JPH08505289A

JPH08505289A - 遺伝子導入植における組換メッセンジャーｒｎａのウィルス増幅関連出願のクロスリファレンス

Info

Publication number: JPH08505289A
Application number: JP6516080A
Authority: JP
Inventors: エイチ．ターペン，トーマス
Original assignee: バイオソースジェネティクスコーポレイション
Priority date: 1992-12-30
Filing date: 1993-12-29
Publication date: 1996-06-11
Also published as: WO1994016089A1; ZA939798B; US6462255B1; US5811653A; DE69332763D1; US6852846B2; ES2194865T3; US20020144308A1; CA2152934A1; AU694102B2; US20050150011A1; US20020104123A1; US5965794A; DE69332763T2; KR960700344A; AU5987194A; ATE234361T1; EP0677113A1; EP0677113B1

Abstract

(57)【要約】植物において遺伝子を過剰発現させる新規の方法を提供する。この方法は植物のプラス鎖RNAウィルスのRNA増幅特性を基礎とする。植物プロモーター、ウィルス複製起点、ウィルス移動タンパク質遺伝子、及びウィルスサブゲノムプロモーターのコントロール下にある１又は複数の外来遺伝子を含むキメラ多重シストロン遺伝子を構築した。１又は複数のこれらのRNA転写体を含む植物にヘルパーウィルスを接種せしめた。ヘルパーウィルスの存在下で、組換転写休は複製され、高レベルの外来遣伝子RNAが生成される。ヘルパーウィルスによるレプリコンRNA増幅及びトバモウィルス群由来の移動タンパク質遺伝子を介する酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの高レベル発現のための配列を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子導入植における組換メッセンジャーRNAのウィルス増幅関連出願のクロスリファレンス本願は現在係属中の1992年12月30日出願された出願番号第997,733号の一部係属出願である。発明の背景本発明は遺伝子導入植物を遺伝子操作する分野に関する。より詳しくは、本発明は植物における外来遺伝子の高レベル発現を達成しめるためのウィルスRNAの利用に関する。高レベルでの外来遺伝子の発現のための遺伝子導入植物の利用は所望の生成物を大量生産するための安価な手段として標的にされている。高等植物は全て光合成独立栄養性であり、CO₂，H₂O，NO₃ ^-1，SO₄ ^-2，PO₄ ^-3及び他の微量の元素のみを成育のために必要とする。このような安価な出発材料から、植物は様々な有用な生成物を合成することができる。低価額の工場としての遺伝子導入植物の利用における進歩は生合成経路の特定及び遺伝子発現技術の更なる開発の両者に依存するであろう。この10年の間、植物に遺伝子を導入する数多くの技術が開発されている（Potr ykus，I.，Annual Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol． 42: 205-225（1991））。例えば、染色体に組込まれた導入遣伝子は遣伝子発現の発生コントロールを担う様々なプロモーターにより発現されている（Walden and Schell，Eur.J.Bio chem． 192：563-576(1990)）。この技術は一定の農業学的特徴、例えば病気耐性又は食品質を改良するために主に利用されている。（Joshi and Jos hi，Febs.Lett． 281：1-8（1991））。しかしながら、既知の遺伝子導入方法論は、１）個別の導入遺伝子の高レベルの発現を獲得する困難性、２）個々の植物の中での複数の遺伝子の協同コントロールにとっての必須の手段の欠如、３）遺伝子発現の正確な過渡的コントロールを可能にする手段の欠如、及び４）導入した遺伝子の未誘引状態でのシャットオフを可能にする適正な手段の欠如、により制約されている（Walden and Schell，Eur.J.Biochem 192：563-576(1990)）。植物の中で最も高く発現される遺伝子は植物のRNAウィルスゲノムにおいてエンコードされている。多くのRNAウィルスは商業用ベクターとしての開発のために有用となる遺伝子発現レベル又は宿主域（hostrange）を有する。（Ahlquist, P., andPacha, R.F.,Physiol.Plant． 79:163-167（1990））；Joshi，R.L.， and Joshi，V.，FEBS Lett． 281：1-8（1991）；Turpen，Ｔ.H.，and Dawson ，W．O.，Amplification，movement and expression of genes in plantｓ by v iral-based vectors，Transgenic plants：fundamentals and applications（A. Hiatt編），Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.195-217．（1992））。例えば、タバコ（ニコチアナタバキュム〔Nicotiana tabacum〕は１ｇの新鮮組織重量当り約１mgのタバコモザイクトンバモウイルス（TMV）（tabacco mosaic tomb amovirus）を接種後７〜14日で蓄積する。TMVコートタンパク質合成は総細胞性タンパク質合成の70％を占めることができ、そして総葉乾燥重量の10％を構成しうる。単一の特異的RNA転写体が総葉mRNAの10％に至るまで蓄積しうる。この転写レベルは、慣用の植物遺伝子操作技術を利用して染色体に組込まれた遺伝子について観察される転写レベルよりも２桁高い。この外来遺伝子発現レベルは植物における従来技術のウィルスベクターを利用してはいまだ獲得されていない。ほとんどの植物ウィルスはブラスセンスRNA（メッセンジャーRNAの極性）のゲノムを含む（Zaitlin and Hull，Ann.Rev.P1ant Physiol．38：291-315（1987））。プラスセンス植物ウィルスは遺伝子発現ベクターとして開発するのに非常に多才なウィルスのクラスであり、なぜなら多種多様な宿主植物種と適合性である 22のプラスセンスウィルスグループのいくつかに由来する大量の株が存在するからである。（Martelli，G.P.，Plant Disease 76：436（1992））。更に、進化論的に近縁するRNA依存性RNAポリメラーゼがこれらの株それぞれよりエンコードされる。この酵素はゲノム複製及びmRNA合成にとって重要であり、植物において公知の最も高い遣伝子発現レベルの一部をもたらしている。遺伝子ベクターとしての植物ウィルスを開発するためには、ウィルスゲノムの分子クローンを操作できなくてはならず、且つ感染性組換体を作製する能力が保持されていなければならない。もしウィルスがRNAウィルスであるなら、このウィルスを一般にcDNAとしてクローンし、そしてプラスミドに挿入する。このプラスミドは全ての構築体を作るのに利用される。数多くのプラスセンスRNAウィルスのゲノムはプラスミドDNAコピーとして操作され、次いで感染性RNA分子を作成するためにインビトロで転写される（Turpen and Dawson，Transgenic Plants， Fundamentals and Applications，Marcel Dekker，New York、頁195-217（1992 ））。植物とウィルスとの相互作用は、TMV／タバコ系で代表される通り、複合分子の生産についての固有の機会を供する（Dawson，W.0.，Virology 186：359-367 (1992)）。