JPH01120290A - 植物ウイルスｒｎａベクター - Google Patents
植物ウイルスｒｎａベクターInfo
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Classifications
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、トバモウイルスＲＮＡを利用した植物ＲＮＡ
ベクター、該ＲＮＡベクター製造用転写ベクターおよび
これらの製造法並びに植物細胞への外来遺伝子の導入方
法に関する。
ベクター、該ＲＮＡベクター製造用転写ベクターおよび
これらの製造法並びに植物細胞への外来遺伝子の導入方
法に関する。
〈従来技術および問題点〉
トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）は、タバコ
、トマト、ササゲ、キュウリ等の植物から分離される棒
状ＲＮＡウィルスであり、タバコ、トマト等を宿主とす
るタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）及びキュウリ等を
宿主とするキュウリ縁座モザイクウィルス（ＣＧＭＭＶ
）等がこれに属する。
、トマト、ササゲ、キュウリ等の植物から分離される棒
状ＲＮＡウィルスであり、タバコ、トマト等を宿主とす
るタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）及びキュウリ等を
宿主とするキュウリ縁座モザイクウィルス（ＣＧＭＭＶ
）等がこれに属する。
ＴＭＶは、タバコから単離された普通系、トマト、ササ
ゲから単離されたトマト系やササゲ系等の数種類がある
ことが知られている。
ゲから単離されたトマト系やササゲ系等の数種類がある
ことが知られている。
トバモウイルスのゲノムにはウィルス複製に関与してい
る２種類のタンパク、３０にタンパクおよびコートタン
パクの４種類のタンパクがコードされていることが知ら
れており、ＴＭＶについて言えば、ウィルス複製に関与
している１３０にタンパクおよびそのリードスルータン
パクである１８０にタンパク、ウィルスの細胞間移転に
必要な３０にタンパクおよびコートタンパクの４種類の
遺伝子から成り立っていることが知られている。
る２種類のタンパク、３０にタンパクおよびコートタン
パクの４種類のタンパクがコードされていることが知ら
れており、ＴＭＶについて言えば、ウィルス複製に関与
している１３０にタンパクおよびそのリードスルータン
パクである１８０にタンパク、ウィルスの細胞間移転に
必要な３０にタンパクおよびコートタンパクの４種類の
遺伝子から成り立っていることが知られている。
本発明者らは既にトバモウイルスのコートタンパク遺伝
子領域を所望の外来遺伝子で置換した配列のＲＮＡを転
写産物とする転写ベクターを開発し、これにより所望の
外来遺伝子を植物細胞で発現させることができる植物Ｒ
ＮＡベクターの製造に成功している（特願昭６ｌ−１５
８４４３）。
子領域を所望の外来遺伝子で置換した配列のＲＮＡを転
写産物とする転写ベクターを開発し、これにより所望の
外来遺伝子を植物細胞で発現させることができる植物Ｒ
ＮＡベクターの製造に成功している（特願昭６ｌ−１５
８４４３）。
この植物ＲＮＡベクターは、植物細胞に感染させること
により植物細胞の形質転換を行うことができるが、感染
能を有するベクターであり、目的外の他の植物へも感染
する可能性を有しており、実際に使用する場合に問題と
なる可能性を残して、 いる。
により植物細胞の形質転換を行うことができるが、感染
能を有するベクターであり、目的外の他の植物へも感染
する可能性を有しており、実際に使用する場合に問題と
なる可能性を残して、 いる。
〈発明の背景〉
本発明者らは、トバモウイルスＲＮＡを利用した植物Ｒ
ＮＡベクターについて更に研究を進め、トバモウイルス
の３０にタンパクおよびコートタンパクをコードする領
域を所望の外来遺伝子で置換することにより植物細胞間
転移能を持たない植物ＲＮＡベクターを製造することに
成功した。
ＮＡベクターについて更に研究を進め、トバモウイルス
の３０にタンパクおよびコートタンパクをコードする領
域を所望の外来遺伝子で置換することにより植物細胞間
転移能を持たない植物ＲＮＡベクターを製造することに
成功した。
