DE69726175T2

DE69726175T2 - Methode zur hervorrufung von virusresistenz in einer pflanze

Info

Publication number: DE69726175T2
Application number: DE69726175T
Authority: DE
Inventors: Hubert Guilley; Gerard Jonar; Ken Richards; Salah Bouzoubaa; Claudine Bleykasten-Grosshans; Guy Weyens; Marc Lefebvre
Original assignee: SES Europe NV SA
Current assignee: SES Europe NV SA
Priority date: 1996-08-19
Filing date: 1997-08-18
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2017-08-19
Also published as: ATE254180T1; DE69726175D1; ES2210557T3; EE9900074A; PL189499B1; UA70915C2; EP0938574B1; EA004328B1; HU223266B1; SK284152B6; SK19799A3; EP0938574A1; AU3935097A; WO1998007875A1; HUP9904271A2; US6297428B1; EA199900144A1; HUP9904271A3; EE04379B1; DK0938574T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Induzieren einer viralen Resistenz in einer Zelle und in einer Pflanze, insbesondere zum Induzieren einer BNYW-Resistenz in einer Zelle einer Zuckerrübe und in der Pflanze, auch betrifft die Erfindung die erzielte Zelle und die Pflanze mit der viralen Resistenz.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Die weit verbreitete Viruskrankheit der Pflanze der Zuckerrübe (Beta vulgaris), welche unter dem Namen Rhizomania bekannt ist, wird von einem Furovirus verursacht, dem Rübenadernvergilbungsvirus (BNYVV = Beet Necrotic Yellow Vein Virus) (23, 24), welcher durch den an den Boden gebundenen Pilz Polymyxa betae (25) in die Wurzel der Rübe übertragen wird.
Die Krankheit beeinträchtigt in kennzeichnender Weise weiträumige Flächen in jenen Gegenden, wo die Zuckerrübenpflanze für die industrielle Anwendung in Europa, in den Vereinigten Statten und in Japan angebaut wird, und sie ist noch dabei sich an mehreren Plätzen in Westeuropa (26, 27) auszubreiten. Da kein praktisches Verfahren für eine wirksame Kontrolle der Ausbreitung des Virus in einem großen Maßstab mit Hilfe von chemischen oder von physikalischen Mitteln (28) vorhanden ist, weder bei den Pflanzen selbst noch in dem Erdboden, hat das Hauptobjektiv bis jetzt darauf abgezielt, die natürlichen Quellen der Resistenz innerhalb des Keimplasmas der Zuckerrübe zu identifizieren und durch Züchten eine Vielfalt von Zuckerrübenpflanzen zu entwickeln, welche die Gene der Resistenzeigenschaft exprimieren. Eine Vielfalt solcher gegenüber dem Virus wirksamer Toleranzgene ist identifiziert worden und einige sind erfolgreich bei dem Züchten von Varietäten von kommerziellen Zuckerrübenpflanzen (29, 30, 31) angewendet worden.
Nur die Verwendung von BNYVV-resistenten oder BNYVV-toleranten Varietäten wird die Farmer dazu befähigen, Zuckerrübenpflanzen in denjenigen BNYVV-verseuchten Gebieten anzubauen, wo die Zuckerrübenpflanze eine wesentliche Komponente der Pflanzenrotation darstellt und wo dieselbe in erheblicher Weise zu dem Einkommen des Bauern beiträgt.
Eine Anzahl von detaillierten Studien hat gezeigt, dass ein Unterschied bei der Empfindlichkeit gegenüber der BNYVV-Ansteckung unter den Genotypen oder unter den Varietäten der Zuckerrübe im Allgemeinen den Unterschied bei der Diffusion oder bei der Translokation des Virus in den Geweben der Wurzel widerspiegelt (32).
Es gibt jedoch erst wenige Berichte, welche einen deutlichen Hinweis darauf liefern, dass die Toleranzgene, sogar solche von unterschiedlichen Quellen des Keimplasmas von Zuckerrüben oder solche des Keimplasmas von wilden Verwandten der Zuckerrübe (33), unterschiedliche Mechanismen der Resistenz liefern würden. Solch eine Situation würde einen Zustand darstellen, der besser gehandhabt werden könnte, um lang andauernde Strategien für die BNYW-Resistenz entwerfen zu können.
Seit 1986 ist in einer gewissen Anzahl von Berichten und Veröffentlichungen die Verwendung von isolierten, viralen Gensequenzen beschrieben worden, welche in einer Pflanze exprimiert wurden, um der Pflanze einen hohen Grad an Toleranz gegenüber dem Virus zu verleihen oder sogar um derselben einen breiten Typus eines Spektrums an Resistenz gegen eine Anzahl von verwandten Viren zu verleihen (34, 35, 36). Eine Strategie, unter den am besten dokumentierten viralen Resistenzstrategien, welche auf einem genetischen Engineering bei vielen kultivierten Arten beruht, wie etwa der Kartoffel, dem Kürbis, der Gurke oder der Tomate, ist die Verwendung einer viralen Gensequenz, welche das Hüllenprotein des Zielvirus (37) kodiert, welches unter der Kontrolle der Regulatorelemente der Pflanze in der Pflanze exprimiert wird.
In dem Fall jedoch, wo die Resistenz durch das Hüllprotein vermittelt worden ist, könnte die Expression eines bestimmten Grades an Resistenz in der transgenen Pflanze auf unterschiedliche Mechanismen zurückzuführen sein, wie etwa auf eine RNA Co-Suppression und nicht notwendiger Weise auf die Produktion der Proteinsequenz.
Im Allgemeinen wird die Virussequenz in eine geeignete Kultur einer Zelle oder eines Gewebes der Pflanzenart transformiert, dies unter Verwendung eines durch ein Agrobacterium vermittelten Transformationssystems oder einer direkten Gentransfermethode gemäß den Zwängen der Methode der Gewebekultur oder der Zellkultur, welche erfolgreich bei einer gegebenen Art angewandt werden kann. Eine ganze Pflanze wird regeneriert werden und die Expression des Transgens wird gekennzeichnet werden.
Obwohl die Zuckerrübe als eine bei der Zellkultur widerspenstige Art bekannt ist, welche das Ausmaß an praktischen Anwendungen des genetischen Engineerings bei diesen Pflanzenarten beschränkt, so gibt es doch eine gewisse Anzahl von vereinzelten Berichten über eine erfolgreiche Transformationen und Regeneration von ganzen Pflanzen (38). Ein paar Beispiele einer Engineeringstoleranz gegenüber dem BNYVV, infolge einer Transformation und einer Expression der Sequenz des BNYVV Hüllproteins in das Genom der Zuckerrübe, sind ebenfalls veröffentlicht worden (39, WO91/13159), obwohl sie selten Daten über die gesamten funktionalen, transgenen Zuckerrübenpflanzen (40) wiedergeben. Insbesondere übermitteln die Berichte nur begrenzte Daten auf der Ebene der Resistenz, so wie dieselbe unter Ansteckungsbedingungen mit transgenen Zuckerrübenpflanzen beobachtet worden ist, welche mit einem Gen transformiert worden sind, welches eine Sequenz des BNYVV Hüllproteins verschlüsselt (41, 42).
Ein vollständiges Technologiepaket, einschließlich eines Verfahrens zur Transformation einer Zuckerrübe und der Verwendung der Expression der Sequenz des BNYVV Hüllproteins als einer Quelle für die Resistenz bei der transgenen Zuckerrübenpflanze, welche durch jenes Transformationsverfahren erzielt worden ist, wird in der Patentanmeldung WO91/13159 beschrieben.
Auf der Basis der veröffentlichten Information kann man nicht den Schluss ziehen, dass der durch das Hüllprotein vermittelte Mechanismus der Resistenz irgendein Potential liefert, um auf die Zuckerrübenpflanze eine völlige Immunität gegenüber der BNYVV-Ansteckung zu übertragen, indem man die Vermehrung des Virus und die Diffusionsmechanismen vollständig verhindert. Einen Mechanismus der Resistenz zu identifizieren, welcher in der Lage wäre, die Ausbreitung des Virus in einem frühen Stadium des Ansteckungsprozesses in signifikanter Weise zu blockieren, dies würde ein größeres Kriterium für einen Erfolg bei der Entwickelung einer transgenen Resistenz sein, zusätzlich zu der Tatsache, dass sogar ein Grad an Resistenz, der vergleichbar ist mit jenem Grad, der von den Resistenzgenen her bekannt ist, die bei dem Keimplasma in der Zuckerrübe identifiziert worden sind, die verfügbaren Mechanismen der Resistenz diversifizieren würde.
Weil es nachgewiesen ist, dass sich die Krankheit in viele Länder oder in viele Gebiete mit einer solchen Geschwindigkeit ausbreitet, welche von der Kombination zahlreicher lokaler Faktoren aus der Umwelt und der Landwirtschaft abhängt, deshalb besteht ein größeres Interesse daran, die Quellen der Mechanismen der genetischen Resistenz zu diversifizieren, was alleine oder in Kombination eine stabile und eine lang andauernde Resistenzstrategie bei den gegenwärtigen und den zukünftigen Varietäten der Zuckerrübenpflanzen, welche für den industriellen Gebrauch angebaut werden, vermitteln kann.
Die Veröffentlichung von Xu H. et al. [Plant Cell Report, Vol. 15, S. 91–96 (1995)] beschreibt das genetische Engineering des Konstruierens einer Resistenz gegen einen Kartoffelvirus X bei vier kommerziellen Kartoffelkulturen. Dieses Dokument stellt jedoch fest, dass transgene Kartoffelklone das 8KG Gen (das TGB3 Konstrukt) mit eingeschlossen haben. Wenn diese transgenen Pflanzen jedoch dem PVX ausgesetzt wurden, dann gab es keinen Schutz gegen PVX, was die Vermutung nahe legt, dass das OK Protein keine Rolle bei dem Schutz gegen PVX spielt.
Ziele der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein neues Verfahren zum Einführen von verschiedenen viralen Resistenzen in eine Zelle und in eine Pflanze zu liefern, auch zielt sie auf die erhaltenen Zellen und Pflanzen mit der viralen Resistenz ab.
Ein Hauptziel der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zum Einführen der BNYVV-Resistenz in eine Zelle und in eine Pflanze zu liefern, auch zielt die Erfindung auf die erhaltene BNYVV-resistente Zelle und Pflanze ab, insbesondere auf die verwirklichte Zuckerrübenzelle und – pflanze (Beta vulgaris ssp.).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung einer alternativen Sequenz eines Pflanzenvirus, insbesondere des BNYVV Virus, um ein hohes Maß an Toleranz gegenüber einer viralen Ansteckung zu erhalten, insbesondere um ein schnelles und vollständiges Blockieren der Mechanismen der Vermehrung und der Diffusion des Virus in einer Pflanze zu gewährleisten, insbesondere in der Zuckerrübenpflanze (Beta vulgaris), einschließlich in der Futterrübe, der sog. Swiss Whard und der Süßrübe, welche dieser viralen Ansteckung ebenfalls ausgesetzt sein können. Die Expression der Resistenz wird in einer transgenen Zelle und Pflanze erzielt werden, insbesondere in Zellen und Pflanzen der Zuckerrübe, welche durch das Transformationsverfahren hergestellt werden, welches Gegenstand der Patentanmeldung WO95/10178 ist, oder durch andere Transformationsverfahren, welche auf dem Agrobacterium tumefaciens oder auf dem direkten Gentransfer beruhen. Wegen der hohen Wirksamkeit befähigt das Transformationsverfahren, so wie es in WO95/10178 beschrieben worden ist, zur Herstellung von großen Stückzahlen von transformierten Pflanzen, insbesondere von Zuckerrübenpflanzen, und man wird diesem Verfahren den Vorzug beim Entwickeln von transgenen Pflanzen geben, welche analysiert und gekennzeichnet werden können hinsichtlich ihres Niveaus an viraler Resistenz, insbesondere hinsichtlich ihrer BNYW-Resistenz, einschließlich ihrer Feldbewertung.
