KR0180274B1

KR0180274B1 - 담배 모자이크 바이러스의 복제효소 내에 존재하는 도메인 1 염기 서열을 이용한 바이러스 저항성 식물의 개발

Info

Publication number: KR0180274B1
Application number: KR1019950043992A
Authority: KR
Inventors: 송은경; 고형곤; 김종기; 이세영
Original assignee: 이세영; 송은경
Priority date: 1995-11-27
Filing date: 1995-11-27
Publication date: 1999-04-01
Anticipated expiration: 2015-11-27
Also published as: KR970025376A

Abstract

본 발명은 담배 모자이크 바이러스의 복제 효소 내에 존재하는 도메인 1의 염기서열을 도입하여 바이러스 저항성 식물을 개발하는 방법과, 이 방법에 의해 개발된 바이러스 저항성의 새로운 형질을 갖는 식물이다.

담배 모자이크 바이러스의 전체 유전자를 포함하는 상보적 디엔에이(cDNA)로부터 도메인 1 염기서열을 잘라내어 식물의 발현 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드를 구성한 다음 아그로박테리움 동시 배양법에 의해 도메인 1 염기서열을 식물에 도입하였다.

유전자 분석에 의해 형질전환 식물들에서 도메인 1 염기서열의 도입 및 발현을 확인하였다. 형질전환 식물들에 대하여 바이러스 저항성 정도를 조사한 결과, 도메인 1 염기서열이 도입된 형질 전환 식물은 모두 바이러스에 대하여 완전 저항성을 나타내었으며, 매우 높은 바이러스 접종 농도(1000㎍/㎖)에서와 담배 모자이크 바이러스 알엔에이(TMV RNA, 10㎍/㎖)를 접종한경우에도 저항성이 유지되었다.

형질전환된 담배식물에서 도메인 1 염기서열의 존재는 담배 모자이크 바이러스 감염과 관련된 병증의 체계적인 발전(systemic disease development) 및 바이러스의 증식을 완전히 저해한다.

본 발명이 담배 모자이크 바이러스에 대해서만 확인되었지만 서로 유연 관계가 없는 식물 알엔에이 바이러스들, 즉 오이 모자이크 바이러스, 알팔파 모자이크 바이러스, 포텍스 바이러스, 브로모 바이러스, 포티 바이러스, 라테오 바이러스(lateovirus)등에서도 도메인 1과 유사한 모티프(motif)가 존재하므로, 도메인 1 염기서열을 이용하는 전략은 이들 바이러스에 대한 저항성 식물의 육종에도 공통적으로 적용될 수 있을 것으로 사료된다.

Description

담배 모자이크 바이러스의 복제 효소 내에 존재하는 도메인 1 염기서열을 이용한 바이러스 저항성 식물의 개발

제1도면은 바이러스 저항성 식물 육종시 유전자원으로 사용하기 위하여 본 발명에서 한국형 담배 모자이크 바이러스의 게놈 알엔에이(genomic RNA)로부터 합성한 상보적 디엔에이(cDNA)의 염기서열을 보여준다.

제2도면은 담배 모자이크 바이러스의 126-킬로달톤 단백질의 도메인 1 염기서열을 가지고 있는 재조합 플라스미드(pTMVDIA)를 보여준다.

126-킬로달톤 단백질의 도멘인 1 염기서열은 CaMV 35S 프로모터와 Nos-터미네이트 사이에 존재한다. 보다 자세하게 설명하면 이 그림에서 도메인 1 염기서열이 식물의 발현 벡터인 pBD121의 클로닝 위치인 제한효소 BamHI과 SacI 사이에 위치함을 보여주며, 백터에 표시되어 있는 숫자는 담배 모자이크 바이러스 게놈의 염기서열 번호를 나타낸다.

NPT II 유전자는 가나마이신 저항성을 부여하여 형질 전환된 식물체의 선별에 도움을 준다,

제3도면은 담배 모자이크 바이러스의 126-킬로달톤 단백질의 결손 도메인 1 염기서열을 가지고 있는 재조합 플라스미드(pTMVDIA)를 보여준다.

