DE69332763T2 - Virale amplifikation rekombinanter boten-rna in transgenen pflanzen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der gentechnischen Herstellung transgener Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung viraler RNA zum Erreichen einer starken Expression fremder Gene in Pflanzen.
  • Die Verwendung von transgenen Pflanzen für die starke Expression von Fremdgenen ist als kostengünstiges Mittel für die Massenproduktion der gewünschten Produkte anvisiert worden. Alle höheren Pflanzen sind photoautotroph und benötigen zum Wachsen nur CO2, H2O, NO3 - 1, SO4 - 2, PO4 -3 und Spurenmengen anderer Elemente. Von diesen kostengünstigen Ausgangsmaterialien ausgehend können Pflanzen eine Vielzahl wertvoller Produkte synthetisieren. Ein Fortschritt bei der Benutzung transgener Pflanzen als kostengünstige Fabriken hängt sowohl von der Charakterisierung biosynthetischer Wege als auch der Weiterentwicklung von Genexpressionstechnologien ab.
  • In den letzten 10 Jahren ist eine Anzahl von Techniken entwickelt worden, um Gene in Pflanzen zu transferieren (Potrykus, I., Annual Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205–225 (1991)). Zum Beispiel sind chromosomal integrierte Transgene durch eine Reihe von Promotoren, die die Entwicklungkontrolle der Genexpression anbieten, exprimiert worden. (Walden und Schell, Eur. J. Biochem. 192: 563–76 (1990)). Diese Technologie ist vorwiegend dazu verwendet worden, bestimmte agronomische Eigenschaften, wie beispielsweise die Resistenz gegenüber Krankheiten oder die Nahrungsmittelqualität, zu verbessern. (Joshi und Joshi, Febs. Lett. 281: 1–8 (1991)). Allerdings wird der Nutzen der bekannten Transgenmethodik eingeschränkt durch 1) die Schwierigkeit, eine starke Expression einzelner Transgene zu erhalten, 2) das Fehlen von Mitteln, die zum Koordinieren der Kontrolle mehrerer Transgene in einer einzelnen Pflanze notwendig sind, 3) das Fehlen von Mitteln zum Ermöglichen der genauen zeitlichen Kontrolle der Genexpression und 9) das Fehlen angemessener Mittel zum Ermöglichen des Abschneidens eingeführter Gene im nicht induzierten Zustand (Wallen und Schell, Eur. J. Biochem. 192: 573–576 (1990)).
  • Die am stärksten exprimierten Gene in Pflanzen sind in Pflanzen-RNA-Virusgenomen kodiert. Viele RNA-Viren besitzen Genexpressionsgrade oder Wirtsbereiche, die sie für die Entwicklung als kommerzielle Vektoren nützlich machen (Ahlquist, P., und Pacha, R. F., Physiol. Plant. 79: 163–167 (1990), Joshi, R. L., und Joshi, V., FEBS Lett. 281: 1–8 (1991), Turpen, T. H., und Dawson, W. O., Amplification, movement and expression of genes in plants by viral-based vectors, Transgenic plants: fundamentals and applications (A. Hiatt, Hrsg.), Marcel Dekker, Inc., New York, Seite 195–217, (1992)). Zum Beispiel sammelt Tabak (Nicotiana tabacum) 7 bis 14 Tage nach der Inokulation ungefähr 10 mg Tabakmosaik-Tobamovirus (TMV) pro Gramm Gewebe (Frischgewicht) an. Die TMV-Hüllproteinsynthese kann 70% der gesamten Zellproteinsynthese darstellen und kann 10% des gesamten Blatt-Trockengewichts ausmachen. Ein einzelnes spezielles RNA-Transkript kann bis zu 10% der gesamten Blatt-mRNA ansammeln. Dieser Transkriptanteil ist mehr als zwei Größenordnungen größer als der Transkriptionsanteil, der bei chromo somal integrierten Genen unter Verwendung von herkömmlicher Gentechnologie für Pflanzen beobachtet wurde. Dieser Anteil an Fremdgenexpression ist unter Verwendung der bekannten viralen Vektoren in Pflanzen noch nicht erhalten worden.
  • Die meisten Pflanzenviren enthalten Genome von Plus-Sinn-RNA (Boten-RNA-Polarität) (Zaitlin und Hull, Ann. Rev. Plant Physiol. 38: 291–315 (1987)). Plus-Sinn-Pflanzenviren sind eine sehr vielseitige Klasse von Viren, die sich als Genexpressionsvektoren entwickeln, da es eine große Anzahl von Stämmen von ungefähr 22 Plus-Sinn-Virusgruppen gibt, die mit einer großen Anzahl von Wirtspflanzenarten kompatibel sind. (Martelli, G. P., Plant Disease 76 : 436 (1992)). Darüber hinaus wird eine entwicklungsmäßig verwandte RNA-abhängige RNA-Polymerase durch jeden dieser Stämme kodiert. Dieses Enzym ist verantwortlich für die Genomreplikation und mRNA-Synthese, die zu einigen der stärksten, bei Pflanzen bekannten Genexpressionen führt.
  • Um einen Pflanzenvirus als Genvektor zu entwickeln, muss man in der Lage sein, molekulare Klone viraler Genome zu manipulieren und die Fähigkeit zu erhalten, infektiöse Rekombinante zu erzeugen. Diese Techniken, die erforderlich sind, um gentechnisch RNA-Viren herzustellen, haben sich schnell weiterentwickelt. Wenn das Virus ein RNA-Virus ist, dann wird das Virus im Allgemeinen als cDNA kloniert und in ein Plasmid eingesetzt. Das Plasmid wird dazu verwendet, alle Konstruktionen herzustellen. Das Genom von vielen Plus-Sinn-RNA-Viren kann als Plasmid-DNA-Kopien manipuliert und dann in vitro transkribiert werden, um infektiöse RNA-Moleküle zu erzeugen (besprochen in Turpen und Dawson, Transgenic Plants, Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, New York, Seite 195–217 (1992)).
  • Die Wechselwirkung zwischen Pflanzen und Viren bietet einzigartige Möglichkeiten für die Herstellung von komplexen Molekülen, wie sie durch das TMV/Tabak-System dargestellt werden (Dawson, W. O., Virology 186: 359–367 (1992)). Äußerst große Mengen an viralen Nukleinsäuren und/oder Proteinen sammeln sich in einem kurzen Zeitraum in infizierten Zellen an. Der Virus katalysiert die schnelle Bewegung von Zelle zu Zelle seines Genoms durch die ganze Pflanze hindurch, und zwar ohne wesentlichen Gewebetropismus. Die Infektion wird über das gesamte Pflanzenleben hinweg aufrechterhalten. Die Pflanzen sind durch die Virusinfektion nicht wesentlich nachteilig beeinflusst, da der Virus wenig oder keine generelle Zytotoxizität oder spezifische Unterdrückung der Wirtsgenexpression hervorruft.
  • Das Tabakmosaik-Tobamovirus ist für die vorliegende Erfindung im Hinblick auf seine Fähigkeit, Gene in Pflanzen in großen Mengen zu exprimieren, von besonderem Interesse. TMV ist ein Mitglied der Tobamovirus-Gruppe. TMV-Virionen sind 300 nm × 18 nm Röhren mit einem Hohlkanal von 4 nm Durchmesser und bestehen aus 2140 Einheiten eines einzelnen Strukturproteins, das spiralförmig um ein einzelnes RNA-Molekül gewickelt ist. Das Genom ist eine Plus-Sinn-RNA mit 6395 Basen. Das 5'-Ende enthält eine cap-Gruppe, und das 3'-Ende enthält eine Reihe von Pseudoknoten und eine tRNAförmige Struktur, die insbesondere Histidin akzeptiert. Die genomische RNA fungiert als mRNA für die Herstellung von Proteinen, die an der viralen Replikation beteiligt sind: ein Protein von 126 kDA, das 68 Nukleotide vom 5'-Terminus beginnt, und ein Protein von 183 kDa, synthetisiert durch Durchlesen eines Amber-Terminatorkodons ungefähr 10% der Zeit (1). Nur die Virusproteine von 183 kDa und 126 kDa sind für die TMV-Replikation in trans erforderlich. (Ogawa, T., Watanabe, Y., Meshi, T. und Okada, Y., Virology 185: 580- 584 (1991)). Zusätzliche Proteine werden von mRNA subgenomischer Größe, die während der Replikation erzeugt wird, translatiert (besprochen in Dawson, W. O., Adv. Virus Res. 38: 307–342 (1990)). Das 30-kDa-Protein ist für die Zell-Zell-Bewegung erforderlich; das 17,5-kDa-Kapsidprotein ist das einzige Virusstrukturprotein. Die Funktion des vorhergesagten 54-kDa-Proteins ist unbekannt.