非常に高レベルのウィルスの核酸及び／又はタンパク質が短時間で感染細胞の中に蓄積する。このウィルスは、顕著な組織向性なしで、植物全体にわたるそのゲノムの迅速な細胞間移動を触媒する。この感染は植物の寿命を通じて維持される。これらの植物のウィルス感染により有意な悪影響を受けず、なぜならこのウィルスは一般に細胞毒性又は宿主遺伝子発現の特異的な抑制をほとんど又は全く引き起こさないからである。タバコモザイクトバモウイルス（tobacco mosic tobamovirns）は、植物において高レベルで遺伝子を発現せしめるその能力との関係で、本発明にとって特に感心がもたれる。TMVはトバモウィルス群の構成員である。TMVビリオンは300nm ×18nmのチューブであり、直径４nmの中空導管を有し、そして一本のRNA分子にらせん状に巻き付いている2140単位の一本鎖構造タンパク質より成る。このゲノムは6395塩基のプラスーセンスRNAである。その５′末端のキャップが付されており、そして３′末端は一式のシュードノット及びヒスチジンを特異的に受け入れるであろうtRNA様構造を含んでいる。このゲノムRNAはウィルス複製にかかわるタンパク質、即ち、５′末端から68ヌクレオチドで開始する126kDaのタンパク質及び約10％の機会でのアンバー停止コドンの読み過し（readthrough）により合成された183-kDaのタンパク質の生産にとってのmRNAとして機能する。183-kDa 及び126-kDaのウィルスタンパク質のみがin transでのTMV複製にとって必要とされる（Ogawa，T.，Watanabe，Y.，Meshi，T.，and Okada，Y.，Virology 185： 580-584（1991））。更なるタンパク質が、複製の際に生産されたサブゲノムサイズのmRNAより翻訳される（Dawson，W.0.，Adv.Virus Res． 38：307-342(199 0)）。30-kDaのタンパク質が細胞間移動にとって必要とされ、17.5-kDaのカスピドタンパク質が一本鎖ウィルス構造タンパク質である。推定54-kDaのタンパク質の機能は不明である。 TMV複製にとってのin cisにおいて必要とされる最小配列は５′及び３′非コード領域に位置しており（複製起点）、それは植物のプロトブラストにおける欠失突然変異体の分析により決定されている（Takamatsu，N．らJ.Viro1． 64：3686-3693（1990），Takamatsu，N．らJ. Viro1． 65：1619-1622（1990））。完全植物において、126／183-kDaの複製タンパク質配列の大半及び30-kDa移動タンパク質配列の大半の欠失により構築されたヘルパー依存性RNAレプリコンが、野性型TMVの存在下で複製、且つ全身に分布される（Raffo A.J.，and Dawson W.O.，Virology 184：277-289（1991））。 Turpenらは簡単、且つ信頼性のある遺伝子導入方法を開示しており、それにおいてはTMVのcDNAを植物細胞における発現のためにＡ．トゥメファシエンス（A.t umefaciens）の中に操作せしめている（Turpen，T.H.，Ph.D.Dissertation，Uni versity of California，Riverside、頁88-105（1992））。この方法は、インビボのウィルスcDNAの宿主転写を基礎に、植物に接種する合成感染性転写体の利用の択一法を供する。Turpenは、この方法を利用しての野性型及び欠損型ウィルスゲノムによるタバコ（Ｎ．タバコキュムcv．キサンチ（Xanthi）及びキサンチ／ nc）の有効なトランスフェクションを示している。トランスフェクションは、染色体に組込まれたTMVの欠損型又は野性型cDNAを含む遺伝子導入細胞系の中で自発的にも起こる（Turpen，Ｔ.H.，Ph.D.Disserta tion，University of California，Riverside、pp.106-132（1992）；Yamaya，J .，ら、Mol.Gen.Genet． 211：520-525（1988））。即ち、一旦染色体に組込まれたら、ウィルス複製は宿主細胞転写の過程より誘導されうる。植物ウィルス感染は植物細胞壁に対する機械的損傷により開始する。はじめに傷付けられた細胞における複製に続き、子孫ウィルスは長距離移動のために導管組織に侵入する前に、短距離にわたって広がる（細胞間移動）。キメウトバモウィルスについての研究は、コートタンパク質が効率的な長距離移動にとって必要であることを示唆している。しかしながら、コートタンパク質が欠失している、又は不活性化されているウィルスは野性型ウィルスと同じように短距離を移動する（Dawson W .O．and Hi1f，M.E.，Ann.Rev.Plant Physiol.P1ant Mol.Biol．43：527-555（1 992））。 TMVの場合、機能性30-kDa移動タンパク質が完全植物における細胞間移動にとって絶対的に必要であるが、しかしプロトプラスト又は接種葉における複製に影響を与えずに欠失又は不活性化せしめることができる（Citovsky，V.，Zambrysk i，P.，BioEssays 13：373-379（1991）及びDeom，C.，Lapidot，M.，and Beac hy，R.N.,Cell 69：221-224（1992）参照のこと）。 TMVのUI株の30kDa移動タンパク質遣伝子内に位置する配列は集成起点を担っている。この集成起点においてTMV RNA及びウィルスカスピドタンパク質は自発的に凝集してビリオンの集成を開始する（But1er,P.J.G.，Mayo，M.A.，Molecular architecture and assembly of tobacco mosaic virus particles, The molecu lar biology of the positive strand RNA viruses．（D.J.Rowlands，M.A.Mayo ，and B.W.J.MahyN編）、Academic Press，London。頁237-257（1987））。効率的な長距離移動にとっては機能的集成起点も必要である（Saito，T.，Vamanaka ，K.，and Okada，Y.，Virology 176：329-336(1990)）。パッケージングのためには任意の更なる要件はないようである。様々な異種配列が封入されることができ、桿状ビリオンであってその長さがその集成起点を含むRNA分子のサイズに比例しているものがもたらされる（Dawson，W.O．ら、Virology 172：285-292 （1989））。植物における外来遺伝子の導入及び発現についての植物RNAウィルスRNの構築は、French，R.，ら、Science 231：1294-1297(1986)；Takamatsu，N.,ら、EMB O J6：307-311（1987）；Ahlquist， P.，ら、Viral Vectors ，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，183-189 （1988）；Dawson，W.O.，ら、Phytopatho1ogy 78：783-789（1988）；Dawson ，W.O.，ら、Virology 172：285-292（1989）；Cassidy， B.，and Nelson， R .，Phvtopathology 80：1037（1990)；Joshi，R.L.，ら、EMBO J．９：2663- 2669（1990）：Jupin，I.，ら、Virology 178：273-280（1990）；Takamatsu,N .，ら、FEBS Letters 269：73-76（1990）；日本国公開公報63-14693号（1988 ）；欧州特許出願067,553号；及び欧州特許出願194,809号、欧州特許出願278,66 7号により実証されている。これらの文献において構築されている大半のウィルスは完全植物の中で全身移動が可能であることが示されていなかった。