DE69535563T2 - Transgene pflanzen, die dna-konstrukte expremieren, die mehrere virusresistenz-verleihende gene enthalten - Google Patents

Transgene pflanzen, die dna-konstrukte expremieren, die mehrere virusresistenz-verleihende gene enthalten Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft das gentechnische Verändern von Pflanzen und ein Mittel und ein Verfahren, um einer Pflanze eine Vielzahl von Merkmalen, einschließlich der Resistenz gegenüber Viren, unter Verwendung eines für eine Vielzahl von Genen, wie zum Beispiel Hüllproteinen, kodierenden Vektors zu verleihen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Viele landwirtschaftlich bedeutende Anbaupflanzen sind gegenüber der Infektion durch Pflanzenviren anfällig, die eine Anbaupflanze ernsthaft schädigen können, ihren wirtschaftlichen Wert für den Landwirt mindern und ihre Kosten für den Verbraucher erhöhen. Es sind Versuche zur Kontrolle oder Verhütung der Infektion einer Anbaupflanze durch ein Pflanzenvirus durchgeführt worden, wobei jedoch virale Pathogene weiterhin ein erhebliches Problem in der Landwirtschaft sind.
  • Wissenschaftler haben unlängst unter Verwendung gentechnischer Verfahren Wege zur Erzeugung von virusresistenten Pflanzen entwickelt. Ein solcher Ansatz ist insofern vorteilhaft, als das den Schutz bereitstellende genetische Material in das Genom der Pflanze selbst eingebaut ist und es an deren Nachkommen vererbt werden kann. Eine Wirtspflanze ist resistent, wenn sie die Fähigkeit zur Unterdrückung oder Verzögerung der Vermehrung eines Virus oder der Entwicklung pathogener Symptome besitzt. „Resistent" ist das Gegenteil von „anfällig" und kann in Abhängigkeit von ihrer Effizienz unterteilt werden in: (1) hochgradige, (2) moderate oder (3) geringe Resistenz. Im Wesentlichen zeigt eine resistente Pflanze reduzierte oder keine Symptomausprägung und die Virusvermehrung in ihr ist reduziert oder vernachlässigbar. Mehrere verschiedene Typen von Wirtsresistenz gegenüber Viren sind erkannt worden. Der Wirt kann resistent sein gegenüber 1) der Etablierung der Infektion, (2) der Vermehrung des Virus oder (3) der Virusfortschreitung.
  • Potyviren sind eine bestimmte Gruppe von Pflanzenviren, die für verschiedene Anbaupflanzen pathogen sind und die eine Kreuzinfektiosität gegenüber Mitgliedern verschiedener Pflanzenfamilien zeigen. Potyviren umfassen das Wassermelonenmosaik-Virus (WMV-2); Papayaringflecken-Virusstämme, wobei das Papayaringflecken-Virus und das Wassermelonenmosaik-Virus I (PRV-p und PRC-w) zwei nahe verwandte Mitglieder der Poty-Pfanzenvirusgruppe sind, die zeitweise als verschiedene Virustypen klassifiziert wurden, gegenwärtig aber als verschiedene Stämme desselben Virus klassifiziert werden; Zucchinigelbmosaik-Virus (ZYMV); Kartoffel-Virus Y; Tabakätz-Virus und viele andere. S. zum Beispiel Tabelle 1 in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 578 627 .
  • Diese Viren bestehen aus gewundenen, filamentösen Partikeln mit Dimensionen von etwa 780 × 12 Nanometern. Die Virus-Partikel enthalten ein einzelsträngiges RNA-Genom von etwa 10 000 Nukleotiden mit positiver (+, kodierender oder Sense-) Polarität. Die Translation des RNA-Genoms der Potyviren zeigt, dass die RNA für ein einziges großes Polyprotein von etwa 330 kD kodiert. Dieses Polyprotein enthält mehrere Proteine, von denen eines eine für die Spaltung des Polyproteins in mindestens sechs weitere Proteine spezifische Protease von 49 kD ist. Diese Proteine können in der infizierten Pflanzenzelle gefunden werden und sie bilden die für die Virusreplikation notwendigen Bestandteile. Eines der in diesem Polyprotein enthaltenen Proteine ist ein 35 kD Kapsid- oder Hüllprotein, das die Virus-RNA umhüllt und vor Abbau schützt. Ein weiteres ist das im Zellkern eingeschlossene, auch als Replikase bezeichnete Protein, von dem angenommen wird, dass es bei der Replikation der Virus-RNA mitwirkt. Im Verlauf einer Potyvirus-Infektion werden das Replikase-Protein (60 kDa, auch als nukleares Einschlussprotein B bezeichnet) und das Protease-Protein (50 kDa, ebenfalls als das nukleare Einschlussprotein I- oder – A bezeichnet) posttranslational in den späten Stadien der Virusinfektion durch die Kernmembran hindurch in der Nukleus der Pflanzen transportiert und akkumulieren zu hohen Spiegeln.
  • Allgemein ist das Hüllprotein-Gen am 3'-Ende der RNA, direkt vor einem Abschnitt endständiger Adenin-Nukleotidreste (200 bis 300 Basen), angeordnet. Die Anordnung des 49 kD Protease-Gens erscheint bei diesen Viren konserviert zu sein. Beim Tabakätz-Virus wurde als Spaltstelle für die Protease das Dipeptid Gln-Ser, Gln-Gly oder Gln-Ala bestimmt. Die Konservierung dieser Dipeptide als Spaltstellen bei diesen Virus-Polyproteinen ist aus den Sequenzen der oben aufgeführten Potyviren ersichtlich.
  • Die Expression der Hüllproteingene, unter anderem des Tabakmosaik-Virus, des Alfalfamosaik-Virus, des Gurkenmosaik-Virus und des Kartoffel-Virus X in transgenen Pflanzen hat zu Pflanzen geführt, die gegenüber der Infektion durch das entsprechende Virus resistent sind. Es ist ebenfalls über einige Nachweise auf heterologen Schutz berichtet worden. Zum Beispiel berichten Namba et al., Phytopathology 82, 940, 1992, dass die Expression von Hüllprotein-Genen des Wassermelonenmosaik-Virus 2 oder des Zucchinigelbmosaik-Virus in transgenen Tabakpflanzen Schutz vor sechs weiteren Potyviren verleiht: Bohnengelbmosaik-Virus, Kartoffel-Virus Y, Erbenmosaik-Virus, Clover Yellow Vein Virus (CYVV), Pepper Mottle Virus (PMV) und Tabakätz-Virus. Stark et al., Biotechnology 1, 1257, 1989, berichten, dass die Expression des Potyvirus Sojabohnenmosaik-Virus in transgenen Pflanzen Schutz vor zwei serologisch nicht verwandten Potyviren vermittelte: vor dem Tabakätz-Virus und dem Kartoffel-Virus Y.
  • Die Expression eines vorab ausgewählten Hüllprotein-Gens verleiht der Pflanze jedoch keinen zuverlässigen heterologen Schutz. Zum Beispiel sind transgene, dass CMV-C-Hüllproteingen enthaltende Kürbispflanzen nicht gegen hochvirulente CMV-Stämme, einschließlich CMV-V-27 und CARNA-5, geschützt. Daher besteht Bedarf an verbesserten Verfahren, um Pflanzen Resistenz gegen Potyviren zu verleihen.
  • Tricoli et al (J. Cell. Biochem. Suppl., 1994, Seite 91) beschreiben die Herstellung von transgenen, mit einer trivalenten Kassette umfassend das CMV-, ZYMV- und WMV-2-Hüllprotein-Gen transformierten Kürbis- und Cantaloupe-Pflanzen. Ein Cantaloupe-Hybrid wird beschrieben, der mit einem gemischten, aus den drei Viren bestehenden Inokulum beimpft wird.
  • Tricoli et al. (1993, Phytopathology 83, 1425, Abstrakt Nr. A830) bezieht sich auf transgene, mit ZYMV- und WMV-2-Hüllprotein-Genen gentechnisch veränderte Kürbisarten. Die Pflanzen werden unter Freilandbedingungen auf ihre Virusresistenz getestet und es wurden zwei Resistenzebenen beobachtet.
  • WO94/28147 beschreibt transformierte Pflanzen, speziell Zuckerrübe, einschließlich für das Hüllprotein eines Luteo-Virus und eines Clostero-Virus kodierenden Nukleotidsequenzen. Für die Pflanzen wird bei einer Infektion mit beiden Viren beschrieben, dass sie eine verbesserte Resistenz zeigen.
  • Jedoch beschreibt kein Dokument aus dem Stand der Technik ein Verfahren zur Erzeugung rekombinanter Pflanzen, die einen im Wesentlichen gleichen Resistenzpegel aufweisen, wenn sie mit mehreren verschiedenen Viren einzeln beimpft werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verleihung einer Multivirus-Resistenz bei einer gegenüber Viren anfälligen Pflanze bereit, worin die Expression der kodierenden DNA-Sequenzen im Wesentlichen gleiche Resistenzpegel gegenüber der Infektion durch jedes der Viren verleiht, umfassend
    • (a) Transformieren von Zellen der anfälligen Pflanze mit einem chimären rekombinanten, mindestens drei tandemartig verbundene DNA-Sequenzen umfassenden DNA-Molekül, wobei jedes einen in Zellen dieser Pflanzen funktionellen Promotor umfasst und in funktionsfähiger Weise mit einer für ein Hüllprotein kodierenden DNA eines Virus verbunden ist, das zur Infektion der Pflanze in der Lage ist, worin besagte Viren aus der Gruppe bestehend aus Potyviren, Cucumoviren und Comoviren ausgewählt sind,
    • (b) Regenerieren der Pflanzenzellen zur Bereitstellung einer differenzierten Pflanze,
    • (c) Identifizieren einer transformierten Pflanze, die die kodierenden DNA-Sequenzen exprimiert, um so die Pflanze gegenüber Infektion durch die Viren resistent zu machen und
    worin eine transformierte Pflanze identifiziert wird, die ein im Wesentlichen gleiches Ausmaß an Virusresistenz aufweist, wenn sie mit jedem der Viren einzeln beimpft wird.