  • Die minimalen Sequenzen, die in cis für die TMV-Replikation erforderlich sind, befinden sich an den äußeren, nicht kodierenden 5'- und 3'-Bereichen (Replikationsursprünge), wie durch die Analyse von Deletionsmutanten in Pflanzenprotoplasten bestimmt (Takamatsu, N. u. a., J. Virol. 64: 3686–3693 (1990), Takamatsu, N. u. a., J. Virol. 65: 1619-1622 (1991)). In ganzen Pflanzen werden helferabhängige RNA-Replikons, die durch Deletion des meisten Teils der 126/183-kDa-Replikationsproteinssequenz und des meisten Teils der 30-kDa-Bewegungsproteinsequenz konstruiert sind, repliziert und in Anwesenheit von Wildtyp-TMV systemisch verbreitet (Raffo, A. J. und Dawson, W. O., Virology 184: 277–289 (1991)).
  • Turpen u. a. offenbart ein einfaches und zuverlässiges Gentransferverfahren, bei dem cDNA von TMV für die Expression in Pflanzenzellen zu A. tumefaciens umgebaut wurde (Turpen, T. H., Dissertation, Universität Kalifornien, Riverside, Seite 88–105 (1992)). Dieses Verfahren stellt eine Alternative zu der Verwendung von synthetischen infektiösen Transkripten zum Inokulieren von Pflanzen auf der Grundlage der Wirtstranskription viraler cDNA in vivo zur Verfügung. Turpen zeigte die erfolgreiche Transfektion von Tabak (N. tabacum cv. Xanthi und Xanthi/nc) mit den Wildtyp- und defekten Virusgenomen unter Verwendung dieses Verfahrens.
  • Die Transfektion tritt auch spontan in transgenen Linien auf, die defekte oder Wildtyp-cDNA von chromosomal integrierter TMV enthalten (Turpen, T. H., Dissertation, Universität Kalifornien, Riverside, Seite 106–132 (1992), Yamaya, J. u. a., Mol. Gen. Genet. 211: 520–525 (1988)). Daher kann die Virusreplikation, wenn sie einmal chromosomal integriert ist, von dem Verfahren der Wirtszelltranskription abgeleitet werden.
  • Pflanzenvirusinfektionen werden durch mechanische Zerstörung der Pflanzenzellwand eingeleitet. Nach der Replikation in den zuvor verletzten Zellen verteilen sich Virennachkommen über kurze Strecken (Zell-Zell-Bewegung), bevor sie für eine Bewegung über längere Strecken in vaskuläres Gewebe eindringen. Untersuchungen mit chimären Tobamoviren zeigen, dass das Hüllprotein für eine wirksame Bewegung über eine längere Strecke notwendig ist. Allerdings bewegt sich ein Virus, bei dem das Hüllprotein deletiert oder inaktiviert wurde, über kurze Strecken wie das Wildtyp-Virus (Dawson W. O. und Hilf, M. E., Ann. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 43: 527–555 (1992)).
  • Im Fall von TMV ist das funktionelle 30-kDA-Bewegungsprotein für die Bewegung von Zelle zu Zelle in ganzen Pflanzen absolut notwendig, kann aber deletiert oder inaktiviert werden, ohne dass die Replikation in Protoplasten oder inokulierten Blättern beeinflusst wird (besprochen in Citovsky, V., Zambryski, P., BioEssays 13: 373–379 (1991) und Deom, C. M., Lapidot, M. und Beachy, R. N., Cell 69: 221–224 (1992)).
  • Eine Sequenz, die sich in dem 30-kDa-Bewegungsproteingen des U1-Stramms von TMV befindet, dient als Ursprung für die Assemblierung. An diesem Ursprung der Assemblierung sammeln sich die TMV-RNA und das virale Kapsidprotein spontan an, um die Assemblierung von Virionen zu initiieren (Butler, P. J. G., Mayo, M. A., Molecular architecture and assembly of tobacco mosaic virus particles, The molecular biology of the positive strand RNA viruses. (D. J. Rowlands, M. A., Mayo und B. W. J. Mahy, Hrsg.), Academic Press, London, Seite 237–257 (1987)). Ein funktionsfähiger Ursprung der Assemblierung ist auch für eine wirksame Bewegung über lange Strecken notwendig (Saito, T., Yamanaka, K. und Okada, Y., Virology 176: 329–336 (1990)). Es scheint keine zusätzlichen Erfordernisse für das Packen zu geben. Eine Reihe von heterologen Sequenzen kann eingekapselt werden, was zu stabförmigen Virionen führt, deren Längen proportional zur Größe des RNA-Moleküls ist, das den Ursprung der Assemblierung enthält (Dawson, W. O. u. a., Virology 172: 285–292 (1989)).
  • Die Konstruktion von RNA-Pflanzenviren für die Einführung und Expression von Fremdgenen in Pflanzen wird in French, R. u. a., Science 231: 1294–1297 (1986); Takamatsu, N. u. a., EMBO J 6: 307–311 (1987); Ahlquist, P. u. a., Viral Vectors, Cold Spring Habror Laboratory, New York, 183–189 (1988); Dawson, W. O. u. a., Phytopathology 78: 783–789 (1988); Dawson, W. O. u. a., Virology 172: 285–292 (1989); Cassidy, B. und Nelson, R., Phtopathology 80: 1037 (1990); Joshi, R. L. u. a., EMBO J. 9: 2663–2669 (1990); Jupin, I. u. a., Virology 178: 273–280 (1990); Takamatsu, N. u. a., FEBS Letters 269: 73-76 (1990); veröffentlichte japanische Anmeldung Nr. 63-14693 (1988); europäische Patentanmeldung Nr. 067 553; und europäische Patentanmeldung Nr. 194 809, europäische Patentanmeldung Nr. 278 667 gezeigt. Bei den meisten in diesen Veröffentlichungen konstruierten Virusvektoren konnte nicht gezeigt werden, dass sie zu einer systemischen Bewegung in ganzen Pflanzen in der Lage sind. Vielmehr ist die Genex pression nur in inokulierten Blättern bestätigt worden. In anderen Fällen wurde die systemische Bewegung und Expression des Fremdgens durch den Virusvektor von einem schnellen Verlust der fremden Gensequenz begleitet (Dawson, W. O. u. a., Virology 172: 285 (1989)).
  • AU-B-71951/91 offenbart ein Pflanzenproteinexpressionssystem, bei dem eine rekombinante genomische Virus-RNA verwendet wird.
  • Die EP-A-0 425 004 offenbart genomisch transkribierte Virusreplikons, denen die RNA/RNA-Polymerase fehlt.
  • Bei weiteren Verbesserungen sind erfolgreiche Vektoren auf der Grundlage der Tobamoviren für den schnellen Gentransfer in Pflanzen entwickelt worden. (Donson u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 7204–7208 (1991)). Zum Beispiel wurde das α-Trichosanthin-Gen zu dem Genom eines Tobamovirusvektors unter der transkriptionellen Kontrolle eines subgenomen Promotors zugegeben, der von einem entfernt mit dem Wildtyp-TMV verwandten Stamm erhalten wurde (Turpen, T. H., Dissertation, Universität Kalifornien, Riverside, Seite 72-87 (1992)). Dieser Vektor ist ein autonomes Virus, das alle bekannten viralen Funktionen enthält. Zwei Wochen nach der Inokulation sammelten transfizierte Nicotiana-benthamiana-Pflanzen α-Trichosanthin bis zu einem Anteil von mindestens 2% des gesamten löslichen Proteins an. Gereinigtes rekombinantes α-Trichosanthin, das mittels dieses Verfahrens hergestellt wurde, wurde richtig verarbeitet und hatte dieselbe spezifische Aktivität wie das von der nativen Quelle abgeleitete Enzym. Deshalb ist Boten-RNA, die durch die virale RNA-Amplifikation in ganzen Pflanzen erzeugt wird, vollständig funktional. Allerdings wurde nach einer langen Replikation von bestimmten Sequenzen unter Verwendung dieses Vek tors eine gewisse genetische Instabilität hauptsächlich aufgrund der Rekombinationsdeletionen und Punktmutationen beobachtet (Kearney, C. M. u. a., Virology (im Druck)).
  • Vor kurzem wurden sehr ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von Genvektoren erhalten, die von zusätzlichen, Pflanzen infizierenden Plus-Sinn-RNA-Viren abgeleitet waren; ein Potyvirus, Tabakätzvirus (Dolja, V. u. a., PNAS 89: 10208-10212 (1992) und ein Potexvirus, Kartoffelvirus X (Chapman, S. u. a., Plant Journal 2: 549–558 (1992)).
  • Daher sind die funktionellen Hauptnachteile existierender bekannter Virusvektoren ihre genetische Instabilität bezüglich der Genauigkeit des Aufrechterhaltens von manchen nicht viralen Fremdgenen in systemisch infizierten ganzen Pflanzen, und zwar nach langer Replikation und Übertragung. Für viele Produkte ist es wünschenswert, die genetische Genauigkeit durch Herabsetzen des Verhältnisses von Deletion und anderen Varianten in amplifizierten Populationen zu steigern.