むしろ、遺伝子発現は接種葉においてのみ確認された。他のケースにおいては、ウィルスベクターによる外来遺伝子の全身移動及び発現は、外来遺伝子の急速損失を伴った（Dawson，W.0.，ら、Virology 172：285（1989））。更なる改良を伴い、植物への迅速な遺伝子導入のためのトバモウィルスを基礎に、有効なベクターが開発された。（Donsonら、Proc．Nat1．Acad.Sci． 88： 7204-7208（1991））。例えば、α−トリクロサンチン遣伝子が、野性型TMVに対して遠縁の株から獲得したサブゲノムプロモーターの転写コントロール下にあるトバモウィルスベクターのゲノムに付加されている（Turpen，Ｔ.H.，Ph.D.Diss ertation，University of California，Riverside、頁72-87（1992））。このベクターは、全ての公知のウィルス機能を含む自律性ウィルスである。接種の２週間後、トランスフェクトされたニコチアナベンサミアナ（Nicotiana benthamian a）植物は２％以上のレベルの総可溶性タンパク質に至るまでα−トリコサンチンを蓄積した。この方法により生産された精製組換α−トリコサンチンは正確にプロセスされ、そして天然起源由来の酵素と同じ比活性を有していた。従って、完全植物の中でウィルスRNA増幅により生産されたメッセンジャーRNAは完全に機能的である。しかしながら、このベクターを利用しての一定の配列の長期複製の後、組換欠損及び点突然変異に主に基づきある程度の遺伝子不安定性が観察されている（Kearney，C.M．らVirology）。近年、非常に類似の結果が植物に感染性の追加のプラスセンスRNAウィルス、即ち、ポチウィルス、タバコエッチウィルス（（Dolja，V．ら、PNAS 89：1020 8-10212（1992））及びボテックスウィルス、ポテトウィルスＸ（Chapman，Ｓ. ，ら、Plant Journal ２：549-557(1992)）に由来するベクターを用いて獲得されている。従って、現存の従来技術のウィルスベクターの主たる機能的欠点は、長期複製及び継代を経た全身感染化完全植物における一部の非ウィルス外来遣伝子の維持の再現性についてのその遣伝子の不安定性にある。数多くの生成物について、欠損率及び増幅集団中の他の変異体の率を下げることにより遣伝的再現性を高めることが所望されるであろう。遺伝子導入植物における外来遺伝子の発現のためのウィルスベクターの利用に関する更なる考えは、外来遺伝子をエンコードするウィルスベクターの生物学的夾雑にある。発明の概要本発明は植物細胞の染色体の中に組込まれた導入遺伝子より転写されたレプリコンに関する。このレプリコンは、プラスセンスと実質的に同一の配列（一本鎖 RNA植物ウィルス）及びプラスセンスにとって非天然の少なくとも一の遺伝子（一本鎖RNA植物ウィルス）を保有する複製起点についてエントコードする。しかしながら、このレプリコンは、複製にとって必要な最低一つのタンパク質についてはエンコードしない。本発明に従い、非天然遺伝子の発現は、複製のためのレプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスにより調節される。本発明に関し、非天然遺伝子をエンコードする配列はレプリコンの３′複製起点に対して５′に位置していることが好ましい。更にこのレプリコンは、全身感染のためのヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子、最も好ましくはレプリコンの５′複製起点に対して３′に位置するウィルス移動タンパク質をエンコードする。本発明は、本発明のレプリコンを用いる植物細胞において発現されるタンパク質にも関連する。本発明は、本発明のレプリコンを用いて植物細胞の中で発現されるRNA配列にも関連する。本発明はまた、本発明のレプリコンによりエンコードされる非天然遣伝子の発現の結果としてのトランスフェクト植物の組織の中に蓄積した一次又は二次代謝物にも関連する。本発明はまた、植物細胞の染色体の中に導入遣伝子を組込むことによる植物の中での遺伝子の発現方法にも関連し、この導入遺伝子は本発明のレプリコンをエンコードする。この遣伝子導入植物を次に複製のためのレプリコンにより必要とさるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスで感染せしめる。図面の簡単な説明図１は野性型TMVのゲノムを示す。図２ａ，ｂ及びｃは請求の範囲のウィルスレプリコンの本質的な特徴を示す。図３は、レプリコン及びヘルパーウィルスが相互依存性である態様を示す。図４は好適なレプリコン遺伝子の並びを示し、ここで外来遺伝子は３′複製起点に対して５′のゲノムの３′末端に位置している。図５はアグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換ベクターにおけるクロラムフェニコールアセチルトランスフュラーゼ（CAT）をエンコードするレプリコンの合成のための導入遣伝子の構築を示す。図６はpBGC272の遺伝子導入部の制限地図を供する。図７はpBGC272及びpBGC273の分離及び同定を示すオートラジオグラフを示す。定義外来遣伝子：「外来遺伝子」とは、ウィルスにとって天然でない全ての配列を意味する。in cis ：「in cis」とは、２本の配列がRNA又はDNAの同一の鎖の上に位置していることを示す。in trans ：「in trans」とは、２本の配列がRNA又はDNAの別々の鎖の上に位置していることを示す。移動タンパク質：「移動タンパク質」とは、植物におけるレプリコン又はウィルスの細胞間移動にとって必要なノンカスピドタンパク質である。集成起点：「集成起点」とは、ウィルスRNA及びウィルスカスピドタンパク質の自己集成が開始してビリオンを形成する配列である。複製起点：「複製起点」とは、ウィルス複製のために必要な線形ウィルスの中の最小末端配列を意味する。レプリコン：「レプリコン」とは、ヘルパーウィルスの存在下で複製可能な宿主 DNAの中に組込まれた導入遣伝子の転写により作成されるRNA配列の配備である。レプリコンは効率的な複製及び安定性にとっての複製起点以外の配列を必要としうる。転写終止領域：「転写終止領域」は転写体の３′末端の形成をコントロールする配列である。自己解裂性リボソーム及びポリアデニル化配列が転写終止配列の例である。導入遣伝子：「導入遺伝子」とは、宿主DNAの中に挿入されるレプリコンについてコードするDNA配列を意味する。ビリオン：「ビリオン」とは、ウィルスRNA及びウィルスカスピドタンパク質より成る粒子である。発明の詳細な説明本発明はウィルスレプリコンによる植物における高レベルな外来遺伝子発現を提供し、ここでこのレプリコンは向上した遺伝的安定性を有している。本発明のレプリコンは組込み導入遺伝子の転写によって宿主植物細胞において生産される。本発明のレプリコンは、一部、一本鎖プラスセンスRNAウィルスに由来する。本発明のレプリコンは少なくとも一の外来遺伝子をコードし、そして複製のためのin cisである必要がある配列を有する（「複製起点」）。これらのレプリコンは、RNA転写体を形成するために、染色体に組込まれた導入遺伝子の宿主細胞転写により生成される。この導入遺伝子はレプリコンについてコードするDNA配列であり、そしてプロモーター及び転写終止領域も含む。図２（ａ）。このレプリコンは導入遺伝子のRNA転写体から、RNAプロセス及びヘルパーウィルスの存在下での複製によって作られる。図２（ｂ）。本発明のレプリコンは機能性複製タンパク質配列を欠く。本発明のレプリコンは複製タンパク質配列を欠くため、それらは複製のためにはヘルパーウィルスの遺伝的相補を頼りとせねばならない。複製についてのヘルパーウィルスに対するこのレプリコンの依存性は、ヘルパーウィルスの導入を介するこれらのレプリコンの調節性増幅を可能にする。ヘルパーウィルスによるレプリコンの遺伝的相補は、遺伝子発現を増幅するための自律性ウィルスベクターに勝る数多くの利点を供する。遺伝子導入植物の各感染細胞は増幅すべき遺伝子の正しいマスターコピーを含む。