  • Vorzugsweise ist jede DNA-Sequenz ebenfalls mit einer 3'-untranslatierten DNA-Sequenz verknüpft, die in Pflanzenzellen bewirkt, dass die Translation beendet und polyadenylierte Ribonukleotide an das 3'-Ende transkribierter mRNA-Sequenzen angehängt werden. Vorzugweise ist das Virus ein pflanzenassoziiertes Virus, wie zum Beispiel ein Potyvirus.
  • Somit kann das vorliegende DNA-Molekül als chimäre(s), rekombinante(s) „Expressionskonstrukt" oder „Expressionskassette" eingesetzt werden, um transgene Pflanzen herzustellen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Infektion durch mindestens zwei Pflanzenviren, wie zum Beispiel Potyviren, aufweisen. Die vorliegenden Kassetten umfassen vorzugsweise auch mindestens ein selektierbares Marker-Gen oder Reporter-Gen, das in das Genom der transformierten Pflanzenzellen in Verbindung mit den viralen Genen stabil integriert ist. Die selektierbaren Marker- und/oder Reporter-Gene erleichtern die Identifizierung transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen. Vorzugsweise wird die Virusgenanordnung von zwei oder mehreren selektierbaren Marker-Genen, Reporter-Genen oder einer Kombination davon flankiert.
  • Es ist ein weiteres, erfindungsgemäßes Ziel, eine Multivirus-resistente transformierte Pflanze bereitzustellen, die stabil-integrierte DNA-Sequenzen kodierende Virusproteine enthält.
  • Es ist noch ein weiteres erfindungsgemäßes Ziel, eine Virus-resistente transformierte Pflanzenstelle bereitzustellen, die eine Vielzahl von viralen Genen, d.h. 2 bis 7 oder mehr Gene, enthält, die als Virusproteine aus demselben Virusstamm aus verschiedenen Virusstämmen mit Wirkung für verschiedene Mitglieder der Virusgruppe, wie zum Beispiel der Potyvirus-Gruppe, exprimiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird vor allem durch die Insertion einer Expressionskassette mit mehreren Virus-Hüllproteinen in ein binäres Plasmid und die nachfolgende Charakterisierung der resultierenden Plasmide veranschaulicht. Kombinationen von CMV-, ZYMV-, WMV-2, SQMV- und PRV-Hüllprotein-Expressionskassetten wurden in das binäre Plasmid pPRBN eingebracht. Anschließend wurden die Expressionskassetten mit mehreren Hüllprotein-Genen tragenden binären Plasmide zur Verwendung in Pflanzentransformations-Verfahren in Agrobacterium hinein mobilisiert. Multiple Expressionskassetten tragende binäre Plasmide werden für den Transfer von zwei oder mehreren, der Transformation zugänglichen Virushüllprotein-Genen zusammen mit den assoziierten selektierbaren Marker- und/oder Reporter-Genen in Pflanzen, wie zum Mitgliedern der Cucurbitaceae, eingesetzt.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur gentechnologischen Veränderung bereit, durch das mehrere Merkmale beeinflusst und als Insertion eines einzigen Gens verfolgt werden können, d.h. wie ein als Einzelgen wirkendes Konstrukt, das wie ein Einzellocus nach Mendel segregiert.
  • Es ist ebenfalls entdeckt worden, dass, wenn Tandem-Gene inseriert werden, sie vorzugsweise alle das im Wesentlichen selbe Ausmaß an Effizienz, und mehr bevorzugt, das im Wesentlichen gleichwertige Ausmaß an Effizienz aufweisen, wobei der Begriff „im Wesentlichen", soweit er Virusresistenz betrifft, mit Bezug auf die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Assays definiert ist. Zum Beispiel findet man, wenn man die zahlreichen transgenen, ein intaktes ZYMV- und WMV-2-Hüllprotein-Gen als Insertion enthaltenden Linien untersucht, dass, falls eine Linie gegenüber der Infektion durch ZYMV immun ist, sie auch gegenüber der Infektion durch WMV-2 immun ist. In ähnlicher Weise wird, falls eine Linie eine verzögerte Symptomentwicklung bei ZYMV zeigt, diese ebenfalls eine verzögerte Symptomentwicklung bei WMV-2 zeigen. Schließlich wird, falls eine Linie gegenüber ZYMV anfällig ist, diese auch anfällig gegenüber WMV-2 sein. Dieses Phänomen ist unerwartet. Falls es keine Korrelation zwischen der Wirksamkeit eines jeden Gens in diesen Konstrukten mit mehreren Genen gibt, wäre dieser Ansatz als Werkzeug in der Pflanzenzucht wahrscheinlich in der Anwendung untragbar schwierig. Sogar mit Einzel-Gen-Konstrukten muss man zahlreiche transgene Pflanzen-Linien testen, um eine zu finden, die einen angemessen Wirksamkeitspegel aufweist. Die Wahrscheinlichkeit zur Auffindung einer Linie mit nützlichem Expressionspegel kann im Bereich von 10 bis 50% (in Abhängigkeit von der betroffenen Spezies) liegen.
  • Falls die Wirksamkeit von Einzelgenen in einem mehrere Gene enthaltenden Ti-Plasmid unabhängig wäre, würde die Wahrscheinlichkeit zur Auffindung einer transgenen, gegenüber jedem Virus, auf das das Verfahren abzielt, resistenten Zell-Linie dramatisch abenehmen. Zum Beispiel läge bei einer Spezies, bei der es unter Verwendung einer Insertion von einem Einzelgen eine 10%ige Wahrscheinlichkeit zur Identifizierung einer Linie mit Resistenz gibt, wenn sie mit einem Dreifach-Genkonstrukt CZW transformiert wird und jedes Gen einen unabhängigen Wirksamkeitspegel zeigt, die Wahrscheinlichkeit zur Auffindung eine Linie mit Resistenz gegenüber CMV, ZYMV und WMV-2 bei 0,1 × 0,1 × 0,1 = 0,001 oder 0,1%. Da jedoch die Wirksamkeit multivalenter Gene nicht voneinander abhängig ist, liegt die Wahrscheinlichkeit zur Auffindung einer Linie mit Resistenz gegenüber CMV, ZYMV und WMV-2 immer noch eher bei 10% als bei 0,1%. Offenkundig wird dieser Vorteil noch ausgeprägter, wenn vier oder mehr Gene enthaltende Konstrukte verwendet werden.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 stellt die Struktur des binären Vektors pPRBoriGN dar.
  • 2 stellt die Struktur des binären Vektors pPRBN dar.
  • 3 stellt die Struktur von pPRCPW dar.
  • 4 stellt die Struktur des binären Plasmids pEPG321 dar.
  • 5 stellt die Struktur des binären Plasmids pEPG106 dar.
  • 6 stellt die Struktur des binären Plasmids pEPG111 dar.
  • 7 stellt die Struktur des binären Plasmids pEPG109 dar.
  • 8 stellt die Struktur des binären Plasmids pEPG115 dar.
  • 9 stellt die Struktur des binären Plasmids pEPG212 dar.
  • 10 stellt die Struktur des binären Plasmids pEPG113 dar.
  • 11 stellt die Struktur des binären Plasmids pGA482GG dar.
  • 12 stellt die Struktur des binären Plasmids pEPG328 dar.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die den Pflanzen erfindungsgemäß verliehene Resistenz gegen Viren wird durch die Expression einer isolierten DNA-Sequenz, die für eine Vielzahl von Virusproteinen, d.h. 2 bis 7 Virusproteine, wie zum Beispiel Hüllproteine, kodierende Nukleotide enthält, in der Pflanze bereitgestellt.
  • Repräsentative Viren, aus denen diese DNA-Sequenzen isoliert sein können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Kartoffel-Virus X (PVX), Potyviren wie zum Beispiel Kartoffel-Virus Y (PVY), Cucumo-Virus (CMV), Tabakblattadernsprenkel-Virus (Tobacco Vein Mottling Virus TVMV), Wassermelonenmosaik-Virus (WMV), Zucchinigelbmosaik-Virus (ZYMV), gemeines Bohnenmosaik-Virus, Bohnengelbmosaik-Virus, Sojabohnenmosaik-Virus, Erdnusssprenkel-Virus (Peanut Mottle Virus), Rübenmosaik-Virus, Weizenstrichelmosaik-Virus, Maisverzwergungsmosaik-Virus, Hirsemosaik-Virus (Sorghum Mosaic Virus), Zuckerrohrmosaik-Virus, Johnsongrasmosaik-Virus, Pflaumenpocken-Virus, Tabakätz-Virus, Süßkartoffeln-Feathery-Mottle-Virus, Yamswurzelmosaik-Virus und Papayaringflecken-Virus (PRV), Cucumoviren, einschließlich CMA und Como-Virus.
  • Allgemein ist ein Potyvirus ein Virus mit Einzelstrang-RNA, die von einem sich wiederholenden proteinösen Monomer umgeben ist, das als Hüllprotein (= CP = coat protein) bezeichnet wird. Das verpackte Virus hat eine gewundene, stabförmige Morphologie. Die Mehrzahl der Potyviren wird in nicht persistierender Weise durch Blattläuse übertragen. Wie aus dem weiten Bereich der vom Potyvirus betroffenen Anbaupflanzen gesehen werden kann, umfasst der Wirtsbereich, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche unterschiedlichen Pflanzenfamilien wie Solanaceae, Chenopodiaceae, Gramineae, Compositae, Leguminosae, Dioscroeaceae, Cucurbitaceae und Caricaceae.
