukleotidsequenz dient als Primer für eine zweite Qβ-Replikase-gesteuerte Elongation entlang dem Produkt der ersten Elongation. Nach Strangtrennung liegt eine replizierbare RNA vor, welche an beiden Enden Qβ-Replikonsequenzen und in der Mitte die Zielsequenz aufweist. Mittlerweile wurde jedoch von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung nachgewiesen, daß die vorgeschlagene Reaktion nicht funktioniert.

WO 90/14439 offenbart eine Verbesserung des bereits bekannten Qβ- Verfahrens, welche zum Ziel hat, Hintergrundsignale zu reduzieren. Es werden zwei Sonden als Primer verwendet, die eine zielspezifische Hybridisierung und eine DNA-Synthesereaktion initiieren können. Dabei entsteht eine doppelsträngige DNA, welche durch Transkription eine RNA liefern kann, die eine replizierbare Sequenz enthält. Für die Transkription wird eine DNA-abhängige RNA-Polymerase verwendet, für die anschließende Amplifikation eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, insbesondere die Qβ-Replikase.

Zur Isolierung von Nukleinsäuren in möglichst reiner Form wurden zahlreiche Extraktionsprotokolle entwickelt. Eine erfolgreiche Methode ist das sogenannte "Gene-Capture"-Verfahren (Ranki et al. (1983), Gene 21, 77-­ 85). Durch Hybridisierung mit einer auf einem Träger immobilisierten Nukleinsäure wird die Zielsequenz spezifisch aus einer Probe extrahiert. Die Hybridisierungsreaktion ist hierbei wenig störanfällig, sie läuft selbst unter Bedingungen ab, unter welchen Enzyme denaturieren und Zellen lysieren. Somit kann eine Degradierung der Nukleinsäuren durch ubiquitäre Nukleasen durch die Wahl von Denaturierungsbedingungen verhindert werden. Die nicht gebundenen Nukleinsäuren sowie andere Bestandteile, Nukleasen und Pufferchemikalien werden durch ausgiebiges Waschen entfernt, und eine enzymatische Verstärkungsreaktion kann angeschlossen werden. Trotz den vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten der Gene-Capture-Methode auf verschiedene Rohproben hat es sich in der Praxis als schwierig erwiesen, ein zuverlässiges Durchführungsprotokoll zu entwickeln.

In den 70er Jahren (Biebricher und Orgel (1973), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 934-938) wurde entdeckt, daß auch DNA-abhängige RNA-Polymerasen RNA-Moleküle replizieren können. Dieser Befund wurde durch Konarska und Sharp (Cell 57 423-431, 1989) bestätigt. Biebricher und Luce (EMBO J. 11, 5129-5135, 1992; Biochemistry 32, 4848-4854, 1993) konnten nachweisen, daß eine RNA-Matrize für die T7 RNA-Polymerase einzelsträngig ist und eine Sekundärstruktur in Form eines "Hairpins" (Haarnadel) aufweist. Die Replikation erfolgt primerunabhängig. Sowohl der Plus-Strang als auch der Minus-Strang können als Matrize dienen, allerdings ist der Minus-Strang bevorzugt, so daß mehr Plus-Strang gebildet wird. Später konnten weitere RNA-Matrizen für die T7 RNA-Polymerase identifiziert werden (Biebricher und Luce (1996), EMBO J., 15, 3458-3465). Dabei besitzt der Plus-Strang des Replikons eine Haarnadelsekundärstruktur und vorzugsweise an beiden Termini die Sequenz GG. Insbesondere wurden drei RNA-Spezies identifiziert, die als Matrize für die Replikation durch T7 RNA-Polymerase besonders gut geeignet sind: T7rp1, T7rp2 und T7rp3. Einige Matrizen können auch durch andere RNA-Polymerasen repliziert werden, wie z. B. die T3 und die SP6-Polymerase, aber nicht durch Qβ- Replikase.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die RNA-Replikation durch DNA­ abhängige RNA-Polymerase als äußerst sensitive und wenig störanfällige Amplifkationsreaktion in einem Nachweisverfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines Analyten eingesetzt werden kann. Ein besonderer Vorteil besteht darin, daß das 3'-Ende des als Matrize verwendeten RNA-Replikons variabel sein kann, so daß - im Gegensatz zum Qβ-System - zusätzliche Sequenzen ohne Schwierigkeiten angefügt werden können.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei man ein Nachweisreagenz verwendet, welches ein RNA-Replikon oder eine für eine solche Sequenz kodierende DNA-Sequenz aufweist, und den Analyten durch Amplifikation des RNA-Replikons mittels einer DNA-abhängigen RNA- Polymerase und anschließende Detektion der Amplifikationsprodukte nachweist.

Die Probe ist ein Material, das auf das Vorhandensein eines oder mehrerer bestimmter Analyten getestet werden soll. Im allgemeinen ist die Probe ein biologisches Material bzw. ein biologische Substanzen enthaltendes Material. Die Probe kann eine Flüssigkeit sein, wie z. B. Trinkwasser oder Körperflüssigkeiten oder Extrakte aus Geweben oder Zellen. Die Methode eignet sich jedoch auch zur Untersuchung äußerlicher Kontaminationen von Feststoffen.

Als Analyt kommen Moleküle in Frage, die in der Lage sind, mit anderen Molekülen Komplexe zu bilden. Bevorzugt werden in einer der oben genannten Proben vorhandene Biomoleküle detektiert, wie z. B. Proteine oder Nukleinsäuren. Besonders bevorzugt ist der Analyt eine Nukleinsäure. Der Nachweis von Nukleinsäuren ist insbesondere für die Bestimmung von Kontaminationen durch Mikroorganismen von Bedeutung.

Das Nachweisreagenz ist ein Molekül, welches den spezifischen Nachweis des Analyten ermöglicht. Dieser Nachweis kann durch unmittelbare Bindung des Nachweisreagenz an den Analyten oder indirekt, z. B. durch Kompetition mit dem Analyten oder durch Bindung an eine weitere analytbindende Substanz, z. B. eine zum Analyten komplementäre Nukleinsäuresequenz, erfolgen. Das Nachweisreagenz enthält mindestens eine Identifikatordomäne zum Nachweis des Analyten und eine Amplifikator- bzw. Reporterdomäne, die aus dem Replikon oder die für das Replikon kodierende DNA besteht. Identifikator- und Amplifikatordomäne sind vorzugsweise kovalent aneinander gekoppelt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nachweisreagenz ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, dessen Identifikatordomäne mit einer nachzuweisenden Nukleinsäure oder einer dazu komplementären Sequenz hybridisiert und dessen Amplifikatordomäne ein RNA-Replikon oder eine dafür kodierende DNA enthält. Die Identifikatordomäne kann gegebenenfalls eine modifizierte Nukleinsäure enthalten, wie z. B. eine peptidische Nukleinsäure (PNA), oder eine Nukleinsäure mit modifizierten Nukleotiden, insbesondere solche, welche gegen enzymatischen Abbau stabiler sind als natürliche Nukleinsäurebausteine.

Im Sinne dieser Erfindung kann das Nachweisreagenz aber auch Identifikatordomänen enthalten, die nicht aus Nukleinsäure bestehen, sondern beispielsweise Polypeptide, wie etwa Antikörper oder Antikörperfragmente oder Peptide, die spezifisch für bestimmte Antikörper sind. Somit können die erfindungsgemäßen Nachweisreagenzien nicht nur für Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren, sondern auch für andere Arten von Nachweisverfahren, z. B. für immunchemische Verfahren zur Detektion von Antigenen oder Antikörpern verwendet werden.

Die Amplifikatordomäne ist eine von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase als Matrize akzeptiertes RNA-Replikon oder eine dafür kodierende DNA.