このことは、RNA ベクターの長期複製を経て配列不安定性及び点突然変異をもたらしうる、RNA集団の複製における遺伝的ドリフトの効果を小さくする（Kearney，C.M.，ら、Vir ology）。本発明の更なる態様において、このレプリコンは、ヘルパーウィルスが依存する少なくとも一の配列についてコードする。従って、この更なる態様において、このレプリコンとヘルパーウィルスとは相互に依存し合う（図３参照のこと）。レプリコンに対するヘルパーウィルス依存性は、完全植物におけるヘルパーウィルスによるレプリコン配列の増幅発現を確実にする。更なる態様において、このレプリコンは機能性移動タンパク質、例えば30kDa のTMV移動タンパク質についてコードする。本態様において用いられるヘルバーウィルスは機能性移動タンパク質を有さない。従って、このヘルパーウィルスは移動機能についてはレプリコンに依存する。移動タンパク質は植物における細胞間移動のために必要である。このレプリコンの上に機能性移動タンパク質配列を置き、そしてヘルパー配列上の同一の配列を不活性化もしくは欠失せしめることにより、又は移動タンパク質を非両立的にエンコードするヘルパーウィルスを有する宿主種により、レプリコンに対するヘルパーウィルスの依存性はウィルスレプリコンとヘルパーウィルスとを有する完全植物の全身感染を可能にする。本発明のこの態様は、環境の中に放出されたウィルスのみが虚弱型ヘルパーウィルスとなるであろうという更なる利点を有する。即ち、このヘルパーウィルスは、ウィルス移動タンパク質の機能的なコピーを予め含んでいない植物の中では広がることができないであろう。この態様は、より緊縮なレベルの生物学的抑制のためのオプションを供し、このことは大量スケールの商業的生産にとっての所定のケースにおいては所望されうる。好適な態様において、このレプリコンは、その複製起点及び移動機能をエンコードする配列が外来遺伝子配列に連結されている状態で作られる。レプリコンをコードする染色体的に組込まれた導入遺伝子は組換mRNAを生成する宿主RNAポリメラーゼIIにより転写される。ヘルパーウィルスの存在下で、これらの転写体は複合集団における追加のレプリコン成分として複製される。ウィルス複製の際、サブゲノムメッセンジャーRNAがレプリコンRNAより生成されることがあり、外来遺伝子の増幅発現をもたらしめる。最も好適なレプリコン遺伝子の並びは、その外来遺伝子を、そのウィルス構造タンパク質が正常にエンコードされるゲノムの最外３′末端に置いている。図４参照のこと。図４に示している通りのゲノムの最外３′末端での外来遣伝子についてのこの位置は高レベル発現にとって重要である（Culver，J．N．ら、Virology）。しかしながら複製起点間に位置するタンパク質コード配列又はその他の遺伝子配列は任意の順序で機能的でありうる。レプリコン配列の更なる好適な態様は、外来遺伝子及び／又は移動タンパク質の発現をコントロールする調節プロモーターの利用を含む。外来タンパク質を含む融合タンパク質の発現のための一のプロモーター又は一式のサブゲノムプロモーターが採用されうる。自己解裂型リボザイム又はポリアデニル化領域を転写終結領域として採用されうる。これらのレプリコンは、植物においてインビボで、宿主植物細胞染色体の中に組込まれた導入遺伝子の転写を介して、及びヘルパーウィルスの存在下での複製を介して作られる。これらの導入遺伝子は様々なプロモーターを用いる公知の形質転換法によって宿主植物細胞染色体の中に導入されうる。レプリコンを宿主に導入した後、得られる遺伝子導入植物を、ヘルバーウィルス株を加えるのに最適な段階にまで成育させる。次にレプリコンをその導入したヘルパーウィルスにより増幅させ、そして外来遺伝子を発現させる。このレプリコンによりコードされる及び発現される外来遺伝子生成物の非常に多種多様なRNA又はタンパク質生成物であることができ、そして例えば、アンチセンス及びリボザイムRNA、調節酵素、並びに構造、調節及び治療性タンパク質であって、天然形態又は遺伝子融合休として発現されうるものである。典型的な治療的タンパク質には、インターロイキン科のタンパク質、並びにコロニー剌激因子、例えばCSF−G、CSF−Gn及びCSF−Mの構成員が含まれる。しかしながら、本発明においてあらゆる治療的タンパク質がコード化されて発現されうることが理解される。外来遺伝子の発現が植物組織の中でのタンパク質又はその他の材料の蓄積をもたらすなら、そのもたらされる生成物は、その生成物の所望の濃縮が達成できれば回収できうる。有意義な量の組換タンパク質、核酸又はその他の代謝物がこの手順を用いて安価に生成できる。同一の構築体により染色体的に形質転換された遺伝子導入生物において観察される低レベルの発現及び幅広い変異（「位置効果」に基づく現象）はこの方法により回避される。RNAベース増幅ははじめの転写体の量には厳密に依存しない。RNAレベルにおいて増幅されうる遺伝子の数の理論的な制約もない。この標的遺伝子は、増幅前の「オフ」であり続け、その理由はサブゲノムmRNAのみがウィルス複製中に生成されるからである。従って、この手法は複雑な生化学的経路をコントロールするのに、又は植物にとって毒性である生成物を生産するために特に適切でありうる。例えば、ヘルパーウィルスによる接種後のみにおいてアンチセンスRNAを増幅させることにより、経路において重要な酵素を過剰発現させ、そして同時に他の遺伝子を下降調節することが可能であろう。このようなタイプの操作は、植物もしくは植物細胞の染色体形質転換のための現在もしくは提案された技術、又は従来技術を用いることによっては可能でない。好適な態様の説明以下の実施例で本発明を更に説明する。実施例１組換メッセンジャーRNAの発見のための導入遺伝子の構築 TMVに由来する導入遣伝子の構築をここに記述する。野性型TMVゲノムを図１に示す。CaMV35Sプロモーターに融合されている５′複製起点を含むDNAブラスミドの構築はOw，D.W．らScience 234：856-859（1986）に説明されており、そしてリボザイム終止領域に融合されている３′複製起点はTurpen，T.H.，Ph.D.Diser tation，University of California，Riverside、頁88-105（1992）に記載されている。コートタンパク質遺伝子のCATコード配列との置換はDawsonらPhytopathol． 78 ：783-789（1988）に記載されている。既に開示されているプラスミドpBGC43，pBGC44，pBGC75，（Turpen，Ｔ.H.，P h.D.Disertation，University of California，Riverside、頁88-136（1992））及びpTMVS3CAT28（Dawson，ら、Phytopathol．78：783-789（1988））をレプリコンRNAの合成のための所望の導入遺伝子の構築のための前駆体として使用した（図５）。プラスミドpBGC43，pBGC44，pBGC75の構築は、Turpen，T.H.，Ph.D.Disertation，Univer sity of California，Riverside、頁92，112（1992）を参考に表１に記載の通りにした。プラスミドpBGC43，pBGC44，pBGC75及びpTMVS3CAT28の構築を以下に説明する。pTMVS3-CAT-28の調製コートタンパク質遺伝子に代わるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子の置換を含むpTMVS3-CAT-28を以下のようにして構築した。 CAT遺伝子を、SalＩによりpCM１（Pharmacia）から除去し、そしてXhoＩ−解裂p TMVS3−28にリゲートした。pTMVS3−28は、Dawson W．ら、Proc.Natl.Acad.Sci ． 83：1832-36（1986）に記載の通り、pBR322の中でゲノム長TMV cDNA（6.4kb ）をクロ−ニングすることによって構築した。CAT構築体はpTMVS3-CAT-28を生成し、それより突然変異cp S3-CAT-28を転写した。