Das Genom des Rübenadernvergilbungsvirus (BNYVV = Beet Necrotic Yellow Vein Virus) besteht aus fünf Plus-Strang-RNAs, von denen zwei (RNAs 1 und 2) Funktionen kodieren, die wesentlich für die Ansteckung aller Pflanzen sind, während die anderen drei (RNAs 3, 4 und 5) mit in einer über einen Vektor vermittelten Ansteckung der Wurzeln einer Zuckerrübe (Beta vulgaris) impliziert sind (1). Eine Bewegung von einer Zelle zu einer anderen Zelle des BNYVV wird beherrscht von einem Satz aus drei aufeinander folgenden, sich leicht überlappenden viralen Genen bei RNA 2, welche als der Dreifachgenblock 3 (TGB = Triple Gene Block) (2) bekannt sind und welche in der genannten Reihenfolge die viralen Proteine P42, P13 und P15 kodieren (Genprodukte werden durch ihren berechneten Faktor M_r in kilodalton bezeichnet) (3).
In der folgenden Beschreibung werden die TGB Gene und die entsprechenden Proteine durch die folgenden Begriffe und Bezeichnungen identifiziert: TGB1, TGB2, TGB3 oder durch ihre kodierten, viralen Proteinnummern P42, P13 und P15. Die TGB Gegenstücke sind in anderen Furoviren (4, 5) und in den Potex-, Carla- und Hordeiviren vorhanden (6).
In der Tabelle 1 sind Viren mit einer TGB3 Sequenz, mit der Angabe des Molekulargewichtes des TGB3 dieser Viren, ihres Wirtes und der Referenzen dargestellt worden.
Tabelle 1
Die Erfinder schlagen hiermit ein neues Verfahren vor für die Bereitstellung einer Resistenz gegenüber Pflanzenviren in einer Pflanze, und zwar durch Blockieren der Mechanismen der Vermehrung und der Diffusion des Virus in der Pflanze, insbesondere in dem Gewebe der Wurzel derselben. Um diese Resistenz zu beweisen, beschreiben die Erfinder nachfolgend die Wirkung der Überexpression der TGB Sequenzen alleine oder in Verbindung auf die Mechanismen der Vermehrung und der Diffusion des BNYVV-Virus in den Pflanzen von C.quinoa, welche auch Wirt für die BNYVV-Viren sind und welche leichter von den Experten auf diesem Gebiet gehandhabt werden können.
Die Erfinder haben auch Experimente mit Beta macrocarpa gemacht. Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass es möglich sein wird, die Transformation von Pflanzen ebenfalls durch das Verfahren gemäß der Erfindung zu erzielen und eine Expression des TGB3 Gens durch jene Pflanzen zu erzielen. Daher könnte dieses Verfahren, so wie dies in der nachfolgenden Beschreibung erklärt wird, dazu verwendet werden, um verschiedene virale Resistenzen in verschiedenen Pflanzenarten zu erhalten, welche Gegenstand einer Ansteckung durch Viren sind, welche durch das Vorhandensein einer TGB3 Sequenz in ihrem Genom gekennzeichnet sind.
Es ist bekannt, dass es beim BNYVV der Synthese eines viralen Hüllproteins nicht bedarf für die Erzeugung von lokalen Schädigungen auf den Blättern des Wirts, wie Chinopodium quinoa (7), was einen Hinweis darauf liefert, dass eine Bildung von Virionen für eine Bewegung von einer Zelle zu einer anderen Zelle nicht erforderlich ist.
Die Art jedoch, nach welcher die TGB Komponenten bei dem Bewegungsprozess helfen, wird nicht verstanden, obwohl computerunterstützte Vergleiche charakteristische beibehaltene Sequenzen nachgewiesen haben, welche die Schlüssel zu ihrer Funktion liefern können. So enthält das 5'- proximale TGB Protein (TGB1) unverändert eine Reihe von Sequenzmotiven, welche für eine ATP/GTP-Bindungshelicase kennzeichnend sind, während das zweite Protein (TGB2) immer zwei eine Membran potentiell überspannende hydrophobe Bereiche ausweist, welche durch eine hydrophile Sequenz voneinander getrennt sind, welche ein in hohem Grad beibehaltenes Peptidmotiv von unbekannter Bedeutung enthält (6). Die Sequenz und die Größe des dritten TGB Proteins (TGB3) ist variabler, obwohl der endständige N-Abschnitt im Allgemeinen eher hydrophob ist. Subgenome RNAs mit 5'-Termen, welche oberhalb der offenen Leseraster (ORFs = Open Reading Frames) für die TGB1 und TGB2 von BNYVV vorkommen, sind nachgewiesen worden (1), aber es ist über keine solchen Arten für den TGB3 von BNYVV berichtet worden (2) oder über irgendwelche anderen den TGB enthaltenden Viren. In dem Fall des Kartoffelvirus X (PVX; Ref. 8) und des Streifenmosaikvirus der Gerste (BSMV; Ref. 9) liegt ein offensichtlicher Beweis dafür vor, dass die TGB2 und TGB3 Produkte aus demselben RNA Subgenom exprimiert werden.
Bis jetzt ist über kein Beispiel eines Virus berichtet worden, bei welchem die drei TGB Elemente unterschiedlich auf derselben RNA angeordnet sind oder auf verschiedene RNA-Genome verteilt sind, was die Vermutung nahe legt, dass ihre Verbindung in einer besonderen Ordnung hinsichtlich der Steuerung ihrer Funktion von Bedeutung sein könnte.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für das Induzieren einer viralen Resistenz gegenüber einem Virus mit einem Dreifachgenblock (TGB), unter der Voraussetzung, dass es sich nicht um den Kartoffelvirus X handelt. Der Virus wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Virus der Stammnarbung des Apfels, dem Virus der Blaubeerefleckenkrankheit, dem Kartoffelvirus M, dem Mosaikvirus des Weißklees, dem Cymbidium Mosaikvirus; dem Streifenmosaikvirus der Gerste, dem Kartoffel-mop-top-Virus, dem Klumpenvirus der Erdnuss und dem vom Boden übertragenen Virus der Rübe; und das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

– ein Zubereiten eines Nukleinsäurekonstruktes, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche mindestens 70% der Nukleinsäuresequenz des TGB3 von jenem Virus oder von seiner entsprechenden cDNA entspricht, und welche im Hinblick auf die Funktionsfähigkeit mit einer oder mit mehreren in einer Pflanze aktiven regulatorischen Sequenzen verbunden ist,
– ein Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Nukleinsäurekonstrukt, und möglicherweise
– ein Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle.

Vorzugsweise ist die Pflanze eine Pflanze, welche von dem oben beschriebenen Virus angesteckt sein kann und sie wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Apfel, der Blaubeere, der Kartoffel, dem Klee, der Orchidee, der Gerste, der Erdnuss und der Rübe.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die erhaltene Pflanzenzelle und die transgene (oder transformierte) Pflanze (hergestellt aus jenen Pflanzenzellen), welche gegenüber jenen Viren resistent sind und welche jenes Nukleinsäurekonstrukt enthalten.
Die Erfinder haben unerwarteter Weise auch entdeckt, dass es möglich ist, in eine Pflanze eine BNYVV-Resistenz zu induzieren mit Hilfe eines Verfahrens, das die folgenden Schritte umfasst:

– ein Zubereiten eines Nukleinsäurekonstruktes, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 90% der Nukleinsäuresequenz enthält, welche enthalten ist zwischen den Nukleotiden 3627 und 4025 des 5' Stranges genomischer oder subgenomischer RNA 2 des BNYVV oder seiner entsprechenden cDNA, und welche im Hinblick auf die Funktionsfähigkeit mit einer oder mit mehreren in einer Pflanze aktiven regulatorischen Sequenzen verbunden ist,
– ein Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Nukleinsäurekonstrukt, und möglicherweise
– ein Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle.

Die Nukleinsäuresequenz, welche zwischen den Nukleotiden 3627 und 4025 des 5' Stranges genomischer oder subgenomischer RNA 2 enthalten ist und welche das P15 Protein kodiert, wird in der 6 und in der Veröffentlichung (3) beschrieben. Diese Nukleinsäuresequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz werden in der nachfolgenden Spezifikation als SEQ ID NO. 1 beschrieben.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Pflanzenzelle und eine transgene Pflanze (hergestellt aus jenen Pflanzenzellen), welche gegenüber BNYVV resistent sind und welche ein Nukleinsäurekonstrukt mit einer Nukleinsäuresequenz umfassen, welche mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 90% der Nukleinsäuresequenz entspricht, welche zwischen den Nukleotiden 3627 und 4025 des 5' Stranges genomischer oder subgenomischer RNA 2 des BNYVV oder seiner entsprechenden cDNA enthalten ist, und welche im Hinblick auf die Funktionsfähigkeit mit einer oder mit mehreren in einer Pflanze aktiven regulatorischen Sequenzen verbunden ist.
Vorzugsweise wird diese Pflanzenzelle oder diese transgene Pflanze (hergestellt aus jenen Pflanzenzellen), welche gegenüber BNYVV resistent ist, nach dem der Erfindung entsprechenden Verfahren erzielt.
Die Varianten der als SEQ ID NO. 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz umfassen das Einfügen, das Ersetzen oder das Weglassen von Nukleotiden, welche dieselben oder verschiedene Aminosäuren kodieren. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch jene Varianten der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 1, welche mehr als 70 Homologie mit jener Nukleinsäuresequenz darstellen und welche vorzugsweise dazu in der Lage sind unter zwingenden oder unter nicht zwingenden Bedingungen zu jener Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren.
Vorzugsweise sind jene Sequenzen auch in der Lage, eine BNYVV-Resistenz in eine Pflanze hinein zu induzieren.
Die Begriffe „eine virale Resistenz in eine Pflanze induzieren" bedeutet ein Induzieren einer möglichen Verringerung oder einer deutlichen Verzögerung bei dem Erscheinen von Infektionssymptomen, bei den Mechanismen der Vermehrung und der Diffusion des Virus in die Pflanze, insbesondere in das Gewebe der Wurzel.
Eine oder mehrere regulatorische Sequenzen jener Nukleinsäuresequenz sind eine oder mehrere Promotor- und Terminatorsequenzen, welche in einer Pflanze aktive sind.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann auch ein auswählbares Markierungsgen enthalten, welches dazu verwendet werden könnte die transformierte Zelle oder Pflanze zu identifizieren und das Nukleinsäurekonstrukt gemäß der Erfindung zu exprimieren.
Vorzugsweise ist die Zelle eine Stomazelle und die Pflanze ist vorzugsweise eine Zuckerrübe (Beta vulgaris ssp.), welche aus jenen Zellen hergestellt worden ist.