また、この植物ＲＮＡベクターを転写産物とするＲＮＡ
ベクターの製造用転写ベクターの製造に成功し、本発明
を完成した。
ベクターの製造用転写ベクターの製造に成功し、本発明
を完成した。
本発明の植物ＲＮＡベクターは、植物細胞間転移能を有
しないために目的外の植物細胞への感染の恐れがな（、
所望の外来遺伝子を植物細胞に導入し、これを培養し有
用産物を生産する場合や所望の遺伝子を導入した植物細
胞を植物体へ育成し従来にない形質を有する新たな植物
を創製する場合等により安全に使用することができる。
しないために目的外の植物細胞への感染の恐れがな（、
所望の外来遺伝子を植物細胞に導入し、これを培養し有
用産物を生産する場合や所望の遺伝子を導入した植物細
胞を植物体へ育成し従来にない形質を有する新たな植物
を創製する場合等により安全に使用することができる。
〈発明の構成〉
本発明は、トバモウイルスＲＮＡの３０にタンパクおよ
びコートタンパクをコードする領域を所望の外来遺伝子
で置換することにより製造した植物ＲＮＡベクター、ト
バモウイルスＲＮＡの３０にタンパクおよびコートタン
パクをコードする領域が所望の外来遺伝子で置換された
植物ＲＮＡベクターを転写産物とするＲＮＡベクター製
造用転写ベクターおよびこれらの製造法並びに植物細胞
への外来遺伝子の導入方法を提供する。
びコートタンパクをコードする領域を所望の外来遺伝子
で置換することにより製造した植物ＲＮＡベクター、ト
バモウイルスＲＮＡの３０にタンパクおよびコートタン
パクをコードする領域が所望の外来遺伝子で置換された
植物ＲＮＡベクターを転写産物とするＲＮＡベクター製
造用転写ベクターおよびこれらの製造法並びに植物細胞
への外来遺伝子の導入方法を提供する。
〈発明の具体的説明〉
本発明のＲＮＡベクターは、トバモウイルスの３０にタ
ンパクおよびコートタンパク遺伝子領域を所望の外来遺
伝子で置換することにより製造することができる。
ンパクおよびコートタンパク遺伝子領域を所望の外来遺
伝子で置換することにより製造することができる。
このＲＮＡベクターの製造は、以下の工程により実施す
ることができる。
ることができる。
１）ウィルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを合成２）ウィル
スＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの３０にタンパクおよびコー
トタンパクをコードする領域が外来遺伝子で置換された
組換えｃＤＮＡを含みこれに対応する配列のＲＮＡを転
写産物とする転写ベクターを構築 ３）上記の転写ベクターを線状化 ４）線状化された転写ベクターを常法に従ってＲＮＡボ
リメラー、ゼによる転写反応を行い、目的の組換えＲＮ
Ａべ・フタ−を製造する。
スＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの３０にタンパクおよびコー
トタンパクをコードする領域が外来遺伝子で置換された
組換えｃＤＮＡを含みこれに対応する配列のＲＮＡを転
写産物とする転写ベクターを構築 ３）上記の転写ベクターを線状化 ４）線状化された転写ベクターを常法に従ってＲＮＡボ
リメラー、ゼによる転写反応を行い、目的の組換えＲＮ
Ａべ・フタ−を製造する。
この際、ｍ ？ｃ ｐｐｐ ｃの存在下にＲＮＡポリメ
ラーゼにより転写反応を行い、ＲＮＡの５゛末端をキャ
ップ構造でブロックした場合には、植物細胞への組み換
えＲＮＡの感染性が顕著に増大するが、ＲＮＡの５゛末
端をキャップ構造でブロックすることは必須ではない。
ラーゼにより転写反応を行い、ＲＮＡの５゛末端をキャ
ップ構造でブロックした場合には、植物細胞への組み換
えＲＮＡの感染性が顕著に増大するが、ＲＮＡの５゛末
端をキャップ構造でブロックすることは必須ではない。
また、ＲＮＡの３”末端については、３”末端を越え
て多くのヌクレオチドが接続してないことが望ましく、
転写ベクターによるｃＤＮＡからのＲＮＡの転写に際し
、ＲＮＡの３゛末端で正確に転写が終了することが望ま
しい。 この為に、鋳型となるｃＤＮＡ３”末端の直近
に適当な制限酵素（例えば、ＭＩｕＩ）による切断部位
を組み込み、転写の前に、そこでｃＤＮＡを切断するこ
とにより転写を停止させることが望ましい。
て多くのヌクレオチドが接続してないことが望ましく、