결손 도메인 1 염기서열은 CaMV 35S 프로모터와 Nos-터미네이트 사이에 존재하며, 백터에 표시되어 있는 숫자는 담배 모자이크 바이러스 게놈의 염기서열 번호를 나타낸다.

그 외에 백터 구성 요소는 제2도면에서 설명한 바와 같다.

제4도면은 폴리머레이즈 연쇄 반응(PCR) 분석에 의해 형질전환 후 재생된 식물체에 유전자가 도입된 것을 보여준다. 도메인 1염기서열(pTMVDIA)이 도입된 경우 2.1킬로 베이스의 증폭된 디엔에이(DNA)절편이 생성되며, 결손 도메인 1염기서열(pTMVDIA)이 도입된 경우 1.3킬로 베이스의 증폭된 디엔에이 절편이 생성된다. 도면에서 보면 재생된 식물체들은 대부분 유전자들이 도입되었음을 알 수 있다.

제5도면은 노던(Northem)분석에 의해 형질전환된 식물에서 도메인 1 염기서열이 발현되는 것을 보여준다. 바이러스 저항성을 보이는 형질전환된 식물 모두에서 도메인 염기서열이 발현되는 것이 확인되었다.

제6도면은 도메인 1 염기서열(pTMVDIA)로 형질전환된 식물이 100㎍/㎖농도의 바이러스 접종에서 저항성을 나타냄을 보여준다. 기호 A와 B는 형질전환 되지 않은 대조구 담배식물들을 보여주며 기호 C와 D는 도메인 1 염기서열로 형질전환된 담배 식물들을 보여준다. 대조구 식물들에서는 바이러스 감염 후 6일 이내에 모두 모자이크 병증이 나타나는 반면, 형질전환 식물들은 감염후 90일이 지난 후 종자를 받을 때까지 병증이 나타나지 않는 완전 저항성을 보여준다.

본 발명은 담배 모자이크 바이러스(TMV)의 복제효소내에 존재하는 도메인 1 염기서열을 식물에 도입하여 바이러스 저항성 식물을 개발하는 방법과 이 방법에 의해 개발된 바이러스 저항성의 새로운 형질을 갖는 식물에 관한 것이다.

바이러스의 감염은 작물의 생산량 및 질을 현저히 떨어뜨린다. 식물이 일단 바이러스에 감염되면 그를 퇴치하기 위한 특별한 농약이 현재로서는 없기 때문에 피해가 더욱 심각하다.

따라서 바이러스에 저항성을 갖는 식물의 육종은 대단히 중요하다. 오래 전부터 농학자들은 식물에 감염하여 심각한 증세를 일으키는 바이러스(발병주; virulent strain)로부터 작물을 보호하기 위해 약한 증세를 유발하는 바이러스(약독주; milf strain)를 인위적으로 접종하여 발병주의 증식을 억제하는 방법(고차 보호; cross protection)을 사용해 왔다. 그러나 교차 보호에 의한 저항성 유도는 약독주가 돌연변이에 의하여 발병주로 변화될 수 있고, 교차 보호를 시키는 바이러스가 한 종류의 식물에서는 약독주로 작용하지만, 다른 종류의 식물에서는 발병주로 작용할 수 있으며, 교차 보호를 시키는 바이러스 자체가 작물의수확량을 감소시킨다는 단점을 갖고 있다.

바이러스 유전자의 일부만 식물에 도입하고, 도입된 유전자에 의해 바이러스의 증식 및 유전자 발현 저해 효과를 유도하면 교차 보호의 이러한 단점은 극복될 수 있다.

식물의 유전자에 바이러스 유전자를 삽입하는 목적은 식물세포 내에서 바이러스 유전자의 일부가 발현됨으로써 바이러스 생활 주기(외피 단백질 벗어짐, 단백질 합성, 게놈 복제 및 세포가 이동 등)의 특정한 단계를 교란하도록 유도하는 것이다.

1986년 Powell등(Science 223; 738, 1986)이 담배 모자이크 바이러스의 외피 단백질(coat proteim)이 도입되어, 그를 발현하는 형질전환 식물이 담배 모자이크 바이러스에 대하여 저항성이 있다는 것을 보고한 후, 바이러스 감염에 대하여 외피 단백질 도입에 의한 저항성 유도가 실시되었다.