  • Ein zusätzliches Interesse bezüglich der Verwendung von Virusvektoren für die Expression von Fremdgenen bei transgenen Pflanzen ist die Eindämmung einer biologischen Wirkung der für Fremdgene kodierenden Virusvektoren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein genetisches System für die Expression von heterologen Genen in Pflanzen, das die Eindämmung einer biologischen Wirkung vorsieht, umfassend ein Replikon, das von einem in das Chromosom einer Pflanzenzelle integrierten Transgen transkribiert wurde. Das Replikon kodiert für die Replikationursprünge, die beträcht liche Sequenzidentität mit einem einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenvirus besitzen, und mindestens ein Gen, das zu einem einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenvirus nicht nativ ist. Allerdings kodiert das Replikon nicht für mindestens ein Protein, das für die Replikation notwendig ist. Nach der vorliegenden Erfindung wird die Expression des nicht nativen Gens durch ein Helfervirus reguliert, das für ein Protein kodiert, das von dem Replikon zur Replikation benötigt wird.
  • Nach der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass sich die Sequenz, die für das nicht native Gen kodiert, 5' zu dem 3'-Replikationsursprung des Replikons befindet. Es ist weiter bevorzugt, dass das Replikon für ein Gen kodiert, das von dem Helfervirus für die systemische Infektion benötigt wird, besonders bevorzugt ein virales Bewegungsprotein, das sich 3' zu dem 5'-Replikationsursprung des Replikons befindet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Expression eines Gens in einer Pflanze durch Integration eines Transgens in ein Chromosom einer Pflanzenzelle, wobei das Transgen für ein Replikon der vorliegenden Erfindung kodiert. Die transgene Pflanze wird dann mit einem Helfervirus infiziert, das für das von dem Replikon für die Replikation benötigte Protein kodiert.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt das Genom des Wildtyp-TMV.
  • 2a, b und c zeigen die wesentlichen Merkmale der hier beanspruchten viralen Replikons.
  • 3 zeigt eine Ausführungsform, bei der das Replikon und das Helfervirus voneinander abhängig sind.
  • 4 zeigt eine bevorzugte Replikongenanordnung, bei der sich das Fremdgen an dem 3'-Ende des Genoms 5' zu dem 3'-Replikationsursprung befindet.
  • 5 zeigt die Konstruktion eines Transgens für die Synthese eines Replikons, das für Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) in einem Agrobakterium-Transformationsvektor kodiert.
  • 6 stellt eine Restriktionskarte des Transgenabschnitts von pBGC272 zur Verfügung.
  • 7 zeigt ein Autoradiograph, das die Trennung und Identifizierung von pBGC272 und pBGC273 veranschaulicht.
  • Definitionen
  • Fremdgen: Ein "Fremdgen" bezieht sich auf jede Sequenz, die zu dem Virus nicht nativ ist.
  • In cis: "In cis" zeigt an, dass zwei Sequenzen auf demselben RNA- oder DNA-Strang angeordnet sind.
  • In trans: "In trans" zeigt an, dass zwei Sequenzen auf verschiedenen RNA- oder DNA-Strängen angeordnet sind. [0029] Bewegungsprotein: Ein "Bewegungsprotein" ist ein Nichtkapsidprotein, das für die Zell-Zell-Bewegung von Replikons oder Viren in Pflanzen erforderlich ist.
  • Ursprung der Assemblierung: Ein "Ursprung der Assemblierung" ist eine Sequenz, bei der die Selbstassemblierung der viralen RNA und des viralen Kapsidproteins die Bildung von Virionen initiiert.
  • Replikationsursprung: Ein "Replikationsursprung" betrifft die minimalen terminalen Sequenzen in linearen Viren, die für die Virusreplikation notwendig sind.
  • Replikon: Ein "Replikon" ist eine Anordnung von RNA-Sequenzen, erzeugt durch Transkription eines Transgens, dass in die Wirts-DNA integriert ist, die bei Vorhandensein eines Helfervirus zur Replikation in der Lage ist. Ein Replikon kann für die wirksame Replikation und Stabilität Sequenzen zusätzlich zu den Replikationsursprüngen erfordern.
  • Transkriptionsterminationsbereich: Der "Transkriptionsterminationsbereich" ist eine Sequenz, die die Bildung des 3'-Endes des Transkripts kontrolliert. Selbstspaltende Ribozyme und Polyadenylierungssequenzen sind Beispiele für Transkriptionsterminationssequenzen.
  • Transgen: Ein "Transgen" betrifft die DNA-Sequenz, die für das in die Wirts-DNA eingefügte Replikon kodiert. [0035] Virion: Ein "Virion" ist ein Teilchen, das aus viraler RNA und viralem Kapsidprotein zusammengesetzt ist.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine starke Expression von Fremdgenen in Pflanzen durch virale Replikons zur Verfügung, wobei die Replikons eine verbesserte genetische Stabilität besitzen. Die Replikons der vorliegenden Erfindung werden durch Transkription von integrierten Transgenen in Wirts-Pflanzenzellen erzeugt. Die Replikons der vorliegenden Erfindung werden teilweise von einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenviren abgeleitet.
  • Die Replikons der vorliegenden Erfindung kodieren für mindestens ein Fremdgen und besitzen Sequenzen, die in cis für die Replikation erforderlich sind ("Replikationsursprünge"). 2(c). Die Replikons werden durch Wirtszelltranskription eines chromosomal integrierten Transgens erzeugt, um ein RNA-Transkript zu bilden. Das Transgen ist eine DNA-Sequenz, die für das Replikon kodiert und auch einen Promotor und einen Transkriptionsterminationsbereich enthält. 2(a). Das Replikon wird von einem RNA-Transkript des Transgens durch RNA-Processing und Replikation in Anwesenheit eines Helfervirus erzeugt. 2(b).
  • Den Replikons der vorliegenden Erfindung fehlen die funktionsfähigen Replikationsproteinsequenzen. Weil den Replikons der vorliegenden Erfindung Replikationsproteinsequenzen fehlen, müssen sie sich auf die genetische Komplementierung mit Helferviren für die Replikation verlassen. Die Abhängigkeit des Replikons von dem Helfervirus für die Replikation ermöglicht die regulierbare Amplifizierung dieser Replikons durch das Einführen des Helfervirus.
  • Die genetische Komplementierung des Replikons mit einem Helfervirus stellt gegenüber autonomen Virusvektoren für die Amplifizierung der Genexpression viele Vorteile zur Verfügung. Jede infizierte Zelle einer transgenen Pflanze enthält eine genaue Originalkopie des zu amplifizierenden Gens. Dies reduziert bei der Replikation der RNA-Populationen die Wirkungen des Gendrifts, der nach langer Replikation eines RNA-Vektors zu Sequenzinstabilitäten und Punktmutationen führen kann (Kearney, C. M. u. a., Virology (in Druck)).
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kodiert das Replikon für mindestens eine Sequenz, von der das Helfervirus abhängt. Daher sind in dieser weiteren Ausführungsform das Replikon und das Helfervirus voneinander abhängig. [Siehe 3]. Die Abhängigkeit des Helfervirus von dem Replikon stellt die amplifizierte Expression der Replikonsequenzen durch das Helfervirus in ganzen Pflanzen sicher.
  • In einer weiteren Ausführungsform kodiert das Replikon für ein funktionsfähiges Bewegungsprotein, wie bei spielsweise das 30kDA-TMV-Bewegungsprotein. Das in dieser Ausführungsform verwendete Helfervirus besitzt kein funktionsfähiges Bewegungsprotein. Daher hängt das Helfervirus bezüglich der Bewegungsfunktionalität von dem Replikon ab. Bewegungsproteine sind in Pflanzen für eine Bewegung von Zelle zu Zelle notwendig. Durch das Anordnen einer funktionsfähigen Bewegungsproteinsequenz auf dem Replikon und entweder das Deaktivieren oder Deletieren derselben Sequenz auf dem Helfervirus oder durch das Verwenden einer Wirtsspezies mit Helfervirus-kodierter Bewegungsproteininkompatibilität ermöglicht die Abhängigkeit des Helfervirus von dem Replikon die systemische Infektion der ganzen Pflanze mit dem viralen Replikon plus Helfervirus.
  • Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat den weiteren Vorteil, dass das einzige Virus, das in die Umgebung entlassen wird, ein geschwächter Helfervirus sein wird. Deshalb wird der Helfervirus nicht in der Lage sein, sich in Pflanzen zu verbreiten, die nicht bereits eine funktionsfähige Kopie des viralen Bewegungsproteins enthalten. Diese Ausführungsform stellt eine Alternative für eine stringentere Eindämmung einer biologischen Wirkung zur Verfügung, die in manchen Fällen für die kommerzielle Massenproduktion wünschenswert sein kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Replikon derart formuliert, dass die Sequenzen, die für die Replikationsursprünge und die Bewegungsfunktionen kodieren, mit den Fremdgensequenzen verbunden sind. Das chromosomal integrierte Transgen, das für das Replikon kodiert, wird durch die Wirts-RNA-Polymerase II transkribiert, wodurch rekomibnante mRNAs produziert werden. In Anwesenheit eines Helfervirus werden diese Transkripte als zusätzliche Replikonkomponenten in einer gemischten Population repliziert.