転写ベクターによるｃＤＮＡからのＲＮＡの転写に際し
、ＲＮＡの３゛末端で正確に転写が終了することが望ま
しい。 この為に、鋳型となるｃＤＮＡ３”末端の直近
に適当な制限酵素（例えば、ＭＩｕＩ）による切断部位
を組み込み、転写の前に、そこでｃＤＮＡを切断するこ
とにより転写を停止させることが望ましい。
上述の転写ベクターとしては、複製開始領域、選択マー
カー、プロモーターおよび転写開始点の直後に鋳型とな
るＤＮＡの挿入部位および挿入されたＤＮＡのすぐ下流
に制限酵素切断部位を有する公知の転写ベクターを用い
ることができる。
カー、プロモーターおよび転写開始点の直後に鋳型とな
るＤＮＡの挿入部位および挿入されたＤＮＡのすぐ下流
に制限酵素切断部位を有する公知の転写ベクターを用い
ることができる。
例えば、アールキスト（Ａｈｌｑｕｉｓｔ）の開発した
ｐＰＭＩ （公開特許公報 昭和６１年５７７９号）等
の公知の転写ベクターを用いることができる。
ｐＰＭＩ （公開特許公報 昭和６１年５７７９号）等
の公知の転写ベクターを用いることができる。
ｐＰＭｌは、転写が挿入したｃＤＮＡの一番端から開始
し、ＲＮＡの３°末端に相当する部分に制限酵素部位を
有し、この部位で切断し線状化後、転写することにより
ウィルスＲＮＡの３°末端をこえて感染性に影響を与え
る程度の余分なヌクレオチドを接続しないように工夫さ
れた転写用ベクターである。
し、ＲＮＡの３°末端に相当する部分に制限酵素部位を
有し、この部位で切断し線状化後、転写することにより
ウィルスＲＮＡの３°末端をこえて感染性に影響を与え
る程度の余分なヌクレオチドを接続しないように工夫さ
れた転写用ベクターである。
本発明において、ベクターとして使用するトバモウイル
スとしては、トマト系、普通系、ササゲ系等のＴＭＶお
よびＣＧＭＭＶを用いるごとができる。 野生株および
植物に対し病徴を生じない感染性を示す自然変異株ある
いは組み換え技術により変異を生じさせ弱毒化したもの
を用いることが可能である。
スとしては、トマト系、普通系、ササゲ系等のＴＭＶお
よびＣＧＭＭＶを用いるごとができる。 野生株および
植物に対し病徴を生じない感染性を示す自然変異株ある
いは組み換え技術により変異を生じさせ弱毒化したもの
を用いることが可能である。
ウィルスＲＮＡの完全長のｃＤＮＡは、逆転写酵素でＲ
ＮＡを逆転写する公知の方法で容易に作成することがで
きる。 例えば、ＴＭＶ−Ｌ株のゲノムＲＮＡ （１〜
６２１５番目）のｃＤＮＡおよび３゛末端１．６Ｋｂの
ｃＤＮＡ、並びニソノ弱毒株ＴＭＶ−Ｌ、、Ａ株の完全
長ｃＤＮＡをクローニングしたプラスミドｐ ＬＴ−Ｄ
２７、ＰＬ−１−１３およびｐ Ｌ’ｚＡ Ａ ２
５などが公知であり、それぞれ０ｈｎｏ ｅｔ ａｌ、
：Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、９６＋ １９１５−１９２３
（１９８４）、Ｔａｋａｍａｓｔｕ ｅｔ、 ａｌ、
： ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １１．
３７６７−３７７８ （１９８３） 、およびＮｉｓ
ｈｉＮ１５ｈｉ ｅｔ ａｌ、 ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １３＋ ５５８５−５５９０ （
１９８５）に記載の方法で製造できる。
ＮＡを逆転写する公知の方法で容易に作成することがで
きる。 例えば、ＴＭＶ−Ｌ株のゲノムＲＮＡ （１〜
６２１５番目）のｃＤＮＡおよび３゛末端１．６Ｋｂの
ｃＤＮＡ、並びニソノ弱毒株ＴＭＶ−Ｌ、、Ａ株の完全
長ｃＤＮＡをクローニングしたプラスミドｐ ＬＴ−Ｄ
２７、ＰＬ−１−１３およびｐ Ｌ’ｚＡ Ａ ２
５などが公知であり、それぞれ０ｈｎｏ ｅｔ ａｌ、
：Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、９６＋ １９１５−１９２３
（１９８４）、Ｔａｋａｍａｓｔｕ ｅｔ、 ａｌ、
： ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １１．
３７６７−３７７８ （１９８３） 、およびＮｉｓ
ｈｉＮ１５ｈｉ ｅｔ ａｌ、 ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １３＋ ５５８５−５５９０ （