Gemäß der Erfindung ist die Promotorsequenz eine konstitutive oder eine fremde, pflanzliche Promotorsequenz, welche vorzugsweise ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus der Promotorsequenz des 355 Blumenkohlmosaikvirus, aus dem Promotor von Polyubiquitin Arabidopsis Thaliana (43), einem Promotor, welcher hauptsächlich in den Wurzelgeweben aktiv ist, wie etwa der Par-Promotor des Haemoglobin-Gens von Perosponia Andersonii (Landsman et al. Mol. Gen. Genet. 214: 68–73 (1988)) oder aus einer Mischung derselben.
Ein letzter Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein transgenes Pflanzengewebe, wie etwa dasjenige einer Frucht, eines Stammes, einer Wurzel, einer Knolle, eines Samens der transgenen Pflanze gemäß der Erfindung oder sie bezieht sich auf eine reproduzierbare Struktur (vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kallus, Knospen oder Embryonen), welche man von der transgenen Pflanze oder Zelle gemäß der Erfindung erhalten hat.
Die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung für die Pflanzentransformation, für die Kultur und die Regeneration der Gewebe eingesetzten Techniken sind jene, die von den Experten auf diesem Gebiet der. Technik gut bekannt sind. Solche Techniken sind vorzugsweise diejenigen, welche in den Internationalen Patentanmeldungen WO95/10178 oder WO91/13159 entsprechend der Europäischen Patentanmeldung EP-B-0517833 beschrieben worden sind, welche durch Bezugnahme mit hierin eingebunden werden. Diese Techniken werden vorzugsweise eingesetzt für die Herstellung transgener Zuckerrüben gemäß der Erfindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 stellt die Struktur eines Wildtyps von BNYVV RNA 2 und von Replikonen (Replikationseinheiten) dar, welche die TGB Proteine exprimieren.
Die 2 stellt die in vitro Translation der Replikonen der TGB Gene in einem Keimextrakt des Weizens dar.
Die 3 stellt die Vermehrung der Replikonen dar, welche die TGB Proteine in den Protoplasten von Chinopodium quinoa kodieren, sowie der Expression von P42.
Die 4 stellt die Komplementation des RNA 2 Transkripts dar, welches Defekte in den verschiedenen TGB Genen enthält, durch das entsprechende Wildtypgen, das von einem Replikon geliefert worden ist.
Die 5 zeigt die Wirkung der Replikonen auf die Ansteckung mit BNYVV RNAs 1 und 2 vom Wildtyp.
Die 6 stellt die Nukleotide und die Aminosäuresequenz des TGB3 dar, welches das P15 von BNYVV kodiert.
Die 7 zeigt das Vorhandensein der Kodierungsgebiete des BNYVV P15 Gens in dem Genom der Zuckerrübe mit Hilfe einer PCR.
Die 8 zeigt die Integration des BNYVV P15 Gens in das Genom der Zuckerrübe mit Hilfe der Southern Blothybridisierung.
Beschreibung der Erfindung
Um die potentielle Anwendung von besonderen aus der viralen RNA2 des BNYVV isolierten Gensequenzen zu identifizieren und um eine BNYVV-Resistenz über den Weg einer Pflanzentransformation in einer Zuckerrübe zu erzeugen, haben die Erfinder Untersuchungen darüber angestellt, ob unabhängige Expressionen des BNYVV TGB Proteins möglich sind über den Weg des Einfügens des ORFs (offenen Leserasters) eines jeden derselben in ein virales replikationsabhängiges "Replikon", welches aus der BNYVV RNA 3 abgeleitet worden ist. Die Erfinder haben gezeigt, dass bei gemischten Infektionen von C.quinoa Blättern das so exprimierte TGB1 oder TGB2 Protein des BNYVV die RNA 2 des BNYVV komplementieren kann, welches eine Mutation enthält, welche das entsprechende TGB Protein mit einer Sperre belegen kann. Es wurde jedoch keine Komplementation mit einem Replikon beobachtet, welches TGB3 enthielt, es sei denn, das TGB3 ORF war abwärts von dem ORF für TGB2 in dem Replikon positioniert. Wenn es so mit den RNAs 1 und 2 vom Wildtyp gemeinsam inokuliert wurde, dann verhinderte das Replikon, welches das TGB3 ORF des BNYVV exprimiert, die Ansteckung. Die Daten sind konsistent mit einem Modell für die Expression der TGB Proteine, in welchen die Translation von P15 von einer dicistronischen subgenomischen RNA die Expressionsgrade der P15 in vivo steuert. Die Erfinder haben auch identifiziert, dass eine hohe Expression von P15 ein schnelles und vollständiges Blockieren der Mechanismen der Vermehrung und der Diffusion des Virus in der Pflanze gewährleisten konnte.
Materialien und Verfahren cDNA Klone
Der Transkriptionsvektor für die Herstellung einer vollständigen Länge von RNA 1 und RNA 2 des BNYVV vom Wildtyp bestand in pB15 (10) bzw. pB2-14 (11). Die Transkriptionsvektoren für die vorher beschriebenen RNA 2 Mutanten waren pB2-14-F, -H, -I und -J (2) und pB2-14-ΔSN, -ΔS12, -ΔS37, -ΔB1, -ΔB2, -ΔB2, -ΔN und -GAA (11). Die RNA 2 Vernichtungsmutante pB2-14-HP1 wurde erzeugt durch Eliminierung der Sequenz zwischen den Nukleotiden 3158 und 3258. Das leere von der RNA 3 des BNYVV abgeleitete Replikon, rep0, wurde durch Transkription der RNA 3 Vernichtungsmutante pB35AΔES (12) erzielt. TGB Sequenzen zum Einfügen in rep0 wurden verstärkt durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) unter Verwendung von Primern, von denen ein jeder an seinem 5'- Ende eine nicht schablonenähnliche BamHI Lage aufwies. PCR Fragmente, die dem P42 Gen (Nukleotide 2127–3297), dem P13 Gen (Nukleotide 3282–3650), dem P15 Gen (Nukleotide 3627–4025) und den beiden Genen P13 und P15 (Nukleotide 3282–4025) entsprachen, wurden mit BamHI digeriert und in die von BamHI aufgespaltete pB35AΔES eingefügt. Die sich daraus ergebenden Konstrukte wurden verwendet, um jeweils rep24, rep13, rep15 und rep1315 zu transkribieren. Ein Replikon, das eine Rasterverschiebungsmutation in dem P15 ORF (Rep15-X). enthielt, wurde hergestellt durch Einfüllen einer XbaI Lage (Nukleotid 3948) in die Überhänge eines Einsatzes. Die eingefügten Rasterverschiebungsmutationen in rep13-I, rep1315-I und rep15-J wurden so erzeugt, wie dies für die entsprechenden Mutationen der RNA 2 in der vollständigen Länge beschrieben worden sind (2). Klonierte PCR-amplifizierte Sequenzen wurden durch Sequenzieren dahingehend überprüft, ob sie fehlerfrei seien (13).
In Vitro Transkripte
Gecappte Transkripte wurden hergestellt durch eine Bakteriophage T7 Polymerase Run-off Transkription (10) eines DNA Plasmids, das durch HindIII für pB15 und die Replikonkonstrukte und durch SalI für pB2-14 und durch verwandte Konstrukte linearisiert worden war. Die Konzentration und die Integrität des Transkriptes wurden bewertet durch eine Gelelektrophorese mit Agarose. Blätter wurden mechanisch inokuliert mit 50 μl pro Blatt einer Inokulationspufferlösung, welche 1 μg eines jeden Transkriptes enthielt (2). Bei einigen Experimenten wurden die RNA 1 und 2 Transkripte durch 0,025 μg der hoch infektiösen viralen RNA ersetzt, welche aus dem vom BNYVV isolierten Stras 12 isoliert und in reiner Form gewonnen worden war (10). Vorläufige Experimente zeigten, dass diese Menge an viraler RNA hinsichtlich ihrer Infektiosität (gemessen durch einen lokalen Schädigungstest) annähernd gleichwertig war mit einer Mischung, die 1 μg von einem jeden der RNA 1 und 2 Transkripte enthielt. Für Protoplastinfektionen wurden 0,5 μg der viralen RNAs 1 und 2 plus ein 3 μg Replikontranskript durch Elektroporation in 2 ·10⁵ Protoplasten hinein inokuliert (2).
Aus Replikonen erhaltene Transkripte wurden in ein Keimextrakt des Weizens übersetzt (14) und die mit [³⁵S]-markierten Translationsprodukte wurden durch eine Autoradiographie nach SDS-PAGE visualisiert (15, 16). Die in die Translationsprodukte eingebundene Radioaktivität wurde mit einem Fujix MAS1000 BioAnalyzer quantifiziert und die Werte wurden angepasst für einen Methioningehalt bei der Berechnung von relativen Translationsniveaus.
Nachweis von viraler RNA und von Proteinen
Die gesamte RNA wurde aus inokulierten Blättern extrahiert (2), und zwar 10 Tage nach der Inokulation (pi = post-inoculation) und aus Protoplasten nach 48 Stunden ab der Inokulation. Virale RNA wurde nachgewiesen durch eine Northern Hybridisierung mit ³²p-markierten, viralen Antisense RNA Transkripten (17) als Sonden. Die RNA 1- spezifische Sonde war komplementär zu den Nukleotiden 4740– 5650, die RNA 2- spezifische Sonde war komplementär zu den Nukleotiden 2324–3789 und die RNA 3- spezifische Sonde zu den Nukleotiden 1–380. Die P42, P14 und das Hüllprotein wurden nachgewiesen durch einen Western Blot der gesamten Proteinextrakte der infektiösen Protoplasten unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums eines Kaninchens, welches für jedes Protein spezifisch ist (18). Die Stabilität der in RNA 2 eingeführten Mutationen wurde getestet durch die Polynukleotid-Kettenreaktion, im Anschluss an die reverse Transkription (RT-PCR) der gesamten RNA Extrakte aus den infektiösen Pflanzen. Reverse Transkripte wurden erzeugt unter Zuhilfenahme eines Kits der Marke Expand^TM (Boehringer) für die reverse Transkription, dies unter Einhaltung der Anweisungen des Herstellers. Die PCR wurde im Wesentlichen so ausgeführt, wie dies in (19) beschrieben worden ist, unter Verwendung von 25 Zyklen nach der folgenden Vorschrift: 94° (30 sec), 50° (30 sec), 72° (3 min). Paare von Primern für eine PCR Vermehrung in verschiedenen Regionen der RNA 2 cDNA entsprach den Nukleotiden 1143–1151 und 3393–3412 (P42 Gen) und den Nukleotiden 3151–3169 und 4128–4148 (P13 und P15 Gene) (oder war komplementär zu denselben in dem Fall des zweiten Mitgliedes eines jeden Paares von Primern. Der Primer, der eingesetzt wurde, um die cDNA Synthese vor den PCR Reaktionen in die Wege zu leiten, war komplementär zu den Nukleotiden 4128–4148.
ERGEBNISSE
Replikonen, welche die BNYVV TGB Proteine exprimieren
Vorausgesetzt es sind ausreichend Sequenzen an den 3'- und 5'- Enden zurückbehalten worden, dann kann ein BNYVV RNA 3 Transkript, von dem der zentrale Bereich gelöscht worden ist, wirksam eine Replikation an den Blättern von C.quinoa durchführen, wenn dasselbe gemeinsam mit RNAs 1 und 2 inokuliert worden ist, und es kann ein fremdes Gen exprimieren, welches an der Stelle der gelöschten Sequenz eingefügt worden ist (12, 20). Die Erfinder haben solch ein „Replikon" auf der Basis von RNA 3 verwendet, um ein jedes der BNYVV TGB Proteine aus seinem normalen Zusammenhang in RNA 2 heraus zu exprimieren, und die Erfinder haben bei einem jeden Replikon die Kapazität getestet, eine in dem entsprechenden TGB Gen fehlende RNA 2 Mutante zu komplementieren.