  • Während der viralen Replikation kann subgenome Boten-RNA von der Replikon-RNA hergestellt werden, was zu der amplifizierten Expression von Fremdgenen führt. Die besonders bevorzugte Replikongenanordnung platziert das Fremdgen an dem äußeren 3'-Ende des Genoms, wo normalerweise das virale Strukturprotein kodiert wird. Siehe 4. Diese Position für das Fremdgen an dem äußeren 3'-Ende des Genoms ist, wie in der 4 veranschaulicht, kritisch für die Expression großer Mengen (Culver, J. N. u. a., Virology (in Druck)). Allerdings können die Protein-kodierenden Sequenzen oder anderen Gensequenzen, die zwischen den Replikationsursprüngen angeordnet sind, in jeder Größenordnung funktionsfähig sein.
  • Zusätzliche bevorzugte Ausführungsformen der Replionsequenz beinhalten die Verwendung von regulierbaren Promotoren zur Kontrolle der Expression des Fremdgens und/oder Bewegungsproteins. Es kann ein Promotor für die Expression eines Fusionsproteins, enthaltend das Fremdprotein oder eine Reihe von subgenomen Promotoren, verwendet werden. Es können auch selbstspaltende Ribozyme oder ein Polyadenylierungsbereich als Transkriptionsterminationsbereiche verwendet werden.
  • Die Replikons werden in vivo in Pflanzen durch Transkription von Transgenen, die in das Wirtspflanzenzellchromosom integriert sind, und durch Replikation in Anwesenheit eines Helfervirus erzeugt. Die Transgene können durch bekannte Transformationsverfahren unter Verwendung einer Reihe von Promotoren in das Wirtspflanzenzellchromosom eingeführt werden. Nachdem das Replikon in den Wirt eingeführt wurde, werden die sich ergebenden transgenen Pflanzen bis zu einer optimierten Stufe wachsen gelassen, zu welcher ein Helfervirusstamm zugesetzt wird. Die Replikons werden dann durch das eingeführte Helfervirus amplifiziert und das Fremdgen wird exprimiert.
  • Das Fremdgenprodukt, das von dem Replikon kodiert und exprimiert wird, kann eine sehr große Zahl von RNA- oder Proteinprodukten sein und weist zum Beispiel Antisinn- und Ribozym-RNA, regulierende Enzyme und strukturelle, regulierende und therapeutische Proteine auf, die in ihrer nativen Form oder als Genfusionen exprimiert werden können. Typische therapeutische Proteine umfassen Mitglieder der Interleukinfamilie von Proteinen und Kolonie-stimulierende Faktoren, wie beispielsweise CSF-G, CSP-GM und CSF-M. Es wird allerdings davon ausgegangen, dass jedes therapeutische Protein in der vorliegenden Erfindung kodiert und exprimiert sein kann.
  • Wenn die Expression des Fremdgens zu der Ansammlung eines Proteins oder eines anderen Materials in den Pflanzengeweben führt, so kann das daraus resultierende Produkt geerntet werden, sobald die gewünschte Konzentration dieses Produkts erreicht ist. Wichtige Mengen an rekombinanten Proteinen, Nukleinsäuren oder anderen Metaboliten können kostengünstig unter Verwendung dieses Verfahrens erzeugt werden. Die geringe Expression und große Variation, die in transgenen Organismen beobachtet wird, die chromosomal mit demselben Konstrukt transformiert sind (ein Phänomen, das den "Positionswirkungen" zugeschrieben wird), wird mit diesem Verfahren vermieden. Die Amplifikation auf der Grundlage von RNA hängt in nicht kritischer Weise von anfänglichen Transkriptmengen ab. Es gibt auch keine theoretische Grenze für die Zahl von Genen, die auf der RNA-Ebene amplifiziert werden können. Das Zielgen bleibt vor der Amplifikation "aus", weil subgenome mRNA nur während der viralen Replikation erzeugt wird. Daher kann dieser Ansatz besonders zur Kontrolle von komplexen biochemischen Wegen oder zur Herstellung von Produkten geeignet sein, die für die Pflanze toxisch sind. Es wäre zum Beispiel machbar, kritische Enzyme in einem Weg zu überexprimieren und gleichzeitig andere Gene durch Amplifikation von Antisinn-RNA nur nach der Inokulation mit einem Helfervirus herunterzuregulieren. Diese Manipulationsarten sind unter Verwendung von bestehenden oder vorgeschlagenen Technologien für die chromosomale Transformation von Pflanzen oder Pflanzenzellkulturen oder unter Verwendung von bekannten viralen Vektoren nicht möglich.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion eines Transgens für die Expression von rekombinanter Boten-RNA
  • Die Konstruktion eines von TMV abgeleiteten Transgens wird hier beschrieben. Das Wildtyp-TMV-Genom ist in der 1 dargestellt. Die Konstruktion von DNA-Plasmiden, enthaltend den 5'-Replikationsursprung in Verbindung mit dem CaMV-35S-Promotor, ist in (Ow, D. W. u. a., Science 234: 856-859 (1986)) beschrieben, und enthaltend den 3'-Replikationursprung in Verbindung mit einem Ribozymterminationsbereich, ist in Tureen, T. H., Dissertation, Universität Kalifornien, Riverside, Seite 88–105 (1992)) beschrieben.
  • Die Substitution des Hüllproteingens für die kodierende Sequenz von CAT ist in Dawson u. a., Phytopathol. 78: 783–789 (1988) beschrieben.
  • Zuvor offenbarte Plasmide, pBGC43, pBGC44, pBGC75 (Turpen, T. H., Dissertation, Universität Kalifornien, Riverside, Seite 88–136 (1992)) und pTMVS3CAT28 (Dawson u. a., Phytopathol. 78: 783–789 (1988)) werden als Vorläufer für die Konstruktion des gewünschten Transgens für die Synthese von Replikon-RNA verwendet (5). Die Konstruktion der Plasmide pBGC43, pBGC44, pBGC75 werden in der Tabelle 1, die von Turpen, T. H, Dissertation, Universität Kalifornien, Riverside, Seite 92, 112 (1992) entnommen wurde, beschrieben. Die Konstruktion der Plasmide pBGC43, pBGC44, pBGC75 und pTMVS3CAT28 werden auch unten erörtert.
  • Herstellung von pTMVS3-CAT-28
  • pTMVS3-CAT-28, das eine Substitution der Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT)-Gens für das Hüllproteingen enthält, wurde die folgt konstruiert. Das CAT-Gen wurde von pCM1 (Pharmacia) mit SalI entfernt und in mit XhoI gespaltenes pTMVS3-28 ligiert. pTMVS3-28 wurde durch Klonieren von TMV-cDNA genomischer Länge (6,4 kb) in pBR322 konstruiert, wie bei Dawson W. u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 1832–36 (1986) beschrieben. Die CAT-Konstruktion erzeugte pTMVS3-CAT-28, aus dem die Mutante cp S3-CAT-28 transkribiert wurde. Die richtige Sequenz und Orientierung wurde durch Sequenzierung bestätigt. Gene Anal. Technol. 2: 89–94.
  • Herstellung von pBGC43
  • pTK49 wurde durch Klonieren des 1,9 kb PstI-HindIII-Fragments von TMV-CDNA in pUC19 konstruiert, wie von Dawson, W. u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 1832–36 (1986) beschrieben. Das 1,4 kb PstI-HindIII von pTK49 wurde wieder in pUC19 kloniert, um pTT1 zu bilden. Das 1,6 kb HindIII- BamHI-Fragment von pDO432, das in Ow u. a., Science 234: 856-59, (1986) beschrieben ist, wurde zu pTT1 kloniert. NotI-Linker wurden bei der HindIII-Stelle des Fragments und der EcoRI-Stelle des Vektors zugeführt. pTT3 wurde durch Verdau von pTT2 mit PstI-BamHI und Mungbohnennuklease konstruiert, um den 35S-Promotor am 5'-Ende der TMV-cDNA anzuordnen. Das 1,9 kb NotI-SmaI-Fragment von pTT3 wurde in pBStKs+ kloniert, um pBGC43 zu bilden.
  • Herstellung von pBGC44
  • Das 1,4 kb SalI-HindIII-Fragment von pTT1 wurde in pstSk- kloniert, um pBGC8 zu bilden. Das 3,6 kb HindIII-Fragment von pTMV204, das bei Dawson u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 1832–36 (1986) offenbart ist, wurde in pBGC8 kloniert, um pBGC9 zu bilden. Das 4,8 kb SmaI-PstI-Fragment von pBGC9 wurde in pBGC43 (oben beschrieben) kloniert, um pBGC44 zu bilden.