현재까지 알팔파 모자이크 바이러스(alfalfa mosaic virus), 토바코 래틀 바이러스(tobacco rattle virus), 포테이토 바이러스 X(potato virus X), 오이 모자이크 바이러스(cucmber mosaic virus), 포티바이러스(potyviruses)등 20여종의 바이러스에 대한 외피 단백질이 식물에 도입되었다. 식물 바이러스에서 외피 단백질이 아닌 다른 염기서열들이 형질전환된 식물들에서 바이러스 감염에 대하여 저항성을 부여하는 지에 대하여도 조사되었다. 알팔파 모자이크 바이러스의 완전한 RNA1의 센서(sense) 염기서열이 도입된 경우 형질전환 식물은 저항성이 없었으며(van Dun 등, Virology 163: 572, 1988) 담배 모자이크 바이러스의 54-킬로달튼(kDa) 단백질을 암호화하는 유전자를 도입한 형질전환 식물체는 상당한 내성을 보였다(Golemboski 등, PNAS 87: 6311, 1990).

담배 모자이크 바이러스 외피 단백질의 안티센스(antisense)염기서열은 형질전환 식물에서 아주 낮은 정도의 저항성을 부여하였으며 (Powell 등, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 86: 6949, 1989)포테이토 바이러스 X의 외피 단백질의 안티센스 염기서열(Hemenway 등, EMBO J. 7: 1273, 1988), 담배 모자이크 바이러스의 54-킬로달톤 또는 126-킬로달톤 단백질의 안티센스 염기서열이 (Golemboski 등, PNAS 87: 6311, 1990) 도입된 경우 형질전환된 대부분의 식물체가 바이러스에 대하여 저항성이 없다.

식물 바이러스의 위상 알엔에이(satellite RNA)의 염기서열로 형질전환된 식물이(예로, 오이 모자이크 바이러스의 위성 알엔에이) 바이러스 감염에 대하여 저항성을 나타내는 것이 보고되었으며(Harrison 등 Nature 328: 799, 1987), 위성 알엔에이의 염기서열을 모체로 한 라이보자임을 이용한 형질전환 식물에 대한 연구보고도 있다(Haseloff 등, Nature 334: 585, 1988). 그러나 바이러스의 리플리케이즈 내에 존재하는 도메인 1염기서열(Domain 1 sequence)로 형질전환된 식물에 대한 연구보고는 아직 없다.

담배 모자이크 바이러스는 포지티브 센스(positive sense)의 단일가닥 알엔에이를 게놈으로 가지며, 담배, 토마토, 고추, 가지 등 30과의 약 200여종의 식물에 감염하는 기주 범위가 매우 넓은 바이러스로서 농작물의 수확량을 크게 감소시킨다.

담배 모자이크 바이러스는 적어도 3개의 비구조 단백질(126-킬로달톤, 183-킬로달톤 및 30-킬로달톤)과 외피 단백질을 암호화한다. 126-킬로달톤과 183-킬로달톤 단백질은 담배 모자이크 바이러스 유전자의 복제 및 증식에 관여한다. 담배 모자이크 바이러스 알엔에이의 5'-말단에 존재하는 유전자로부터 암호화되는 126-킬로달톤과 183-킬로달톤 단백질은 동일한 N-말단을 가지며, 아미노산 서열이 중복되는 데, 183-킬로달톤 단백질은 126-킬로달톤 단백질 합성이 끝나는 엠버(amber) 종료 코돈에서 끝나지 않고, 서프레서(suppressor)에 의해 계속 읽힘으로써 합성된다.

담배 모자이크 바이러스의 복제에는 126-킬론달톤과 183-킬로달톤 단백질 모두가 필요하며, 이들 중에서 어느 하나만으로는 복제가 일어나지 않는다 (Beier 등, EMBO J. 3: 341, 1984). 30-킬로달톤 단백질은 바이러스 유전자의 세포간 이동에 관여한다(Demo 등, Science 237: 389, 1987). 이와 같이 담배 모자이크 바이러스 게놈의 편성은 아주 잘 알려져 있으나, 게놈과 아게놈(subgenomic) 알엔에이의 합성에 관련된 복제 효소의 정확한 성질은 아직까지 완전히 밝혀지지 않았다. 복제 효소 중의 하나인 126-킬로달톤 단백질은 도메인 1과 도메인 2로 구성된다(Ahlquist 등, J. Virol. 53: 536, 1985; 도면 2).