Die in dieser Untersuchung eingesetzten Replikonen sind in der 1 dargestellt. Die 1A ist die Genomkarte der RNA 2. Die TGB Gene sind schattiert und Linien oberhalb der Kartierung deuten auf die Extension der subgenomen RNAs 2sub_a und 2sub_b hin. Die Positionen der Deletionen und der durch Rasterverschiebung induzierten Einfügungen in RNA 2 sind angedeutet. Die 5'- endständige Capping Struktur ist durch einen Kreis gekennzeichnet. P21 ist das größere virale Hüllprotein. RT = Bereich zum Hindurchlesen (3). (B) BNYVV RNA 3 – abgeleitete Replikonen, enthalten die TGB Gene des BNYVV (leicht schattiert) oder das TGB3 Gen, welches das P17 des Klumpenvirus der Erdnuss (PCV) (dunkel schattiert) kodiert. Die BamHI Lage in dem leeren Replikon (rep0), welche für das Einfügen der PCR-amplifizierten TGB Sequenzen verwendet wird, ist gezeigt worden. Die Positionen der eine Rasterverschiebung induzierenden Einfügungen in den verschiedenen P13 und P15 Replikonenmutanten sind angedeutet. Zusätzlich zu den Konstrukten rep42, rep13 und rep15, von denen ein jedes ein TGB Gen enthält, wurde ein viertes Konstrukt (rep1315) erzeugt, welches beide Gene enthielt, sowohl das P13 Gen als auch das P15 Gen, welche in derselben relativen Konfiguration wie in RNA 2 angeordnet sind. Die Fähigkeit eines jeden Replikons zur direkten Expression des eingefügten Gens oder der eingefügten Gene wurde durch eine in vitro Translation des Transkripts in einen Keimextrakt des Weizens getestet. Von den rep42, rep13 und rep15 Transkripten steuerte ein jedes eine Synthese eines ergiebigen Produktes (2A., Linie 2; 2B, Linien 2 und 3), welches nicht in Translationen erzeugt wurde, welche mit einem Transkript programmiert worden waren, welches dem leeren Replikon rep0 entspricht ( 2A, Linie 1; 2B, Linie 1). In der 2(A) sind mit S³⁵-Methionin markierte Translationsprodukte des leeren Replikons rep0 (Linie 1) und rep42 (Linie 2) durch eine Autoradiographie nach PAGE (15) dargestellt worden. Das angedeutete Band wurde als P42 identifiziert durch Vergleich seiner Beweglichkeit mit derjenigen der Markierungen für das Molekulargewicht (nicht gezeigt). In der 2(B) sind Translationsprodukte dargestellt, welche durch rep0 (Linie 1), rep13 (Linie 2), repl5 (Linie 3) und rep1315 (Linie 4) gerichtet und durch Autoradiographie nach PAGE veranschaulicht sind (16). Die versuchsweise als P13 und P15 identifizierten Bande sind mit einem Hinweis nach rechts indiziert worden. Das mit einem Sternchen bezeichnete Hintergrundband wurde auch synthetisiert als kein Transkript in das Translationsextrakt eingeführt wurde. Die relativen Beweglichkeiten der verschiedenen Translationsprodukte waren so, wie man es sich erwartet hatte, mit der Ausnahme, dass das mutmaßliche P13 sich ein bisschen langsamer bewegte als das P15, vermutlich wegen seiner nicht typischen Aminosäurezusammensetzung. Das dicistronische Konstrukt rep1315 steuerte die Synthese von beiden, sowohl von P13 als auch von P15 (2B, Linie 4), in relativen molaren Mengen von 3 : 1 (Werte die berichtigt sind mit der Differenz der Anteile an Methionin der zwei Proteine; wenn das N-endständige Methionin eines jeden Proteins posttranslational entfernt wird, dann beträgt das molare Verhältnis 5 : 1).
Die Kapazität der Replikonen durch die virale Replikationsmaschinerie in vivo vermehrt zu werden, wurde getestet durch eine gemeinsame Inokulation mit Replikontranskripten auf C.quinoa Protoplasten zusammen mit BNYVV RNAs 1 und 2. Eine Northern Blotanalyse der gesamten RNA, welche aus den Protoplasten nach 48 Stunden pi extrahiert worden war, deckte auf, dass sämtliche Replikone, die TGB Gene enthielten, wirksam vermehrt worden sind ( 3A). Die 3(A) stellt den Nachweis durch eine Northern Hybridisierung von viralen RNAs in C.quinoa Protoplasten dar, welche mit BNYVV RNAs 1 und 2 alleine (Linie 2) oder ergänzt mit rep0 (Linie 3), rep42 (Linie 4), rep13 (Linie 5), rep1315 (Linie 6) und rep15 (Linie 7) inokuliert worden sind. Die RNA von modellinokulierten Protoplasten wurde in der Linie 1 analysiert. Die Protoplasten wurden nach 48 Stunden pi geerntet und virale RNAs wurden nachgewiesen unter Verwendung von ³²p-markierten, viralen RNA-spezifischen Antisense RNA Sonden. Die Replikonen sind zur Kennzeichnung mit Pfeilköpfen versehen. Die 3(B) stellt einen Immunonachweis von P42 in den gesamten Proteinextrakten von C.quinoa Protoplasten dar, welche inokuliert worden sind mit BNYVV RNAs 1 und 2 (Linie 2), mit dem Transkript von der RNA 1 des Wildtyps plus dem Transkript der RNA 2 Mutante pB2-14-H, welche eine Rasterverschiebungsmutation in dem P42 Gen (11) (Linie 3) enthält, mit der RNA 1 und mit pB2-14-H Transkripten plus rep42 (Linie 4). Aus modellinokulierten Protoplasten extrahiertes Protein wurde in Linie 1 analysiert. Nach PAGE (15) und einem Elektrotransfer auf Nitrocellulose wurden P42, ein größeres virales Hüllenprotein (CP) und P14 durch einen Immunonachweis festgestellt mit einer Mischung eines. für jedes Protein spezifischen Antiserums (18). Die Stellen der Molekulargewichtsstandards sind links an dem Blot mit kilodalton gekennzeichnet. Eine Western-Blot Analyse offenbarte, dass der P42 Anteil in den Protoplasten, welche mit einer Mischung von rep42 plus Transkripten von RNA 1 und der Rasterverschiebungsmutante pB2-14-H infiziert worden waren, verursacht durch ein Einfüllen in eine SpeI Lage innerhalb des P42 Gens von RNA 2 (siehe 1), etwa das Zweifache von jenen Protoplasten betrug, welche mit RNA 1 plus RNA 2 vom Wildtyp infiziert worden waren (3B, Linien 2 und 3). Man beachte, dass die Niveaus der Akkumulation von zwei anderen immunonachweisbaren RNA 2 Genprodukten (dem größeren viralen Hüllenprotein und P14; 1) durch die Anwesenheit von rep42 nicht verändert wurden. P13 und P15 konnten in solchen Experimenten nicht durch einen Immunonachweis festgestellt werden.
Die BNYVV TGB Proteine können in trans ergänzt werden
Die Fähigkeit der Replikonen, welche die TGB Gene enthalten, Bewegungsfunktionen in ganzen Pflanzen bereitzustellen, wurde getestet indem Blätter des Wirtes der lokalen Läsion C.quinoa gemeinsam inokuliert wurden mit einer unter einer Serie von RNA 2 Transkripten, welche eine Mutation enthielten, welche ein TGB Gen behindert, plus ein Replikon, welches das entsprechende Gen vom Wildtyp enthält. Bei allen Experimenten enthielt der Inokulationsstoff das Transkript der RNA 1 vom Wildtyp als eine Quelle für eine virale RNA-abhängige RNA Replikase, obwohl diese Tatsache weiter unten nicht immer explizit vermerkt wird. Für das P42 Gen umfassten die gestesteten RNA 2 Mutanten die Rasterverschiebungsmutante (pB2-14-H), verursacht durch ein Einfüllen einer SpeI Lage an dem Nukleotid 2280, eine Reihe von Mutanten, die in dem Raster kurze Deletionen an verschiedenen Stellen in dem P42 ORF (Mutanten pB2-14-ΔS12, -ΔSN, -ΔB1, -ΔB2, -ΔN und -ΔHP1; 1A; siehe auch Referenz 11) enthielten, und eine Deletionsmutante (pB2-14- F; 1), wo ein Entfernen einer 935 Nukleotidsequenz stromaufwärts von dem P42 ORF den Promotor für das RNA Subgenom (RNA 2sub_a) inaktiviert hat, welches für die P42 Synthese verantwortlich ist. Inokulationsstoffe, welche ein RNA 1 Transkript plus irgendeines der obigen Transkripte der Mutanten der RNA 2 enthielten, erzeugten keine lokalen Schädigungen an C. quinoa und es konnten 10 Tage nach der Injektion (p. i.) keine Nachkommen von viraler RNA in den inokulierten Blättern nachgewiesen werden (4, Linien 3 und 5; siehe Referenz 11 für die anderen Mutanten). In der 4 wurde das Replikon, welches oben an der Spitze einer jeden Linie angezeigt ist, auf Blätter von C. quinoa inokuliert zusammen mit dem RNA 1 Transkript vom Wildtyp plus entweder einem RNA 2 Transkript vom Wildtyp (Linie 2) oder der Mutante des RNA 2 Transkriptes, welche oberhalb einer jeden Linie identifiziert sind. In den Linien 19 und 20 enthielt der Inokulationsstoff rep42 und rep15 (Linie 19) oder rep42 und rep1315 (Linie 20) zusätzlich zu RNA 1 und pB2-14-HP1 Transkripten. Die Linie 1 enthält RNA von einer nicht inokulierten Kontrollpflanze. Inokulierte Blätter wurden 10 Tage pi geerntet und auf ihre Gehalte an viraler RNA durch die Northern Hybridisierung getestet, so wie diese im Rahmen der 3 beschrieben worden ist. Die Positionen der Replikonen sind durch Pfeile angezeigt. Wenn das rep42 Transkript mit in den Inokulationsstoff eingeschlossen wurde, dann erschienen zahllose lokale Schädigungen (20–80 pro Blatt) auf den inokulierten Blättern mit der Ausnahme für denjenigen Inokulationsstoff, der das Transkript der RNA 2 Deletionsmutante pB2-14-HP1 enthielt, welche ohne Symptome verblieb. Die sich daraus ergebenden blassgrünen Schädigungen waren in ihrer Erscheinung ähnlich wie diejenigen, welche als Reaktion auf eine Inokulation mit RNA 1 plus RNA 2 vom Wildtyp ausgelöst worden waren mit der Ausnahme der RNA 2 Mutante pB2-14-F, wo nekrotische lokale Schädigungen gebildet wurden. In diesem letzteren Fall kann der Phänotyp der nekrotischen Schädigung zusammenhängen mit der Herstellung einer gestutzten Form des überlesenen Proteins (RT = readthrough) durch diese RNA 2 Mutante (7).
Die Northern Hybridisierung der inokulierten Blätter 10 Tage pi deckte die Anwesenheit von Nachkommen des viralen RNAs von einer Länge auf, wie sie für die RNAs 1, 2 und rep42 für alle RNA 2 Mutanten (4, Linien 2, 4, 7–11) erwartet worden war, mit Ausnahme der Deletionsmutante pB2-14-HP1 (4, Linie 13). Wie weiter unten gezeigt wird, ist das Versagen von pB2-14-ΔHP1, durch rep42 ergänzt zu werden, wahrscheinlich auf die Deletion des Promotors für das Subgenom RNA (RNA 2sub_b) zurückzuführen, von dem man glaubt, es steuere die Translation der abwärts gelegenen TGB Proteine.