  • Herstellung von pBGC75
  • Das 2,1 kb EcoRI-PstI-Fragment von pTMV204, das bei Dawson, W. u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 1832–36 (1986) beschrieben ist, wurde in pBstSk- kloniert, um pBGC11 zu bilden. Das 3,6 kb HindIII-Fragment von pTMV204 wurde in pBGC11 kloniert, um pBGC14 zu bilden. Das 0,4 kb NcoI-PstI-Fragment von pTMVcpS3-28 (0,5 kb Hüllproteindeletion von pTMV304, bei Dawson, W. u. a., Phytopathology 78: 783–789 beschrieben) wurde für das 0,9 kb NcoI-PstI-Fragment von pGC14 substituiert, um pGC15 zu bilden. PBGC19 wurde durch Deletion des 0,03 kb KpnI-HindIII-Polylinkerbereichs von pBGC14 gebildet.
  • pBGC70 wurde durch Klonieren eines 0,05 kb synthetischen ApaI-PstI-Ribozyms-kodierenden Fragments in pBstSk+ gebildet. pBGC72 wurde durch Deletion des 3,5 kb ClaI-Fragments von pBGC19 gebildet. pBGC73 wurde durch Klonieren des 0,05 kb ApaI-PstI-Fragments von pBC70 in pBGC72 gebildet. pBGC74 wurde durch Substitution des 0,1 kb ClaI-NsiI-Fragments von pBGC15 für das 0,5 kb ClaI-NsiI-Fragment von pBGC73 gebildet. Das 3,5 kb ClaI-Fragment von pBGC19 wurde in pBGC74 kloniert, um pBGC75 zu bilden.
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
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  • Figure 00260001
  • Im Hinblick auf die Konstruktion des Transgens ist es wünschenswert, das 30-kDa-Bewegungsproteingen genau in derselben Position wie das Replikasegen zu platzieren (bezüglich des 5'-Replikationursprungs in dem Wildtyp-TMV-Genom, siehe 5). Um dies zu erreichen, wird bei dem Startkodon jedes Gens durch Mutagenese auf Grundlage von PCR unter Verwendung von synthetischen Primern und einzigartigen benachbarten Klonierungsstellen eine NdeI-Stelle eingeführt. Ein 270 pb Mutageneseprodukt, das die interne NdeI-Stelle von dem PCR-Primer enthält, wird unter Verwendung der EcoRV-Stelle in dem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor und der HindIII-Stelle in dem 30-kDa-Proteingen subkloniert. Das Ligationsprodukt wird dann sequenzverifiziert.
  • Das 3'-Segment des Replikons, das das CAT-Gen enthält, wird benachbart dem 3'-Ribozyme als HindIII-NsiI-Fragment von dem transienten TMV-Vektor pTMVS3CAT28 angeordnet (5). In dem abschließenden Klonierungsschritt werden der 5'-Abschnitt des Transgens und der 3'-Abschnitt in die einzigartige BamHI-Stelle des Pflanzentransformationsvektors pAP2034 (Velton und Schell, NAR 13: 6981–6998 (1985)) als zuvor beschriebenes BglII-BamHI-Fragment subkloniert (Turpen, T. H. Dissertation, Universität Kalifornien, Riverside, Seite 88–132 (1992)). Die Sequenz der Replikon-RNA, die durch Wirtstranskription, RNA-Verarbeitung und Replikation in Anwesenheit eines Helfervirus erzeugt wird, wird als SEQ. No. 1 angegeben. Daher wird das Fremdgen (CAT) auf einem viralen RNA-Replikon unter der Kontrolle des subgenomen Hüllproteinpromotors für die Boten-RNA-Synthese angeordnet (die sich am 3'-Ende des Bewegungsproteingens befindet).
  • Beispiel 2
  • Transformation von Pflanzen
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Agrobacterium tumefaciens zum Einsetzen dieser Sequenz in das Pflanzenchromosom verwendet, wie zuvor beschrieben (Tureen, T. H. Dissertation, Universität Kalifornien, Riverside, Seite 106–132 (1992)). Der Transformationsvektor pAP2034 ist ein Agrobacteriumsvektor der kointegrierenden Art. pAP2034, der die Transkriptionseinheit für die Herstellung der Replikon-RNA enthält, wird durch Konjugation unter Verwendung des Helferstamms GJ23 zu A. tumefaciens mobilisiert (Van Haute, E., Joos u. a., EMBO J. 2: 411–417 (1983)). Die Transkonjuganzien werden ausgewählt und der Aufbau des Kointegrats zwischen Donorplasmid und dem entschärften Ti-Plasmid pGV3850 (Zambryski, P. u. a., EMBO J. 2: 2143–2150 (1983)) wird durch Southern-Blot-Hybridisierung bestätigt. Ein richtiges homologes Rekombinationsereignis ordnet das Transgenkonstrukt zwischen den T-DNA-Grenzen an.
  • Axenische Blattsegmente von N. tabacum cv. Xanthi werden in der folgenden Sequenz behandelt (Horsch, R. B. u. a., Leaf disc transformation, Plant molecular biology manual. (S. B. Gelvin, R. A. Schilperoort und D. P. S. Verma, Hrsg.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande, Seite A5 : 1–9 (1988)): Tag 1: Blattsegmente werden in A. tumefaciens-Flüssigkultur getaucht und auf Regenerationsmedien (RM) gelegt, Tag 3: Die Explantate werden auf RM übertragen, das mit Cefotaxim (500 μg/ml) ergänzt ist, Tag 5: Die Explantate werden auf RM/Cefotaxim (500 μg/ml) + Kanamycin (100 μg/ml) übertragen, Tag 30–40: die Triebe werden herausgeschnitten und auf Wurzelmedien mit Cefotaxim (500 μg/ml) und Kanamycin (100 μg/ml) gelegt. Die Kulturen werden unter kontinuierlichem fluoreszierendem Licht bei 20°C gehalten (Sylvania GTE, Gro-Lux WS).
  • Abgehärtete Pflanzen werden in herkömmlicher Blumenerde bei einer Temperatur von 21–29°C wachsen gelassen (Cascade Forest Products Inc., Arcata, Kalifornien), und zwar mit einem gesteuert freigesetzten Dünger (Osmocote, 14-14-14) unter Verwendung von natürlichem Licht (Vacaville, Kalifornien), das mit fluoreszierendem Licht bei einer Tageslänge von 16 Stunden in einem Zimmergewächshaus ergänzt wird. Die antibiotische Widerstandeigenschaft, die in transgenen Linien weitergegeben wird, wird durch Keimen von Sämlingen in sterilem Agar in Anwesenheit von 100 ug/ml Kanamycin erzielt (Dunsmuir, P. u. a., Stability of introduced genes and stability of expression, Plant molecular biology manual. (S. B. Gelvin, R. A. Schilperoort und D. P. S. Verma, Hrsg.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande, Seite C1 : 1–17 (1988)).
  • Beispiel 3
  • Herstellung von Replikon-RNA in Anwesenheit des Helfervirus
  • Die Sequenz der Replikon-RNA, erzeugt durch Wirtstranskription, RNA-Verarbeitung und Replikation in Anwesenheit eines Helfervirus, wird als SEQ. No. 1 angegeben. Tobamoviren mit Mutationen oder einer natürlich auftretenden Variation im 30-kDa-Proteingen sind unzulänglich, was die Zell-Zell-Bewegung auf bestimmten Wirtsspezies angeht. Transgene Pflanzen oder sich abwechselnde Wirte können diesen Defekt komplementieren. Der Fachmann wird zu würdigen wissen, dass es zusätzlich zu den Helfervarianten oder Wirtsspezieskombinationen, die natürlich auftreten, zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Helfertobamoviren mittels Gentechnik oder Mutagenese gibt. Ebenso sind Verfahren zum Herstellen von transgenen Pflanzen veröffentlicht worden, die 30-kDa-Protein exprimieren und die defekte 30-kDaenthaltende Viren komplementieren. Zum Beispiel können defekte Bewegungshelferviren durch Transkription von TMV mit bekannten Mutationen für die Herstellung von RNA-Inoculum synthetisiert werden. Transgene Pflanzen, die das 30-kDa-Protein exprimieren, komplementieren diesen Defekt (Deom, C. M. u. a., Science 237: 389–394 (1987)). Daher können große Mengen an einem Helfervirus verbreitet werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine 30-kDa-Protein-Rasterverschiebungsmutante, die eine einzelne Basenpaardeletion in der Position 4931 hat, wodurch eine EcoRV-Stelle in der cDNA geschaffen wird, als Helfervirus verwendet. Transgener Tabak (~ 100 Pflanzen) wird regeneriert, der diese Replikontransgenkonstruktion enthält, und auf CAT-Aktivität in Anwesenheit und Abwesenheit von Helferviren unter Verwendung von beschriebenen Verfahren untersucht (Shaw, W. V., Chloramphenicol acetyltransferase from chloramphenicol-resistant bacteria, Methods in Enzymology, Bd. 53 (S. Fleischer und L. Packer, Hrsg.), Seite 737–755 (1975)). 200 mg Blattgewebe wird in Analysepuffer zerkleinert, danach wird 0,5 mM Acetyl-CoA und 0,1 uCi [14C]Chloramphenicol zugegeben, 45 min. bei 37°C inkubiert, extrahiert, durch Dünnschichtchromatographie und Autoradiographie aufgelöst.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von CAT in Tabakpflanzen unter Verwendung einer Replikon-RNA in Anwesenheit von Helfervirus.