도메인 1은 마이너스-센스(minus-sense) 알엔에이를 합성시 초기에 관여하고, 도메인 2는 아게놈 알엔에이 합성에 관여하는 것으로 추측되며 이들이 기능을 나타내기 위해서는 기주 식물의 단백질을 요구하는 것으로 알려져 있다(Dawson과 Letho, Adv. in Virus Research 38: 307, 1990).

본 발명가들은 바이러스 게놈의 복제 효소 중의 하나인 126-킬로달톤 단백질 내에 존재하는 도메인 1 염기서열로 형질 전환된 식물이 바이러스 감염에 대하여 저항성이 있다는 것을 밝힌다.

본 발명에서 이용된 도메인 1 염기서열에 의한 바이러스에 대한 저항성 부여는 아직까지 국내, 외에서 보고된 바 없으므로, 도메인 1 염기서열은 바이러스 저항성 부여능이 있는 새로운 형태의 염기서열이다.

본 발명에서 사용한 식물 바이러스는 국내에서 자생하는 담배 모자이크 바이러스로서 한국형 담배 모자이크 바이러스로 명명된 것이다.

바이러스 저항성 작물을 육종하기 위해 본 발명에서는 한국형 담배 모자이크 바이러스의 전체 유전자에 대한 상보적 디엔에이(cDNA) 합성 및 합성된 상보적 디엔에이에 대한 염기서열을 결정하였으며, 알엔에이 프로모터(T7 프로모터)아래에 한국형 담배 모자이크 바이러스의 전체 유전자를 클로닝한 다음 알엔에이 중합효소에 의해 한국형 담배 모자이크 바이러스의 상보적 디엔에이에 대한 전사체를 합성하여 시험관내에서 합성된 전사체의 감염력을 검정하였다.

본 발명가들은 바이러스 저항성 작물을 육종하기 위하여 담배 모자이크 바이러스의 복제 효소(126-킬로달톤 단백질)유전자를 식물에 도입하였다.

126-킬로달톤 유전자를 도입할 때 이 단백질의 N-말단을 암호화하는 도메인 1 염기서열을 사용하였다. 그 이유는 담배 모자이크 바이러스의 완전한 126-킬로달톤 단백질 유전자가 식물에서 발현될 경우, 병증 발달에 있어서 상승 효과를 일으킬 가능성이 있으며, 실제로 Golemboski 등은(PNAS 87: 6311, 1990) 126-킬로달톤 단백질의 완전한 유전자를 도입하여 바이러스 내성을 조사한 결과 대조구 담배와 거의 같은 정도로 민감하다고 보고한 바 있다. 126-킬로달톤 단백질의 유전자는 3.4 킬로 베이스의 크기를 가지는 데, 이를 2가지 크기로 만들어 식물의 발현 백터에 구성하였다.

하나는 완전한 도메인 1 염기서열을 포함하며 (pTMVDIA: 1-2149)이며, 다른 하나는 도메인 1 염기서열의 4/5 정도만 포함한다(pTMVD1Bl1-1343). 형질전환 식물에 대하여 바이러스 저항성 정도를 조사한 결과, 결손 도메인 1 염기서열 (pTMVD1B)이 도입된 형질전환 식물은 바이러스 저항성이 낮은 반면, 완전한 도메인 1 염기서열(pTMVD1A)이 도입된 형질 전환 식물은 바이러스에 대하여 모두 저항성을 나타내었으며, 매우 높은 바이러스 접종 농도(1000㎍/㎖)에서와 담배 모자이크 바이러스 알엔에이(10㎍/㎖)를 접종한 경우에도 그 저항성은 유지되었다.