適正配列及び配向は配列決定により確認した。Gene Anal.Technol．２：89-94。pBGC43の調製 pTK49は、Dawson，W.らProc.Natl.Acad.Sci． 83：1832-36（1986）に記載の通り、pUC19の中でTMV cDNAの1.4kbのPstＩ−HindIIIフラグメントをクローニングすることによって構築した。pTK49由来の1.4kbのPstＩ−HindIIIをpUC19の中に再クローンしてpTT１にした。OwらSｃienｃe 234：856-59，（1986）に記載のpD0432由来の1.6kbのHindIII−BamHＩフラグメントをpTT１にクローンした。N otＩリンカーをこのフラグメントのHindIII部位及びこのベクターのEcoRI部位に加えた。pTT３はpTT２をPstＩ−BamHＩ及びマングビーンヌクレアーゼにより消化し、そしてTMV cDNAの５′末端に35Ｓプロモーターを配置することにより構築した。pTT３の1.9kｂのNotＩ−SmaＩフラグメントをpBStKs+にクローンしてpBGC 43 にした。pBGC44の調製 pTT１由来の1.4kbのSalＩ−HindIIIフラグメントをpstSk^-にクローンしてpBGC ８にした。DawsonらProc.Natl.Acad.Sci． 83：1832-36（1986）に開示のpTMV2 04由来の3.6kbのHindIIIフラグメントをpBGC８にクローンしてpBGC９にした。pB GC９由来の4.8kbのSmaＩ−PstＩフラグメントにpBGC43（上記）にクローンしてp BGC44にした。pBGC75の調製 Dawson，W.らProc.Natl.Acad.Sci． 83：1832-36（1986）に記載のpTMV204由来の2.1kbのEcoRＩ−PstＩフラグメントをpBstSK-にクローンしてpBGCllにした。pTMV204由来の3.6kbのHindIIIフラグメントをpBGCllにクローンしてpBGC14にした。pTMVcpS3-28の0.4kbのNcoＩ−PstＩフラグメント（pTMV304の0.5kbのコートタンパク質欠失；Dawson，W.らPhytopathology 78：783-789に記載）を、pGC 14の0.9kbのNcoＩ−PstＩフラグメントと置換してpGC15にした。pBGC19は、pBGC 14の0.03kbのKpnＩ−HindIIIポリリンカ−領域を欠失させることによって形成した。 pBGC70は、0.05kbの合成ApaＩ−PstＩリボザイムエンコードフラグメントをpB stSK+にクローンすることによって作った。pBGC72は、pBGC19由来の3.5kbのCla Ｉフラグメントを欠失することによって作った。pBGC73はpBGC70の0.05kbのApa Ｉ−PstＩフラグメントをpBGC72にクローンすることによって作った。pBGC74は、pBGC15の0.1kbのClaＩ−NsiＩフラグメントをpBGC73の0.5kb の ClaＩ−NsiＩフラグメントと交換することにより作った。pBGC19の3.5kｂのClaＩフラグメントとpBGC74にクローンしてpBGC75を作った。導入遣伝子の構築に関し、30−kDa移動タンパク質遺伝子をレプリカーゼ遺伝子と同じ位置（野生型TMVノムにおける５′複製起点に対し；図５参照）に正確に置くことが所望される。これを成し遂げるため、NdeＩ部位を、合成プライマー及び図面隣接クローニング部位を用いるPCRをベースとする突然変異誘発によって各遣伝子の開始コドンに導入する。PCRプライマー由来の内在NdeＩ部位を含む270bpの突然変異誘発生成物をEcoRV部位を利用してカリフラワーモザイクウィルス35Ｓプロモーターの中に及びHindIII部位を利用して30−kDaタンパク質遣伝子の中にサブクローンする。 CAT遣伝子を含むレプリコンの３′セグメントは、一過性TMVベクターpTMVS3CA T28由来のHindIII−NsiＩフラグメントとして３′リボザイムの隣りに置かれるであろう（図５）。最終クローニング段階において、導入遺伝子の５′部及び３ ′部を、公知の通り（Turpen，Ｔ.Ｈ.，Ph.Ｄ.Disertation，University of Cal ifornia，Riveside，頁88-132（1992）），BglII−BamHＩフラグメントとして植物形質転換ベクターpAP2034（Velton and Schell，NAR 13：6981-6998（1985））の固有BamHＩ部にサブクローンする。宿主転写、RNAプロセス及びヘルパーウィルスの存在下での複製により生成されたレプリコンRNA配列をSEO．No．１に示す。即ち、外来遺伝子（CAT）をRNAウィルスレプリコンの上に、メッセンジャー RNA合成のためのコートタンパク質サブゲノムプロモーターのコントロール下で置く（移動タンパク質遺伝子の３′末端に位置する）。実施例２植物の形質転換本発明の一態様において、アグロバクテリウムトゥメファシエンスを、公知の通りにして（Turpen，T.H.，Ph.D．Dissertation，University of California ，Riverside，頁106-132（1992））、この配列を植物染色体の中に挿入するために用いる。この形質転換ベクターpAP203 4は共組込式アグロバクテリウムベクターである。レプリコンPNAの生産のための転写ユニットを含むpAP2034は、ヘルパー株GJ23を用いる接合によってA．トゥメファシエンスの中に動員させる（Van Haute，E.，Joosら、EMB0 J．２:411-41 7（1983））。トランス接合固体を選び、そしてドナープラスミドと解除（disar med）TiプラスミドpGV3850との間の共組込体の構造（Zambryski，P．ら，EMB0Ｊ．２:2143-2150（1983））をサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。適正な相同性組換現象はT-DNA境界間に導入遺伝子構築体を置く。 N．タバキュムcv．キサンチの無菌葉切片を（Horsch，R.B.，ら，Leaf disc t ransformation, Plant molecular biology manual．（S.B．Gelvin，R.A．Schil peroort，and D.P.S．Verma,編），Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，T he Netherlands，pp．A5：1-9（1988））以下の順序で処理する：１回目；葉切片をA.トゥメファシエンス培地に浸し、そして再生培地（RM）の上に載せる：３日目；外植体を、セフォタキシム（500μｇ／ml）の添加したRnに移す：５日目；外植体をRM／セフォタキシム（500μｇ／ml）＋カナマイシン（100μｇ／ml）に移す：30〜40日目；菌糸を切り、そしてセフォタキシム（500μｇ／ml）及びカナマイシン（100μｇ／ml）を含む発根培地上に載せる。培養物を連続蛍光ライト（Sylvania GTE，Gro-Lux WS）の下に2０℃で維持する。硬質化した植物を商業用鉢植土壌（Cascade Forest Products Inc.，Arcata， CA）の中で、21〜29℃の温度で、コントロール式リリースファティライザー（Os mocote，14-14-14）により，蛍光ライトを伴う自然光（Vacaville，CA）を利用し、16日間にわたり、室内グリーンハウスの中で成育させる。遺伝子導入系において保持されている抗生物質耐性特性を、100μｇ／mlのカナマイシンの存在下で減菌寒天の中で発芽する実生を評価する（Dunsmuir，P.，ら，Stability of introduced gene s and stability of expression，Plant molecular biology manual．（S.B．Ge lvin，R.A．Schilperoort，and D.P.S．