Ähnliche Experimente der Komplementation wurden ausgeführt mit rep13, rep15 und mit dem dicistronischen Konstrukt rep1315. Beide, rep13 und rep1315, waren in der Lage, die Akkumulation auf den Blättern (4, Linien 14 und 15) der Mutante pB2-14-I zu komplementieren, in welcher das P13 Gen durch das Einfügen von vier Nukleotiden (das Einfügen schuf eine XhoI Lage) invalide gemacht worden war, obwohl die sich daraus ergebenden lokalen Schädigungen nekrotischer Art waren. Nekrotische, lokale Schädigungen wurden auch im Verlauf von gemischten Infektionen mit den vorher erwähnten Replikonen und den RNAs 1 und 2 vom Wildtyp (siehe unten) erzeugt, was einen Hinweis dafür lieferte, dass das replikonbezogene Phänotypsymptom dominant gegenüber dem Wildtyp ist. Die neuen Symptome können bezogen sein auf Unterschiede in dem Zeitverlauf der Synthese oder auf das Niveau der Akkumulation von P13, wenn es eher von dem Replikon als von der RNA 2 mit voller Länge exprimiert wird.
Bei solchen Experimenten, wie sie oben beschrieben worden sind, ist es wichtig zu zeigen, dass die in das P42 oder P13 Gen auf dem RNA 2 Transkript ursprünglich eingeführte Mutation noch bei den Nachkommen der RNA 2 vorhanden ist, das heißt, die fehlerhafte Kopie des TGB Gens auf dem Transkript war nicht umgewandelt worden in den Wildtyp durch eine RNA Rekombination in planta (21) mit der auf dem Replikon vorhandenen Kopie. Daher wurde ein RT-PCR Experiment durchgeführt an den Nachkommen der viralen RNA aus einer Pflanze, die infiziert worden war mit RNA 1, pB2-14-H eines Transkripts (P42 Gen unterbrochen durch ein Einfüllen an einer SpeI Lage) und rep42. Das in dem RT-PCR verwendete Primerpaar hybridisierte zu RNA 2 Sequenzen, welche das P42 Gen flankierten, und damit amplifiziert sich die Kopie des in der RNA 2 vorhandenen Gens, aber nicht die Kopie an dem Replikon, wo die flankierenden Sequenzen nicht vorhanden sind. Eine Restriktionsenzymanalyse deckte auf, dass die SpeI Lage in dem sich ergebenden, amplifizierten DNA Fragment nicht vorhanden war, wie es eher für die mutierte Form des TGB Gens als für die Form des TGB Gens vom Wildtyp erwartet worden wäre. Eine ähnliche Analyse der Nachkommen an viraler RNA von Pflanzen, welche infiziert worden war mit RNA 1, pB2-14-I (Rasterverschiebungsmutation in dem P13 Gen, was eine anXhoI Lage schafft) und entweder mit rep13 oder mit rep1315, zeigte in ähnlicher Weise, dass die Mutation, welche die Kopie des P13 Gens auf dem RNA 2 Transkript invalide macht, in den Nachkommen von RNA 2 erhalten wurde. Wir schließen daraus, dass rep42 und rep13 in der Tat die Funktion von P42 und P13 komplementieren, indem sie das Genprodukt eher in trans liefern als dass sie einfach als eine Quelle der Wildtyp TGB Sequenz für die Rekombination dienen.
Unerwarteter Weise war das Replikon, welches das P15 Gen vom Wildtyp exprimiert (rep15), unfähig die P15 fehlerhafte RNA 2 Mutante pB2-14-J in gemischten Inokulationen zu komplementieren. Es konnten keine auf den inokulierten Blättern 10 Tage pi entstandenen lokalen Schädigungen und keine viralen RNAs in den Blättern durch einen Northern Blot nachgewiesen werden (4, Linie 17). Andererseits erschienen, wenn das pB2-14-J Transkript zusammen mit rep1315 inokuliert wurde, lokale Schädigungen (von dem nekrotischen Typ) und es wurden leicht Nachkommen von viralen RNAs nachgewiesen (4, Linie 18). In diesem letzteren Fall offenbarte die Analyse eines RT-PCR Produktes, welches das P15 Gen bei den Nachkommen der RNA 2 enthält, dass die Mutation, welche das Gen invalide machte, noch immer vorhanden war. Eine Komplementation von pB2-14-J ereignete sich noch, als das P13 ORF (ORF = offenes Leseraster) in dem dicistronischen Replikon durch eine Rasterverschiebungsmutation (rep1315-I; 1) unterbrochen wurde, was dazu führte, dass die Expression eines P13 von voller Länge von dem ersten ORF des dicistronischen Replikons nicht erforderlich ist für eine Komplementation durch die abwärts gelegene Kopie des P15 Gens.
Beweis, dass P15 aus einem dicistronischen Subgenom RNA exprimiert wird
Ein RNA 2- abgeleitetes Subgenom RNA (RNA 2sub_b) von einer Länge von etwa 1500 Nukleotiden ist in einem BNYVV-infizierten Gewebe nachgewiesen worden (2). Die 5'-Endstelle dieser Art ist nicht genau auf einer Karte eingetragen worden, aber man sagt von ihr voraus, dass sie in der Nähe des 5'- Terminus des P13 ORF liegt. Kein Subgenom RNA mit einem 5'- Ende aufwärts von dem P15 ORF ist nachgewiesen worden, was die Möglichkeit erhöht, dass sowohl P13 als auch P15 beide von RNA 2sub_b exprimiert werden, wie in BSMV (8).
Die zuvor erwähnte Unfähigkeit von rep42, die P42-fehlerhafte RNA 2 Mutante pB2-14-HP1 zu komplementieren, könnte von polaren Wirkungen der RNA 2 Deletion auf die Synthese der abwärts gelegenen TGB Proteine herstammen, wenn die Deletion den RNA 2sub_b Promotor invalide gemacht hat (die rechtsseitige Grenze der Deletion in pB2-14-ΔHP1 liegt nur 30 Reste aufwärts von dem P13 Initiationscodon). Um diese Hypothese zu testen, wurde ein Experiment ausgeführt, bei welchem das pB2-14-ΔHP1 Transkript sowohl mit dem rep42 als auch mit dem rep1315 komplementiert wurde. Die mit dieser Mischung inokulierten Blätter entwickelten lokale Schädigungen und sie enthielten Nachkommen von viralen RNAs (4, Linie 20). Wenn andererseits eher rep13 als rep1315 zusammen mit rep42 eingesetzt wurde, um pB2-24-HP1 zu komplementieren, dann erschienen keine Symptome und es wurden keine Nachkommen von viralen RNAs durch das Northern Blotverfahren nachgewiesen (4, Linie 19). Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit der Hypothese, dass die pB2-14-HP1 Deletion mit der Expression des abwärts angeordneten TGB ORF's interferiert, vermutlich durch ein Blockieren der RNA 2sub_b Transkription. Weiterhin offenbart die Tatsache, dass die Komplementation mit rep1315 erfolgreich war; aber nicht mit rep13, dass sowohl P15 als auch P13 von RNA 2sub_b übersetzt werden.
Eine unabhängige Expression von P15 hemmt eine Infektion mit viraler RNA vom Wildtyp
Die Fähigkeit von rep1315, aber nicht von rep15, die P15- fehlerhafte RNA 2 Mutante pB2-14-J bei Blattinfektionen zu komplementieren, könnte einen Hinweis darauf liefern, dass eine unabhängige Expression von P15 aus dem monocistronischen Replikon mit dem viralen Infektionskreislauf interferiert, indem das Genprodukt in übermäßigen Mengen relativ zu P13 erzeugt wird. Um diese Hypothese zu testen, wurde ein Experiment ausgeführt, in welchem rep15 auf die Blätter von C. Quinoa inokuliert wurde, zusammen mit viralen RNAs 1 und 2 vom Wildtyp. Es erschienen keine Schädigungen auf den inokulierten Blättern, sogar nicht nach langen Zeitspannen pi (5A), und es konnte keine virale RNA durch den Northern Blot nachgewiesen werden (5B, Linie 6). Die 5(A) stellt Blätter von C. quinoa dar, welche mit RNAs 1 und 2 (links) oder RNAs 1 und 2 plus rep15 (rechts) inokuliert worden sind. Die Blätter wurden 20 Tage pi fotografiert, als die lokalen Schädigungen auf der linken Seite auf dem Blatt sich derart ausgedehnt hatten, dass sie einen großen Teil der Blattoberfläche bedecken. In der 5(B) wird eine mittels der Northern Hybridisierung (wie in 3 beschrieben) durchgeführte Analyse gezeigt für die Gehalte an viraler RNA der Blätter von C. quinoa, welche mit BNYVV RNAs 1 und 2 allein (Linie 1) oder zusammen mit rep0 (Linie 2), rep42 (Linie 3), rep13 (Linie 4), rep1315 (Linie 5), rep15 (Linie 6), rep15-J (Linie 7), rep15-X (Linie 8) oder repPCV-P17 (Linie 9) inokuliert worden sind. Die Positionen der Replikonen sind durch Pfeile angezeigt. (C) zeigt eine Analyse mittels der Northern Hybridisierung der Gehalte an viraler RNA der inokulierten Blätter (Linien 1, 3 und 5) und der Wurzeln (Linien 2, 4 und 6) von Beta macrocarpa und zwar entweder modellinokuliert (Linien 1 und 2), inokuliert mit BNYVV RNAs 1, 2 und 3 (Linien 3 und 4) oder mit RNAs 1, 2 und 3 plus rep15 (Linien 5 und 6). RNA 3 wurde mit in den Inokulationsstoff einbezogen, weil es notwendig ist für die systemische Bewegung bei B. macrocarpa (22). Unter diesen Bedingungen wurden die mit den RNAs 1 und 2 allein inokulierten Blätter erheblich infiziert (5A; 5B, Linie 2). Die Hemmung der Virusinfektion durch rep15 war abhängig von der Dosis. Eine Zugabe von zehnmal weniger rep 15 zu der Inokulationsstoffmischung führte noch immer zu einer fast vollständigen Hemmung der Ausprägung einer Schädigung, aber geringere Mengen des Replikons wurden zunehmend weniger wirksam bei dem Blockieren der Infektion. Rep15 blockierte auch das Auftreten von Nachkommen der viralen RNA in den inokulierten Blättern und in den Wurzeln von Beta macrocarpa, ein systemischer Wirt von BNYVV ( 5C, Linien 5 und 6). Das leere Replikon, rep0, und diejenigen Replikonen, welche die anderen zwei TGB Proteine (rep42, rep13, rep1315) exprimieren, hemmten andererseits die BNYVV Infektion der Blätter von C. quinoa (5B, Linien 2–5) nicht wesentlich.