따라서 본 발명의 특지은 126-킬로달톤 단백질내에 존재하는 도메인 1 염기서열을 도입함에 의하여 담배 모자이크 바이러스에 대하여 완전 저항성을 나타내는 식물을 창출하는데 성공한 것이다. 담배 식물에서 이 염기서열의 존재는 담배 모자이크 바이러스 감염과 관련된 병증의 체계적인 발전(systemic disease development) 및 바이러스의 증식을 완전히 저해한다.

[실시예 1]

식물과 바이러스의 배양 및 계대

한국형 담배 모자이크 바이러스는 이 바이러스가 감염된 니토티아나 타바쿰 잔티(N. tabacum cv. Xanthi)로부터 분리했다. 바이러스 알엔에이는 페놀 추출과 에틸 알콜 침전에 의해 분리되었다. 니코티아나 타바쿰 잔티(cv. Xanthi) 및 니코티아나 타바쿰 잔티 엔씨(cv. Xanthi nc)는 국부적인 고사현상을 관찰하는 식물로 사용되었다.

담배 모자이크 바이러스는 23-25℃에서 가장 증식이 잘되므로 식물들은 24℃의 배양실에서 14시간의 명주기하에서 배양하였다.

[실시예 2]

한국형 담배 모자이크 바이러스 전체 유전자에 대한 상보적 디엔에이(cDNA) 합성

본 발명에서는 바이러스에 저항성을 갖는 식물을 육종하기 위하여 국내에서 자생하는 한국형 담배 모자이크 바이러스대한 알엔에이를 분리하여 이로부터 한국형 담배 모자이크 바이러스의 전체 유전자에 대한 상보적 디엔에이를 합성하고 그의 염기서열을 결정하였다(Koh등, Nucleic Aids Research 20: 5474, 1992; 도면 1). 한국형 담배 모자이크 바이러스 염기서열을 조사해 본 결과 미국형 담배 모자이크 바이러스(TMV-vulgare)와 41개의 염기만이 상이하여 99%의 염기서열 상동성을 보여주며, 또한 상보적 디엔에이는 6395개의 염기를 갖고 있어 미국형 담배 모자이크 바이러스와는 유전자 크기로 동일하다.

[실시예 3]

한국형 담배 모자이크 바이러스의 상보적 디엔에이를 주형으로 하여 합성된 전사체의 감염능 검정

실시예 2에서 합성된 상보적 디엔에이가 생물학적 활성을 갖는 지를 조사하기 위해서 한국형 담배 모자이크 바이러스의 전체 유전자를 포함하는 상보적 디엔에이를 주형으로 하여 시험관 내에서 알엔에이 중합효소(polymerase)에 의해 전사체를 합성하여, 이 전사체를 식물에 접종하여 감염능을 조사하였다.

전사체를 만들기 위해 T7 프로모터 다음에 담배 모자이크 바이러스 알엔에이의 전체 염기서열을 포함하는 상보적 디엔에이를 구성하였다(pTMV 6.4B). pTMV 6.4B는 T7 프로모터와 담배 모자이크 바이러스의 첫 번째 염기(G)사이에 단지 3개의 담배 모자이크 바이러스의 염기가 아닌 벡터 유래의 염기가 존재하며, 상보적 디엔에이 다음에는 PstI 제한 효소의 단일 절단 부위가 존재한다.

시험관 내에서 T7 알엔에이 중합효소에 의해 합성된 전사체의 감염력을 확인하기 위하여 국부적 고사 기주인 니코티아나 타바쿰 잔티 엔씨(cv. Xanthi nc)와 체계적 병증발달 기주인 니코티아나 타바쿰 잔티(cv. Xanthi)에 전사체를 인위적으로 감염시켰다.

그 결과 감염 2일 후부터 전사체가 감염된 잎에 전형적인 국부적 고사 현상이 나타났으며, 또한, 전사체를 잔티(cv. Xanthi)에 감염시킨 2주 후에 감염잎의 상엽을 취하여, 단백질을 추출한 다음 담배 모자이크 바이러스 외피 단백질에 대한 항체를사용하여 이뮤노블롯팅(immunoblotting)을 수행한 결과, 전사체가 감염된 잔티(cv. Xanthi)에서 담배 모자이크 바이러스의 외피 단백질이 검출되었다. 이러한 결과로부터 시험관 내에서 합성된 전사체가 감염력이 있음을 확인하였으며, 이로써 상보적 디엔에이는 바이러스 유전자 서열을 제대로 갖추고 있는 생물학적 활성이 있는 물질이며, 또한 담배 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 갖는 작물을 육종하는데 있어서 유전자 자원으로 이용될 수 있음이 확인되었다.