  • Mehrere Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) wurden mit einem Transgen der vorliegenden Erfindung transformiert, um die Fähigkeit des Transgens, in einer Pflanzenzelle exprimiert zu werden, sowie die Fähigkeit des Transgens, systemisch eine Pflanze zu infizieren und ein Protein, das von dem Transgen kodiert wurde, zu exprimieren, zu beurteilen. Bei dem vorliegenden Beispiel wurde die systemische Expression von durch das Transgen kodierter Chloramphenicol Acetyltransferase bei einem Anteil erreicht, der zweimal so hoch wie de des Hintergrundanteils und mit Anteilen vergleichbar war, die für einzelne Kopien von Tabakgenen erhalten wurden.
  • Bei dem vorliegenden Beispiel wurden pBGC272 und pBGC273 zur Einschleusung der Transgene benutzt. Eine Restriktionskarte des Transgenabschnitts von pBGC272 wird in der 6 zur Verfügung gestellt. pBGC272 ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer ... hinterlegt. Es wird schon jetzt gesagt, dass die amplifizierte Expression von CAT aus pBGC272 in Anwesenheit eines Helfervirus durch Komplementation mit dem Helfervirus beobachtet würde.
  • Es wurde auch ein Kontrollplasmid hergestellt, nämlich pBGC273, das sich von pBGC272 insofern unterscheidet, als der nicht kodierende 3'-Bereich deletiert wurde. Es wird mit pBGC273 keine amplifizierte Expression von CAT erwartet, weil die Deletion des nicht kodierenden 3'-Bereichs die Synthese des Minus-Strangs verhindert.
  • Identifizierung der Transkriptherstellung
  • Tabakpflanzen wurden entweder mit pBGC272 oder pBGC373 unter Verwendung eines Agrobacterium tumefaciens-Blatttauchverfahrens transformiert, wie in dem Beispiel 2 beschrieben. Um Zeit zu sparen, wurde eine bakterielle Konjugation vermieden, und zwar durch Verwenden eines binären Plasmidvektorsystems für die Pflanzentransformation anstelle von kointegrierten Vektoren. Bevan, M. u. a., Nucleic Acid Res. 12: 8711–8721 (1984).
  • Die Anwesenheit der viralen Transkripte nach der Inokulation wurde mittels Northern Hybridisierung gemessen. Insbesondere wurde die gesamte RNA gereinigt, glyoxaliert, mittels Elektrophorese aufgetrennt, auf eine Nylonmembran (Nytran) gegeben und mit dem NdeI-NsiI-Fragment von pGBC272 untersucht, das durch das Zufallsprimerverfahren mit 32P markiert worden war. Ein Autoradiograph, der die Trennung und Identifikation von pBGC272 und pBGC273 zeigt, ist in der 7 veranschaulicht. Die Spuren 1, 2 und 20 enthalten Kontroll-DNA-Restriktionsfragmente von pBGC272. Die Spuren 3–10 und 13–18 enthalten die gesamte RNA aus transgenen Pflanzenproben (pBGC272, pBGC273). Die Spuren 11 und 12 enthalten Kontrollproben von 30K transgenen Pflanzen (Linie 26C), die, wie bekannt ist, das Helfervirus TMMVDEcoRV komplementieren. Die Spur 19 enthält RNA (1/220 Äquivalent) von mit Helfervirus TMMVDEcoRV infizierten Kontrollpflanzen der Linie 26B.
  • Von 16 Pflanzen, die mit pBGC272 transformiert waren, enthielten 12 sehr viel Transkript. Ähnlich erzeugten von 6 mit pBGC273 transformierten Pflanzen 4 Pflanzen Transkripte.
  • Identifizierung der CAT-Herstellung
  • Es wurde auch die Fähigkeit von pBGC272 beurteilt, eine Pflanze systemisch zu infizieren und ein Markerprotein, nämlich Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT), CAT herzustellen. CAT-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines ELISA-Assay bestimmt. Gendloff, E. u. a., Plant Mol. Biol. 14: 575–583 (1990). Blattscheibenproben (# 8 Kernbohrung) wurden verwendet. Das gesamte lösliche Protein von denselben Blattscheibenproben, die für CAT/ELISA verwendet wurden, wurde mittels des Verfahrens von Bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248–254 (1976) bestimmt.
  • Drei Pflanzengruppen, die pBGC272 oder pBGC273 enthielten, wurden durch das Agrobacterium tumefaciens-Blatttauchverfahren mit einem von drei Helferviren infiziert. Die Helferviren, die in dem vorliegenden Beispiel verwendet wurden, umfassen das Wildtyp-TMV-Virus (TMVU1), TMVDEcoRV und TMV30K-O. Die Helferviren, die in der vorliegenden Untersuchung verwendet wurden, sind von den leicht verfügbaren Tobamovirusstämmen TMVU1 (auch als gemeiner oder Wildtyp-Stamm ATCC Nr. PV135 bekannt) und dem Odonoglossum-Ringspot-Tobamovirus (ORSV, ATCC Nr. PV274) abgeleitet. Paul, H., C .M. I./A. A. B. Descriptions of Plant Viruses, No. 155 (TMVU1); Zaitlin, M. C. M. I./A. A. B. Descriptions of Plant Viruses, No. 151 (ORSV).
  • Das Helfervirus TMVDEcoRV enthält eine Punktmutation in dem TMV-30K-Gen. TMVDEcoRV wurde durch Deletion des Nukleotids 4931 durch Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese von TMVU1-cDNA erzeugt, wodurch eine EcoRV-Stelle in dieser Position eingeführt wurde und eine Rasterverschiebungsmutation in dem 30K-Gen bewirkt wurde. Infektöse RNA-Transkripte werden dann in vitro synthetisiert und als Inokulum verwendet.
  • TMV30K-O enthält das 30K-Gen des Odonoglossum-Ringspot-Tobamovirus (ORSV) in einem U1-Stamm-Hintergrund. TMV30K-O ist teilweise defekt bezüglich der Bewegungsfunktion und zeigt eine delatierte und sporadische, systemische Infektion in Xanthi tobacco. Dawson, W. u. a., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 527–555 (1992). Der Hel fervirus TMV30K-O kann durch Substitution der das 30K-Gen des TMVU1-Stamms kodierenden cDNA mit dem 30K-Gen von ORSV durch genetische Routinemanipulationstechniken hergestellt werden. Infektiöse RNA-Transkripte werden dann in vitro synthetisiert und als Inokulum verwendet.
  • Die erste Pflanzengruppe (147 Stück) wurde mit TMVDEcoRV infiziert. pBGC272 enthaltende Pflanzen zeigten keine Symptome einer systemischen Infektion und waren daher nicht in der Lage, das Helfervirus zu komplementieren oder die CAT-Expression zu amplifizieren.
  • Die zweite Pflanzengruppe (9 Stück) wurden mit TMVU1 infiziert. Diese Pflanzen zeigten eine systemische Infektion des Wildtypvirus, waren aber nicht in der Lage, die CAT-Expression über die Hintergrundkontrollanteile zu amplifizieren, weil für eine systemische Infektion der Pflanze mit einem Wildtyp-Helfervirus die genetische Komplementierung nicht notwendig ist.
  • Die dritte Pflanzengruppe (78 Stück) wurde mit TMV30K-O infiziert. Von den 78 inokulierten Pflanzen wurden 24 früher als Pflanzen systemisch infiziert, die nur mit TMV30K inokuliert waren, was eine Komplementierung des in seiner Bewegungsfunktion debiliterten Helfervirus mit pBGC272 zeigt.
  • Von den 24 systemisch infizierten Pflanzen waren 19 Pflanzen mit pBGC272 und 5 mit pBGC273 infiziert worden. Von den 19 mit pBGC272 infizierten Pflanzen enthielten 12 erhöhte CAT-Anteile. Nach einer erneuten Entnahme und dreifachen Untersuchung wurde gefunden, dass 8 Pflanzen CAT-Anteile von etwa 0,1 ng CAT/mg gesamtes lösliches Protein hatten, was zweimal so viel wie der Hintergrundanteil ist.
  • Biologische Hinterlegungen
  • Die folgenden Plasmide sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und darunter fallende Bestimmungen (Budapester Vertrag) hinterlegt und sind daher bewahrt und nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags zugänglich gemacht. Die Verfügbarkeit solcher Plasmide soll nicht als Lizenz dafür ausgelegt werden, die Erfindung entgegen der Rechte, die mit der Genehmigung jeder Regierung gemäß deren Patentrecht gewährt werden, auszuüben.
  • Die hinterlegten Kulturen haben die angegebenen ATCC-Hinterlegungsnummern erhalten:
    Figure 00350001
  • Gemäß 37 C. F. R §1.808 stimmen die Anmelder zu, dass alle Beschränkungen von dem Hinterlegenden über den Zugang der Öffentlichkeit für die hinterlegten Plasmide mit der Erteilung eines Patents auf die vorliegende Anmeldung unwiderruflich aufgehoben werden.