Da rep15 nicht mit der Amplifikation von RNA 1 und 2 in den C. quinoa Protoplasten (siehe 3) interferierte, gibt dies Anlass zu der Vermutung, dass das Replikon mit der Bewegung des Virus von der Anfangsstelle der Infektion hinein in die Nachbarzellen (Bewegung von einer Zelle zu der anderen Zelle) während der Bildung der lokalen Schädigung an den Blättern interferiert. Die Bildung einer Schädigung wurde nicht gehemmt durch eine gemeinsame Inokulation von Stras 12 RNA mit den Replikonen rep15-J oder rep15-X ( 5B, Linien 7 und 8), welche die um eine Rasterverschiebung verkürzten Formen von P15 kodieren. Diese Entdeckung bestätigt, dass vielmehr die Expression von P15 von dem Replikon, eher als das einfache Vorhandensein der entsprechenden RNA Sequenz für die Hemmung während der gemischten Infektionsexperimente erforderlich ist. Bei der Anwesenheit. von rep15-X jedoch beliefen sich die resultierenden lokalen Schädigungen auf etwa ein Drittel des Durchmessers der Schädigungen, die durch eine Infektion mit Stras 12 alleine oder mit Stras 12 plus rep15-J entstanden sind, und der Anteil an Nachkommen der viralen RNA in den inokulierten Blättern war deutlich niedriger (5B, Linie 8). Diese Entdeckung legt die Vermutung nahe, dass fast die vollständige Länge des durch rep15-X produzierten P15 Moleküls mit der Aktivität der Bewegung von Zelle zu Zelle des aus RNA 2 produzierten P15 vom Wildtyp interferieren kann, obwohl dasselbe in einem komplementären Versuch nicht zu einer Substitution durch P15 von der Wildtypform befähigt ist. Vermutlich stehen die Form mit der vollen Länge und die verkürzte Form von P15 gegenseitig in Konkurrenz miteinander beim Abbinden von Stellen auf einer anderen Komponente (welche entweder von viralem oder von zellulärem Ursprung sein könnte), welche mit in dem Bewegungsprozess impliziert ist.
Wie oben bemerkt haben Sequenzvergleiche zwischen verschiedenen Viren, denen ein TGB gehört, eine geringe Sequenzähnlichkeit zwischen den verschiedenen TGB3 Genen aufgedeckt. Zum Beispiel zeigt das 17 kDa TGB3 Protein (P17) des Klumpenfurovirus der Erdnuss (PCV) keine deutliche Sequenzähnlichkeit mit P15 von BNYVV (4), obwohl beide Viren C. quinoa infizieren können. Um zu bestimmen, ob eine unabhängige Expression des PCV TGB3 Proteins eine BNYVV Infektion in einer Art und Weise stören kann, welche ähnlich zu jener ist, die mit rep15 beobachtet worden ist, wurde ein von BNYVV RNA 3-abgeleitetes Replikon konstruiert, welches das PCV TGB3 (repPCV-P17; 1) enthält. C. quinoa Blätter, welche mit BNYVV RNAs 1 und 2 plus repPCV-P17 inokuliert wurden, entwickelten keine Symptome und es konnten keine Nachkommen von BNYVV RNAs durch Northern Blot (5A, Linie 9) nachgewiesen werden. Diese Beobachtung verleitet zu der Vermutung, dass die Wege, über welche BNYVV und PCV sich von Zelle zu Zelle in C. quinoa bewegen, sich mindestens ein gemeinsames Element miteinander teilen, welches trotz ihrer Unterschiedlichkeit in der Sequenz in Wechselwirkung mit den TGB3 Produkten beider Viren tritt.
Die Erfinder haben gezeigt, dass Replikone, welche das P42 und P13 tragen, eine BNYVV RNA 2, welche das entsprechende defekte Gen trägt, komplementieren können, dass aber ein Replikon, welches ein P15 trägt, dieses nicht kann. In dem letzteren Fall kann eine Komplementation jedoch eintreten, wenn das P15 Gen als das zweite Gen auf einer dicistronischen RNA (rep1315) geliefert wird, welches das P13 Gen an der ersten Position trägt. Es sollte angemerkt werden, dass die relative Anordnung der P13 und P15 Gene auf rep1315 identisch ist zu der Anordnung derselben auf der RNA 2sub_b, der Subgenom RNA, von der man glaubt, sie steuere die Synthese von beiden Proteinen bei Infektionen von der Wildtypform. Dies führt zu der Vermutung, dass eine erfolgreiche Bewegung von Zelle zu Zelle von BNYVV die Anwesenheit von P13 und P15 in geeigneten relativen Mengen erfordert und dass die Erzeugung von beiden Proteinen aus derselben Subgenom RNA einen Mechanismus zur Koordination ihrer Synthese darstellt. Die Unfähigkeit von repl5, die P15 Mutante RNA 2 Transkript pB2-14-J zu komplementieren, und die Fähigkeit derselben, eine Infektion durch einen Virus vom Wildtyp zu hemmen, würden dann beide auf eine Überproduktion von P15 relativ zu P13 zurückzuführen sein, wenn ersteres aus dem Replikon übersetzt wird und letzteres von der RNA 2. Wenn andererseits P15 von dem dicistronischen Replikon rep1315 exprimiert wird, dann würden geeignete relative P13–P15 Anteile erzeugt werden, die es einer Bewegung von Zelle zu Zelle ermöglichen abzulaufen. Die „richtigen" relativen Niveaus der Akkumulation von P13 und P15 in einer Infektion vom Wildtyp sind nicht bekannt. Eine Translation von rep1315 in einem Keimextrakt des Weizens erzeugte drei- bis fünfmal mehr P13 als P15, aber solche Experimente spiegeln die Situation in planta nicht notwendiger Weise wieder, weil die Umsatzgeschwindigkeiten der zwei Proteine sich deutlich unterscheiden können. Es ist zu beachten, dass diese Ergebnisse einen Hinweis darauf liefern, dass die über das TGB vermittelte Bewegung von Zelle zu Zelle weniger empfindlich ist gegenüber einer Überexpression von P42 und P13 relativ zu den „richtigen" Niveaus, welche kennzeichnend sind für eine normale Infektion, da eine gemeinsame Inokulation von rep42, rep13 oder rep1315 mit dem Virus vom Wildtyp eine Infektion nicht hemmte (5, Linien 3–5), obwohl die in der Anwesenheit von rep13 und rep1315 erzeugten Schädigungen nekrotischer Art waren. Somit wird gezeigt, dass die Expression von P15 in transgenen Pflanzen einen Mechanismus für das Induzieren einer BNYVV-Resistenz in solchen Pflanzen liefern könnte („pathogen-abgeleitete Resistenz; Ref. 23), vorausgesetzt es können genügend P15 Expressionsniveaus erreicht werden.
Um ein besseres Verständnis darüber zu erzielen, wie die relativen Anteile von P13 und P15 während der Translation gesteuert werden, wird es erforderlich sein zu lernen, wie von den Ribosomen auf der RNA 2sub_b an das Cistron heran getreten wird. Die Einleitung einer Translation an einem internen Cistron einer eukaryontischen Messenger-RNA (Boten-RNA) kann über mehrere Mechanismen eintreten, einschließlich (i) eines durchlässigen Abtastverfahrens, bei dem ein Anteil der ribosomalen Untereinheiten, welche das Abtasten der RNA an der 5'-Endstelle beginnen, sich an der ersten (nicht optimalen) aufwärts gelegenen AUG ohne eine Initiierung (24) vorbeibewegen, und (ii) eines internen Eintretens, bei dem ribosomale Untereinheiten direkt an eine spezielle Sequenz an der RNA in der Nähe des internen Initiationscodons anbinden (25). Ein dritter möglicher Mechanismus, eine Termination-Reinitiation (24), erscheint in der Anwendung auf irgendeines der TGB enthaltenden Viren unwahrscheinlich, weil die Überlappung zwischen den TGB2 und den TGB3 Cistronen schon Ribosomen erfordern würde, um rückwärts abzutasten, nachdem TGB2 beendet worden ist, um das TGB3 Initiationscodon zu erreichen. Man hat in Vorschlag gebracht, dass die TGB3 Proteine von BSMV und PVX durch einen durchlässigen Abtastmechanismus übersetzt werden (8, 9). Das BNYVV P15 Gen kann auch durch ein durchlässiges Abtasten erzeugt werden, obwohl jedoch angemerkt werden sollte, dass der Zusammenhang des BNYVV P13 Initiationscodons (AUAAUGU) beinahe optimal ist und dass es ebenfalls zwei abwärts angeordnete AUG's gibt, welche die abtastenden Untereinheiten zu ignorieren haben, um den P15 Initiationscodon zu erreichen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind eine Pflanzentransformation, welche durch die in der Internationalen Patentanmeldung WO95/10178 beschriebene Technik bewerkstelligt wird, welche durch diese Bezugnahme mit hierin eingebunden wird.
Das Pflanzenmaterial und die Wachstumsbedingungen waren diejenigen, die von Hall et al., Plant Cell Reports 12, S. 339–342 (1993), Pederson et al., Plant Sciences 95, S. 89–97 (1993) und Hall et al, Nature Biotechnology 14, 1996, im Druck, beschrieben worden sind.
Plasmidvektoren und DNA Herstellung
Das Plasmid pET-P15 (welches die P15 Nukleinsäuresequenz beherbergt) wurde an seiner einzigen BamHI Lage einer Restriktion unterzogen und mit Hilfe der T4 DNA Polymerase mit einem glatten Ende versehen. Nach einer Reinigung durch Elektrophorese in einem 0,8% Agarosegel wurde das lineare Plasmid an seiner einzigen NcoI Lage einer Restriktion unterzogen. Das P15 Genfragment von 400 bp wurde durch Elektrophorese gereinigt und in ein pMJBX-Ub eingefügt [welches beherbergt den Arabidopsis Polyubiquitin Promotor (Norris et al., Plant Molevular Biology 21, pp. 895–906 (1993), eine TMV Erweiterungssequenz und den Nos 3' Terminator], welches mit NcoI und SmaI Restriktionsendonukleasen verschnitten ist. In dem so erhaltenen Plasmid (pMJBX-Ub-P15) ist die Nukleinsäuresequenz des P15 Gens angeordnet unter der Kontrolle des Arabidopsis Polyubiquitin Promotors, gefolgt von der TMV Erweiterungssequenz. Das EcoRI Fragment von dem Plasmid pB235SAck enthält das Pat Gen, welches als die selektive Markierung eingesetzt wird und die Phosphinothricinacetyltransferase kodiert (bezogen von Agrevo, Berlin, Deutschland). Auf diesem EcoRI Fragment befindet sich die Nukleinsäuresequenz des Pat Gens unter der Kontrolle der 5' und 3'Expressionssignale des Blumenkohlvirus. Das Plasmid pMJBS6, welches aus der Kombination dieses EcoRI-Pat-Fragmentes und eines teilweisen EcorI Abbaus des Plasmids pMJBX-Ub-P15 resultiert, enthält beides, sowohl das Pat Gen als auch das P15 Gen. Dieses pMJBS6 Plasmid ist ein Plasmid mit hoher Kopiezahl, welches auf dem pUC18 Vektor beruht und welches auch das Laktamase Gen (amp^r) enthält. In dem Plasmid pIGPD7, welches dasselbe Pat Fragment wie pB235SAck beherbergt, wurde das Laktamase Gen durch ein igpd Gen (Imidazolglycerinphosphatdehydratase) aus Saccharomyces cerevisiae ersetzt (Struhl et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 73, pp. 1471–1475 (1976). Eine Auswahl für und eine Beibehaltung des Plasmids in Escherichia coli wurden erreicht durch eine Komplementation eines auxotrophen hisB Stammes SB3930 auf einem minimalen Medium in der Abwesenheit von Antibiotika. Das P15 Fragment, mit seinem Ubiquitin Promotor und seiner Terminatorsequenz, wurde wie ein 2500 by Fragment gereinigt, welches aus dem pMJBX-Ub-P15 Plasmid gewonnen worden ist, nachdem es an der einzigen HindIII Lage geteilt worden war, gefolgt von einer teilweisen EcoRI Restriktion. Dieses Fragment besaß ein glattes Ende und fügte sich in ein pIGPD7 Plasmid mit einem glatten Ende ein, welches an der einzigen NcoI Lage geteilt worden war. Das daraus resultierende pIGPDS4 Plasmid enthält beides, sowohl das Pat Gen als auch das P15 Gen auf einem Vektor ohne das β-Laktamase Gen.