[실시예 4]

126-킬로달톤 단백질의 도메인 1 염기서열의 클로닝

도메인 1 염기서열을 식물 발현 벡터에 구성하기 위하여 담배 모자이크 바이러스의 전체 유전자를 포함하는 상보적 디엔에이를 갖고 있는 플라스미드는 제한효소 KpnI로 절단한 뒤 T4 디엔에이 중합효소에 의해 3'-말단에 튀어나온 염기를 제거하고 다시 제한효소 SacI으로 절단하여 2.1킬로 베이스의 디엔에이 절편을 분리한 다음 미리 제한효소 SmaI과 SacI로 절단한 pT7T318U 벡터에 연결하여 pT18D1A라는 재조합 플라스미드를 얻었다. pT18D1A는 담배 모자이크 바이러스 서열 중 1-2149 까지를 포함한다. pT18D1A를 다시 제한효소 BamHI과 SacI으로 절단한 후 2.1킬로 베이스의 디엔에이 절편을 분리하여 식물의 발현 벡터인 pBD121에 연결하여 pT18D1A를 얻었다(도면 2). pT18D1A는 도메인 1 염기서열을 완전히 포함한다. pBD121는 CaMV 35S 이중 푸로모터와 NOs 터미네이터 사이에 BamHI, SacI의 제한효소 단일 절단 부위를 가진다. CaMV 35S 프로모터와 도메인 1 염기서열의 방향성은 제한 효소로 절단하여 확인하였다.

결손 도메인 1 염기서열을 식물 발현 벡터에 구성하기 위하여 pT18D1A를 제한효소 ClaI으로 절단한 뒤 T4 디엔에이 중합효소를 처리한 다음 제한효소 BamHI으로 절단하여 1.3 킬로 베이스의 디엔에이 절편을 분리한 다음 SacI, T4 디엔에이 중합효소 BamHI 처리된 pBD121에 연결하여 pTMVD1B를 얻었다(도면 3). pTMVD1B는 도메인 1 염기서열의 4/5 가량을 포함한다. CaMV 35S 프로모터와 결손 도메인 1 염기서열의 방향성은 제한 효소로 절단하여 확인하였다. 이렇게 대장균에서 구성된 재조합 플라스미드 pTMVD1A와 pTMVD1B는 아그로박테리움 투메파시엔스 (A. tumerfaciemce) LBA 4404에 도입되었다. 형질전환된 아그로박테리움은 가나마이신 저항성을 이용하여 선별하였다.

[실시예 5]

식물 형질전환

니코티아나 타바쿰 잔티(cv. Xanthi)와 엔씨 82(cv. NC 82)를 무균적으로 배양한 후, 잎을 잘게 자른 다음 담배 모자이크 바이러스의 도메인 1 염기서열을 갖고 있는 플라스미드 벡터들이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404와 동시 배양하는 방법에 의하여 식물의 형질전환을 시도하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스가 갖고 있는 티아이(Ti) 플라스미드는 식물의 발현 벡터의 경계 염기서열(border sequence)내에 존재하는 디엔에이를 식물에 전달(transfer)함으로써 외부 유전자가 식물에 형질전환도리 수 있도록 한다. 200㎍/㎖의 가나마이신을 첨가한 배지에서 성장한 새순을 잘라 내어 가나마이신이 100㎍/㎖ 첨가되었으며, 호르몬이 제거된 배지에 옮겨 배양함으로써 뿌리를 형성하도록 유도하였다. 뿌리가 형성되면 기내에서 2주일 동안 더 배양한 다음 화분에 이식한 후 경화 과정을 거쳐 완전한 식물체로 재생시켰다.