  • Während die Erfindung der vorliegenden Patentanmeldung mit Bezug auf die Einzelheiten von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung offenbart ist, versteht es sich, dass diese Offenbarung beispielhaft und nicht einschränkend sein soll, da davon ausgegangen wird, dass dem Fachmann Modifikationen ohne weiteres einfallen, die im Geist der Erfindung und dem Umfang der beigefügten Ansprüche liegen. Es wird weiter davon ausgegangen, dass die vorliegende Erfindung alle Viren infizierenden Pflanzen und Pflanzen im Allgemeinen betrifft und nicht auf Plasmide, Viren oder Pflanzen, die hier beschrieben sind, beschränkt ist.
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
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  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001

Claims (8)

  1. Genetisches System zur Expression von heterologen Genen in Pflanzen und welches die Eindämmung einer biologischen Wirkung vorsieht, umfassend: ein Replicon, das für folgendes kodiert: Replikationsursprünge, die beträchtliche Sequenzidentität mit einem einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenvirus besitzen, mindestens ein Gen, das zu einem einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenvirus nicht nativ ist, das Replicon, das für mindestens ein Protein, das für die Replikation des Replicons notwendig ist, nicht kodiert; und ein Helfervirus, das für folgendes kodiert: mindestens ein Protein, das von dem Replicon zur Replikation benötigt wird, und das Helfervirus, das für mindestens ein Protein, das für eine systemische Infektion notwendig ist, nicht kodiert, wobei das Replicon weiter für mindestens ein Protein kodiert, das von dem Helfervirus für die systemische Infektion benötigt wird, und wobei eine DNA-Sequenz des Replikons als Transgen im Chromosom einer Pflanzenzelle integriert ist.
  2. Genetisches System nach Anspruch 1, wobei das Protein, das nicht durch das Replicon kodiert ist und durch das Helfervirus kodiert ist und wobei das Protein für die Replikation des Replicons notwendig ist, Replikase ist.
  3. Genetisches System nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Sequenz, die das nicht-native Gen im Replikon kodiert, sich 5' zu dem 3'-Replikationsursprung des Replicons befindet.
  4. Genetisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Protein, das nicht durch das Helfervirus kodiert ist und durch das Replikon kodiert ist und wobei das Protein vom Helfervirus für die systemische Infektion benötigt wird, ein virales Bewegungsprotein ist.
  5. Genetisches System nach Anspruch 4, wobei das virale Bewegungsprotein zu einem Tobamovirus oder einem Virus vom TMV-Stamm nativ ist, wobei wahlweise eine DNA, die für das Tobamovirus- oder das TMV-Stamm-Virus-Bewegungsprotein kodiert, sich 3' bezüglich des 5'-Replikationsursprungs des Replicons befindet.
  6. Genetisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das nicht-native Gen systemisch in Anwesenheit eines Helfervirus, das für ein Protein kodiert, das von dem Replicon zur Replikation benötigt wird, exprimiert ist.
  7. Transgene Pflanze, die ein genetisches System zur Expression von heterologen Genen in Pflanzen enthält und welches die Eindämmung einer biologischen Wirkung vorsieht, umfassend: ein Replicon, das für folgendes kodiert: Replikationsursprünge, die beträchtliche Sequenzidentität mit einem einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenvirus besitzen, mindestens ein Gen, das mit einem einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenvirus nicht nativ ist, das Replicon, das für mindestens ein Protein, das für die Replikation des Replicons notwendig ist, nicht kodiert; und ein Helfervirus, das für folgendes kodiert: mindestens ein Protein, das von dem Replicon zur Replikation benötigt wird, und das Helfervirus, das für mindestens ein Protein, das für eine systemische Infektion notwendig ist, nicht kodiert, wobei das Replicon weiter für mindestens ein Protein kodiert, das von dem Helfervirus für die systemische Infektion benötigt wird, und wobei das Replikon als Transgen im Chromosom einer Pflanzenzelle integriert ist.
  8. Verfahren zur Expression eines Gens in Pflanzen, umfassend (a) Integrieren eines Transgens in ein Chromosom einer Pflanzenzelle, wobei das Transgen für ein Replikon kodiert, das für folgendes kodiert: Replikationsursprünge, die beträchtliche Sequenzidentität mit einem einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenvirus besitzen, mindestens ein Gen, das mit einem einsträngigen Plus-Sinn-RNA-Pflanzenvirus nicht nativ ist, das Replicon, das für mindestens ein Protein, das für die Replikation des Replicons notwendig ist, nicht kodiert; und (b) Infizieren der Pflanzenzelle mit einem Helfervirus, wobei das Helfervirus für folgendes kodiert: mindestens ein Protein, das von dem Replicon zur Replikation benötigt wird, und das Helfervirus, das für mindestens ein Protein, das für eine systemische Infektion notwendig ist, nicht kodiert, wahlweise ein Bewegungsprotein, z. B. ein Bewegungsprotein, das zu dem Tobamovirus oder zu dem Virus vom TMV-Stamm nativ ist, wobei das Replicon weiter für mindestens ein Protein kodiert, das von dem Helfervirus für die systemische Infektion benötigt wird, wahlweise ein Bewegungsprotein, das zu dem Tobamovirus oder zu dem Virus vom TMV-Stamm nativ ist.
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ZA (1) ZA939798B (de)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5811653A (en) * 1992-12-30 1998-09-22 Biosource Technologies, Inc. Viral amplification of recombinant messenger RNA in transgenic plants
DE4315109A1 (de) * 1993-05-06 1994-11-10 Inst Pflanzengenetik & Kultur Verfahren und Vektorkonstrukt zur Expressionssteigerung von Transgenen
GB9615349D0 (en) * 1996-07-22 1996-09-04 Zeneca Ltd Virus resistance in plants
US6468745B1 (en) 1998-01-16 2002-10-22 Large Scale Biology Corporation Method for expressing a library of nucleic acid sequence variants and selecting desired traits
US6300133B1 (en) 1998-01-16 2001-10-09 Large Scale Biology Corporation RNA transformation vectors derived from an uncapped single-component RNA virus
US6344597B1 (en) * 1998-01-16 2002-02-05 Large Scale Biology Corporation Interspecific nicotiana hybrids and their progeny
US6426185B1 (en) * 1998-01-16 2002-07-30 Large Scale Biology Corporation Method of compiling a functional gene profile in a plant by transfecting a nucleic acid sequence of a donor plant into a different host plant in an anti-sense orientation
US6303848B1 (en) 1998-01-16 2001-10-16 Large Scale Biology Corporation Method for conferring herbicide, pest, or disease resistance in plant hosts
US20030166169A1 (en) * 1998-01-16 2003-09-04 Padgett Hal S. Method for constructing viral nucleic acids in a cell-free manner
US6300134B1 (en) 1998-01-16 2001-10-09 Large Scale Biology Corporation RNA transformation vectors derived from a single-component RNA virus and contain an intervening sequence between the cap and the 5′ end
US20020164585A1 (en) * 1998-01-16 2002-11-07 Sean Chapman Method for enhancing RNA or protein production using non-native 5' untranslated sequences in recombinant viral nucleic acids
US20030027173A1 (en) * 1998-01-16 2003-02-06 Della-Cioppa Guy Method of determining the function of nucleotide sequences and the proteins they encode by transfecting the same into a host
US20030074677A1 (en) * 1998-05-22 2003-04-17 Lada Rasochova Improved materials and methods for transformation
AR022383A1 (es) 1998-09-18 2002-09-04 Univ Kentucky Res Found Sintasas
DE19904285A1 (de) * 1999-02-03 2000-08-10 Max Planck Gesellschaft Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Analyten in Proben mit Hilfe von RNA-Replikons
DE19952955A1 (de) * 1999-11-03 2001-05-17 Acgt Progenomics Ag Verfahren zur Charakterisierung und zur Auftrennung von molekularen Assoziaten
US6878861B2 (en) * 2000-07-21 2005-04-12 Washington State University Research Foundation Acyl coenzyme A thioesterases
DE10049587A1 (de) 2000-10-06 2002-05-02 Icon Genetics Ag Vektorsystem für Pflanzen
US7060442B2 (en) * 2000-10-30 2006-06-13 Regents Of The University Of Michigan Modulators on Nod2 signaling
DE10061150A1 (de) 2000-12-08 2002-06-13 Icon Genetics Ag Verfahren und Vektoren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen
DE10102389A1 (de) 2001-01-19 2002-08-01 Icon Genetics Ag Verfahren und Vektoren zur Plastidentransformation höherer Pflanzen