  • Wie hierin in Hinblick auf eine DNA-Sequenz oder ein „Gen" verwendet, ist der Begriff „isoliert" so definiert, dass er bedeutet, dass die Sequenz entweder mit chemischen Hilfsmitteln aus ihrem Kontext im viralen Genom extrahiert und gereinigt und/oder in dem Ausmaß modifiziert wurde, dass sie in die vorliegenden Vektoren in der geeigneten Orientierung, d. h. Sense oder Antisense, eingebracht werden kann. Wie hierin verwendet, ist der Begriff „chimär" so definiert, dass er die Verknüpfung von zwei oder mehr DNA-Sequenzen bedeutet, die aus verschiedenen Quellen, Stämmen oder Spezies stammen, d.h. von Bakterien und Pflanzen, oder dass zwei oder mehr DNA-Sequenzen aus derselben Spezies in einer im nativen Genom nicht vorkommenden Weise miteinander verknüpft werden. Somit können erfindungsgemäß nützliche DNA-Sequenzen natürlich vorkommend, halb-synthetisch oder vollständig synthetisch sein. Die DNA-Sequenz kann linear oder zirkulär sein, sie kann sich in einem intakten oder linearisierten Plasmid befinden, wie zum Beispiel in den nachfolgend beschriebenen binären Plasmiden. Wie hierin verwendet, ist der Begriff „heterolog" so definiert, dass er nicht identische, zum Beispiel in Nukleotid- bzw. Aminosäure-Sequenz oder Phänotyp verschiedene Isolate oder ein unabhängiges Isolat bedeutet. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Expression" Transkription oder Transkription gefolgt von Translation eines bestimmten DNA-Moleküls.
  • Die meisten Verfahren mit rekombinanter DNA bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung sind Standardverfahren, die dem Fachmann gut bekannt und im Detail zum Beispiel in der Veröffentlichung der Europäischen Patentanmeldung Nr. 223 452 , veröffentlicht am 29. November 1986, beschrieben sind, welche hierin durch Zitat einbezogen wird. Die Enzyme werden aus herkömmlichen Quellen bezogen und gemäß der Empfehlung des Lieferanten oder gemäß dem Fachmann bekannter Variationen verwendet. Allgemeine, solche Standardverfahren enthaltende Referenzen beinhalten die folgenden: R. Wu, Hrsg, 1979, Methods in Enzymology, Band 68; J.H. Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage; D.M. Glover, Hrsg., 1985, DNA Cloning, Band II; H.G. Polites und K.R. Marotti, 1987, „A step-wise protocol for cDNA synthesis," Biotechniques 4, 514-520, S.B. Gelvin und R.A. Schilperoort, Hrsg., „Indroduction, Expression, and Analysis of Gene Products in Plants", die alle hier durch Zitat einbezogen sind.
  • Zur praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung muss ein virales Gen aus dem viralen Genom isoliert und in einen Vektor eingefügt werden, der die zur Expression des eingefügten Gens benötigten genetischen Regulationssequenzen enthält. Dementsprechend muss ein Vektor so konstruiert sein, dass er die regulatorischen Sequenzen in der Weise bereitstellt, dass sie nach Einfügen eines gewünschten Gens funktionell sind. Wenn das Expressionsvektor/Insertions-Konstrukt zusammengefügt ist, wird es zum Transformieren von Pflanzenzellen verwendet, die dann zur Regeneration von Pflanzen verwendet werden. Diese transgenen Pflanzen tragen das Virus-Gen in dem Expressionsvektor/Insertions-Konstrukt. Das Gen wird in der Pflanze exprimiert und eine erhöhte Resistenz gegenüber viraler Infektion wird dadurch verliehen.
  • Es gibt mehrere verschiedene Arbeitsgänge zur Isolierung eines Virus-Gens. Um dies zu bewerkstelligen, kann der Fachmann Informationen über die genomische Organisation von Potyviren, Cucumoviren und Comoviren verwenden, um das Hüllprotein-Gen oder die nuklearen Einschluss-Gene zu lokalisieren und zu isolieren. Das Hüllprotein-Gen befindet sich in Potyviren am 3'-Ende der RNA, direkt vor einem Abschnitt von etwa 200 bis 300 Adenin-Nukleotid-Resten. Das Gen für den nuklearen Einschlusskörper B (NIb) befindet sich direkt 5' von dem Hüllprotein-Gen und das Gen für den nuklearen Einschlusskörper A (NIa) ist 5' vom NIb-Gen angeordnet. Außerdem wird die die proteolytischen Spaltstellen betreffende Information verwendet, um den N-Terminus des Potyvirus-Hüllprotein-Gens und den N- und C-Terminus des Nicht-Hüllprotein-Gens zu bestimmen. Die Protease-Erkennungsstellen sind bei den Potyviren konserviert und sind als Dipeptide Gln-Ser bzw. Gln-Gly oder Gln-Ala bestimmt worden. Die für diese Dipeptide kodierenden Nukleotid-Sequenzen können bestimmt werden.
  • Unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren wird eine Menge an Virus herangezogen und geerntet. Die virale RNA wird dann abgetrennt und das virale Gen unter Verwendung einer Anzahl bekannter Verfahren isoliert. Die cDNA-Genbank wird unter Verwendung der viralen RNA durch dem Fachmann bekannte Verfahren angelegt. Die virale RNA wird mit an die virale RNA hybridisierenden Primern und reverser Transkriptase inkubiert und ein komplementäres DNA-Molekül hergestellt. Ein DNA-Komplement der komplementären DNA wird hergestellt und diese Sequenz repräsentiert eine DNA-Kopie (cDNA) des ursprünglichen Virus-RNA-Moleküls. Das DNA-Komplement kann in einer Weise hergestellt werden, die zu einer einzigen doppelsträngigen cDNA führt oder es können Polymerasekettenreaktionen unter Verwendung von für das virale Gen spezifischen Oligonukleotid-Primern zum Amplifizieren der für die cDNA kodierenden DNA verwendet werden. Diese Primer können zusätzlich zu den Virus-spezifischen Primern neue, in nachfolgenden Klonierungsschritten verwendete Restriktionsschnittstellen beinhalten. Somit wird ein doppelsträngiges DNA-Molekül erzeugt, das die Sequenzinfomation der viralen RNA enthält. Diese DNA-Moleküle können nach Hinzufügen von Restriktionsenzym-Linker-Molekülen durch DNA-Ligase in E.Coli-Plasmid-Vektoren kloniert werden. Die verschiedenen Fragmente werden in Klonierungsvektoren, wie zum Beispiel gut charakterisierte Plasmide eingefügt, die dann zum Transformation von E. coli zum Anlegen einer cDNA-Genbank verwendet werden.
  • Da Potyvirus-Gene im Allgemeinen konserviert sind, können auf einem analogen Gen aus einem früheren Isolat basierende Oligonukleotid-Primer oder ein analoges Gen-Fragment aus einem früheren Isolat als Hybrisierungssonde zum Screenen der cDNA-Genbank verwendet werden, um festzustellen, ob jedes der transformierten Bakterien DNA-Fragmente mit den entsprechenden viralen Sequenzen enthält. Die cDNA-Insertionen von jeder der an diese Sonden hybridisierenden Bakterienkolonien können sequenziert werden. Das virale Gen liegt in seiner Gesamtheit in den Kolonien vor, die Sequenzen enthalten, die sich 5' bis zu für eine N-terminale proteolytische Spaltstelle kodierenden Sequenzen und 3' bis zu für eine C-terminale proteolytische Spaltstelle des Gens von Interesse kodierenden Sequenzen erstrecken.
  • In alternativer Weise können cDNA-Fragmente in Sense-Orientierung in Expressionsvektoren eingefügt werden. Antikörper gegen ein virales Protein können zum Screenen von cDNA-Expressions-Genbanken verwendet werden und das Gen kann aus den Kolonien isoliert werden, die das Protein exprimieren.