１９８５）に記載の方法で製造できる。
本発明のＲＮＡベクターの製造に鋳型として用いられる
ＤＮＡは、ウィルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの３０にタ
ンパクおよびコートタンパクの遺伝子領域を外来遺伝子
ＤＮＡで置換したＤＮＡを転写ベクターに組み込むこと
により製造されるが、この組換え転写ベクター自体の構
築は、遺伝子組換えで用いられる常法を用いることによ
り行うことができる。
ＤＮＡは、ウィルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡの３０にタ
ンパクおよびコートタンパクの遺伝子領域を外来遺伝子
ＤＮＡで置換したＤＮＡを転写ベクターに組み込むこと
により製造されるが、この組換え転写ベクター自体の構
築は、遺伝子組換えで用いられる常法を用いることによ
り行うことができる。
特に、複製開始領域、選択マーカー、プロモーターおよ
びトバモウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの３０にタンパクお
よびコートタンパク遺伝子領域が除去され、この部分に
外来遺伝子挿入のための制限酵素切断部位が挿入された
配列のトバモウイルスＲＮＡのｃＤＮＡから成り、該プ
ロモーターの転写開始ヌクレオチドが該ｃＤＮＡの最初
のヌクレオチドであるように接続されているユニバーサ
ル転写ベクターを用いることにより容易に行うことがで
きる。 このユニバーサル転写ベクターの外来遺伝子挿
入部位に所望の遺伝子を通常の遺伝子組換え技術を用い
挿入することにより目的とする転写ベクターを構築する
ことができる。
びトバモウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの３０にタンパクお
よびコートタンパク遺伝子領域が除去され、この部分に
外来遺伝子挿入のための制限酵素切断部位が挿入された
配列のトバモウイルスＲＮＡのｃＤＮＡから成り、該プ
ロモーターの転写開始ヌクレオチドが該ｃＤＮＡの最初
のヌクレオチドであるように接続されているユニバーサ
ル転写ベクターを用いることにより容易に行うことがで
きる。 このユニバーサル転写ベクターの外来遺伝子挿
入部位に所望の遺伝子を通常の遺伝子組換え技術を用い
挿入することにより目的とする転写ベクターを構築する
ことができる。
上記のユニバーサル転写ベクターは公知の技術を用いて
製造することができる。
製造することができる。
本発明により植物細胞へ導入される遺伝子としては、特
に限定されるものではないが、例えば、高温や低温に対
する耐性を改善する遺伝子、霜、害虫、病原微生物、ウ
ィルス等に対する耐性を改善する遺伝子、除草剤に対す
る耐性を改善する遺伝子、植物の成長に関与する遺伝子
、窒素固定化に関与する酵素等、光合成に関与する遺伝
子、植物の栄養上の特性や風味に関する遺伝子、有用物
質の遺伝子など種々の遺伝子が挙げられる。
に限定されるものではないが、例えば、高温や低温に対
する耐性を改善する遺伝子、霜、害虫、病原微生物、ウ
ィルス等に対する耐性を改善する遺伝子、除草剤に対す
る耐性を改善する遺伝子、植物の成長に関与する遺伝子
、窒素固定化に関与する酵素等、光合成に関与する遺伝
子、植物の栄養上の特性や風味に関する遺伝子、有用物
質の遺伝子など種々の遺伝子が挙げられる。
植物細胞の形質転換は上述のようにして作成した組換え
ＲＮＡベクターを植物細胞へ感染させることにより行う
ことができる。 植物細胞への感染は、必要に応じ水、
緩衝液等で適当な濃度へ希釈後、あるいはＲＮＡを緩衝
液等で懸濁しカーボランダムと共に植物へ接種すること
により容易に行うことができる。
ＲＮＡベクターを植物細胞へ感染させることにより行う
ことができる。 植物細胞への感染は、必要に応じ水、
緩衝液等で適当な濃度へ希釈後、あるいはＲＮＡを緩衝
液等で懸濁しカーボランダムと共に植物へ接種すること
により容易に行うことができる。
また、本発明の転写ベクターを用いて製造したＲＮＡベ
クターを、例えば、エレクトロボーレーション法等の公
知方法で植物細胞のプロトプラストに導入した後、これ
を培養し目的の形質転換細胞を得ることができる。
クターを、例えば、エレクトロボーレーション法等の公
知方法で植物細胞のプロトプラストに導入した後、これ