Verma,編），Kluwer Academic Publishe rs，Dordrecht，TheNetherlands，頁C1：1-17（1988））。実施例３ヘルパーウィルスの存在下でのレプリコンRNAの生産宿主転写、RNAプロセス及びヘルパーウィルスの存在下での複製により生成されたレプリコンRNAの配列をSEQ ID No．１に示す。30−kDaタンパク質遺伝子において突然変異又は天然変異を有するドバモウィルスは特定の宿主種での細胞間移動能を欠く。遣伝子導入植物又は改変宿主はこの欠陥を補完しうる。当業者にとっては、このようなヘルパー変異体又は天然の宿主種コンビネーションに加え、遺伝子操作による又は突然変異誘発によるヘルパートバモウィルスの数多くの生産方法があることを知っているであろう。同様に、30kDaタンパク質を発現する、及び欠陥30kDa含有ウィルスを相補する遺伝子導入植物を生産するための方法が公開されている。例えば、移動欠陥ヘルパーウィルスはRNA接種の生産のための公知の突然変異を伴うTMVの転写によって合成できうる。30kDaタンパク質を発現する遺伝子導入植物がこの欠陥を相補する（Deom，C.M.ら.，Science 237 ：389-394（1987））。従って、大量のヘルパーウィルスが繁殖しうる。本発明の一態様において、一塩基対欠損を4931位において有し、従ってcDNAの中にEcoR V部位を作り出す30−kDaタンパク質フレームシフト突然変異体がヘルパーウィルスとして利用される。このレプリコン導入遺伝子構築体を含む遺伝子導入タバコ（〜100体の植物）を再生させ、そして公知の手順（Shaw，W.V.， Chloramphenico1 acetyltransferase from chloramphenicol-resis tant bacter ia，Methods in Enzymology， Vol.53，（S.F1eischer and L.Packer，編），頁 737-755（1975））を利用してヘルパーウィルスの存在下及び非存在下でCAT活性について評価する。200mgの葉組織をアッセイバッファーの中でふやかし、次いで0.5mMのアセチルCoA及び0.1μCiの〔¹⁴Ｃ〕クロラムフェニコールを加え、37 ℃で45minインキュベートし、抽出し、薄層クロマトグラフィーで分解し、そしてオートラジオグラフィーにかける。実施例４ヘルパーウィルスの存在下でレプリコンRNAを用いるタバコ植物におけるCATの生産数体のタバコ植物（ニコチアナタバキュム）を、植物内で発現される導入遣伝子の能力並びにこの導入遺伝子の植物に全身的に感染する能力及びこの導入遺伝子によりエンコードされるタンパク質を発現する能力を評価するため、本発明の導入遺伝子で形質転換せしめた。本例においては、この導入遺伝子によりエンコードされるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの全身発現は、バックグランドレベルの２倍のレベルで達成され、そして単一コピータバコ遺伝子について獲得されるレベルに匹敵していた。本例においては、pBGC272及びpBGC273を導入遺伝子を導入するために用いた。 pBGC272の導入遺伝子部の制限地図を図６に示す。pBGC272はアメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville，Maryland（ATCC）に寄託番号号で寄託されている。pBGC272由来のCATの増幅発現は、ヘルパーウィルスの存在下でこのヘルパーウィルスによる相補を介して観察されるであろうことが予測される。コントロールプラスミドpBGC273も調製し、これはpBGC272とは、３′非コード領域が欠失している点で異なる。CATの増幅発現はpBGC273では予測されず、その理由は３′非コード領域の欠如がマイナス鎖の合成を阻止することにある。転写生産の同定タバコ植物を、実施例２記載のアグロバクテリウムトゥメファシエンス葉浸漬法を利用して、pBGC272又はpBGC273のいづれかにより形質転換させた。時間の節約のため、細菌接合は、共組込ベクターを採用する代わりに植物形質転換のためにバイナリープラスミドベクター系を利用することによって回避した。Bevan ，Ｍ．らNucleic Acid Res． 12：871-8721（1984）。接種後のウィルス転写体の存在はノーザンハイブリダイゼーションにより測定した。詳しくは、全RNAを精製し、グリオキサル化し、電気泳動により分離し、ナイロン膜（Nytran）にプロットし、そしてランダムプライマ一法により³²Ｐ− ラベルしておいたpBGC272のNdeＩ−NsiＩフラグメントでプローブした。pBGC272 及びpBGC273の分離及び同定を示すオートラジオグラフを図７に示す。レーン１，２及び20はpBGC272由来のコントロールDNA制限フラグメントを含む。レーン３ −10及び13−18は遺伝子導入植物サンプル由来の全RNAを含む（pBGC272，pBGC27 3）。レーン11及び12は、ヘルパーウィルスTMMVDEcoRVを相補することで知られる30ｋ遺伝子導入植物（系２６Ｃ）由来のコントロールサンプルを含む。レーン 19はヘルパーウィルスTMMVDEcoRV−感染系26Ｃコントロール植物由来のRNA（１／220当量）を含む。 pBGC272で形質転換した16体の植物のうちの12体が豊冨なレベルの転写体を含んでいた。同様に、pBGC273で形質転換した６体の植物のうち４体が転写体を生成していた。CAT生産の同定植物を全身感染する及びマーカータンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）を生成するpBGC272の能力も評価した。CAT濃度はELI SAアッセイを利用して決定した。Gendloff，E．らPlant nol．Biol． 14：575- 583（1990）。葉のディスクサンプル（＃８コアボア）を使用した。CAT/ELISAのために用いた同一の葉ディスクサンプル由来の総可溶性タンパク質をBradford，Mr Anal．Biochem． 72：248-254（1976）の方法により決定した。アグロバクテリウムトゥメファシエンス葉浸漬法によりpBGC272又はpBGC273 を含む３グループの植物を３つのヘルパーウィルスの１つで感染せしめた。本例において用いたヘルパーウィルスは野生型TMVウィルス（TMVUI）、TMVDEcoRV及びTMV30k-0を含む。本研究において用いたヘルパーウィルスは容易に入手できるトバモウィルス株TMVUI（一般又は野生株としても知られる；ATCC No．PV135）及びオドノグロッサムリングスポットトバモウィルス（odonoglossum rings pot tobamoviruｓ）（ORSV，ATCC No．PV274）である。Paul，H.，C.M.I./A.A.B ．Descriptions of Plant Viruses，No.155（TMVUI）；Zaitlin，M.，C.M.I./A. A.B．Descriptions of Plant Viruses，No．151（ORSV）。ヘルパーウィルスTMVDEcoRVはTMV30k遺伝子の中に点突然変異を含む。TMVDEco RVはヌクレオチド4931を、TMVUlcDNAのオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発により作り出され、従ってこの位置にはEcoRV部位が導入され、そして30ｋ遺伝子の中ではフレームシフト突然変異が生じている。感染性RNA転写体を次にインビトロで合成し、そして接種物として使用する。 TMV30k-OはＵ１株バックグランドの中にオドノグロッサムリングスポットトバモウィルス（ORSV）由来の30ｋ遺伝子を含む。TMV30k-0は移動機能を若干欠いており、キサンチタバコにおける遅れた及び散発的な全身感染を示す。Dawson，W．らAnn．Rev．Plant Physiol．Pl ant Mol．Biol．43 ：527-555（1992）、へルパーウィルスTMV30k-0はTMVU1株の3 0ｋ遺伝子をエンコードするcDNAをORSV由来の30ｋ遣伝子と、通常の遺伝子操作技術によって変換することにより調製されうる。