[실시예 6]

유전자 도입 및 발현 분석

유전자 도입 분석은 도메인 1 염기서열은 또는 결손 도메인 1 염기서열로 형질전환된 식물들 모두에 대하여 실시하였으며, 유전자 발현 분석은 1차 바이러스 저항성 조사(1㎍/㎖의 바이러스 접종)에서 모두 바이러스 저항성을 보이는 도메인 1 염기서열로 형질전환된 식물들에 대해서만 실시했다. Gawel등(Plant Molecular Biology Reporter 9: 461, 1991)의 방법에 따라 형질전환된 식물체로부터 게놈 디엔에에를 분리하였으며, 게놈 디엔에이와 도메인 1 염기서열에 특이적인 프라이머(primer) 존재 하에서 앰플리 택 디엔에이 중합효소(Ampli Taq. DNA polymerase)에 의해 폴리머레이즈 연쇄 반응(PCR)을 수행함으로써 형질전환 식물에 유전자가 도입되었는지의 여부를 확인하였다. 도메인 1 염기서열이 도입된 경우 1.3킬로 베이스의 증폭된 디엔에이 절편이 형성되며, 결손 도메인 1 염기서열이 도입된 경우 1.3킬로 베이스의 증폭된 디엔에이 절편이 형성된다. 도면 4에서 보면 가나마이신 선택 배지에서 재생된 식물체들은 대부분 유전자들이 도입되었음을 알 수 있다. 잎 조직으로부터 알엔에이의 분리는 Chomzynski의 방법을 변형하여 수행하였다(Analytical Biochem 162: 156, 1987).

전체 알엔에이를 포름알데히드(formaldehyde)를 포함하는 1.2% 아가로스 겔에서 전개한 후 나일론막으로 알엔에이를 이동시킨 다음 도메인 1 염기서열에 특이적이며,³²P 동위원소로 표지된 디엔에이 프로브(DNA probe)를 사용하여 하이브리디제이션(hybridzation)하였다. 그 결과 대부분의 형질전환된 식물에서 도입된 염기서열이 발현되는 것이 확인되었다. 전체 알엔에이에서 2.1킬로 베이스로 예상되는 메신저 알엔에이가 각각의 형질전환 식물체에서 확인되었으며, 형질 전환되지 않은 식물체에서 추출한 전체 알엔에이에서는 125-킬로달톤 탐침 프로브와 하이브리디제이션 하는 어떠한 조짐(signal)도 발견되지 않았다(도면 5).

[실시예 7]

형질전환 식물의 바이러스 내성 조사

도메인 1 염기서열(pTMVD1A)이 도입된 식물체를 유전자가 안정하게 게놈상에 존재하는가를 확인하기 위하여 2번에 걸쳐 뿌리를 잘라 버린 상층부를 가나마이신이 함유된 새 선택배지에 옮겨 배양하였을 때 여전히 가나마이신 저항성을 나타내는 식물체(T2) 17주에 대하여 1㎍/㎖의 담배 모자이크 바이러스를 감염시켜서, 바이러스 저항성 정도를 조사한 결과 형질전환된 식물 전부가 바이러스에 대하여 내성을 나타내었다. 도메인 1의 결손 염기서열(pTMVD1b)이 도입된 식물(t2) 15주에 대하여 1㎎/㎖의 농도로 담배 모자이크 바이러스를 감염시켜서 바이러스 저항성을 실시한 결과, 15주중 3주만이 저항성을 나타내며 나머지는 담배 모자이크 바이러스에 대하여 민감하였다.