US6800748B2 (en) 2001-01-25 2004-10-05 Large Scale Biology Corporation Cytoplasmic inhibition of gene expression and expression of a foreign protein in a monocot plant by a plant viral vector
DE10109354A1 (de) * 2001-02-27 2002-09-05 Icon Genetics Ag Rekombinante virale Schaltersysteme
DE10114209A1 (de) 2001-03-23 2002-12-05 Icon Genetics Ag Ortsgerichtete Transformation durch Verwendung von Amplifikationsvektoren
DE10115507A1 (de) 2001-03-29 2002-10-10 Icon Genetics Ag Verfahren zur Kodierung von Information in Nukleinsäuren eines genetisch veränderten Organismus
DE10121283B4 (de) * 2001-04-30 2011-08-11 Icon Genetics GmbH, 80333 Verfahren und Vektoren zur Amplifikation oder Expression von gewünschten Nucleinsäuresequenzen in Pflanzen
DE10132780A1 (de) 2001-07-06 2003-01-16 Icon Genetics Ag Plastidäre Genexpression über autonom replizierende Vektoren
DE10143237A1 (de) 2001-09-04 2003-03-20 Icon Genetics Ag Herstellung künstlicher interner ribosomaler Eingangsstellenelemente (Ires-Elemente)
DE10143238A1 (de) 2001-09-04 2003-03-20 Icon Genetics Ag Identifizierung eukaryotischer interner Ribosomen-Eingangsstellen (IRES)-Elemente
US7164056B2 (en) * 2002-05-03 2007-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Gene targeting using replicating DNA molecules
WO2004001003A2 (en) * 2002-06-20 2003-12-31 Board Of Trustees Operating Michigan State University Plastid division and related genes and proteins, and methods of use
DE50212323D1 (de) * 2002-08-01 2008-07-10 Trumpf Werkzeugmaschinen Gmbh Laserbearbeitungsmaschine
US6863731B2 (en) * 2002-10-18 2005-03-08 Controls Corporation Of America System for deposition of inert barrier coating to increase corrosion resistance
AU2003284388A1 (en) * 2002-11-01 2004-06-07 New England Biolabs, Inc. Organellar targeting of rna and its use in the interruption of environmental gene flow
EP1629090B1 (de) * 2002-11-06 2014-03-05 iBio, Inc. Expression von fremdsequenzen in pflanzen unter verwendung eines trans-aktivierungssystems
US7683238B2 (en) * 2002-11-12 2010-03-23 iBio, Inc. and Fraunhofer USA, Inc. Production of pharmaceutically active proteins in sprouted seedlings
US8148608B2 (en) * 2004-02-20 2012-04-03 Fraunhofer Usa, Inc Systems and methods for clonal expression in plants
US7692063B2 (en) * 2002-11-12 2010-04-06 Ibio, Inc. Production of foreign nucleic acids and polypeptides in sprout systems
ES2531125T3 (es) 2003-02-03 2015-03-10 Ibio Inc Sistema para la expresión de genes en plantas
US7655833B2 (en) * 2003-05-29 2010-02-02 Brookhaven Science Associates, Llc ADS genes for reducing saturated fatty acid levels in seed oils
WO2005019449A2 (en) * 2003-07-03 2005-03-03 Board Of Trustees Operating Michigan State University Expression of a recombinant transgene
DK1682667T3 (da) * 2003-11-10 2010-08-23 Icon Genetics Gmbh RNA-virus afledt plantekspressionssystem
WO2006012906A1 (en) * 2003-11-10 2006-02-09 Icon Genetics Ag Rna virus-derived plant expression system
MXPA06003715A (es) 2003-11-10 2006-06-23 Icon Genetics Ag Sistema de expresion de planta derivado de virus de arn.
EP1564295A1 (de) * 2004-01-23 2005-08-17 Icon Genetics AG Von RNA Viren abgeleitetes Expressionssystem
EP1616959A1 (de) 2004-07-07 2006-01-18 Icon Genetics AG Biologisch sichere transiente Proteinexpression in Pflanzen
CN100362104C (zh) * 2004-12-21 2008-01-16 华中农业大学 利用水稻转录因子基因OsNACx提高植物抗旱耐盐能力
CA2608717A1 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 The Board Of Trustees Operating Michigan State University Resistance to soybean aphid in early maturing soybean germplasm
EP2044204B1 (de) 2006-06-07 2014-04-30 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Pflanzliche expressionskonstrukte und verfahren zu deren nutzung
US7977535B2 (en) 2006-07-12 2011-07-12 Board Of Trustees Of Michigan State University DNA encoding ring zinc-finger protein and the use of the DNA in vectors and bacteria and in plants
US20090061492A1 (en) * 2006-11-15 2009-03-05 The Board Of Trustees For Michigan State University System Method for producing biodiesel
AR064180A1 (es) 2006-12-07 2009-03-18 Univ Kansas State Sorgo resistente a herbicida de acetolactato sintasa
ES2443118T3 (es) 2007-01-12 2014-02-17 Kansas State University Research Foundation Sorgo resistente a herbicidas inhibidores de acetil-CoA-carboxilasa
US20100240597A1 (en) 2007-06-15 2010-09-23 Arkansas State University Methods of delivery of molecules to cells using a ricin subunit and compositions relating to same
MX2010011511A (es) 2008-04-21 2011-06-09 Danziger Innovations Ltd Vectores de expresion viral de planta y uso de los mismos para generar variaciones genotipicas en genomas de plantas.
US9133475B2 (en) 2008-11-26 2015-09-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Aphid resistant soybean plants
US8362318B2 (en) 2008-12-18 2013-01-29 Board Of Trustees Of Michigan State University Enzyme directed oil biosynthesis in microalgae
US8373025B2 (en) 2009-02-09 2013-02-12 Chromatin Germplasm, Llc Herbicide resistant sorghum
WO2011048600A1 (en) 2009-10-21 2011-04-28 Danziger Innovations Ltd. Generating genotypic variations in plant genomes by gamete infection
WO2011082253A2 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Board Of Trustees Of Michigan State University A method to produce acetyldiacylglycerols (ac-tags) by expression ofan acetyltransferase gene isolated from euonymus alatus (burning bush)
WO2012074868A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Ms Technologies, Llc Optimized expression of glyphosate resistance encoding nucleic acid molecules in plant cells
WO2013005211A2 (en) 2011-07-05 2013-01-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Boron complexing plant materials and uses thereof cross-reference to related applications
CA2836403A1 (en) 2013-01-04 2014-07-04 Board Of Trustees Of Michigan State University New sources of aphid resistance in soybean plants
US10392629B2 (en) 2014-01-17 2019-08-27 Board Of Trustees Of Michigan State University Increased caloric and nutritional content of plant biomass
JP2017535296A (ja) 2014-11-27 2017-11-30 ダンツィガー イノベイションズ リミテッドＤａｎｚｉｇｅｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ． ゲノム編集のための核酸構築物
WO2018101824A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Universiteit Van Amsterdam Plants comprising pathogen effector constructs

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1192510A (en) * 1981-05-27 1985-08-27 Lawrence E. Pelcher Rna plant virus vector or portion thereof, a method of construction thereof, and a method of producing a gene derived product therefrom
CA1288073C (en) * 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
JPS6314693A (ja) * 1986-07-04 1988-01-21 Sumitomo Chem Co Ltd 植物ウイルスｒｎａベクタ−
ES2060646T3 (es) * 1987-02-09 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Virus rna hibrido.
US5811653A (en) * 1992-12-30 1998-09-22 Biosource Technologies, Inc. Viral amplification of recombinant messenger RNA in transgenic plants
ATE278791T1 (de) * 1988-02-26 2004-10-15 Large Scale Biology Corp Nichtnukleare chromosomale transformation
WO1990012107A1 (en) * 1989-03-31 1990-10-18 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Recombinant expression system based on satellite tobacco mosaic virus
NL9001711A (nl) * 1989-10-03 1991-05-01 Clovis Matton N V Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat.
WO1991013994A1 (en) * 1990-03-13 1991-09-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene expression
JPH04121200A (ja) 1990-09-07 1992-04-22 Nippon Nohyaku Co Ltd 植物細胞におけるポリペプチドの製造法
EP0479180A3 (en) * 1990-10-05 1992-08-26 Hoechst Aktiengesellschaft Virus resistant plants, method for their production
ATE194656T1 (de) * 1992-04-28 2000-07-15 Nihon Nohyaku Co Ltd Verfahren zur herstellung eines fremden gens oder dessen produkt in pflanzenzellen
IL108241A (en) * 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus

Also Published As

Publication number Publication date
EP0677113A1 (de) 1995-10-18
AU5987194A (en) 1994-08-15
US20020104123A1 (en) 2002-08-01
US5811653A (en) 1998-09-22
US6852846B2 (en) 2005-02-08
US20050150011A1 (en) 2005-07-07
ES2194865T3 (es) 2003-12-01
ZA939798B (en) 1995-02-28
US5965794A (en) 1999-10-12
CA2152934A1 (en) 1994-07-21
US6462255B1 (en) 2002-10-08
DE69332763D1 (de) 2003-04-17
KR960700344A (ko) 1996-01-19
AU694102B2 (en) 1998-07-16
ATE234361T1 (de) 2003-03-15
WO1994016089A1 (en) 1994-07-21
EP0677113B1 (de) 2003-03-12
US20020144308A1 (en) 2002-10-03
JPH08505289A (ja) 1996-06-11

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