を培養し目的の形質転換細胞を得ることができる。
対象となる植物としては、例えば、タバコやトマト等の
トバモウイルスが増殖しうるものであればよく、特に制
限はない。
トバモウイルスが増殖しうるものであればよく、特に制
限はない。
次に実施例により本発明を更に詳細に説明する。
タバコモザイクウィルス−Ｌ株（ＴＭＶ−Ｌ）の完全長
ｃＤＮＡを転写ベクターｐＰＭ１（特開昭６ｌ−５７７
９）に組み込んだ公知のプラスミドｐＬＦＷ３（特願昭
６１−１５８４６１−１５８４４３Ｈａｌ、： Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、Ｖｏｌ、
８３． ｐｐ。
ｃＤＮＡを転写ベクターｐＰＭ１（特開昭６ｌ−５７７
９）に組み込んだ公知のプラスミドｐＬＦＷ３（特願昭
６１−１５８４６１−１５８４４３Ｈａｌ、： Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、Ｖｏｌ、
８３． ｐｐ。
５０４３−５０４７ （１９８６））から７．９Ｋｂの
ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩ断片および０．５４ＫｂのＫｐｎＩ
−３ｓｐｌ断片を調整、一方、ｐＬＦＷ３のコートタン
パクをコードする領域がＣＡＴ遺伝子で置換されたプラ
スミドｐＣＬＢ２９ （特願昭６１−１５８４４３ ；
Ｔａｋａｍａｔｓ ｅｔ ａｌ、： ＥＭＢＯＪ、
Ｖｏｌ、６． ｐｐ、３０７−３１１ （１９８６）
）から１．ＯＫｂのＡａｔＩ−Ｍｌｕｌ断片を調整した
。 上記の３種類の断片を混合しＴ４リガーゼ反応を行
うことにより３０にタンパクおよびコートタンパクをコ
ードする領域がＣＡＴ遺伝子で置換された配列を有する
プラスミドｐＬＤ３０ＫＣＡＴを構築した。
ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩ断片および０．５４ＫｂのＫｐｎＩ
−３ｓｐｌ断片を調整、一方、ｐＬＦＷ３のコートタン
パクをコードする領域がＣＡＴ遺伝子で置換されたプラ
スミドｐＣＬＢ２９ （特願昭６１−１５８４４３ ；
Ｔａｋａｍａｔｓ ｅｔ ａｌ、： ＥＭＢＯＪ、
Ｖｏｌ、６． ｐｐ、３０７−３１１ （１９８６）
）から１．ＯＫｂのＡａｔＩ−Ｍｌｕｌ断片を調整した
。 上記の３種類の断片を混合しＴ４リガーゼ反応を行
うことにより３０にタンパクおよびコートタンパクをコ
ードする領域がＣＡＴ遺伝子で置換された配列を有する
プラスミドｐＬＤ３０ＫＣＡＴを構築した。
三 育 へのＬｌ′／Ｉ−および上記のように製
造した転写ベクターｐＬＤ３０ＫＣＡＴ、ｐＬＦＷ３お
よびｐ ＣＬＢ ２９をそれぞれＭｌｕｌで消化後、大
腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用い公知法 （Ａｈｌｑｕｉ
ｓｔ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８１．７０６６−７０７０ （
１９８４）により転写した。 得られたＲＮＡをフェノ
ール抽出およびエタノール沈澱で精製した。これを公知
のエレクトロポレーション法（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ
ａｌ。
造した転写ベクターｐＬＤ３０ＫＣＡＴ、ｐＬＦＷ３お
よびｐ ＣＬＢ ２９をそれぞれＭｌｕｌで消化後、大
腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用い公知法 （Ａｈｌｑｕｉ
ｓｔ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８１．７０６６−７０７０ （
１９８４）により転写した。 得られたＲＮＡをフェノ
ール抽出およびエタノール沈澱で精製した。これを公知
のエレクトロポレーション法（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ
ａｌ。
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ、 ２１９． ｐ６５−６９
（１９８７））により直接タバコのプロトプラストに導
入した。 プロトプラストを洗浄後、２８°Ｃで２３時