感染性RNA転写体を次にインビトロで合成し、そして接種物として用いる。第１グループの植物（147体）はTMVDEcoRVで感染させた。pBGC272を含む植物は全身感染の徴候を示さず、従ってヘルパーウィルスを相補できない又はCAT発現を増幅できなかった。第２グループの植物（９体）にはTMVU1を感染せしめた。これらの植物は野生型ウィルスの全身感染を示したが、しかしバックグランドコントロールよりも高くCAT発現を増幅できず、なぜなら遣伝子相補は野生型ヘルパーウィルスを有する植物の全身感染にとっては必要でないからである。第３グループの植物（78体）にはTMV30k-0を感染せしめた。78の接種植物のうち、24体が、TMV30kのみを接種せしめた植物より早く全身感染し、移動機能の相補はpBGC272を有するヘルパーウィルスを虚弱化することが示唆された。 24体の全身感染植物のうち、19体がpBGC272で、そして５体がpBGC273で感染していた。pBGC272で感染された19体の植物のうち12体が高いCATレベルを含んでいることが認められた。再サンプリングし、そして三重アッセイすることにより、８体の植物は大まかに0.1ngのCAT／１mgの総可溶性タンパク質のCATレベルを有することが認められ、これはバックグランドレベルの２倍である。生物の寄託以下のプラスミドはブタペスト条約に基づく特許手続の目的及び規則に関する微生物の寄託の国際認定もとで、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託してあり、従ってブタペスト条約のもとで保管され、且つ入手できる。かかるプラスミドの入手能力は、特許法に関する任意の政府の権威のもとで認められている権利の違背行為において、本発明を実施するためのライセンスとして拘束されない。寄託培養物には表示のATCC寄託番号が認定されている。プラスミド ATCC No． pBGC272 37C.F.R.§1.808に従い、出願人は寄託プラスミドの公的機関に対する寄託人により強いられる入手法に基づく全ての制約は、本願に基づく特許の認定に基づき排除するものとみなすことに同意する゜本願の発明を好適な態様で説明してきたが、本開示内容は単なる例示にすぎず、当業者にとって自明な改良が本発明の範囲を逸脱することなくなし得る。本発明は全ての植物感染性ウィルス及び植物に適用され、そして本発明はここに記載のプラスミド、ウィルス又は植物に限定されない。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：Turpen，Thomas H．（ii）発明の名称：遺伝子導入植物における組換メッセンジャーRNAのウィルス増幅（iii）配列の数：１（iv）通信先：（Ａ）あて先：Limbach & Limbach （Ｂ）通り：2001 Ferry Building （Ｃ）市：San Francisco （Ｄ）州：CAL （Ｆ）郵便番号：94111 （ｖ）コンピュータ読取形式：（Ａ）媒体タイプ：Floppy disk （Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible （Ｃ）作動システム：PC-DOS/MS-D0S （Ｄ）ソフトウェアー：Patent in Re1esse ＃1.0，Version ＃1.25 （vi）現出願データー：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）先の出願のデーター（Ａ）出願番号：US 07/997,733 （Ｂ）出願日：30-DEC-1992 （Viii）代理人／代理店情報：（Ａ）名称:Halluin，Albert P．（Ｂ）登録番号：25,227 （Ｃ）参照／事件番号：BIOG-20220 USA （ix）通信情報：（Ａ）電話：415-433-4150 （Ｂ）テレファックス：415-433-8716 （２）SEQ ID NO：１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1826 （Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：RNA（エピソーム）、ペプチド（Ａ）詳細：ペプチドはTMV 30kDaが移動タンパク質（268残基）及びCAT（20 残基）をエンコードする（iii）ヒポセティカル：NO （iv）アンチーセンス：NO （vi）起源：（Ａ）生物：タバコモザイクウィルス（vii）直接の起源：（Ｂ）クローン：（ix）特徴：（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：１：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年２月２日【補正内容】請求の範囲１．植物細胞の染色体の中に組込まれた導入遣伝子より転写されたレプリコンであって、ここでこのレプリコンはプラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスと実質的に同一の配列を有する複製起点；及びプラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然である少なくともーの遺伝子；をエンコードし、ここでこのレプリコンは複製にとって必要な最低一種のタンパク質についてはエンコードしないものであり、ここでこの非天然遣伝子の発現は複製のためにこのレプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィフレスにより言周節されるものであり；そしてここでこのレプリコンは全身感染のためにこのヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子を更にエンコードするものである；レプリコン。２．前記非天然遺伝子が、複製のためにこのレプリコンにより必要とされるレプリカーゼについてエンコードするヘルパーウィルスにより調節されている、請求項１記載のレプリコン。３．前記非天然遺伝子をエンコードする配列がこのレプリコンの３′複製起点に対して５′側に位置している、請求項１記載のレプリコン。４．前記ヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子がウィルス移動タンパク質である、請求項１記載のレプリコン。５．前記ウィルス移動タンパク質が前記レプリコンの５′複製起点に対して３ ′側に位置している、請求項４記載のレプリコン。６．前記非天然遺伝子をエンコードする配列が前記レプリコンの３′複製起点に対して５′側に位置している、請求項５記載のレプリコン。７．前記非天然遺伝子が、複製のために前記レプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスの存在下で全身的に発現される、請求項４記載のレプリコン。８．前記移動タンパク質がトバモウィルスである、請求項４記載のレプリコン。９．前記移動タンパク質がTMV株ウィルスにとって天然である、請求項４記載のレプリコン。 10．請求項１記載のレプリコンを利用して植物細胞の中で発現されるタンパク質であって、プラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然である遺伝子によりエンコードするタンパク質。 11．請求項４記載のレプリコンを利用して植物細胞の中で発現されるタンパク質であって、プラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然である遣伝子によりエンコードするタンパク質。 12．請求項１記載のレプリコンを利用して植物細胞の中で発現されたRNA配列。 13．請求項４記載のレプリコンを利用して植物細胞の中で発現されたRNA配列。 14．請求項１記載のレプリコンによりエンコードされる非天然遣伝子の発現の結果としてトランスフェクト植物の組織の中で蓄積した一次又は二次代謝物。 15．