Solche RNA-Replikons wurden bereits zuvor beschrieben. Bevorzugt weist der Plus-Strang des Replikons an seinem 5'-Ende die Basenfolge pppGpG auf und an seinem 3'-Ende die Basenfolge GG(OH). Die Sequenz ist zumindest teilweise palindromisch, so daß das Replikon eine Hairpin-förmige Sekundärstruktur ausbilden kann. Bevorzugt liegt das Replikon zum größten Teil basengepaart vor, wobei nur die mittleren Nukleotide und die endständigen Nukleotide ungepaart vorliegen. Der innere Loop besteht bevorzugt auf jedem Strang aus 4 bis 5 Basen, die jeweils in der Mitte im Plus-Strang die Basenfolge CC und im Minus-Strang die Basenfolge GG aufweisen. Die Hälften des Replikons sind selbst teilweise palindromisch, so daß eine alternative Sekundärstruktur möglich ist, die jedoch weniger stabil ist. Auch die RNA-Amplifikatordomäne kann modifizierte Nukleotidbausteineenthalten (z. B. 2'-O-Alkyl-, 2'-O-Alkenyl-, 2'-O-Alkinyl-, 2'-Amino-, gegebenenfalls substituiert, 2'-Halogen-, 2'-Thio-Nukleosideund dgl.), sofern dadurch eine Replikation durch eine DNA-abhängige RNA- Polymerase nicht beeinträchtigt wird.

Die Amplifikatordomäne kann einerseits im Nachweisreagenz in einer bereits replikationsfähigen Form vorliegen, z. B. als RNA-Replikon. Andererseits kann die Amplifikatordomäne aber auch erst während der Nachweisreaktion gebildet werden, z. B. durch Transkription eines DNA-Fragments oder/und durch Ligation von Teilsequenzen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren kann jede Art von DNA-abhängiger RNA-Polymerase eingesetzt werden, die in der Lage ist, ein RNA-Replikon zu amplifizieren. Geeignet sind bakterielle RNA-Polymerasen und insbesondere RNA-Polymerasen aus Bakteriophagen, z. B. aus "T­ ungeraden" E.coli Phagen wie etwa T1, T3, T5 oder T7 oder damit verwandten Phagen wie SP6. Besonders bevorzugt sind die Polymerasen von T3 und T7. Am meisten bevorzugt ist T3 RNA-Polymerase.

In einer ersten Ausführungsform besteht das Nachweisreagenz aus einem Replikon, welches bevorzugt an seinem 3'-Ende mit einer Identifikatordomäne verknüpft ist, welche direkt an den nachzuweisenden Analyten bindet. Vorzugsweise enthält die Identifikatorsequenz eine Oligonukleotidsequenz, welche spezifisch mit dem Analyten oder einer dazu komplementären Sequenz hybridisiert. Bevorzugt ist der Identifikator in der Lage, mit einem streng für den Analyten spezifischen Sequenzabschnitt, z. B. mit einem für einen nachzuweisenden Organismus art- oder individuen­ spezifischen Sequenzabschnitt zu hybridisieren. Besonders bevorzugt ist die Identifikatordomäne spezifisch für eine einzige bakterielle Spezies oder Subspezies. Geeignete Identifikatorsequenzen sind solche, die mit ribosomaler DNA oder RNA hybridisieren können, wie etwa der 16S rDNA/RNA oder der 23S rDNA/RNA.

Die im Nachweisreagenz enthaltene Amplifikatordomäne kann jedwede Sequenz aufweisen, die in Form einer RNA durch eine DNA-abhängige RNA- Polymerase amplifiziert werden kann. Als besonders geeignet haben sich die Replikonsequenzen T7rp1, T7rp2 und T7rp3 (SEQ ID NO. 1-3) erwiesen. Die Replikonsequenz hat bevorzugt eine Länge von 50 bis 200 Basen.

Neben dem Nachweisreagenz kann - insbesondere wenn das erfindungs­ gemäße Verfahren als heterogender Test unter Verwendung eines festen Trägers durchgeführt wird - auch ein Fangreagenz verwendet werden. Das Fangreagenz enthält eine Fängerdomäne, die vorzugsweise zur Bindung des Analyten und besonders bevorzugt zur Immobilisierung des Analyten auf der Festphase dient. Im Gegensatz zur Identifikatordomäne des Nachweisreagenz muß die Fängerdomäne des Fangreagenz nicht streng analytspezifisch sein. Wenn die Fängerdomäne des Fangreagenz eine Nukleinsäure ist, kann sie beispielsweise in einem hochkonservierten, nicht artspezifischen Sequenzabschnitt des nachzuweisenden Organismus reagieren. Selbstverständlich kann jedoch auch eine streng analytspezifische Fängerdomäne eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fangreagenz auf einem Träger immobilisiert oder enthält eine Immobilisierungsgruppe. Besonders bevorzugt ist es, für die Immobilisierung ein spezifisches Bindepaar zu verwenden, dessen einer Partner als Immobilisierungsgruppe an das Fangreagenz gekoppelt ist, und dessen anderer Partner sich auf dem Träger befindet. Derartige, zur Immobilisierung auf Trägermaterialien geeignete Bindepaare sind bekannt, beispielsweise können Biotin-Streptavidin, Biotin-Avidin oder Oligo(C)-Oligo(G) verwendet werden.

Der Nachweis der Amplifikationsprodukte kann auf beliebige Art und Weise vorzugsweise über Markierungssubstanzen erfolgen, die z. B. in Form markierter Nukleosidtriphosphate in die Amplifikationsprodukte eingebaut werden können. Alternativ können die Amplifikationsprodukte auch durch Nukleinsäure-bindende Markierungssubstanzen nachgewiesen werden. Vorzugsweise werden fluoreszierende oder lumineszierende Markierungssubstanzen verwendet. Besonders geeignet sind intercalierende fluoreszierende Substanzen, beispielsweise Ethidiumbromid, Propidiumiodid, Acridin-Orange, Thiazol-Orange sowie dessen Derivate ToPro1 und YoPro1 (Molecular Probes, Eugene, OR). Mit Hilfe von Markierungssubstanzen und gegebenenfalls eines internen Standards wird eine Quantifizierung des Analyten möglich. Beispielsweise kann die Menge des Analyten in der Probe durch Messung der Zeit bestimmt werden, welche benötigt wird, um lineares RNA-Wachstum zu erhalten. Zur Detektion können herkömmliche Fluoreszenzmeßgeräte verwendet werden, wie sie für die Analyse von Mikrotiterplatten bekannt sind. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine Quantifizierung mit einer Sensitivität von bis zu 100 Nukleinsäuremolekülen in der Probe (vgl. Abb. 7). Wenn die ribosomale RNA als Analyt nachgewiesen wird, ist es daher möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein einziges Bakterium in der Probe nachzuweisen, denn Bakterien, die exponentiell wachsen, enthalten bis zu 10000 Ribosomen pro Zelle.

Für den Nachweis von Bakterien wird vorzugsweise die ribosomale RNA extrahiert und von anderen Zellkomponenten getrennt. Günstigerweise werden dabei die Bedingungen so gewählt, daß RNasen inhibiert werden. Besonders geeignet ist ein Lysepuffer, enthaltend ein Detergens, ein Reduktionsmittel, z. B. ein Thiolreagenz und 0,1-0,5 M Salz, z. B. LiCl. Ein besonders geeigneter Lysepuffer enthält 1% Natriumdodecylsulfat/1% β- Mercaptoethanol/0,2 M LiCl/10 mM TES (pH 6,5). Weiterhin ist es bevorzugt, die ribosomale RNA mit Hilfe eines Fangreagenz auf einem Träger zu immobilisieren.

Eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Fig. 1 dargestellt. Der Analyt (1) ist eine Nukleinsäure, z. B. eine ribosomale RNA. Das Nachweisreagenz (2) besteht aus einem RNA-Replikon (3), das an seinem 3'-Ende mit einer Identifikatorsequenz (4) verknüpft ist. Die Identifikatorsequenz (4) hybridisiert mit einem Abschnitt des Analyten (1). Der Analyt (1) wird durch ein Fangreagenz (5), das eine Sequenz aufweist, die spezifisch mit dem Analyten hybridisieren kann (6), auf einen Träger (7) immobilisiert. Dabei ist das Fangreagenz (5) über ein spezifisches Bindepaar (8a/8b) an den Träger gebunden.