間インキュベートし約１０５セルのプロトプラストをエ
ッペンドルフ管にとり遠心した。 集めたプロトプラス
トを１００μ２の抽出液（２５０ｍＭＴｒ １ｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，５）、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１
％アスコルビン酸、０．５ｍＭロイペプチン、１ｍＭＰ
ＭＳＦ）に懸濁した後−７０°Ｃで凍結させた。
（１９８７））により直接タバコのプロトプラストに導
入した。 プロトプラストを洗浄後、２８°Ｃで２３時
間インキュベートし約１０５セルのプロトプラストをエ
ッペンドルフ管にとり遠心した。 集めたプロトプラス
トを１００μ２の抽出液（２５０ｍＭＴｒ １ｓ−ＨＣ
Ｉ （ｐＨ７，５）、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１
％アスコルビン酸、０．５ｍＭロイペプチン、１ｍＭＰ
ＭＳＦ）に懸濁した後−７０°Ｃで凍結させた。
室温でとかした後、６０°Ｃで１０分間熱処理し、１５
０００ｒｐｍ５分間遠心分離し上清を回収した。 この
上清１０μｌを緩衝液で１００μｌとし５μ！の１０ｍ
ＭアセチルＣｏＡおよび０．０６７μＣｉの１４ｃラベ
ル−クロラムフェニコール（５３ｍＣ１／ｍｍｏ １
；アマジャム）と混合し３７°Ｃで３０分間インキュベ
ートした。 クロラムフェニコールおよびその誘導体を
酢酸エチルで抽出し減圧下に乾固した後、５μｌの酢酸
エチルに懸濁した。この懸濁液をクロロホルム／メタノ
ール（９５：５）を溶媒としシリガゲル薄層クロマトグ
ラフィーにかけ、 クロラムフェニコールおよびそのア
セチル誘導体（ＩＡｃＣｍ：１−アセチルクロラムフェ
ニコール、 ３ＡｃＣｍ：３−アセチルクロラムフェニ
コール、 １．３ＡｃＣｍ：１，３−ジアセチルクロ
ラムフェニコール）をオートラジオグラフィー（室温、
１６時間）により検出した。 結果を第２図に示す。
この図中、レーン１は、ｐＬ、ＦＷ３の転写産物のもの
であり、ＣＡＴを含まないのでクロラムフェニコールの
誘導体は認められない。 レーン２および３は、ｐＣＬ
Ｂ２９およびｐＬＤ３０ＫｃＡＴの転写産物を感染させ
たものであり、ＣＡＴ活性が確認された。３ＡｃＣｍの
生成量は両者でほぼ同じであった。レーン４はｐＬＦＷ
３の転写産物を感染させたプロトプラスト抽出液に０．
０３ ユニットのＣＡＴを添加したものでポジティブ
コントロールである。
０００ｒｐｍ５分間遠心分離し上清を回収した。 この
上清１０μｌを緩衝液で１００μｌとし５μ！の１０ｍ
ＭアセチルＣｏＡおよび０．０６７μＣｉの１４ｃラベ
ル−クロラムフェニコール（５３ｍＣ１／ｍｍｏ １
；アマジャム）と混合し３７°Ｃで３０分間インキュベ
ートした。 クロラムフェニコールおよびその誘導体を
酢酸エチルで抽出し減圧下に乾固した後、５μｌの酢酸
エチルに懸濁した。この懸濁液をクロロホルム／メタノ
ール（９５：５）を溶媒としシリガゲル薄層クロマトグ
ラフィーにかけ、 クロラムフェニコールおよびそのア
セチル誘導体（ＩＡｃＣｍ：１−アセチルクロラムフェ
ニコール、 ３ＡｃＣｍ：３−アセチルクロラムフェニ
コール、 １．３ＡｃＣｍ：１，３−ジアセチルクロ
ラムフェニコール）をオートラジオグラフィー（室温、
１６時間）により検出した。 結果を第２図に示す。
この図中、レーン１は、ｐＬ、ＦＷ３の転写産物のもの
であり、ＣＡＴを含まないのでクロラムフェニコールの
誘導体は認められない。 レーン２および３は、ｐＣＬ
Ｂ２９およびｐＬＤ３０ＫｃＡＴの転写産物を感染させ
たものであり、ＣＡＴ活性が確認された。３ＡｃＣｍの
生成量は両者でほぼ同じであった。レーン４はｐＬＦＷ
３の転写産物を感染させたプロトプラスト抽出液に０．
０３ ユニットのＣＡＴを添加したものでポジティブ
コントロールである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の転写ベクターｐＬＤ３０ＫｃＡＴ構
築の概略を示す図である。 図中Ｐｍは、アールキストの開発したｐＰＭ１由来のλ
ファージのプロモーターを表す。 １３０に／１８０に、３０におよびＣＰは、ＴＭｖの１
３０に／１８０にタンパク遺伝子、３０にタンパク遺伝
子およびコートタンパク遺伝子を表す。 その前後の四