  • Die für die Hüllprotein-Gene und die nuklearen Einschluss-Gene kodierenden Nukleotidsequenzen sind für eine Anzahl von Viren bestimmt und die Gene in Expressionsvektoren eingefügt worden. Die Expressionsvektoren enthalten die erforderlichen genetischen regulatorischen Sequenzen zur Expression eines eingefügten Gens. Das Hüllprotein-Gen wird so eingefügt, dass diese regulatorischen Sequenzen funktionell sind und die Gene exprimiert werden können, wenn sie in das Genom einer Pflanze eingebaut wurden. Ausgewählte Literaturreferenzen über Verfahren zur Isolierung, Klonierung und Expression viraler Gene sind unten in Tabelle I aufgeführt. TABELLE I Klonierte Gene von RNA-Viren
    Virus-Gen Referenz
    Papayaringflecken-Virus-Hüllprotein M.M. Fitch et al., Bio/Technology 10, 1466, 1992
    Kartoffel-Virus X-Hüllprotein K. Ling et al., Bio/Technology 9, 752, 1991 A. Hoekema et al, Bio/Technology 7, 273, 1989
    Wassermelonenmosaik-Virus II-Hüllprotein H. Quemada et al., J. Gen. Virol. 71, 1451, 1990 S. Namba et al., Phytopathology 82, 940, 1992
    Zucchinigelbmosaik-Virus-Hüllprotein S. Namba et al., Phytopathology 82, 940, 1992
    Tabakmosaik-Virus-Hüllprotein R.S. Nelson et al., Bio/Technology 6, 403, 1988 P.Powell Abel et al., Science 232, 738, 1986
    Alfalfamosaik-Virus-Hüllprotein Loesch-Fries et al., EMBO J. 6, 1845, 1987 N.E. Turner et al., EMBO J. 6, 1181, 1987
    Sojabohnenmosaik-Virus-Hüllprotein D.M. Stark et al., Biotechnology 7, 1257, 1989
    Gurkenmosaik-Virus Stamm C-Hüllprotein H.Q. Quemada et al., Molec. Plant Pathol. 81, 794, 1991
    Gurkenmosaik-Virus Stamm WL-Hüllprotein UpJohn Co. (PCT WO90/02185 )
    Tabakätz-Virus-Hüllprotein Allison et al., Virology 147, 309, 1985
    Tabakätz-Virus nukleares Einschlussprotein J.C. Carrington et al., J. Virol. 61, 2540, 1987
    Paprikasprenkel-Virus (Pepper Mottle Virus)-Hüllprotein W.G. Dougherty et al., Virology 146, 282, 1985
    Kartoffel-Virus Y-Hüllprotein D.D. Shukla et al., Virology 152, 118, 1986
    Kartoffel-Virus Y nukleares Einschlussprotein Europäische Patentanmeldung 578 627
    Kartoffel-Virus X-Hüllprotein C. Lawson et al., Biotechnology 8, 127, 1990
    Tabakstrichel-Virus (TSV)-Hüllprotein C.M. Van Dun et al., Virology 164, 383, 1988
  • Zur Expression des viralen Gens müssen die erforderlichen Genregulations-Sequenzen bereitgestellt werden. Da die von einem Potyvirus kodierten Proteine durch posttranslationales Prozessieren eines Polyproteins hergestellt werden, enthält ein aus viraler RNA isoliertes Gen nach Transferieren und Integrieren in ein Pflanzengenom keine zu seiner Transkription und Translation erforderlichen Signale.
  • Es muss daher gentechnisch so verändert werden, dass es einen in Pflanzen exprimierbaren Promotor, ein Translations-Initiations-Codon (ATG), und ein in Pflanzen funktionelles Signal zur Poly(A)-Anhängung (AATAAA) 3' seines Translations-Terminations-Codons enthält. Bei der vorliegenden Erfindung wird ein virales Gen in einen Vektor eingefügt, der Klonierungsstellen zur 3'-Insertion des Initiations-Codons und 5'-Insertion des Poly(A)-Signals enthält. Der Promotor liegt 5' vom Initiations-Codon, so dass nach Insertion von Strukturgenen in die Klonierungsstelle eine funktionelle Einheit gebildet wird, bei der das eingefügte Gen unter der Kontrolle verschiedener genetischer Regulationssequenzen exprimiert wird.
  • Das als Promotor bezeichnete DNA-Segment ist für die Regulierung der Transkription von DNA in mRNA verantwortlich. Eine Anzahl von in Pflanzenzellen funktionierenden Promotoren ist dem Fachmann bekannt und diese können zur praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Diese Promotoren können aus einer Anzahl von Quellen wie Pflanzen oder Pflanzenviren ausgewählt werden und sie können, ohne darauf beschränkt zu sein, aus der Caulimo-Virus-Gruppe, wie zum Beispiel dem Blumenkohlmosaik-Virus-35S-Promotor (CaMV35S), dem verstärkten Blumenkohlmosaik-Virus-Promotor (enh CaMV35S), dem Braunwurzmosaik-Virus-Promoter als Transkript in voller Länge (FMV35S) und dem Chlorophyll a/b-bindenden Protein ausgewählt sein. Weitere nützliche Promotoren beinhalten Promotoren, die zur Expression der Potyvirus-Proteine in induzierbarer oder gewebespezifischer Weise in bestimmten, für das Auftreten der Infektion bekannten Zelltypen in der Lage sind. Zum Beispiel können die induzierbaren Promotoren der Phenylalaninammoniumlyase, der Chalconsynthase, des hydroxyprolinreichen Glucoproteins, des Extensins, von Pathogenese-verwandten Proteinen (z.B. PR-1a) und des durch Verwundung induzierbaren Protease-Inhibitors aus Kartoffel nützlich sein.
  • Bevorzugte Promotoren zur Verwendung in den vorliegenden viralen Genexpressions-Kassetten beinhalten die konstitutiven Promotoren des CaMV, der Nopalin-Synthase-(Bevan et al., Nucleic Acids Res. II, 369-385, 1983) und Octopin-Synthase-Gene aus Ti (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 561-564, 1982) und des Gens für das Speicherprotein Phaseolin der Bohne. Die Signale für die Poly(A)-Anhängung von diesen Genen sind ebenfalls zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet. Die bestimmten ausgewählten Promotoren sind bevorzugt zur Veranlassung ausreichender Expression der mit ihnen verknüpften kodierenden DNA-Sequenzen in der Lage, was zur Produktion von zur Verleihung der Virusresistenz wirksamen Mengen an Proteinen oder RNAs führt, aber nicht in einem solchen Ausmaß, dass die die Expression ausführende Zeile geschädigt wird. Die ausgewählten Promotoren sollten zum Funktionieren in Geweben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, epidermalen, vaskulären und Mesophyll-Geweben in der Lage sein. Die tatsächliche Auswahl des Promotors ist nicht kritisch, solange er eine zur Expression der vorselektierten Proteine oder der Anti-Sense-RNA mit anschließender Resistenzverleihung der Pflanzen ausreichende transkriptionelle Aktivität hat.
  • Die nicht translatierte Leader-Sequenz kann aus jeder geeigneten Quelle stammen und kann speziell modifiziert werden, um die Translation der mRNA zu erhöhen. Die 5'-untransiatierte Region kann von dem zur Expression ausgewählten Promotor, einem nicht verwandten Promoter, von der nativen Leader-Sequenz des Gens oder der zu exprimierenden kodierenden Region, von viralen RNAs, geeigneten eukaryontischen Genen oder einer synthetischen Gen-Sequenz erhalten werden. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die in den folgenden Beispielen dargestellten Konstrukte beschränkt.
  • Die verwendete Teminationsregion oder 3'-untranslatierte Region ist eine, die die Beendigung der Transkription und das Anhängen der polyadenylierten Ribonukleotide an das 3'-Ende der transkribierten mRNA-Sequenz bewirkt. Die Terminationsregion kann nativ zu der Promotorregion oder zu dem Strukturgen gehören oder sie kann aus einer anderen Quelle stammen und beinhaltet vorzugsweise eine Terminationssequenz und eine für die Polyadenylierung kodierende Sequenz. Geeignete 3'-untransiatierte Bereiche des chimären Pflanzengens beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, (1) die 3'-transkribierten, nicht translatierten, das Polyadenylierungsignal von Agrobacterium tumefaciens- Plasmid-Genen (Ti), wie zum Beispiel das Nopalin-Synthase (NOS)-Gen, enthaltenden Bereiche und (2) Pflanzengene, wie zum Beispiel das 7S Speicherprotein-Gen von Sojabohne.
  • Selektierbare Marker-Gene können in die vorliegenden Expressions-Kassetten eingebaut und zur Selektion auf diejenigen Zellen oder Pflanzen verwendet werden, die transformiert wurden. Das eingesetzte Marker-Gen kann Resistenz gegenüber einem Antibiotikum, wie zum Beispiel Kanamycin, Gentamycin, G418, Hygromycin, Streptomycin, Spectinomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol und dergleichen exprimieren. Weitere Marker können zusätzlich oder als Alternative eingesetzt werden, wie zum Beispiel ein Gen, das für eine Herbizid-Toleranz kodiert, wie zum Beispiel Toleranz gegenüber Glyphosat, Sulfonylharnstoff, Phosphinothricin oder Bromxynil. Zusätzliche Mittel der Selektion können Resistenz gegenüber Methotrexat, Schwermetallen, einem auxotrophen Wirt Prototrophie verleihende Komplementation und dergleichen beinhalten. Siehe zum Beispiel Tabelle 1 der oben zitierten PCT WO/91/10725 . Die vorliegende Erfindung zieht auch das Austauschen aller virus-assoziierten Gene gegen eine Anordnung selektierbarer Marker in Betracht.
  • Der bestimmte eingesetzte Marker sollte ein solcher sein, der die Selektion auf transformierte im Gegensatz zu nicht transformierten Zellen gestattet. In Abhängigkeit von der Anzahl der verschiedenen Wirts-Spezies kann ein oder können mehrere Marker dort eingesetzt werden, wo verschiedene Selektionsbedingungen zur Selektion bei verschiedenen Wirten nützlich wären und diese sind dem Fachmann bekannt. Ein durch Screenen nachweisbarer Marker oder ein „Reporter-Gen", wie zum Beispiel das β-Glucoronidase-Gen oder das Luciferase-Gen, können anstelle von oder mit einem selektierbaren Marker verwendet werden. Bei Behandlung mit 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-β-D-glucuronid (X-Glu) können mit diesem Gen transformierte Zellen durch die Produktion eines blauen Produkts identifiziert werden.
  • Bei der Entwicklung des vorliegenden Expressionskonstrukts werden die verschiedenen Komponenten des Expressionskonstrukts wie zum Beispiel die DNA-Sequenzen, Linker oder Fragmente davon, normalerweise in einen geeigneten Klonierungsvektor, wie zum Beispiel ein Plasmid oder einen Phagen, eingefügt, die zur Replikation in einem bakteriellen Wirt, wie zum Beispiel E. coli, in der Lage sind. Es existieren zahlreiche Klonierungsvektoren, die in der Literatur beschrieben wurden. Nach jeder Klonierung können die Klonierungsvektoren isoliert und weiterer Manipulation wie zum Beispiel Restriktionsverdau, Insertion neuer Fragmente, Ligation, Deletion, Herausschneiden, Insertion, in vitro Mutagenese, Hinzufügen von Polylinker-Fragmenten und dergleichen unterworfen werden, um einen Vektor bereitzustellen, der eine spezielle Anforderung erfüllt.