Die den Analyten enthaltende Probe wird mit dem Fangreagenz und dem Nachweisreagenz in Kontakt gebracht, wobei die Reihenfolge der Zugabe der beiden Reagenzien unerheblich ist. Die Nukleotidsequenz wird beim Fangreagenz vorzugsweise so gewählt, daß damit die ribosomale RNA jedweder Spezies von Bakterien erkannt werden kann, bevorzugt handelt es sich deshalb hierbei um eine stark konservierte Sequenz. Das Fangreagenz kann beispielsweise auf eine Mikrotiterplatte, z. B. NucleoLink™ (Nung AS, Roskilde, Dänemark) immobilisiert sein. Das Fangreagenz kann - wie gezeigt -über ein spezifisches Bindepaar aber auch direkt kovalent an den Träger gebunden sein, beispielsweise durch die 5'-Phosphatgruppe oder durch 5'- oder 3'-Aminolinkergruppen des Oligonukleotids. Über Aminolinker gekoppelte Nukleotide sind hierbei bevorzugt, da sie gegen Hydrolyse stabil sind. Das Nachweisreagenz enthält außer dem RNA Replikon eine spezies- oder isolat-spezifische Identifikatorsequenz, welche direkt an den Analyten bindet, wobei diese Sequenz jedoch von derjenigen des Oligonukleotids des Fangreagenz verschieden ist. Besonders bevorzugt für diese Ausführungsform befindet sich das RNA Replikon am 5'-Ende und die Identifikatorsequenz am 3'-Ende. Nach dem Inkontaktbringen des Analyten mit dem Fangreagenz und dem Nachweisreagenz erfolgt eine Waschprozedur. Dann wird die DNA-abhängige RNA-Polymerase hinzugegeben, und es findet eine Amplifikation des RNA-Replikons statt. Während oder/und nach der Amplifikation können die Amplifikationsprodukte durch Zugabe einer Markersubstanz detektiert werden.

In einer weiteren Ausführungsform kann die Sensitivität des Verfahrens erhöht werden, indem das RNA Replikon in situ und nur in Gegenwart des nachzuweisenden Analyten gebildet werden kann. Diese Ausführungsform umfaßt die Schritte:

• a) lnkontaktbringen der Probe mit einem Fangreagenz umfassend eine Nukleinsäuredomäne, die mit einem Nukleinsäure-Analyten hybridisieren und dessen 3'-Ende als Primer für eine enzymatische Elongation dienen kann, und mit einem Blockerreagenz, welches an einer bestimmten Stelle stromabwärts vom Fangreagenz an den. Analyten binden kann und in der Lage ist, eine enzymatische Elongation zu stoppen,
• b) enzymatisches Elongieren des Fangreagenz unter Verwendung des Analyten als Matrize, wobei ein zum Analyten komplementärer Nukleinsäurestrang gebildet wird, der bis zur Bindestelle des Blockerreagenz auf dem Analyten reicht,
• c) Abtrennen des Analyten und Inkontaktbringen des Komplementär­ strangs mit einem Nukleinsäure-Nachweisreagenz umfassend eine Amplifikatordomäne, die eine für ein RNA-Replikon kodierende Sequenz in operativer Verknüpfung mit einem Promotor enthält, und eine Identifikatordomäne, die mit dem 3'-Ende des in Schritt (ii) gebildeten Komplementärstrang hybridisieren kann,
• d) weiteres enzymatisches Elongieren des in Schritt (ii) gebildeten Komplementärstrangs unter Verwendung des Nachweisreagenz als Matrize, wobei ein Nukleinsäuredoppelstrang aus dem Nachweisreagenz und einem dazu komplementären Nukleinsäurestrang gebildet wird,
• e) Transkribieren des Doppelstranges unter Bildung eines RNA- Replikons,
• f) Amplifizieren des transkribierten RNA-Replikons durch eine DNA­ abhängige RNA-Polymerase und
• g) Detektieren des Amplifikationsprodukts.

Bei dieser Ausführungsform ist der Analyt eine Nukleinsäure, welche bevorzugt als einzelsträngige DNA oder RNA vorliegt. Das Fangreagenz weist bevorzugt eine Nukleinsäuredomäne auf, welche spezifisch mit dem Analyten - vorzugsweise mit einem hochkonservierten Sequenzabschnitt - z. B. mit vielen und bevorzugt allen Spezies von Eubakterien hybridisieren kann. Das 3'-Ende dieser Nukleinsäuredomäne kann als Primer für eine enzymatische Elongation fungieren. Vorzugsweise ist das Fangreagenz auf einem festen Träger immobilisiert oder enthält eine zur Immobilisierung fähige Gruppe. Nach Bindung des Analyten an die Fängerdomäne des Fangreagenz erfolgt eine enzymatische Elongation an dessen freiem 3'-Ende, z. B. mit Hilfe einer Reversen Transkiptase oder einer DNA-Polymerase, wobei ein zum Analyten komplementärer Nukleinsäurestrang, insbesondere ein DNA-Strang gebildet wird. Wesentlich ist bei dieser Reaktion, daß auf dem neugebildeten DNA-Strang ein definiertes 3'-Ende entsteht. Bevorzugt wird deshalb vor der Initiierung der Elongation ein Blockerreagenz hinzugegeben, welches ebenfalls spezifisch an den Analyten bindet und in der Lage ist, die Elongation einer Polymerase an einer definierten Stelle zu stoppen, so daß ein definiertes 3'-Ende auf dem neugebildeten Komplementärstrang entsteht. Ein solches Blockerreagenz kann beispielsweise eine Oligonukleotidsequenz sein, welche an einer definierten Stelle stromabwärts von der Stelle, an welcher das Fangreagenz hybridisiert, mit dem Analyten hybridisiert. Vorzugsweise ist das Blockerreagenz derart beschaffen, daß es kein als Elongationsprimer geeignetes freies 3'-Ende aufweist. Da die meisten RNA-abhängigen DNA-Polymerasen keine 3'→5'- Exonukleasaktivität besitzen, führt das Vorhandensein eines doppelsträngigen Bereichs zum Stop der Elongation an dieser Stelle. Das Blockerreagenz kann gegebenenfalls modifizierte Nukleotidbausteine enthalten, beispielsweise aus PNA, oder auch ein Polypeptid sein, welches in der Lage ist, sequenzspezifisch an den Analyten zu binden und die Elongation zu stoppen.

In Schritt (iii) des Verfahrens wird der als Matrize für die Elongation in Schritt (ii) verwendete Analyt abgetrennt. Dies kann auf verschiedene Art und Weise, z. B. durch Denaturierung des Hybrids zwischen Analyt und Fangreagenz mittels Erwärmen und/oder alkalischer Behandlung, geschehen. Wenn der Analyt eine RNA ist, kann die Abtrennung auch durch Abbau des Analyten mittels chemischer oder enzymatischer Methoden, z. B. mit Hilfe einer RNase, beispielsweise RNase H, erfolgen. Nach dem Abtrennen des Analyten entsteht ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, welches einen zum Analyten komplementären Sequenzabschnitt und ein definiertes 3'- Ende aufweist.

Das Nachweisreagenz ist eine einzelsträngige Nukleinsäure, z. B. eine DNA, die eine Identifikatordomäne enthält, die mit dem 3'-terminalen Bereich des in Schritt (ii) elongierten Analyt-Komplementärstrangs hybridisieren kann. Weiterhin enthält das Fangreagenz als Amplifikatordomäne eine für ein RNA- Replikon kodierende DNA-Sequenz in operativer Verknüpfung mit einem von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase erkannten Promotor. Vorzugsweise liegt die Identifikatordomäne stromabwärts von der Amplifikatordomäne. Die Identifikatordomäne hybridisiert mit dem 3'-Ende des in Schritt (ii) synthetisierten Stranges und kann dann als Primer für eine zweite enzymatische Elongationsreaktion dienen. Diese Elongation wird vorzugsweise mittels einer DNA-Polymerase durchgeführt, so daß ein DNA- Doppelstrang entsteht. Durch Zugabe einer DNA-abhängigen RNA- Polymerase kann dieser DNA-Doppelstrang transkribiert werden, wobei RNA-Moleküle entstehen, die an ihrem 5'-Ende ein RNA-Replikon aufweisen. Dieses RNA-Replikon kann dann mit Hilfe der DNA-abhängigen RNA- Polymerase amplifiziert werden, wobei das Vorhandensein zusätzlicher Nukleotide am 3'-Ende des Replikons der ursprünglich transkribierten RNA keinen Nachteil darstellt. Diese zusätzlichen Sequenzen werden nicht mitamplifiziert.