角で囲んだ５および３は、それぞれ５”末端非翻訳領域
および３”末端非翻訳領域を表す。 第２図は、ＣＡＴの発現を確認する実験におけるオート
ラジオグラフィーの結果を示す図である。 第２図
築の概略を示す図である。 図中Ｐｍは、アールキストの開発したｐＰＭ１由来のλ
ファージのプロモーターを表す。 １３０に／１８０に、３０におよびＣＰは、ＴＭｖの１
３０に／１８０にタンパク遺伝子、３０にタンパク遺伝
子およびコートタンパク遺伝子を表す。 その前後の四
角で囲んだ５および３は、それぞれ５”末端非翻訳領域
および３”末端非翻訳領域を表す。 第２図は、ＣＡＴの発現を確認する実験におけるオート
ラジオグラフィーの結果を示す図である。 第２図
Claims (5)
- （１）トバモウイルスＲＮＡのコートタンパクおよび３
０Ｋタンパク遺伝子領域を外来遺伝子で置換することに
より製造した植物ＲＮＡベクター - （２）トバモウイルスＲＮＡのコートタンパクおよび３
０Ｋタンパク遺伝子領域が外来遺伝子で置換された配列
を有するトバモウイルスＲＮＡを転写産物とする転写ベ
クター - （３）コートタンパクおよび３０Ｋタンパク遺伝子領域
が外来遺伝子で置換された配列のトバモウイルスＲＮＡ
のｃＤＮＡ、複製開始領域、選択マーカーおよびプロモ
ーターからなり、該プロモーターの転写開始ヌクレオチ
ドが該ｃＤＮＡの最初のヌクレオチドであるように接続
されている特許請求の範囲第２項記載の転写ベクター - （４）プロモーターがλファージのプロモーターである
ことを特徴とする特許請求の範囲第２あるいは３項記載
の転写ベクター - （５）トバモウイルスＲＮＡのコートタンパクおよび３
０Ｋタンパク遺伝子領域を外来遺伝子で置換することに
より製造した植物ＲＮＡベクターを接種することを特徴
とする植物細胞へ外来遺伝子を組み込む方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28053087A JPH01120290A (ja) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | 植物ウイルスｒｎａベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28053087A JPH01120290A (ja) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | 植物ウイルスｒｎａベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01120290A true JPH01120290A (ja) | 1989-05-12 |
Family
ID=17626381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28053087A Pending JPH01120290A (ja) | 1987-11-05 | 1987-11-05 | 植物ウイルスｒｎａベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01120290A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1070495A2 (en) | 1999-07-22 | 2001-01-24 | Showa Denko Kabushiki Kaisha | Medical container with multiple chambers and method of producing the same |
-
1987
- 1987-11-05 JP JP28053087A patent/JPH01120290A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1070495A2 (en) | 1999-07-22 | 2001-01-24 | Showa Denko Kabushiki Kaisha | Medical container with multiple chambers and method of producing the same |
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