請求項４記載のレプリコンによりエンコードされる非天然遺伝子の発現の結果としてトランスフェクト植物の組織の中で蓄積した一次又は二次代謝物。 16．植物細胞の染色体の中に組込まれた導入遺伝子を含んで成る遺伝子導入植物であって、前記導入遣伝子が：プラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスと実質的に同一の配列を有する複製起点；及びプラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然の少なくとも一つの遣伝子；をエンコードするレプリコンについてエンコードするものであり，ここでこのレプリコンは複製にとって必要な最低一種のタンパク質をエンコードしないものであり；ここでこの非天然遺伝子の発現は複製のためにこのレプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスにより調節されるものであり；そしてここでこのレプリコンは全身感染のためにこのヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子を更にエンコードするものである；レプリコン。 17．植物において遺伝子を発現する方法であって：ａ）植物細胞の染色休の中に導入遣伝子を組込むこと、ここでこの導入遺伝子は：プラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスと実質的に同一の配列を有する複製起点；及びプラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然の少なくとも一の遺伝子；をエンコードするレプリコンについてエンコードするものであり，ここでこのレプリコンは複製にとって必要な最低一種のタンパク質をエンコードしないものであり；ここでこの非天然遣伝子の発現は複製のためにこのレプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスにより調節されるものであり；そしてここでこのレプリコンは全身感染のためにこのヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子を更にエンコードするものである；レプリコン。ｂ）複製のためにこのレプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスをこの植物細胞に感染せしめること；を含んで成る方法。 18．前記ヘルパーウィルスにより必要とされる遣伝子が移動タンパク質についてエンコードする、請求項17記載の方法。 19．前記移動タンパク質がトバモウィルスにとって天然である、請求項18記載の方法。 20．前記移動タンパク質がTMV株ウィルスにとって天然である、請求項18記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:92）

Claims

【特許請求の範囲】１．植物細胞の染色体の中に組込まれた導入遺伝子より転写されたレプリコンであって、ここでこのレプリコンはブラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスと実質的に同一の配列を有する複製起点；及びプラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然である少なくともーの遺伝子；をエンコードし、ここでこのレプリコンは複製にとって必要な最低一種のタンパク質についてはエンコードしないものである、レプリコン。２．前記非天然遺伝子が、複製のためにこのレプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスにより調節されている、請求項１記載のレプリコン。３．前記非天然遺伝子をエンコードする配列がこのレプリコンの３′複製起点に対して５′側に位置している、請求項１記載のレプリコン。４．前記レプリコンが全身感染のためにこのヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子についてエンコードする、請求項２記載のレプリコン。５．前記ヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子がウィルス移動タンパク質である、請求項４記載のレプリコン。６．前記ウィルス移動タンパク質が前記レプリコン５′複製起点に対して３′ 側に位置している、請求項５記載のレプリコン。７．前記非天然遺伝子をエンコードする配列が前記レプリコンの３′複製起点に対して５′側に位置している、請求項５記載のレプリコン。８．前記非天然遣伝子が、複製のために前記レプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスの存在下で全身的に発現される、請求項５記載のレプリコン。９．前記移動タンパク質がトバモウィルスである、請求項５記載のレプリコン。 10．前記移動タンパク質がTMV株ウィルスにとって天然である、請求項５記載のレプリコン。 11．請求項１記載のレプリコンを利用して植物細胞の中で発現されるタンパク質であって、プラスセンスー一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然である遺伝子によりエンコードされるタンパク質。 12．請求項５記載のレプリコンを利用して植物細胞の中で発現されるタンパク質であって、プラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然である遺伝子によりエンコードされるタンパク質。 13．請求項１記載のレプリコンを利用して植物細胞の中で発現されたRNA配列。 14．請求項５記載のレプリコンを利用して植物細胞の中で発現されたRNA配列。 15．請求項１記載のレプリコンによりエンコードされる非天然遺伝子の発現の結果としてトランスフェクト植物の組織の中で蓄積した一次又は二次代謝物。 16．請求項５記載のレプリコンによりエンコードされる非天然遺伝子の発現の結果としてトランスフェクト植物の組織の中で蓄積した一次又は二次代謝物。 17．植物細胞の染色体の中に組込まれた導入遺伝子を含んで成る遺伝子導入植物であって、前記導入遣伝子が：プラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスと実質的に同一の配列を有する複製起点；及びプラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然の少なくともーの遺伝子；をエンコードするレプリコンについてエンコードするものであり，ここでこのレプリコンは複製にとって必要な最低一種のタンパク質をエンコードしないものである、植物。 18．植物において遺伝子を発現する方法であって：ａ）植物細胞の染色体の中に導入遺伝子を組込むこと、ここでこの導入遺伝子は：プラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスと実質的に同一の配列を有する複製起点；及びプラスセンス一本鎖RNA植物ウィルスにとって非天然の少なくとも一の遺伝子；をエンコードするレプリコンについてエンコードするものであり，ここでこのレプリコンは複製にとって必要な最低一種のタンパク質をエンコードしないものである；ｂ）複製のためにこのレプリコンにより必要とされるタンパク質についてエンコードするヘルパーウィルスをこの植物細胞に感染せしめること；を含んで成る方法。 19．前記レプリコンが、全身感染のためにこのヘルパーウィルスにより必要とされる遣伝子についてエンコードする、請求項18記載の方法。 20．前記ヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子が移動タンパク質についてエンコードする、請求項19記載の方法。 21．前記移動タンパク質がトバモウィルスにとって天然である、請求項20記載の方法。 22．前記移動タンパク質がTMV株ウィルスにとって天然である、請求項20記載の方法。