Eine schematische Darstellung dieser Verfahrensvariante ist in Fig. 2 gezeigt. Das Replikon (3) wird aus dem Nachweisreagenz (12) durch Transkription in situ gebildet. Wie in Fig. 1 ist der Analyt (1) über die Fängerdomäne (6) eines Fangreagenz (5) und ein Bindepaar (8a/8b) an den Träger (7) gebunden. Stromaufwärts von der Stelle, an der das Fangreagenz mit dem Analyten hybridisiert, befindet sich ein Blockerreagenz (9). Dieses dient dazu, die enzymatische Elongation bei Erreichen des Blockerreagenz zu stoppen, so daß ein bis zu dieser Stelle reichender komplementärer Strang(11) synthetisiert wird.

Im nächsten Schritt wird der Analyt durch RNAse-H-Verdau abgebaut und der neusynthetisierte Komplementärstrang freigelegt. Mit diesem Komplementärstrang kann wiederum das Nachweisreagenz (12) hybridisieren, das in 5'-3'-Richtung einen Promotor (13), eine für ein Replikon kodierende Sequenz (14) und eine Identifikatorsequenz (15) aufweist. Anschließend wird eine weitere Elongation mit einer DNA- Polymerase durchgeführt. Danach wird mittels einer RNA-Polymerase der neugebildete Doppelstrang transkribiert, um eine replizierbare RNA (17) zu liefern. Diese kann mit einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase zu RNA- Replikons (3) repliziert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, vorzugsweise in Form einer DNA, welche in 5'-3'-Richtung die folgende Elemente umfaßt: einen Promotor, eine für eine RNA-Replikon, vorzugsweise ausgewählt aus T7rp1, T7rp2 und T7rp3, kodierende Sequenz und eine Identifikatorsequenz, wobei die Nukleinsäure durch Transkription ein RNA- Replikon liefern kann, dessen 3'-Ende die Identifikatorsequenz aufweist. Der Promotor ist bevorzugt ein Promotor für eine DNA-abhängige RNA- Polymerase, bevorzugt aus den Bakteriophagen T7, T3 oder SP6, so daß bei der zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens dieselbe RNA- Polymerase für den Transkriptionsschritt und den Amplifikationsschritt verwendet werden kann.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, umfassend ein RNA-Replikon, dessen 3'-Ende eine Identifikatordomäne aufweist. Die Identifikatordomäne kann hierbei wie oben definiert sein und das RNA-Replikon kann gegebenenfalls modifizierte Nukleotidbausteine enthalten.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Assaykit, der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann. Er umfaßt ein Nachweisreagenz, gegebenenfalls ein Fangreagenz und ein Blockerreagenz, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und gegebenenfalls weitere Polymerasen (wie etwa die für die zweite Ausführungsform benötigte Reverse Transkriptase oder DNA-Polymerase), sowie übliche Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffe.

Die Erfindung wird durch folgende Figuren und Beispiele weiter erläutert:

Fig. 1 zeigt die schematische Darstellung einer ersten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Fig. 2 zeigt die schematische Darstellung einer zweiten bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Fig. 3A zeigt eine Nukleinsäure, die in 5'-3'-Richtung einen T3- Promotor, ein T7rp1-Replikon und eine Bpm I-Erkennungsstelle CTGGAG (Bpm I rec) sowie eine 16 Nukleotide davon entfernte Spaltstelle (BpmI) aufweist.

Fig. 3B zeigt die Insertion von heterologen Sequenzen, z. B. einer Identifikatorsequenz für 23 S rRNA aus E.coli in die BpmI- Spaltstelle.

Fig. 4 zeigt die Sequenzen und Sekundärstrukturen der Plus- und Minus-Stränge des RNA-Replikons T7rp1.

Fig. 5 zeigt die Herstellung von 5'-terminalen Fusionen des 5'- Partialstrangs von T7rp1. Die Transkription beginnt mit GGG. In die asymmetrische BstEll-Restriktionsstelle wird die Identifikatorsequenz eingefügt. Der Partialstrang von T7rp1 (Minusstrang) beginnt mit CCAAAA. Die Termination der Transkription wird durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym Eco57I erreicht, dessen Erkennungssequenz (GTCAAG) angezeigt ist.

Fig. 6 zeigt die Herstellung von 3'-terminalen Fusionen des 3'- Partialstrangs von T7rp1. In die Bpml-Spaltstelle wird ein Oligonukleotid mit einer Fängersequenz (komplementär zu einer in Bakterien konservierten Sequenz der 16 S rRNA) einligiert. Die Termination der Transkription wird durch Spaltung des Plasmids mit Sacl erzwungen. Dabei entsteht ein Poly(C) Ende, das zur Immobilisierung an einen mit Poly(G) beschichteten Träger verwendet werden kann.
Die in Fig. 5 und 6 gezeigten Teilmoleküle von T7rp1, die durch Transkription hergestellt werden, ergeben nach Ligation vermehrungsfähiges T7rp1.

Fig. 7 zeigt Amplifikationsprofile verschiedener Verdünnungen einer Sonde in Gegenwart des Farbstoffs YoPro, aufgenommen mit einem Mikrotiterplatten-Fluorimeter.
SEQ ID NO. 1 zeigt den Plusstrang des RNA-Replikons T7rp1.
SEQ ID NO. 2 zeigt den Plusstrang des RNA-Replikons T7rp2.
SEQ ID NO. 3 zeigt den Plusstrang des RNA-Replikons T7rp3.
SEQ ID NO. 4 zeigt die Sonde CB111 (23S rRNA E.coli 1179-1160).
SEQ ID NO. 5 zeigt die Sonde CB112 (23S rRNA E.coli 1160-1181).
SEQ ID NO. 6 zeigt die Sonde CB117 (23S rRNA E.coli 1160-1115).
SEQ ID NO. 7 zeigt die Sonde CB118 (23S rRNA E.coli 1950-1920).
SEQ ID NO. 8 zeigt die Sonde CB178 (poly G-Sonde).
SEQ ID NO. 9 zeigt die Sonde CB174 (1-27: 16S rRNA E.coli 469- 443).
SEQ ID NO. 10 zeigt die Sonde CB176 (1-24: 23S rRNA E.coli 1946-
1921).
SEQ ID NO. 11 zeigt die Sonde CB182 (3-18: T3 Promotor; 16-99 T7rp1; 99-124: 16S rRNA E.coli 226-250).
SEQ ID NO. 12 zeigt die Sonde CB188 (12-36: 16S rRNA E.coli 361- 347).
SEQ ID NO. 13 zeigt die Sonde CB184 (1-26: 16S rRNA E.coli 224- 199).

Beispiele 1. Synthese von Oligonukleotiden

Oligoribonukleotide und Oligodeoxyribonukleotide wurden durch einen Synthesizer hergestellt oder kommerziell bezogen. Oligonukleotide mit Kettenlängen von mehr als 40 Bausteinen wurden zusätzlich mittels Gelelektrophorese gereinigt. Für eine Ligation eingesetzte Oligonukleotide wurden am 5'-Ende durch Polynukleotidkinase und ATP phosphoryliert.

Weiterhin wurden modifizierte Oligonukleotide mit Biotingruppen am 5'- und 3'-Ende sowie mit einer Aminogruppe am 5'- und 3'-Ende hergestellt.

2. Bereitstellung von DNA-abhängigen RNA-Polymerasen 2.1 Aufreinigung der RNA-Polymerasen

Als Ausgangsmaterialien wurden E.coli Stämme verwendet, welche die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen der Bakteriophagen T7, T3 oder SP6 überexprimieren (Davanloo et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2035-2039; Morris et al. (1986), Gene 41, 193-200 und Jorgensen et al. (1991), J. Biol. Chem. 266, 645-651).

Die Bakterien wurden in 20 l Vollmedium + 100 µg/ml Ampicillin bei 37°C kultiviert. Nach Erreichen einer optischen Dichte A600 von 0,5 wurden sie mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid induziert und für weitere 4 h kultiviert. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet.