Pflanzenmaterial
In vitro Sprosskulturen von kleinen Zuckerrübenpflanzen wurden der Initiation unterworfen, um eine wieder verwendbare und gleichmäßige Quelle eines sterilen Startmaterials zu liefern, und die Kulturen wurden während einer 4-wöchigen Subkulturperiode gehalten, so wie von Hall et al., Plant Cell Reports 12, pp. 339–342 (1993), beschrieben.
Eine Isolation der Epidermis der Zurckerrübe im großen Maßstab
Eine veränderte Version der Mischungsmethode von Kruse et al., Plant Physiology 690, S. 1382–1386 (1989) wurde verwendet. Für jede Isolation wurden 2 g Blätter (mit entfernten Mittelrippen) von 4 Wochen alten Trieben (Sprossen) in einem Waring Rührmischer mit der maximalen Geschwindigkeit (23000 rpm = 23000 Umdrehungen pro Minute = 23000 UpM) während einer Dauer von 60 sec in einem 250 ml Becherglas aus Metall gemischt, welches 50 ml kaltes (4°C) Ficollmedium enthielt (100 g/l Ficoll, 735 mg/l CaCl₂·2H₂O, 1 g/l PVP40 im Autoklav behandelt). Die epidermalen Fragmente wurden dann auf einem 297 μm Nylonfilter wiedergewonnen und mit 500 ml sterilem Leitungswasser gewaschen. Diese wurden von dem Filter in eine 9 cm Petrischale ausgewaschen unter Verwendung von 10 ml CPW9M, welches 3,8% (Gewicht/Volumen) CaCl₂·2H₂O enthielt [Krens et al., Theoretical and Applied Genetics 79, S. 390–396 (1990)]. Irgendwelche verbliebenen, restlichen Blattfragmente wurden entfernt und die Schalen wurden während der Dauer von einer Stunde bei Raumtemperatur vorinkubiert.
Protoplastisolation einer Schließzelle aus angereicherten Epidermisfraktionen
Um den Epidermisanteil wiederzugewinnen, wurde die Suspension während der Dauer von 1 Minute bei 55 × g zentrifugiert, danach wurde das oben Schwimmende entfernt. Das Pellet wurde erneut in Suspension gebracht in einer 50 ml Enzymmischung und 5 ml aliquote Teile wurden auf jede der 10 Petrischalen von 6 cm übertragen (Greiner, TC Qualität), mit einem Parafilm versiegelt und über Nacht bei 25°C in der Dunkelheit unter einer mäßigen Bewegung inkubiert. Das Abbaumedium bestand aus CPW9M, ergänzt mit 0,5 (Gewicht/Volumen = G/V) Zellulase RS und 3% (G/V) Macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokio, Japan), pH 5,8. Am folgenden Morgen sah man allgemein die Protoplasten wie sie nahe an der Oberfläche der Abbaumischung schwammen. Nach einer mäßigen Bewegung der Suspensionen unter Verwendung einer sterilen Pipette, um die Protoplasten abzulösen, welche noch an den Cuticulafragmenten anhafteten, wurden die Abbauprodukte gesammelt und durch 297 und 555 μm Nylonfilter hindurchgeleitet. Das Filtrat wurde mit einem gleichen Volumen von iso-osmotischem Percoll gemischt, welches 15 (G/V) Saccharose (Percoll15S) enthielt, und es wurde auf 12 × 12 ml Zentrifugenröhrchen verteilt. In jedem Röhrchen wurden zuerst 1 ml CPW15S (Krens et al., 1990) und dann 0,5 ml 9% (G/V) Mannit, welches 1 mM CaCl₂·(9 M) enthielt, sorgfältig oben auf die Protoplastsuspension geschichtet. Nach einem Zentrifugieren bei 55 × g während einer Dauer von 10 Minuten wurden die lebensfähigen Schließzellen in Banden an der CPW15S/9M Schnittstelle sichtbar. Um die Protoplasten zu konzentrieren, wurden diese Banden gesammelt und mit Percoll15S gemischt, um ein endgültiges Volumen von 16 ml zu ergeben. Dieses wurde dann auf 2 Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, welche wie oben angegeben geschichtet waren, und dann wurde erneut zentrifugiert. Ein sorgfältiges Entfernen der 9 M Schichten ergab die angereicherte Protoplastfraktion der Schließzellen für ein nachfolgendes Zählen unter Verwendung eines Haemocytometers.
Protoplasttransformation
Die Transformationen wurden in 12 ml Zentrifugenröhrchen durchgeführt, von denen ein jedes 1 × 10⁶ Protoplasten enthielt, welche in einem 0,75 ml 9 M Medium suspendiert waren. Plasmid DNA (50 μg von pMJBX-Ub-P15 und pIGPDS4) wurde hinzu gegeben und unmittelbar nach dem Mischen wurde ein 0,75 ml PEG Medium tropfenweise (40% PEG 6000, aufgelöst in dem F Medium (Krens et al., Nature 296, S. 72–74, 1982) hinzu gesetzt. Nach einem kräftigen Mischen wurde die Suspension bei Raumtemperatur gehalten, dies während einer Dauer von 30 Minuten mit zwischenzeitlichem Schütteln. Anschließend wurden in 5 Minuten Abständen 4 × 2 ml aliquote Teilchen des F Mediums hinzu gegeben. Nach dem Zentrifugieren während einer Dauer von 5 Minuten bei 55 × g wurde das oben Schwimmende entfernt und das Protoplastpellet wurde erneut suspendiert in 9 M und erneut zentrifugiert. Die Zellen wurden schließlich zum Zählen erneut in 1 ml eines 9 M Mediums suspendiert.
Protoplastkultur und Auswahl
Die Protoplasten wurden in Ca Alginat eingebettet und in einem veränderten, flüssigen K8P Medium kultiviert (Hall et al., 1990). Zum auszuwählen von stabilen transformierten Zellen, wurde Bialaphos, die aktive Verbindung aus Herbiace (Meiji Seika Ltd, Japan) nach 7 Tagen hinzu gegeben, um eine endgültige Konzentration von 200 μg/l zu erzielen. Am Tag 18 wurden die runden Alginatplatten in 3 mm Scheiben geschnitten und in das PGo Medium übertragen (De Greef und Jacobs, Plant Science Letters 17, pp. 55–61, 1979), mit 1 μm BAP (PG1B) und 250 μg/l Bialaphos ergänzt und mit 0,8 Agarose verfestigt.
Calluskultur und Regeneration
Nach 21 Tagen wurden die Teile des Alginats, welche die nicht sichtbaren Mikrocalli enthielten, auf 9 cm Petrischalen übertragen, welche 20 ml Medium K enthielten (3 Saccharose, 0,8% Agarose, 1 μM BAP, PGo Medium, pH = 5,8 im Autoklav behandelt). Die Kultur wurde, so wie oben beschrieben, in der Dunkelheit aufbewahrt.
Bröckelige Calli vom wässrigen Typ, welche die Größe von annähernd 1–2 mm im Durchmesser erreicht hatten, wurden individuell heraus gesammelt und in Gruppen von 20 auf einem frischen Medium K kultiviert. In dieser Phase bestätigten PCR Analysen die Anwesenheit von Transformanten.
In Abständen von zwei Wochen wurden alle Calli auf einem frischen Medium subkultiviert.
Regeneranten erschienen während der ersten 8 Wochen der Kultur von einzelnen Calli. Als die ersten Triebe sichtbar wurden und eine Größe von annähernd 2 mm erreicht hatten, wurde die Schale an das Licht (3000 lux) überführt, bei 25°C und 15 Stunden während des Tages.
Kleine Pflanzen von annähernd 4 mm Länge wurden auf einzelne Kulturröhrchen übertragen, welche 15 ml des Mediums K enthielten, und sie wurden ferner an dem Licht subkultiviert, wie oben angegeben.
Wurzelbildung und Transfer in den Erdboden
Als die kleinen Pflanzen das Stadium der vier Blätter erreicht hatten (gewöhnlich nach 5 bis 6 Wochen mit einer Subkultur nach 3 Wochen), wurden sie in die Kulturröhrchen übertragen, welche 15 ml des Mediums L enthielten (3 Saccharose, 0,8% Agarose, 25 μM Indolbuttersäure (IBA), PGo Medium, pH = 5,8 im Autoklav behandelt) (PGo Medium beschrieben von De Greef W. et al., Plant Science Letters 17, pp. 55–61, (1979)), und sie wurden weiter kultiviert wie oben angegeben.
Wenn mindestens eine Wurzel die Länge von 1 cm erreicht hatte, dann wurden die kleinen Pflanzen aus den Kulturrröhrchen entfernt und unter dem laufenden Leitungswasser gewaschen, um alle Fragmente des Agar zu entfernen, und sie wurden in den Erdboden in 9 cm Töpfen in dem Gewächshaus übertragen.
Die kleinen Pflanzen wurden mit einer durchsichtigen Plastikhaube überdeckt, um eine feuchte Umgebung während einer Dauer von 7 Tagen zu bewerkstelligen, und nach dieser Zeit konnten sie ohne Schutz wachsen.
Die mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 gemäß der Erfindung transformierte Pflanze wird zurückgewonnen und sie hat P15 exprimiert.
DNA Analyse
Das von den primären Transformanten isolierte DNA Genom wird nach einer Behandlung mit Restriktionsenzymen einer Elektrophorese in einem 0,8% Agarose Gel unterworfen, und auf eine Membran aus Nitrozellulose übertragen unter Verwendung von Standardverfahren gemäß dem Protokoll des Herstellers. Eine Hybridisierung wird durchgeführt mit der DNA, wie α³²-dATP-gekennzeichnete Sonden, deren Anwesenheit einzurichten erwünscht ist. Die Membranen wurden auf eine endgültige Reinheit von 0,1% × SSC, 0,1% SDS bei 60°C gewaschen. Die hybridisierte DNA wird sichtbar gemacht durch Schwärzung des Röntgenfilms während 24 bis 48 Stunden.
PCR Analyse
Standard PCR Techniken wurden eingesetzt, um einen Bereich intakter Plasmidsequenzen nachzuweisen. Reaktionen wurden durchgeführt unter Verwendung von 25 Denaturierungszyklen von 1 Minute bei 94°C; 1 Minute Abkühlung; 2 Minuten Extension bei 72°C, mit einer abschließenden Extensionsdauer von 5 Minuten. Die Abkühltemperaturen wurden für jede Primerkombination optimiert. Die Anwesenheit des Kodierungsbereiches des BNYVV P15 Gens in dem Genom der Zuckerrübe wurde durch die PCR verifiziert unter Verwendung eines Paares von Oligonukleotiden als Primern: MOV1, Richtungsprimer [5'-GGTGCTTGTGGTTAAAGTAGATTTATC-3' (Nukleotide 3 bis 29 auf SEQ ID NO. 1)] und MOV2 Antisense Primer [5'-CTATGATACCAAAACCAAACTATAGAC-3' (komplementär zu den Nukleotiden 369 bis 395 auf SEQ ID NO. 1)]. Dieses 393 by lange Fragment enthält den gesamten Kodierungsbereich des P15 Gens für BNYVV (siehe 7).