바이러스는 50mM 인산염 완충용액(pH 7.4)에 현탁되어 있는 것을 사용하였으며, 잎 표면에 상처를 주기 위해 현탁액에 5㎍/㎖의 농도로 셀라이트(celite)를 첨가하였다. 도메인 1 염기서열(pTMVD1A)이 도입된 T2 형질전호나 식물이 1㎍/㎖의 담배 모자이크 바이러스 농도에 대하여 저항성을 보이므로 T3 형질전환 식물체에 대하여 100㎍/㎖, T4 형질 전환 식물체에 대하여 1000㎍/㎖의 담배 모자이크 바이러스를, 감염시켰다. 그 결과 감염 후 6일 이내에 대조구 담배는 전형적인 담배 모자이크 바이러스의 모자이크 병증을 나타내는 반면 대부분의 형질전환 식물체는 전혀 병증이 나타나지 않았다(도면 6). T5 식물체에 대하여는 10㎍/㎖의 농도로 담배 모자이크 바이러스 알엔에이를 접종하였다. 담배 모자이크 바이러스 알엔에이는 50mM 트리스-이디티에이 완충 용액(Tris-EDTA, pH 8.0) 현탁되어있는 것을 사용하였으며, 역시 잎표면에 상처를 주기 위해 현탁액에 5㎍/㎖의 농도로 셀라이트가 첨가되었다. 그 결과 감염 후 6일이내에 대조구 담배는 전형적인 담배 모자이크 바이러스의 모자이크 병증을 나타내는 반면 대부분의 형질전환 식물체는 전혀 병증이 나타나지 않았다. 이러한 저항성을 보이는 식물의 상엽을 마쇄한 후 그 즙액을 국부적 고사를 나타내는 기주인 잔티 엔시(cv. Xanthi nc)에 접종하여 바이러스가 실제로 존재하지 않는가를 확인하여 보았다. 그 결과 전혀 국부적인 고사 현상이 나타나지 않았으며, 이것은 저항성 식물에서 바이러스가 존재하지 않음을 의미한다. 또한 저항성을 보이는 식물의 상엽을 취하여 이뮤노 블롯팅(immunoblotting)과, 노던 블롯팅(Northern blotting)을 수행한 결과 외피 단백질 및 바이러스의 알엔에이가 발견되지 않았으며 이는 이 식물체가 바이러스 감염 초기에 바이러스의 증식이 일어나지 못하도록 하여 완전한 저항성을 보이는 것을 의미한다.

도메인 1 염기서열에 의한 저항성의 특성은 완전 저항성(complete resistance)부여로서, 바이러스 저항성 작물의 육종에 이용되었던 바이러스의 외피 단백질 유전자는 이 유전자가 도입된 형질전환 식물 모두에게 완전한 바이러스 저항성을 부여하지 못하는 반면에 도메인 1 염기서열은 이 염기서열이 도입된 모든 형질전환 식물에게 바이러스 저항성을 부여하며, 형질전환 담배는 담배 모자이크 바이러스의 농도를 1000㎍/㎖ 농도로 높여 접종한 결과에서도 저항성을 나타내며(문헌에 보고된 담배 모자이크 바이러스의 접종 최고 농도는 외피 단백질의 경우 0.4㎍/㎖이며, 54-킬로달톤 단백질의 경우는 500㎍/㎖임), 또한 바이러스 알엔에이를 접종한 경우에도 저항성을 나타냄을 보여준다. 도메인 1 염기서열을 농가 주 재배 품종인 니코티아나 타바쿰 엔씨 82(cv. NC82)에 도입하여 형질 전환된 식물체에 대하여 100㎍/㎖의 담배 모자이크 바이러스를 접종하여 바이러스 저항성 실험을 실시하였으며, 그 결과에서도 마찬가지로 형질전환 식물체는 완전한 내성을 저항성이 후대에도 전달되는 가를 확인하기 위해 형질전환 식물체를 자가수정하여 종자를 받은 후 종자를 발아시켜 담배 모자이크 바이러스를 접종한 결과 후대 식물에서도 바이러스 저항성이 있음은 확인되었다.

Claims

유전자 조작법에 의해 담배 모자이크 바이러스의 126-킬로달톤 단백질 내에 존재하는 도메인 1 염기서열을 사용하여 식물이 담배 모자이크 바이러스에 대하여 저항성을 획득하는 방법.
제1항에서 사용된 도메인 1 염기서열이 하기와 같은 경우이며, 이 도메인 1의 전체 혹은 부분을 포함하는 염기서열, 즉 TMV 게놈의 1번 뉴틀레오티드부터 2149번 뉴클레오티드까지 전체 혹은 부분을 포함하는 염기서열

(숫자는 TMV 게놈의 염기서열의 위치를 나타냄)
제2항의 유전자에 의해 암호화되는 하기 아미노산 서열의 전체 혹은 부분을 갖는 단백질.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pTMVD1A와 pTMVD1B