Die Aufreinigung erfolgte im wesentlichen nach der von Davanloo et al. (1984), supra, beschriebenen Prozedur. Die Bakterien wurden durch Behandlung mit Lysozym und anschließend mit Natriumdeoxycholat lysiert. Der Rohextrakt wurde homogenisiert, die Nukleinsäuren durch Polymin P- Präzipitation entfernt und das Enzym durch Ammoniumsulfatpräzipitation gesammelt. Die Aufreinigung zur Homogenität erfolgte durch Kationenaustauscherchromatographie an S-Sepharose FF (Pharmacia), Filtration durch TSK cm und Anionenaustauscherchromatographie an TSK DEAE (Merck, Darmstadt). Das gereinigte Enzym wurde durch Ammoniumsulfatpräzipitation konzentriert und bei einer Konzentration von 2 mg/ml in 50 mM Tris HCl pH 7,7, 1 mM Dithiothreithol, 50% Glycerin bei -80°C aufbewahrt. Die Enzympräparation behielt ihre Aktivität über einen Zeitraum von drei Jahren. Verdünntere Enzympräparationen, die bei -30°C aufbewahrt wurden, verloren ihre Replikationsaktivität innerhalb weniger Wochen, überraschenderweise war ihre Transkriptionsa ktivität weit weniger betroffen.

2.2 Charakterisierung der RNA-Polymerase

Die Transkriptionsaktivität wurde durch Inkubation von 100 nM RNA- Polymerase (T3, T7, SP6) für 30 min bei 37°C in 0,05 M Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithioerythrithol (DTE), 100 mg/ml (30 nM) pBluescript SK DNA (Stratagene), 0,5 mM ATP, CTP, GTP und UTP bestimmt. Eine Einheit ist definiert als Einbau von 1 nmol NTP in RNA in 30 min. 1 mg T3 RNA Polymerase hatte unter diesen Bedingungen eine Aktivität von 472 000 Einheiten.

Die Replikationsaktivität wurde durch Inkubation von 1 µM RNA Polymerase (T3, T7, SP6) in 0,05 M Tris HCl Puffer, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTE, 1 mM jeweils ATP, CTP, GTP und UTP und 1 amol bis 1 µmol RNA-Matrize für 180 min 37°C gemessen.

Die erzeugten Materialmenge wurde bestimmt durch

• 1. Messen des Einbaus von radioaktiv markierten Nukleotiden,
• 2. Auftrennen der Produkte durch Gelelektrophorese und Anfärben und
• 3. Zugabe von RNA-intercalierenden Fluoreszenzfarbstoffen, z. B. Zugabe von 2 µM YoPro1 zum Replikationspuffer.

Letztgenannte Methode erlaubt die Durchführung von Echtzeitmessungen.

Durch Wahl geeigneter Bedingungen konnte die Aktivität der RNA- Polymerase in Richtung Transkription oder Replikation gelenkt werden. Bei Zugabe eines Überschusses von DNA wurde die RNA-Replikation unterdrückt. Andererseits überwuchsen bei hoher Enzymkonzentration die autokatalytisch amplifizerten RNA-Replikons die nur linear anwachsenden Transkripte.

Die Vervielfältigung eines Replikons durch RNA-Polymerase erzeugte ein exakt reproduzierbares RNA-Konzentrationsprofil. Zu Beginn liegt die RNA- Matrize normalerweise im großen Unterschuß zur RNA-Polymerase vor. Der neusynthetisierte Strang und die reaktivierte Matrize finden neue Enzymmoleküle, um neue Replikationsrunden zu starten. Es findet somit ein exponentieller Anstieg der RNA-Konzentration statt. Schließlich haben sich die RNA-Stränge soweit vermehrt, daß alle Enzymmoleküle mit Matrize gesättigt sind. Der weitere Anstieg ist durch die Enzymkonzentration limitiert und man beobachtet einen linearen Anstieg der RNA-Konzentration. Bei weiterer Vervielfältigung sinkt die Replikationsgeschwindigkeit durch Produktinhibition.

Bei sehr kleinen RNA-Konzentrationen bleibt die anfängliche exponentielle Verstärkung im Profil zunächst nicht sichtbar, bis eine hinreichend große Menge an RNA synthetisiert ist, deren Signal gut nachweisbar ist. Die Replikationsprofile (siehe Abb. 7) zeigen somit eine Anlaufphase, wobei die Länge der Anlaufzeit ein genaues Maß für die anfängliche Konzentration der RNA-Moleküle in der Probe darstellt. Anlaufzeit und Logarithmus der Anfangskonzentration sind miteinander linear korreliert, so daß der meßbare RNA-Konzentrationsbereich etwa acht Größenordnungen umspannt.

Die RNA-Spezies T7rp1 wird durch T7- oder T3-RNA-Polymerase in einer Konzentration von 1 µM in Gegenwart von 1 mM Triphosphaten um exakt 1 dB/min verstärkt, so daß sich bei Verdünnung der RNA um den Faktor 100 die Kurve um 20 min auf der Zeitachse verschiebt, bei 8 Größenordnungen um 80 min. Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, kann eine Replikationskaskade durch etwa mindestens 100 RNA-Moleküle ausgelöst werden.

3. Manipulation der Replikonsequenz

Rekombinante RNA wurde durch Manipulation von DNA und anschließende Transkription erzeugt. Hierzu wurde die cDNA des Replikons T7rp1 in den Klonierungsvektor pUC18 hinter eine T3 Promotorsequenz (Biebricher und Luce (1996), supra) gesetzt, so daß die Transkription exakt am 5'-Terminus des Replikons beginnt. Um die DNA-Sequenz am 3'-Terminus des Replikons abzuschneiden, wurde eine Restriktionsstelle verwendet. Um von Sequenzrestriktionen am 3'-Ende des Replikons unabhängig zu sein, wurde ein Restriktionsenzym vom Typ IV, BpmI, gewählt, dessen Erkennungsstelle 14 Nukleotide stromabwärts von der Schnittstelle liegt (Fig. 3). Eine zweite Bpml-Restriktionsstelle im Klonierungsvektor pUC 18 wurde durch gerichtete Mutation eliminiert, so daß diese Stelle nur einmal vorkommt. Vom geschnittenen Plasmid ließ sich durch in vitro Transkription mit T3 RNA Polymerase RNA herstellen, die sich in ihren Replikationseigenschaften als ununterscheidbar von einer durch Replikation synthetisierten Replikon RNA erwies.

Da Transkription und Replikation das gleiche Enzym und die gleichen Substrate benützen, lassen sich unter den Replikationsbedingungen beide Schritte in einem Topf durchführen. Zunächst wird vom Plasmid durch Transkription RNA erzeugt, die dann durch Replikation amplifiziert wird. Dabei wird die Transkription nach kurzer Zeit durch die Replikation überflügelt und spielt keine Rolle mehr. Auf diese Weise kann somit die DNA-Matrize direkt zur Replikon-Amplifikation eingesetzt werden. Genaue Messungen zeigten, daß man in diesem System Profile wie bei der RNA- Amplifikations erhält, daß jedoch die Empfindlichkeit auf den Wert von 1 DNA-Molekül pro Probe gesteigert werden kann.

Hinter der Bpml-Stelle des Klonierungsvektors liegen weitere Restriktionsstellen. Bei Linearisierung des Vektors an diesen Restriktionsstellen wird durch Transkription eine um Sequenzteile des Klonierungsvektors verlängerte RNA erzeugt. Durch Gelelektrophorese wurde nachgewiesen, daß die resultierenden Transkripte tatsächlich um die berechnete Anzahl von Nukleotiden länger waren. Diese verlängerten Transkripte werden auch als Replikationsmatrizen akzeptiert, jedoch waren als Syntheseprodukte nur die Replikonsequenzen selbst nachweisbar. Die zusätzlich angehängten Nukleotide wurden somit ignoriert. Durch serielle Verdünnung ließen sich Replikationsprofile erzeugen, die mit denen nicht verlängerter Replikons deckungsgleich waren.

Die am 3'-Terminus des Replikons liegende Bpml-Restriktionsstelle eignet sich sehr gut zum Einligieren beliebiger Sequenzen, z. B. von analytspezifischen Identifikatorsequenzen. Beispielsweise wurden Sequenzen gewählt, die zu speziesspezifischen Abschnitten der rRNA- Sequenz von E.coli komplementär waren. Als Beispiel ist in Abb. 3B das Einligieren der Oligonukleotide CB111/CB112 (SEQ ID NO. 4 und 5) gezeigt, die den Positionen 1160 bis 1180 der 23S RNA von E.coli entsprechen. Im resultierenden Konstrukt ist die Bpml-Stelle an das Ende der einligierten Sequenz gerutscht und kann somit zum Einligieren weiterer Sequenzen verwendet werden. Auf diese Weise kann eine komplexe Sequenz aus kurzen Sequenzabschnitten aufgebaut werden.