  • Für Agrobacterium-vermittelte Transformation ist die Expressionskassette in einen Vektor eingebaut und von Fragmenten des Agrobacterium-Ti- oder -Ri-Plasmids flankiert, die die rechte und ggf. die linke Begrenzung (Border) der vom Ti- oder Ri-Plasmid transferierten DNA darstellen (T-DNA). Dies erleichtert die Integration der vorliegenden chimären DNA-Sequenzen in das Genom der Wirtspflanzenzelle. Dieser Vektor enthält ebenfalls Sequenzen zur Erleichterung der Replikation des Plasmids in Agrobacterium- sowie auch in E. coli-Zellen.
  • Alle DNA-Manipulationen werden typischerweise in E. coli-Zellen durchgeführt und das fertige, die Potyvirus-Expressionskassette tragende Plasmid wird durch direkte DNA-Transformation, Konjugation und dergleichen in Agrobacterium-Zellen eingebracht. Diese Agrobacterium-Zellen enthalten ein zweites, ebenfalls von Ti- oder Ri-Plasmiden abstammendes Plasmid. Dieses zweite Plasmid trägt alle für den Transfer einer Fremd-DNA in Pflanzenzellen erforderlichen Virulenz-Gene (vir-Gene).
  • Geeignete Pflanzentransformations-Klonierungsvektoren beinhalten diejenigen, die von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abstammen, wie allgemein in Glassman et al. ( US Pat. Nr. 5 258 300 ) offenbart. Zusätzlich zu den offenbarten sind die folgenden zu nennen: Herrera-Estrella, Nature 303, 209, 1983, Biotechnica (veröffentlichte PCT-Anmeldung WO/91/10725 ) und US-Patent 4 940 838 , von Schilperoort et al.
  • Eine Vielfalt von Verfahren steht für die Einführung von genetischem Material in eine oder zur Transformation von einer pflanzliche(n) Wirtszelle zur Verfügung. Die bestimmte Art und Weise der Einführung des Pflanzenvektors in den Wirt ist jedoch zur praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung nicht kritisch und jedes, eine effiziente Transformation bereitstellende Verfahren kann verwendet werden. Zusätzlich zu der Transformation unter Verwendung von tumorinduzierenden (Ti) oder wurzelinduzierenden (Ri) Pflanzentransformationsvektoren können alternative Verfahren zur Einbringung der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte in Pflanzenzellen verwendet werden. Solche Verfahren können zum Beispiel die Verwendung von Liposomen, die Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen, Chemikalien, die die direkte Aufnahme von DNA erhöhen (Paszkowski et al., EMBO J. 3, 2717, 1984), Mikroinjektion (Crossway et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179, 1985), Elektroporation (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 824, 1985) oder Hochgeschwindigkeitsmikroprojektilen (Klein et al., Nature 327, 70, 1987) beinhalten.
  • Die Auswahl des Pflanzengewebe-Ausgangsmaterials oder der Pflanzenzellen aus Zellkultur zur Transformation hängt von der Eigenart der Wirtspflanze und dem Transformationsprotokoll ab. Nützliches Ausgangsmaterial beinhalten Callus, Zellen aus Zellkultur in Suspension, Protoplasten, Blattsegmente, Stammsegmente, Pflanzenanhänge, Pollen, Embryos, Hypokotyle, Knollensegmente, meristematische Bereiche und dergleichen. Das Gewebeausgangsmaterial ist regenerierbar, insoweit als es die Fähigkeit zur Regeneration zu vollständigen, fertilen Pflanzen nach der Transformation beibehält.
  • Die Transformation wird unter auf das ausgewählte Pflanzengewebe ausgerichteten Bedingungen durchgeführt. Die Pflanzenzellen oder -gewebe werden für einen wirksamen Zeitraum der die vorliegende Expressionskassette mit mehreren Genen enthaltenden DNA exponiert. Dies kann im Bereich von einem elektrischen Impuls von weniger als 1 sec bei der Elektroporation bis hin zu zwei Tagen der Co- Kultivierung in Gegenwart von Plasmid-tragenden Agrobacterium-Zellen liegen. Die verwendeten Puffer und Medien variieren ebenfalls hinsichtlich des Ausgangsmaterials an Pflanzengeweben und des Transformationsprotokolls. Bei vielen Transformationsprotokollen wird eine Nährschicht (feeder layer) von suspendierten Zellkulturzellen (z.B. Tabak oder schwarzer mexikanischer Süßmais) auf der Oberfläche von Platten mit festem Medium eingesetzt, die von den zu transformierenden Pflanzenzellen oder -geweben durch eine sterile Filterpapierscheibe getrennt sind.
  • Nach der Behandlung mit DNA können die Pflanzenzellen oder -gewebe vor der Selektion für einen unterschiedlich langen Zeitraum kultiviert oder sie können sofort einem wie oben beschriebenen Selektionsmittel exponiert werden. Bei Protokollen, die die Exposition gegenüber Agrobacterium umfassen, enthält das Medium ebenfalls ein das Wachstum der Agrobacterium-Zellen hemmendes Mittel. Üblicherweise verwendete Verbindungen sind Antibiotika wie zum Beispiel Cefotaxim und Carbenicillin. Die zur Selektion verwendeten Medien können so zubereitet sein, dass transformierter Callus oder Zellen in Zellkultur in einem undifferenzierten Stadium aufrechterhalten werden oder das die Bildung von Trieben aus Callus, Blatt- oder Stängelsegmenten, Knollenscheiben und dergleichen gestattet wird.
  • Von Zellen oder Callus, deren oder dessen Wachstum in Gegenwart von normalerweise hemmenden Konzentrationen eines Selektionsmittels beobachtet wird, wird vorausgesetzt, dass sie transformiert sind und sie können mehrere zusätzliche Male in demselben Medium subkultiviert werden, um nicht-resistente Anteile zu entfernen. Die Zellen oder Calli können dann in einem Assay auf das Vorliegen der Virus-Genkassette untersucht oder sie können bekannten Pflanzenregenerationsprotokollen unterworfen werden. Bei den die direkte Produktion von Trieben betreffenden Protokollen wird bei den auf selektivem Medium erscheinenden Trieben vorausgesetzt, dass sie transformiert sind und sie können abgeschnitten und entweder auf für Wurzelbildung geeignetem selektiven Medium oder einfach durch Eintauchen des abgeschnittenen Triebes in eine wurzelinduzierende Verbindung und direktes Einpflanzen in Vermiculit bewurzelt werden.
  • Um transgene, Multiresistenz aufweisende Pflanzen zu erzeugen, müssen die viralen Gene in die Pflanzenzelle aufgenommen und stabil in das Pflanzengenom integriert werden. Für hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber einem Hemmstoff ausgewählte Pflanzenzellen und -gewebe wird vorausgesetzt, dass sie die selektierbaren, für diese Resistenz kodierenden Marker während der Transformationsbehandlung erworben haben. Da das Marker-Gen üblicherweise mit den viralen Genen verknüpft ist, kann angenommen werden, dass die viralen Gene gleichermaßen erworben wurden. Southern-Blot-Hybrisierungsanalyse unter Verwendung einer für die viralen Gene spezifischen Sonde kann dann verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Fremdgene aufgenommen und in das Genom der Pflanzenzelle integriert wurden. Dieses Verfahren kann ebenfalls Hinweise auf die Anzahl der eingebauten Genkopien geben. Die erfolgreiche Transkription des Fremdgens in mRNA kann unter Verwendung der Northern-Blot-Hybridisierungsanalyse der gesamten zellulären RNA und/oder der hinsichtlich polyadenylierter Regionen angereicherten RNA ebenfalls untersucht werden. In den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossene mRNA-Moleküle sind diejenigen, die virusspezifische, von den im transformierten Vektor vorliegenden Virus-Genen abstammende Sequenzen enthalten, die von derselben Polarität wie die virale genomische RNA sind, so dass sie zur Basenpaarung mit spezifischer viraler RNA der entgegengesetzten Polarität unter den in Kapitel 7 von Sambrook et al, 1989, beschriebenen Bedingungen in der Lage sind. Ebenfalls in den Schutzumfang der Erfindung eingeschlossene mRNA-Moleküle sind diejenigen, die virusspezifische, von den im transformierten Vektor vorliegenden Virus-Genen abstammende Sequenzen enthalten, die von der entgegengesetzten Polarität wie die virale genomische RNA sind, so dass diese zur Basenpaarung mit viraler genomischer RNA unter den in Kapitel 7 von Sambrook et al., 1989, beschriebenen Bedingungen in der Lage sind.
  • Die Gegenwart eines viralen Gens kann ebenfalls durch immunologische Assays, wie zum Beispiel als doppelter Antikörper-Sandwich-Assay von Namba et al., Gene 107, 181, 1991, beschrieben und wie von Clark et al., J. Gen. Virol. 34, 475, 1979 modifiziert, nachgewiesen werden. Siehe auch Namba et al., Phytopathology 82, 940, 1992.
  • Virus-Resistenz kann durch Infektiositäts-Studien wie allgemein von Namba et al., ebenda offenbart, untersucht werden, worin Pflanzen nach Symptomatik eingestuft werden, wenn ein beimpftes Blatt Aufhellung der Blattadern, Mosaik- oder nekrotische Symptome zeigt.