7: Analyse von PCR Produkten, welche mit der DNA der Zuckerrübe aus P15-Transformanten (Linie 5 bis 7) und aus einer untransformierten Pflanze (Linie 4) gewonnen worden sind. Eine niedrige DNA [Mass Ladder^® (Life Technologies)] wurde als ein Größenmarkierer (Linie 1) verwendet. Die Linien 2 und 3 entsprechen den positiven Kontrollen (pMJBS6/pIGPDS4). Der Pfeil auf der linken Seite zeigt die Position des erwarteten PCR Produktes.
Southern Blot Hybridisierunsanalyse
Die Integration des BNYVV P15 Gens in das Genom der Zuckerrübe wurde durch die Southern Blot Hybridisierung verifiziert. Die totale DNA der primären transgenen Regeneranten wurde isoliert, mit Restriktionsenzymen digeriert (PstI, KpnI, NcoI, SacI), einer Elektrophorese unterworfen, einem Blot unterzogen und mit BNYVV P15 – spezifischen ³²P – gekennzeichneten Sonden hybridisiert unter Verwendung von PCR amplifizierten MOV1–MOV2 Fragmenten (siehe 8).
8: Southern Blot Analyse. Lambda DNA, digeriert mit HindIII, wurde als ein Größenmarkierer (Linie 1) verwendet. Die Linien 2 und 16, DNA der Transgenen: 2 bis 4 digeriert mit SaCI, 6 bis 8 digeriert mit PstI, 10 bis 12 digeriert mit NcoI, 14 bis 16 digeriert mit KpnI. Die Linien 5, 9, 13 und 17 entsprechen der nicht transformierten Pflanze.
REFERENZEN

1. Richards K. E. & Tamada T., Annu. Rev. Phytopathol. 30, pp. 291–313 (1992)
2. Gilmer D. et al., Virology 189, pp. 40–47 (1992)
3. Bouzoubaa S. et al., J. Gen. Virol. 68, pp. 615–626 (1987)
4. Herzog E. et al., J. Gen. Virol. 18, pp. 3147–3155 (1994)
5. Scott K. P. et al., J. Gen. Virol. 75, pp. 3561–3568 (1994)
6. Koonin E. V. & Dolja V. V., Crit. Rev. Biochem. and Mol. Biol. 28, pp. 375–430 (1993)
7. Schmitt C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, pp. 5715–5719 (1992)
8. Morozov S. Y. et al., J. Gen. Virol. 72, pp. 2039–2042 (1991)
9. Zhou H. & Jackson A. O., Virology 216, pp. 367–379 (1996)
10. Quillet L. et al., Virology 172, pp. 293–301 (1989)
11. Bleykasten et al., J. Gen. Virol. 77. pp. 889–897 (1996)
12. Jupin 1. et al., Virology 178, pp. 273–280 (1990)
13. Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, pp. 5463–5467 (1977)
14. Fritsch C. et al., J. Gen. Virol. 46, pp. 381–389 (1980)
15. Laemmli U. K., Nature 227, pp. 680–685 (1972)
16. Schägger H, & von Jagow G., Anal. Biochem. 166, pp. 368– 379 (1987)
17. Lemaire 0. et al. Virology 162, pp. 232–235 (1988)
18. Niesbach-Klösgen U. et al., Virology 178, pp. 52–61 (1990)
19. Hehn A. et al., Virology 210, pp. 73–81 (1995)
20. Tamada T. et al., J. Gen. Virol. 70, pp. 3399–3409 (1989)
21. Kozak M., J. Cell. Biol. 108, pp. 299–241 (1989)
22. Pelletier J. & Sonenberg N,. Nature 334, pp. 320–325 (1988)
23. Tamada T. & Baba T., Annals of the Phytopathological Society oft Japan 39, pp. 325–332 (1973)
24. Kuszala M. & Putz C., Annals of Phytopathology 9, pp. 435–446 (1977)
25. Keskin B., Archiv für Mikrobiology 49, pp. 348–374 (1964)
26. Asher M. J. C., Rhizomania In The sugar beet crop, ed. D. A. Cooke and R. K. Scott, Chapman & Hall, London, pp. 312–338 (1993)
27. Richard-Molard M., Rhizomanie In Institut francais de la betterave industrielle. Compte-rendu des travaux effectues en 1994, ITB, Paris pp. 225–229 (1995)
28. Henry C. M. et al, Plant Pathology 41, pp. 483–489 (1992)
29. Grassi G. et al., Phytopath. Medit. 28, pp. 131–139 (1989)
30. Merdinoglu D. et al., Acad. Agric. Fr. 79, n° 6, pp. 85– 98 (1993)
31. Scolten O. E. et al., Archives of Virology 136, pp. 349– 361 (1994)
32. Büttenr G. & Bürcky K., Proceedings of the First Symposium of the International Working Group on Plant Viruses with Fungal Vectors, Braunschweig Germany, August 21–24 (1990)
33. Whitney E. D., Plant Disease 73, pp. 287–289 (1989)
34. Powell A. P. et al., Science 232, pp. 738–743 (1986)
35. Fritchen J. H. & Beachy R. N., Ann. Rev. Microbiol. 47, pp. 739–763 (1993)
36. Wilson T. M. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, pp. 3134– 3141 (1993)
37. Gonsalves D. & Slightom J. L., Seminars in Virology 4, pp. 397–405 (1993)
38. D'Halluin K. et al., Biotechnology 10, pp. 309–314 (1992)
39. Kallerhof J. et al., Plant Cell Reports 9, pp. 224–228 (1990)
40. Ehlers U. et al., Theoretical and Applied Genetic 81, pp. 777–782 (1991)
41. Kraus J. et al., Field performance of transgenic sugar beet plants expressing BNYVV coat protein plants, Fourth International Congress of Plant Molecular Biology, Int. Soc. for Plant Molecular Biology, Amsterdam (1994)
42. Maiss E. et al., Proceedings of the Third International Symposium on the Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, Monterey, pp. 129–139 (1994)
43. Norris et al., Plant Molecular Biology 21, pp. 895–906 (1993)

Claims

Verfahren für das Induzieren einer Resistenz gegenüber einem Virus mit einer Sequenz eines Dreifachgenblockes 3 unter der Voraussetzung, dass es sich nicht um den Kartoffelvirus X handelt, in einer Pflanzenzelle oder in einer Pflanze, das die folgenden Schritte umfasst: – ein Zubereiten eines Nukleinsäurekonstruktes, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche mindestens 70% der Nukleinsäuresequenz des Dreifachgenblockes 3 des besagten Virus oder der entsprechenden cDNA entspricht, und welche im Hinblick auf die Funktionsfähigkeit mit einer oder mit mehreren in einer Pflanze aktiven regulatorischen Sequenzen verbunden ist, – ein Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Nukleinsäurekonstrukt, und möglicherweise – ein Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz des Nukleinsäurekonstruktes mindestens 90% der Nukleinsäuresequenz des Dreifachgenblockes 3 des besagten Virus oder der komplementären cDNA entspricht.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: dem Virus der Stammnarbung des Apfels, dem Virus der Blaubeerefleckenkrankheit, dem Kartoffelvirus M, dem Mosaikvirus des Weißklees, dem Cymbidium Mosaikvirus, dem Streifenmosaikvirus der Gerste, dem Kartoffel-mop-top-Virus, dem Klumpenvirus der Erdnuß und dem vom Boden übertragenen Virus der Rübe.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzenzelle eine Stomazelle ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanze ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: dem Apfel, der Blaubeere, der Kartoffel, dem Klee, der Orchidee, der Gerste oder der Erdnuß.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ein BNYVV ist, dass die Nukleinsäuresequenz des Dreifachgenblockes 3 des besagten Virus zwischen dem Nukleotid 3627 und 4025 des 5' Stranges genomischer oder subgenomischer RNA 2 des BNYVV enthalten ist und dass die Pflanze eine Rübe ist, vorzugsweise eine Zuckerrübe (Beta vulgaris).
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz oder eine Terminatorsequenz umfasst, welche in einer Pflanze aktiv sind.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorsequenz eine konstitutive oder eine fremde, pflanzliche Promotorsequenz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorsequenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: dem Promotor des 35S Blumenkohlmosaikvirus und/oder aus dem Promotor von Polyubiquitin Arabidopsis Thaliana.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorsequenz ein Promotor ist, welcher hauptsächlich in dem Wurzelgewebe der Pflanzen aktiv ist, wie etwa der Par-Promotor des Haemoglobin-Gens von Perosponia Andersonii.
Transgene Pflanze, die eine Resistenz gegenüber einem Virus aufweist, unter der Voraussetzung, dass es sich nicht um den Kartoffelvirus X handelt, welche ein Nukleinsäurekonstrukt mit einer Nukleinsäuresequenz umfasst, welche mindestens 70% der Nukleinsäuresequenz des Dreifachgenblockes 3 des besagten Virus oder der entsprechenden cDNA entspricht, und welche im Hinblick auf die Funktionsfähigkeit mit einer oder mit mehreren in einer Pflanze aktiven regulatorischen Sequenzen verbunden ist.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt eine Nukleinsäuresequenz aufweist, welche mindestens 90% der Nukleinsäuresequenz des Dreifachgenblockes 3 des besagten Virus oder der komplementären cDNA entspricht.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: dem Virus der Stammnarbung des Apfels, dem Virus der Blaubeerefleckenkrankheit, dem Kartoffelvirus M, dem Mosaikvirus des Weißklees, dem Cymbidium Mosaikvirus, dem Kartoffelvirus X, dem Streifenmosaikvirus der Gerste, dem Kartoffel-mop-top-Virus, dem Klumpenvirus der Erdnuß und dem vom Boden übertragenen Virus der Rübe.
Transgene Pflanze gemäß den Ansprüchen 11 bis 13, wobei es sich um eine Pflanze handelt, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: dem Apfel, der Blaubeere, der Kartoffel, dem Klee, der Orchidee, der Gerste oder der Erdnuß.
Transgene Pflanze gemäß den Ansprüchen 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der transgenen Pflanze um eine Rübe handelt, vorzugsweise um eine Zuckerrübe (Beta vulgaris), dass das Virus ein BNYVV ist und dass die Nukleinsäuresequenz des Dreifachgenblockes 3 des besagten Virus enthalten ist zwischen dem Nukleotid 3627 und 4025 des 5' Stranges genomischer oder subgenomischer RNA 2 des BNYVV oder der entsprechenden cDNA.
Transgene Pflanze gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz und eine in einer Pflanze aktive Terminatorsequenz umfasst.
Transgene Pflanze gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine regulatorische Sequenz eine Promotorsequenz umfasst, welche eine konstitutive oder eine fremde, pflanzliche Promotorsequenz ist.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorsequenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: dem Promotor des 35S Blumenkohlmosaikvirus und/oder aus dem Promotor von Polyubiquitin Arabidopsis Thaliana.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Promotorsequenz ein Promotor ist, welcher hauptsächlich in den Wurzelgeweben aktiv ist, wie etwa der Par-Promotor des Haemoglobin-Gens von Perosponia Andersonii.
Transgene Pflanzengewebe, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einer Frucht, einem Stamm, einer Wurzel, einer Knolle, einem Samen einer Pflanze gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 11 bis 19.