Die um den Identifikator verlängerte RNA wurde durch Transkription erzeugt und auf ihre Replikationseigenschaften untersucht. Wie in dem vorigen Experiment wurde bei der Verstärkung der Identifikator ignoriert und nur die Replikonsequenz amplifiziert.

4. Hybridisierung der Identifikatorsequenz mit rRNA von E.coli

Die Hybridisierungsbedingungen der DNA-Sonde CB112 und der entsprechenden Identifikator-Reporter-RNA-Sonde wurden untersucht, indem beide am 5'-Ende mit P32 markiert wurden. Hierzu wurden 4 µmol Sonde und 4 µmol rRNA in 5 µl SSC-Puffer vermischt und die Hybridisierung wurde durch Comigration in der Gelelektrophorese nachgewiesen. Es wurde gefunden, daß nach Erhitzen auf 65°C für 2 min. gefolgt von langsamem Abkühlen innerhalb von 60 min auf 37°C, eine quantitative Hybridisierung sowohl der DNA-Sonde als auch der RNA-Sonde mit 23S rRNA erfolgte. Unter entsprechenden Bedingungen hybridisierten auch andere geprüfte Sondensequenzen mit 23S oder 16S rRNA. Auch bei höherer Verdünnung war die Hybridisierung in Lösung nach etwa 30 min komplett.

5. Lyse von Bakterien und Freisetzung der rRNA

Auf dem Markt werden eine Vielzahl von Verfahren zur RNA-Extraktion aus biologischen Materialien angeboten. Sie beruhen auf einer Extraktion durch Guanidinium-Rhodanid oder Phenol. Bei kleineren Probemengen sind diese Extraktionsverfahren oftmals jedoch verlustreich und nur wenig reproduzierbar.

Eine Hybridisierung direkt unter Lysebedingungen konnte unter Verwendung eines Lyse-Hybridisierungspuffers aus 1% Natriumdodecylsulfat, 1% Mercaptoethanol, 0,2 M LiCI, 0,01 M Piperazin-1,4-bis-2-ethansulfonsäure, pH 6,5 erreicht werden. Unter diesen Bedingungen konnte nach 30 min Behandlung bei 60°C die rRNA quantitativ freigesetzt und mit den Sonden hybridisiert werden. Titration mit den Sonden ergaben Werte von jeweils 20000 16S und 23S rRNA Molekülen für eine im Vollmedium kultivierte E.coli Zelle. Eine Degradierung von Sonde oder rRNA wurde nicht beobachtet, d. h. RNasen sind unter diesen Bedingungen inaktiviert. Eine Untersuchung mit anderen Bakterienspezies ergab, daß sich diese Bedingungen gut auf andere Gram-negative Bakterien übertragen lassen. Für Gram-positive Zellen ist eine Vorbehandlung mit Lysozym oder Lysostaphin vor Zugabe des Lysepuffers erforderlich.

6. Einfang von Analytsequenzen über kovalent immobilisierte Oligonukleotide

Zum Einfangen ribosomaler RNA wurde eine Hybridisierung mit immobilisierten oder immobilisierbaren Oligonukleotiden benutzt. Diese Oligonukleotide waren komplementär zu Sequenzbereichen der 16S oder 23S rRNA, die für alle Eubakterien konserviert sind (Amann et al. (1995), Microbiol. Rev. 59 143-169). Durch Dot-Blot-Hybridisierung mit verschiedenen Eubakterienstämmen wurde die Brauchbarkeit dieser Sequenzen bestätigt.

Es wurden verschiedene Immobilisierungstechniken untersucht. Grundsätzlich konnte die Immobilisierung direkt durch Hybridisierung mit bereits trägergebundenen Oligonukleotiden erfolgen. Alternativ wurde die Hybridisierung in Lösung mit einem Fangreagenz durchgeführt, das mit einer immobilisierbaren Gruppe versehen war und in einer Folgereaktion an die Oberfläche gebunden wurde.

Für die direkte Methode wurden die Oligonukleotide kovalent mit der Oberfläche verknüpft. Hierzu wurden die zwei kommerziellen Mikrotiterplattenpräparationen CovaLink und NucleoLink (Nalge-NUNC, Roskilde, Dänemark) verwendet. Die Kupplung an die Oberfläche wurde nach den Protokollen des Herstellers sowohl mit 5'-phosphorylierten als auch mit einer 5'-Aminogruppe versehenen Oligonukleotiden mit dem Kupplungsmittel 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid durchgeführt. Dabei konnten bis zu 10 µmol Oligonukleotide pro Vertiefung in einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden. Diese Menge ist für die Immobilisierung von Analytnukleinsäuren ausreichend.

Die Hybridisierung von gelösten Nukleinsäuren (z. B. ribosomale RNA) an die immobilisierten Oligonukleotide kann verbessert werden durch

• a) eine Hybridisierungsdauer von mindestens 6, vorzugsweise mindestens 12 h (z. B. über Nacht);
• b) zusätzliche ungepaarte Nukleotide am 5'-Ende des Oligonukleotids.

Teilweise werden Nukleinsäuren auch unspezifisch an die Oberfläche gebunden. Diese unspezifisch gebundenen Nukleinsäuren können weitgehend durch Waschen mit Wasser und insbesondere mit Lysepuffer entfernt werden.

Eine alternative Methode zur Immobilisierung von Oligonukleotiden ist die indirekte Immobilisierung, bei der nicht das Fangreagenz selbst kovalent an den Träger gebunden, sondern zwei Substanzen gewählt werden, die schnell und spezifisch einen stabilen Komplex ausbilden. Diese Arten der Immobilisierung sind in den folgenden Beispielen beschrieben.

7. Biotin-Streptavidin-Immobilisierung

Als Streptavidin-beschichtete Träger wurden magnetische Beads (Dynabeads M-280) oder Mikrotiterplatten verwendet. Als Fangreagenzien wurden 5'- oder 3'-biotinylierte Oligonukleotidsonden verwendet. Diese Sonden wurden in Lösung an komplementäre Analytnukleinsäuren hybridisiert und anschließend über die Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung immobilisiert.

Diese Immobilisierung wurde durch Verwendung von markierten Oligonukleotiden nachgewiesen. Pro 0,5 mg Dynabeads wurden 2,9 µg (2,8 pmol) 23S rRNA gebunden.

Zur Prüfung der Gesamtreaktion wurde eine 5'-[³²P] markierte RNA-Sonde (Fusion von T7rp 1 mit Identifikator für E.coli 23S rRNA) hergestellt. 10 µmol rRNA, 10 µmol Fänger (3'-biotinylierte Sonden CB117 und CB118 entsprechend SEQ ID NO. 6 und 7) und 5 µmol markierte RNA-Sonde wurden in 25 µl Lysepuffer unter den oben genannten Hybridisierungsbedingungen miteinander inkubiert und mit 50 µl Dynabeads (0,5 mg) versetzt. Negative Kontrollen wurden ohne Fänger oder RNA durchgeführt. Nach Waschen der Dynabeads wurde die gebundene Menge an markierter Sonde durch Messen der immobilisierten Radioaktivität bestimmt. Bei den negativen Kontrollen war nach dem Waschen keine immobilisierte Radioaktivität mehr meßbar. Bei der Gesamtreaktion wurden hingegen 1,4 µmol Sonde an die Dynabeads gebunden.

Die Dynabeadproben wurden anschließend in 50 µl 0,1 X SSC-Puffer (SSC- Puffer: 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat-Puffer pH 7,0) suspendiert, auf 80°C erhitzt und der Überstand entfernt. Jeweils 1 µl dieses Überstands wurden mit 100 µl Replikationspuffer und 100 µmol T3 RNA Polymerase vermischt und bei 37°C inkubiert. Leerproben ohne Matrizenzusatz wurden ebenfalls routenmäßig mitgeprüft. Nach 30, 60, 100, 120 und 180 min Inkubation wurden jeweils 10 µl Aliquots entnommen und gelelektrophoretisch aufgetrennt.