  • Es sei verstanden, dass die Erfindung funktionstüchtig ist, wenn entweder Sense oder Anti-Sense spezifische virale RNA von den oben beschriebenen Expressionskassetten transkribiert wird. Das heißt, es wird dem von den transgenen Pflanzen gezeigten gewünschten Phänotyp und/oder Genotyp kein spezieller molekularer Mechanismus zugeschrieben. Somit kann der Schutz vor dem Virus im Immunitätstest durch irgendeinen oder jede Anzahl von Mechanismen auftreten.
  • Es sei ebenfalls verstanden, dass Virusresistenz durch Expression jedes durch das Virus kodierte Gen auftreten kann. Somit können ein Hüllprotein-Gen oder ein Nicht-Hüllprotein-Gen exprimierende transgene Pflanzen im Immunitätstest gegen ein homologes oder heterologes Virus resistent sein. Zum Beispiel wurde eine transgene, ein PRV NIa-Protease-Gen tragende Pflanze im Immunitätstest als resistent gegenüber PRV befunden (s. Tabelle 7, Beispiel III); eine transgene, das Hüllprotein-Gen eines WMV-2 FL-Stamms tragende Pflanze war im Immunitätstest resistent gegen den heterologen Stamm WMV-2 NY des Virus (Tabellen 1-8, Beispiele I-IV) und eine transgene, ein CMV-C-Hüllprotein-Gen tragende Pflanze war im Immunitätstest auf irgendeine Weise resistent gegen ZYMV (wegen weiterer Information s. die ebenfalls anhängige Patentanmeldung der Rechtsnachfolger der Anmelder, Serien Nr. 08/367 016 inzwischen fallengelassen, mit dem Titel „Transgenic Plants Exhibiting Heterologous Viral Protection", eingereicht am 30. Dezember 1994).
  • Samen von in Gewebekultur regenerierten Pflanzen wird in Freiland herangezogen und zur Erzeugung von reinerbigen Pflanzen mit dem eigenem Blütenstaub befruchtet. Die Nachkommen von diesen Pflanzen werden reinrassige Zuchtlinien, die hinsichtlich ihrer Virus-Resistenz im Freiland für eine Reihe von Umwelbedingungen bewertet werden können. Der kommerzielle Wert virus-resistenter Pflanzen ist am größten, wenn viele verschiedene Hybridkombinationen mit Resistenz zum Verkauf zur Verfügung stehen. Der Landwirt baut typischerweise basierend auf solchen Unterschieden wie Reife, Krankheits- und Insektenresistenz, Farbe oder weiterer agronomischer Merkmale mehr als eine Hybridsorte an. Zusätzlich sind die an einen Teil des Landes angepassten Hybride nicht an einen weiteren Landesteil angepasst wegen der Unterschiede bei solchen Merkmalen wie Reife, Krankheits- und Insektentoleranz oder der öffentlichen Nachfrage nach speziellen Sorten an einem gegebenen geografischen Ort. Deswegen besteht die Notwendigkeit, bei einer großen Anzahl von Elternlinien die Virusresistenz züchterisch zu etablieren, so dass viele Hybridkombinationen hergestellt werden können.
  • Das Hinzufügen von Virusresistenz zu landwirtschaftlichen Elitelinien wird äußerst wirksam erzielt, wenn die genetische Kontrolle der Virusresistenz verstanden ist. Dies erfordert kreuzresistente und -sensitive Pflanzen und das Studium des Vererbungsmusters in segregierenden Generationen, um zu erforschen, ob das Merkmal dominant oder rezessiv exprimiert wird sowie die Anzahl der beteiligten Gene und die Erforschung jeder möglichen Interaktion zwischen Genen, falls mehr als ein Gen für die Expression erforderlich ist. Hinsichtlich transgener Pflanzen des hier offenbarten Typs zeigen die Transgene dominantes Einzelgen-Verhalten nach Mendel. Diese genetische Analyse kann Teil der Ausgangsbemühungen sein, landwirtschaftlich elitäre, aber sensitive Linien zu resistenten Linien zu konvertieren. Ein Konversionsprozess wird durch Rückkreuzung der ursprünglich resistenten Linie mit einer sensitiven Elitelinie und Rückkreuzung der Nachkommenschaft mit dem sensitiven Elternstamm durchgeführt. Die Nachkommenschaft aus dieser Kreuzung segregiert in der Weise, dass einige Pflanzen das/die Resistenzgen(e) tragen, wohingegen andere dies nicht tun. Die das/die Resistenzgen(e) tragende Pflanze wird erneut mit dem sensitiven Elternstamm gekreuzt, was zu einer Nachkommenschaft führt, die erneut bezüglich Resistenz und Sensitivität segregiert. Dies wird wiederholt, bis der ursprünglich sensitive Elternstamm zu einer resistenten Linie konvertiert wurde, die jedoch noch alle weiteren, ursprünglich in dem sensitiven Elternstamm vorhandenen wichtigen Attribute besitzt. Ein separates Rückkreuzungsprogramm wird für jede sensitive Elitelinie durchgeführt, die zu einer virusresistenten Linie konvertiert werden soll.
  • Im Anschluss an die Rückkreuzung werden die neuen resistenten Linien und die geeigneten Kombinationen von Linien, die gut kommerzielle Hybride ausmachen, sowohl auf Virus-Resistenz als auch auf eine ganze Reihe wichtiger landwirtschaftlicher Merkmale bewertet. Es werden resistente Linien und Hybride erzeugt, die getreu dem Typus der ursprünglichen sensitiven Linien und der Hybride sind. Diese erfordert die Bewertung unter einer Reihe von Umweltbedingungen, unter denen die Linien oder Hybride kommerziell gezüchtet werden. Elternlinien von Hybriden, die dies zufrieden stellend erfüllen, werden vermehrt und unter Hybridherstellungs-Standardpraxis zur Hybridherstellung verwendet.
  • Die Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beispiele beschrieben.
  • BEISPIEL 1
  • Kürbispflanzen-Arten mit multipler Virusresistenz
  • A. Binäre Plasmidvektoren
  • Die DNA, die in die Pflanzengenome transferiert wurde, war in binären Plasmiden (M. Bevan, Nucleic Acids Res. 11, 369, 1983) enthalten. Das binäre Elternplasmid war pGA482, konstruiert von G. An, Plant Physiol. 81, 86, 1986. Dieser Vektor enthält die T-DNA-Border-Sequenzen von pTiT37, das selektierbare Marker-Gen Nos-NPT II (das den in Pflanzen exprimierbaren Nopalin-Gen-Promotor fusioniert mit dem aus Tn5 erhaltenen bakteriellen NPT II-Gen enthält), eine multiple Klonierungsstelle und die kohäsiven Enden des Phagen Lambda.
  • Das Plasmid pPRBoriGN (1) wurde von dem Plasmid pGA482 wie folgt abgeleitet: Ein bakterieller, selektierbarer Marker, die Gentamycin-Resistenz, (R. Allmansberger et al., Molec. Gen. Genet. 198, 514, 1985) wurde der rechten Begrenzung (Border) (BR) benachbart, aber außerhalb der T-DNA-Region eingefügt. Das Nos-NPT II-Gen wurde dann ausgeschnitten und die multiple Klonierungsstelle (MCS) benachbart von BR, gerade außerhalb der T-DNA, regeneriert. Als nächstes wurde eine in Pflanzen exprimierbare β-Glucuronidase (GUS)-Genkassette (R.A. Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901, 1987) innerhalb der T-DNA-Region, dem pBR322 Replikationsursprung benachbart, eingefügt. Schließlich wurde ein in Pflanzen exprimierbares NPT II-Gen innerhalb der T-DNA-Region benachbart der linken Begrenzung (Border) (BL) eingefügt. Dieses NPT II-Gen wurde durch Einfügung der für NPT II-kodierenden Region in die Expressionskassette des E. coli-Plasmids pDH51 (R. Kay et al., Nucl. Acids Res. 15, 2778, 1987) hergestellt. Dies stellte ein Polyadenylierungssignal des Blumenkohlmosaik-Virus (CaMV) 35S-Promotor bereit.
  • Das Plasmid pBRBN (2) wurde von pPRBoriGN wie folgt abgeleitet: Die Region von pPRBoriGN vom Anfang der für GUS-kodierenden Region bis BL wurde deletiert. Deshalb wurden das GUS-Gen und die 35S/NPT II-Kassette als eine Einheit entfernt. Diese Region wurde dann durch ein aus der 35S/NPT II-Kassette allein bestehendes Fragment ersetzt. Das Endergebnis dieser Schritte war die Entfernung des GUS-Gens und einer kurzen Region der pBR322-Homologie, was das in Pflanzen exprimierbare NPR II-Gen benachbart zu BL zurückließ.
  • B. Donor-Gene
  • 1. Wassermelonenmosaik-Virus 2 (= WMV2)
  • Ein in Pflanzen exprimierbares WMV2-Gen wurde unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer konstruiert, um ein aus der für das WMV2-Hüllprotein kodierenden Region aus dem Stamm WMV-2 PL und den dieses flankierenden AatII (5') und BglII (3')-Restriktionsenzymschnittstellen bestehendes Fragment zu erzeugen. Dieses Fragment wurde in den mit AatII/BglII geschnittenen Plasmidvektor pUC19B2 ligiert, der das in der Weise modifizierte Plasmid pUC19 ist, dass es eine BglII-Restriktionsenzymschnittstelle in seiner multiplen Klonierungsstelle enthält. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pUCWM2P25, wurde durch Hinzufügen des CaMV 35S-Promotors und des aus pUC1813/CP19 (J.L. Slightom, Gene 100, 251, 1991) erhaltenden Polyadenylierungssignals zur Herstellung einer in Pflanzen exprimierbaren Hüllprotein-Kassette weiter modifiziert. Das durch die Expression dieses Gens hergestellte Protein sollte eine Fusion aus dem WMV2-Hüllprotein und dem NH3-terminalen Anteil des CMV-Hüllprotein-Gens sein. Diese Kassette (CPW) wurde dann durch BamHI-Verdau ausgeschnitten und in die BglII-Schnittstelle von pPRBoriGN zur Herstellung eines als pPRCPW bezeichneten binären Plasmids ligiert (3).