Während die Leerproben keine RNA-Replikation zeigten, wurde in allen anderen Proben RNA-Replikation gefunden. Aufgrund einer offenbar nicht quantitativen Entfernung der Sonde beim Waschen wurde auch bei Kontrollproben, denen keine rRNA zugesetzt war, ein geringes - und von positiven Proben unterscheidbares - Hintergrundsignal gefunden.

8. Poly(C):Poly(G)-Immobilisierung

Eine mit einem Poly(G) Tail versehene Oligonukleotidsonde CB178 (SEQ ID NO. 8) wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren kovalent an eine Nukleolink-Mikrotiterplatte (1,2 µmol Oligonukleotid pro Vertiefung) gebunden. Das gebundene Oligonukleotid zeigte eine rasche und quantitative Hybridisierung mit Poly(C)-Fangsonden wie CB174 und CB176 (SEQ ID NO. 9 und 10).

105 E.coli Zellen wurden mit je 0,1 µmol Fangreagenz CB176 und Sonde in 100 µl Lysepuffer bei 60°C für 10 min inkubiert und dann in mit dem Poly(G) Oligonukleotid CB178 beschichtete und gewaschene Mikrotiterplatte überführt. Als Kontrolle diente ein Ansatz, bei dem die Bakterienlösung weggelassen wurde. Nach Bindung für 30 min bei 30°C wurde mit Lysepuffer und dann mit Wasser gewaschen. Anschließend wurden Replikationspuffer und T3 RNA-Polymerase zugesetzt. Das Auftreten von makroskopischen RNA-Mengen wurde gelelektrophoretisch verfolgt. Eine quantitative Abschätzung der eingesetzten Bakterienmenge war bis auf etwa 100 Bakterien einwandfrei möglich.

9. Generation von Replikons während der Reaktion

Eine Verringerung des Testhintergrunds läßt sich erzielen, wenn das Replikon im Testansatz in situ erst durch Vorhandensein des Analyten erzeugt wird.

9.1 Ligierung von Teilsequenzen des Replikons

Aus nichtreplizierenden Teilsequenzen eines Replikons wurde durch Ligation ein replikationsfähiges Molekül erhalten, indem beide Teilstücke durch Hybridisierung an zwei benachbarten Sequenzregionen derart sterisch angeordnet wurden, daß die Ligierung nach Hybridisierung um mehrere Größenordnungen rascher abläuft als ohne. Durch Klonierung wurden Plasmidkonstrukte erzeugt, bei denen entsprechende Teilsequenzen von T7rp 1 durch Transkription erzeugt werden können (siehe Abb. 5 und 6). Die Fusion mit den hybridisierenden Regionen - für das 5'-terminale Teilfragment am 5'-Ende, für das 3'-terminale Fragment am 3'-Ende - wurde gemäß den Abb. 5 und 6 durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß das 3'- terminale Teilstück überhaupt nicht replizierbar war und das 5'-terminale Teilstück erst nach längerer Zeit in ein replikationsfähiges Molekül umgebaut wurde. Der 5'-Terminus des 3'-terminalen Teilstücks wurde durch Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase und anschließender Phosphorylierung mit ATP und Polynukleotidkinase in die zur Ligation geeignete 5'-Monophosphatform überführt.

Bei 37°C zeigten die Teilstücke schon ohne Hybridisierung an den Analyten eine teilweise Bildung eines Doppelstrangs. Die Teilstücke konnten in einer an den Analyten hybridisierten Form durch DNA Ligase ligiert werden.

9.2 Elongation der hybridisierten Sequenz

Eine weitere Strategie, ein replikationsfähiges Molekül zu erzeugen, geht davon aus, daß der Analyt nach Hybridisierung als Matrize für eine instruierte Synthese von komplementären Sequenzen dienen kann.

Dabei wird ausgenützt, daß ein DNA Einzel- oder Doppelstrang mit der Sequenz eines RNA-Replikons zur Replikation völlig unfähig ist. Ein Einzelstrang ist auch zur RNA-Synthese mittels Transkription ungeeignet, zumindest die Promotorsequenz muß in doppelsträngiger Form vorliegen, um Transkription zu ermöglichen.

Es wurde daher die DNA-Sonde CB182 (SEQ ID NO. 11) synthetisiert, die einen Promotor gefolgt von der Replikonsequenz enthält, an dessen 3'-Ende die Identifikatorsequenz des Analyten (in positiver Polarität) angefügt ist. Diese Sonde war nicht replikationsfähig. Durch Zugabe eines zum 3'-Ende der Sonde komplementären DNA-Oligonukleotids und DNA-Polymerase aus E.coli wurde ein DNA-Doppelstrang gebildet, der mittels Transkription/Replikation durch T3 RNA-Polymerase ein quantifizierbares Amplifikationssignal ergab.

Wurde rRNA mit Fängernukleotid CB188 (SEQ ID NO. 12) als Primer eingesetzt, ließ sich mittels Reverser Transkriptase mit einer Ausbeute von 80% ein Transkript von ungefähr 350 Nukleotiden Länge erzeugen.

Durch Zusatz des Blockerreagenz CB184 (SEQ ID NO. 13), das die weitere Elongation von CB188 über die Hybridisierungssequenz hinaus blockierte, wurde die Effizienz der Doppelstrangsynthese verbessert. Noch bessere Resultate wurden durch den Einsatz des modifizierten Oligonukleotids CB190 (entsprechend CB184 mit einer 3'-terminalen Aminogruppe) erzielt, da dieses Oligonukleotid selbst nicht als Primer wirken konnte. Es entstanden in guter Ausbeute Transkripte, die nach Zerstörung der DNA:RNA-Hybride durch Erhitzen zum Priming der DNA-Polymerase- Reaktion von CB182 geeignet waren.

Die Immobilisierung von bakterieller rRNA erfolgte mit 3'-gekuppelter Oligo(dG,dl). Es konnte gezeigt werden, daß die Gesamtreaktion wie in Abb. 2 gezeigt funktioniert, und daß Hintergrundreaktionen wesentlich langsamer verlaufen.

10. Quantifizierung der Reaktion

Entscheidend für die Brauchbarkeit eines Nachweisverfahrens für Routineanwendungen ist die leichte Automatisierbarkeit. Methoden, die Probenentnahmen während der Reaktion und aufwendige Analysenmethoden erfordern, sind zu teuer und störanfällig.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können hierzu intercalierende Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden, deren Fluoreszenzintensität durch Intercalierung in eine RNA- oder DNA-Struktur stark erhöht wird. Abb. 7 zeigt semilogarithmische Wachstumsprofile einer RNA-Sonde gegen 16S rRNA aus E.coli unter Standardreplikationsbedingungen in Gegenwart von 10^-7 M des Fluoreszenzfarbstoffs YoPro1 (Molecular Probes, Yuichin, OR). Die Y-Achse zeigt die relative Fluoreszenz (ohne RNA = 1), die X-Achse die Meßpunkte (alle 5 min). Es sind die Verstärkungsprofile verschiedener Verdünnungen der Sonde aufgenommen mit einem handelsüblichen Mikrotiterplattenfluorometer, das das Anregungs- und Emissionslicht durch die Bodenplatte der Mikrotiterplatte aufnimmt, gezeigt. Ein Öffnen der Reaktionskammer war nicht erforderlich, so daß eine Kontamination vermieden werden kann.

In Abwesenheit der Matrize nimmt die Fluoreszenz eines inkubierten Amplifikationsgemisches nur sehr langsam und fast linear zu. Von dieser unspezifischen Reaktion kann die viel rascher und fast exponentiell folgende matrizenabhängige Amplifikation ohne weiteres unterschieden werden. Die Abbildung zeigt, daß eine Quantifizierung bis auf eine Konzentration von 10² Strängen Sonde gelingt.

11. Zusammensetzung von Kits und Reaktionsprotokolle 11.1 Erste Ausführungsform

Benötigte Apparate: Ein temperierbarer Heizblock für Mikrotiterplatten, Mikrotiterplatten-Fluorometer.