  • 2. Zucchinigelbmosaik-Virus (Zucchini Yellow Mosaic Virus = ZYMV)
  • Die Klonierung und Charakterisierung des hierin verwendeten ZYMV-Hüllprotein-Gens aus dem Stamm ZYMV FL ist in H. Quemada et al., J. Gen. Virol. 71, 1451, 1990, beschrieben. Die bei der Konstruktion des in Pflanzen exprimierbaren ZYMV-Hüllprotein-Gens angewandte Strategie ist in J.L. Slightom, 1991, oben zitiert, und S. Namba et al., Phytopathology 82, 945, 1992, beschrieben.
  • 3. Gurkenmosaik-Virus (Cucumber Mosaic Virus = CMV)
  • Die Klonierung, Charakterisierung und gentechnische Veränderung des in unseren Experimenten verwendeten CMV-Hüllprotein-Gens sind in H. Quemada et al., J. Gen. Virol. 70, 1065, 1989 und in der oben zitierten Veröffentlichung aus 1991 beschrieben.
  • 4. Kürbismosaik-Virus (Squash Mosaic Virus = SQMV)
  • SQMV ist ein Comovirus, das durch Samen übertragen und durch gestreifte oder gefleckte Gurkenkäfer (Acalymma spp. und Diabrotica spp.) verbreitet wird. Die Insekten erwerben das Virus innerhalb von 5 min und es wird während bis zu 20 Tagen beibehalten. Der Wirtsbereich ist auf Cucurbitaceae beschränkt. Dieses Virus besteht aus isometrischen Partikeln mit einem Durchmesser von 30 nm, die in zwei funktionelle, als M-RNA und B-RNA bezeichnete Teile unterteilte einzelsträngige RNA enthalten (Provvidenti, in: Plant Viruses of Horticultural Crops in the Tropics and Subtropics, Taiwan, Rep. of China, 1986, auf den Seiten 20-36).
  • Die Isolierung, DNA-Sequenz, Modifizierung und Expression dieser Gene in Pflanzenzellen sind von Hu. et al., Arch. Virol. 130, 17, 1993, beschrieben. Kurz gesagt, werden nach Isolierung und Sequenzierung die Gene durch gentechnische Verfahren gemäß Slightom, Gene 100, 251, 1991 in die Pflanzenexpressionskassette pUC18cpexpress eingebaut. Die Verwendung dieser Verfahrensweise und dieser Expressionskassette ergaben im Leserahmen an den 5'-untranslatierten Leader des Gurkenmosaik-Virus angehängte SQMV-Hüllprotein-Klone. Die Fusionen wurden von dem 35S Promotor und unter Verwendung des 35S-Terminators angetrieben (4). Die modifizierten Gene wurden dann nach HindIII-Verdau isoliert und in einem einzigen Schritt in das binäre Upjohn-Plasmid pGA482GG (11) eingefügt. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pGA482 (An, Methods in Enzymol. 153, 292, 1987). Die beiden Hüllprotein-Kassetten sind in derselben Richtung orientiert wie das NPT II-Gen. Die Gene liegen in Einzelkopien vor.
  • 5. Papayaringflecken-Virus (Papaya Ringspot Virus = PRV)
  • Ein in Pflanzen exprimierbares PRV-Gen wird durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer isoliert. Zur weiteren Information wird auf die ebenfalls anhängige Patentanmeldung der Rechtsnachfolger der Anmelder mit der Serien-Nr. 08/366 881 mit dem Titel „Papaya Ringspot Virus Coat Protein Gene", eingereicht am 30. Dezember 1994, inzwischen fallengelassen, verwiesen. Nach Isolierung und Sequenzierung wurde das Gen mit gentechnischen Verfahren in die Pflanzenexpressionskassette pUC18cpexpress gemäß Slightom, ebenda, 1991, eingefügt.
  • 6. Konstrukte mit mehreren Hüllproteinen
  • Expressionskassetten mit einem einzigen Hüllprotein wurden in verschiedenen Kombinationen zusammengefügt, um binäre Plasmide zu erhalten, die mehr als ein in Pflanzen exprimierbares Gen in das Genom von Pflanzen transferieren können.
  • (a) ZYMV72/WMBN-22
  • ZYMV72/WMBN22 wird aus dem binären Plasmid pPRBN abgeleitet, in das Expressionskassetten für ZYMV- und WMV2-Hüllproteine eingefügt worden waren. Die Expressionskassetten wurden nacheinander in die einzige BglII-Schnittstelle von pPRBN eingefügt. Um dies zu erreichen, wurde eine BamHI-Schnittstelle 5' des 35S-Promotors und eine BglII-Schnittstelle 3' der Poly-A-Anhängungssequenz in die WMV-2- und ZYMV-Expressionskassetten eingefügt. Die BamHI- und BglII-Schnittstellen wurden unter Verwendung geeigneter Oligonukleotid-Primer während der PCR-Amplifikation der Kassetten eingefügt. Die PCR-Produkte wurden mit BamHI und BglII verdaut, um geeignete Enden zu erzeugen. Die BamHI/BglII-Enden tragende WMV-2-Kassette wurde zur Erzeugung von ZYMV72/WMBN22 (5) in die einzige Schnittstelle mit BamHI/BglII-Enden eingefügt. Die binäre Kassette wird ZW genannt.
  • (b) CMV73/ZYMV72/WMBN22
  • Die CMV-C Hüllprotein-Expressionskassette wurde in die einzige HindIII-Schnittstelle von ZYMV72/WMBN22 eingefügt, was CMV73/ZYMV72/WMBN22 (5) ergab. Diese tertiäre Kassette wird CZW genannt.
  • (c) CMV-WL41/ZYMV72/WMBN22 (C-WLZW)
  • Expressionskassetten für die CMV-WL (Stamm White Leaf)-, ZYMV- und WMV2-Hüllprotein-Gene werden in das binäre Plasmid pPRBN eingefügt, um CMV-WL41/ZYMV72/WMV2 (C-WLZW) zu erhalten. Um diese Kombination von Virushüllproteinkassetten in pPRBN einzubauen, wurde eine Hüllprotein-Genexpressionskassette des CMV-WL(White Leaf)-Stamms in ZYMV72/WMVN22 eingefügt (s. oben bezüglich der Konstruktion von ZYMV72/WMBN22). Zur Konstruktion der CMV-WL-Hüllprotein-Expresssionskassette fügten Namba et al., Gene 107, 181, 1991, die für das Hüllprotein von CMV-WL kodierende Region in das Plasmid cpexpress ein. Ein die CMV-WL-Expressionskassette enthaltendes HindIII-Fragment wurde in die HindIII-Schnittstelle von ZYMV72/WMBN22 eingefügt, um CMV-WL41/ZYMV72/WMBN22 (7) zu erhalten. Diese binäre Plasmid wird CWLZW genannt.
  • (d) WM310/ZYMV47/482G
  • Ein die oben beschriebene ZYMV-Hüllproteinexpressionskassette tragendes HindIII-Fragment wurde in die einzige HindIII-Schnittstelle von pGA482G eingefügt, um ZYMV47/482G zu erhalten. Als nächstes wurde das die WMV2-Kassette tragende BamHI-Fragment in die einzige BglII-Schnittstelle von ZYM47/482G eingefügt, um WMV310/482G zu erhalten. Das Konstrukt wird WZ genannt.
  • (e) PRVcpwm16S/WZWL41/ZY72/WMBN22
  • Expressionskassetten für die Hüllproteine-Gene des PRV-FL-Stamms (wegen weiterer Information s. die ebenfalls anhängige Patentanmeldung der Rechtsnachfolger der Anmelder mit der Serien-Nr. 08/366 881 mit dem Titel „Papaya Ringspot Virus Coat Protein Gene", eingereicht am 30. Dezember 1994, inzwischen fallengelassen und hier durch Bezugnahme einbezogen), des CMV-WL(White Leaf)-Stamms, des ZYMV und des WMV-2 wurden in das binäre Plasmid pPRBN eingefügt, um PRVcpwm16S/CWL41/ZY72/WNBN22 (9) zu erhalten. Das Konstrukt wird PCZW genannt.
  • (f) PNIa22/CWL41/ZY72/WMBN22
  • Expressionskassetten für das PNIa-Gen des PRV-P-Stamms (wegen weiterer Information s. die ebenfalls anhängige Patentanmeldung der Rechtsnachfolger der Anmelder mit der Serien-Nr. 08/366 881 mit dem Titel „Papaya Ringspot Virus Coat Protein Gene", eingereicht am 30. Dezember 1994, inzwischen fallengelassen und hier durch Bezugnahme einbezogen) und die Hüllprotein-Genkassetten für den CMV-WL-Stamm, ZYMV und WMV wurden in das binäre Plasmid pPRBN eingefügt, um PNIa22/CWL41/ZY72/WMBN22 (10) zu erhalten. Dieses Konstrukt wird PNIa CZW genannt.
  • (g) SQ21/SQ42/WMBN22/ZY72/PRVcpwm16s/CWL41
  • Es wurden Expressionsvektoren für die Hüllproteingene von WMV-2, ZYMV und PRV-FL und für den CMV-WL-Stamm und für zwei Proteingene von SqMV hergestellt und in das binäre Plasmid pGA482GG (12) eingefügt. Dieses Konstrukt wird SWZPC genannt.