Kit-Bestandteile: Lysepuffer und Replikationspuffer, T3-, T7- oder SP6-RNA- Polymerase, Sonden und Fänger, jeweils 12 Aliquote für je 8 Proben, 12 mit Immobilisator gekuppelte Mikrotiterstrips. Die Sondenkonstrukte sind oben beschrieben, ebenso die Fänger; sie müssen an die jeweilige Anwendung angepaßt werden. Der Fänger kann als Gemisch mit der Sonde oder direkt immobilisiert auf der Mikrotiterplatte vorliegen.

Prozedur: Das Spezimen wird je nach Masse mit einem gleichen Volumen Lysepuffer in 1,5 ml Reaktionsgefäßen gemischt und auf 60°C gebracht. Festproben werden mit kleinen Plastik-Einmalpistillen mit dem Lysepuffer intensiv vermischt. Die Probe wird durch Zentrifugation grob geklärt. 150 µl dieser Probe werden mit 2 µl Sonden-Fänger-Lösung versetzt und 30 min bei 55°C inkubiert. Die Lösung wird in frisch mit Lysepuffer vorgespülte Mikrotiterplatten gegeben und weitere 15 min zum Immobilisieren bei 50°C inkubiert. Die Mikrotiterplatten sollten dabei zur besseren Durchmischung schonsam agitiert werden. Die Lösungen werden verworfen und die Strips mit Lysepuffer und Wasser gründlich gewaschen. 1 Aliquot Replikationspuffer und 1 Aliquot T3-RNA-Polymerase werden gemischt und je 100 µl dieser Mischung pro Vertiefung einpipettiert. Die Fluoreszenz der Proben wird durch das Fluorometer aufgenommen und ausgewertet. Pro Reihe sollte eine Blankprobe als Kontrolle mitlaufen, um etwaige Kontaminationen zu entdecken.

11.2 Zweite Ausführungsform

Kit-Bestandteile: Lysepuffer und Replikationspuffer, T3-, T7- bzw. SP6-RNA- Polymerase-DNA-Polymerasegemisch, Gemisch von Fänger und Blockieroligonukleotid wie oben. Zusätzlich benötigt werden der Retrotranskriptionspuffer und Reverse Transkriptase. Der Replikationspuffer enthält zusätzlich je 0,1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, die RNA- Polymeraselösung enthält zusätzlich DNA-Polymerase aus E.coli.

Prozedur: Das Spezimen wird je nach Masse mit einem gleichen Volumen Lysepuffer in 1,5 ml Reaktionsgefäßen gemischt und auf 60°C gebracht. Festproben werden mit kleinen Plastik-Eirlmalpistillen mit dem Lysepuffer intensiv vermischt. Die Probe wird durch Zentrifugation grob geklärt. 150 µl dieser Probe werden bei indirekter Immobilisierung mit 2 µ1 Fänger-Lösung versetzt und 30 min bei 55°C inkubiert; bei direkter Immobilisierung des Fängers entfällt dieser Schritt. Die Lösung wird in frisch mit Lysepuffer vorgespülte Mikrotiterplatten gegeben und bei direkter Immobilisierung 40 min. bei indirekter Immobilisierung 15 min bei 50°C inkubiert. Die Lösungen werden verworfen und die Strips mit Lysepuffer und Wasser gründlich gewaschen. Retrotranskriptasepuffer und Reverse Transkriptase werden gemischt und je 100 µl dieser Mischung pro Vertiefung einpipettiert. Nach 40 min bei 45°C wird mit warmen Wasser nachgespült. Replikationspuffer, Nachweisreagenz, RNA-Polymerase und DNA-Polymerase werden gemischt und je 100 µl dieser Mischung pro Vertiefung einpipettiert. Die Fluoreszenz der Proben wird durch das Fluorometer aufgenommen und ausgewertet, wobei der Zeitpunkt der makroskopisch sichtbaren Verstärkung zur Quantifizierung der Probe dient.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (21)

1. Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nachweisreagenz verwendet, welches ein RNA-Replikon oder eine für eine solche Sequenz kodierende DNA-Sequenz aufweist, und daß man den Analyten durch Amplifikation des RNA-Replikons mittels einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase und anschließende Detektion der Amplifikationsprodukte nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nachweisreagenz eine für den Analyten spezifische Identifikatordomäne aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifikatordomäne ein Peptid oder Polypeptid oder eine Nukleinsäure darstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifikatordomäne in der Lage ist, unmittelbar an den Analyten zu binden.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifikatordomäne eine Nukleinsäure darstellt, welche in der Lage ist, mit der Komplementärsequenz eines Nukleinsäure-Analyten zu hybridisieren.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich ein Fangreagenz verwendet, welches eine mit dem Analyten bindefähige Fängerdomäne enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fängerdomäne eine Nukleinsäure ist, welche in der Lage ist, mit einem Nukleinsäure-Analyten zu hybridisieren.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Fangreagenz auf einem Träger immobilisiert ist oder eine zur Immobilisierung fähige Gruppe enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Fangreagenz einen Partner eines Bindepaares umfaßt, dessen anderer Partner an den Träger gekoppelt ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindepaar ausgewählt wird aus Biotin-Streptavidin, Biotin- Avidin und Oligo(C)-Oligo(G).

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung eines Nukleinsäure-Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

• a) Inkontaktbringen eines den Analyten enthaltende Probe mit einem Fangreagenz umfassend eine Nukleinsäuredomäne, die mit dem Analyten hybridisieren und deren 3'-Ende als Primer für eine enzymatische Elongation dienen kann, und mit einem Blockerreagenz, welches an einer bestimmten Stelle stromabwärts vom Fangreagenz an den Analyten binden kann und in der Lage ist, eine enzymatische Elongation zu stoppen,
• b) enzymatisches Elongieren des Fangreagenz unter Verwendung des Analyten als Matrize, wobei ein zum Analyten komplementärer Nukleinsäurestrang gebildet wird, der bis zur Bindestelle des Blockerreagenz auf dem Analyten reicht,
• c) Abtrennen des Analyten und lnkontaktbringen des Komplementärstrangs mit dem Nachweisreagenz, umfassend eine Amplifikatordomäne, die eine für ein RNA-Replikon kodierende Sequenz in operativer Verknüpfung mit einem Promotor enthält und eine Identifikatordomäne, die mit dem 3'- Ende des in Schritt (ii) gebildeten Komplementärstrangs hybridisieren kann,
• d) enzymatisches Elongieren des in Schritt (ii) gebildeten Komplementärstrangs unter Verwendung des Nachweisreagenz als Matrize, wobei ein Nukleinsäuredoppelstrang aus dem Nachweisreagenz und einem dazu komplementären Nukleinsäurestrang gebildet wird,
• e) Transkribieren des DNA-Doppelstranges unter Bildung eines RNA-Replikons,
• f) Amplifizieren des transkribierten RNA-Replikons durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und
• g) Detektieren des Amplifikationsprodukts.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Replikon oder die dafür kodierende DNA-Sequenz ausgewählt wird aus den Sequenzen T7rp1, T7rp2 und T7rp3.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als DNA-abhängige RNA-Polymerase T7-Polymerase, T3- Polymerase oder SP6-Polymerase verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion der Amplifikationsprodukte mit Hilfe einer Markierungssubstanz durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungssubstanz aus Nukleinsäure-intercalierenden fluoreszierenden Substanzen, bevorzugt aus Ethidiumbromid, Propidiumiodid, Acridin-Orange, Thiazol-Orange sowie dessen Derivate YoPro1 und ToPro1 ausgewählt wird.

16. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfaßt: einen Promotor, eine für ein RNA-Replikon kodierende Sequenz, vorzugsweise ausgewählt aus T7rp1, T7rp2 und T7rp3, und eine Identifikatordomäne.

17. Nukleinsäure nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ausgewählt ist aus dem Promotor für T7- oder T3- RNA-Polymerase.

18. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine RNA- Replikonsequenz und eine Identifikatordomäne.

19. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie modifizierte Nukleotidbausteine enthält.

20. Assaykit, umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 16, 17, 18 oder 19, sowie gegebenenfalls einen Träger, ein Fangreagenz, eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und weitere Polymerasen, sowie übliche Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffe.

21. Verwendung einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase zum Nachweis eines Analyten durch Amplifikation eines RNA-Replikons und Detektion der Amplifikationsprodukte.