  • C. Transformation von Kürbis
  • Nach Entfernen der Samenschalen werden die Samen während 20 bis 25 min in einer 20%igen, Tween 20 (200 μl/1000 ml) enthaltenden Natriumhypochloritlösung (Chlorox) oberflächensterilisiert. Der Ungezieferbekämpfung folgten drei Spülungen mit 100 ml destilliertem Wasser. Die Samen wurden in 20 ml Murashige und Skoogminimal organisches (MS) Medium von ¼ Stärke, verfestigt mit 0,8% Difco Bacto Agar, enthaltenden 150 × 25 mm Kulturröhrchen ausgekeimt. Nach 5 bis 7 Tagen wurden die Kotyledonen von den Keimlingen entfernt, die Spitzen der Triebe abgeschnitten und in 75 ml mit 1,5% Difco Bacto Agar verfestigtes MS-Medium enthaltende GA7-Gefäße (Magenta Corp.) überführt. Falls nicht anders angegeben, wurden alle Kulturen in einem Anzuchtraum bei 25°C mit einer Photoperiode von 16 h Licht inkubiert. Licht wurde sowohl durch kalte Fluoreszenz-(Phillips F40CW) als auch Pflanzenwachstumslampen (General Electric F40-PF) bereitgestellt.
  • Blattstücke (0,5 cm) wurden von den in vitro-Pflanzen gesammelt, in Agrobacterium tumefaciens-Kulturmedium eingeweicht und dann in 40 ml, mit 1,2 mg/l 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure (2,4,5-T) und 0,4 mg/l Benzylaminosäure (BAP) (MS-I) und mit 200 μM AS supplementiertes MS-Medium enthaltende Petrischalen überführt. Die Platten wurden bei 23°C inkubiert. Nach zwei bis drei Tagen wurden Blattstücke auf 500 mg/l Carbenicillin, 200 mg/l Cefotaxim und 150 mg/l Kanamycinsulfat enthaltendes MS-I-Medium (MS-IA) überführt. Nach 10 Tagen wurden die Blätter in frisches MS-IA-Medium überführt. Danach wurde das Gewebe alle drei Wochen in frisches MS-IA-Medium überführt. Nach etwa 16 bis 24 Wochen wurde kanamycinresistenter embryonischer Callus geerntet und in mit 500 mg/l Carbencillen und 150 mg/l Kanamycinsultat und 1,03 mg/l CaCl2·2H2O supplementiertes flüssiges MS minimal organisches Medium enthaltende Drehgestellröhrchen überführt. Die sich entwickelnden Embryonen wurden geerntet und in 20 mg AgNO3 enthaltendes, minimal organisches MS-Medium transferiert. Die keimenden Embryonen wurden in frischem Medium subkultiviert bis Wurzelsprosse erhalten wurden. Die Pflänzchen wurden zur R1-Samenproduktion in Erde überführt.
  • D. Pflanzenanalyse
  • Kanamycin resistente Transformanten wurden durch ELISA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (5-Prime 3-Prime, Boulder, CO) auf die Expression des NPT II-Gens analysiert. Polymerasekettenreaktionen unter Verwendung geeigneter Primer wurden durchgeführt, um das NPT II-Gen (der rechten Begrenzung [border] benachbart) und das der linken Begrenzung am nächsten gelegene Hüllprotein-Gen zu amplifizieren. Einige Linien wurden unter Verwendung von Southern-Blot-Analyse weiter charakterisiert. Die Expression des viralen Hüllprotein-Gens in mutmaßlich transformierten Pflanzen wurde durch ELISA unter Verwendung von mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörpern gemäß dem Protokoll von M.F. Clark et al., J. Gen. Virol. 34, 475, 1977, nachgewiesen. Die Antiseren gegen CMV-C, WMV-2-NY und ZYMV-FL wurden von D. Gonsalves (Cornell University, Geneva, New York) bereitgestellt.
  • Die Gegenwart oder Abwesenheit von T-DNA in der R1 und den nachfolgenden Generationen wurde durch ELISA-Tests auf die selektierbaren NPT II-Marker-Gene ermittelt. PCR- oder Southern-Blot-Analyse wurden verwendet, um die Vererbung in der Linie ZW20 zu verfolgen, deren nachfolgenden Generationen das NPT II-Gen fehlte.
  • D. Beimpfungsverfahren
  • Segregierende R1- oder R2-Nachkommen wurden zusammen mit geeigneten Kontroll-Linien im Gewächshaus ausgekeimt. Vor der Beimpfung mit Virus wurden Proben der Kotyledonen für NPT II-ELISA-Assays gesammelt. Mit Karborund bestäubte Kotyledonen wurden bei 6 Tage alten Keimlingen mit einer 1 × 10–1 w/v-Verdünnung des CMV-Stamms C, des ZYMV-Stamms FL oder des WMV-2-Stamms NY (erhalten von D. Gonsalves, Cornell University), die auf Cucumis sativus, Cucurbita pepo bzw. Phaseolus vulgaris vermehrt worden waren, mechanisch beimpft. Die Pflanzen wurden mit dem Virus im Gewächshaus beimpft. Etwa 7 bis 10 Tage nach Beimpfung wurden die Pflanzen ins Freiland verpflanzt. In einigen Versuchen wurden nicht beimpfte Kontrollpflanzen einbezogen, um eine gewisse Virusausbreitung durch Blattläuse zu überwachen. Daten bezüglich der Symptomentwicklung wurden vor Durchsicht der NPT II-ELISA-Ergebnisse gesammelt, so dass eine Einstufung ohne Kenntnis des transgenen Status der zu bewertenden Segreganten vorgenommen wurde.
  • Den Pflanzen wurde basierend auf den Blattsymptomen eine Einstufung der Erkrankungsschwere von 0 bis 9 zugeordnet (0 = keine Symptome = asymptomatisch, 3 = Symptome auf beimpften Blättern und/oder sehr milde Symptome auf neu gewachsenem Gewebe, 5 = moderate systemische Ausbreitung, 7 = schwere systemische Ausbreitung, 9 = schwere systemische Ausbreitung und Stauche). Die Früchte wurden ebenfalls bezüglich der Symptomschwere bewertet (0 = keine Symptome = asymptomatisch, 3 = milde grüne Fleckung der Früchte, 5 = moderate Entfärbung, 7 = schwere Entfärbung, 9 = Entfärbung und Verformung der Früchte). Jeder Linie wurde dann eine Krankheitseinstufung hinsichtlich der Früchte und Blätter zugeordnet, die ein Durchschnitt der Bewertungen einzelner Pflanzen war.
  • E. Freilandflächendesign
  • Das Freilandflächendesign wurde mit vom Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) des Landwirtschaftsministeriums der USA (USADA) erteilten Genehmigungen durchgeführt. Es wurde ein Design entwickelt, bei dem jede Reihe bestehend aus einer transgenen Linie mit einer das nicht-transgene Gegenstück als Kontrolle enthaltenden Reihe gepaart wurde. Jede Reihe bestand aus 15 Pflanzen, zwei Fuß von einander entfernt, mit fünf Fuß zwischen den Reihen. Zwei bis drei Replikationen jeder transgenen Linie wurden in jeden Test einbezogen. Die Flächen waren von einer mindestens 30 Fuß Grenzzone nicht-transgener Kürbispflanzen umgeben, um den Flug transgener Pollen aus dem Versuchsgebiet zu reduzieren und um die Virusausbreitung im Freiland zu überwachen. In den Test einbezogenes transgenes Material umfasste R1- und R2-Nachkommen von mit eigenem Blütenstaub befruchteten oder rückgekreuzten Ro-Yellow-Crookneck-Kürbis-Reinzuchtlinien. In einigen Fällen wurde eine transgene Reinzuchtlinie mit der geeigneten nicht-transgenen Reinzuchtlinie gekreuzt, um die transgenen Versionen der handelsüblichen Kürbis-Hybride Pavor oder Dixie hervorzubringen.
  • F. Ergebnisse
  • ZW-Konstrukte
  • Die Linie ZW20 wurde aus einer Ro-Pflanze herangezogen, die mit ZYMV72/WMBN22 transformiert worden war. Die während der Freilandversuche 1 und 2 an der R1-Population gemachten Beobachtungen zeigten, dass alle die NPT II-Insertion enthaltenden Pflanzen während der gesamten Versuchsdauer resistent gegenüber ZYMV und WMV-2 blieben.
  • Die Linie ZW19 wurde aus einer Ro-Pflanze herangezogen, die mit ZYMV72/WMVN22 transformiert worden war. Im Gegensatz zu der Linie ZW-20 ergab die Linie ZW-19 eine Reduktion der Symptomentwicklung, wenn sie entweder mit ZYMV oder WMV-2 beimpft wurde (Tabelle 1). TABELLE 1
    Symptomentwicklung auf transgenen Yellow Crookneck (YC)-Kürbisreinzuchtlinien 40 bis 47 Tage nach Beimpfung mit einer 1/10 w/v-Verdünnung eines ZYMV-FL-Stamms oder eines WMV-2-NY-Stamms während unserer in 1991 und 1992 durchgeführten Feldversuche (# (%) symptomatische Pflanzen)
    Linie NTP II 1991 WMV-2-Versuch 1992 WMV-2-Versuch 1992 ZYMV-Versuch
    ZW-19 + – -- -- -- -- 14/14 16/16 (100) (100) 11/11* 19/19 (100) (100)
    ZW-20 + – 0/14 5/18 (0) (28) 0/5 10/25 (0) (40) -- -- -- --
    *mild
  • CW-Konstrukte
  • Transgene, die Expressionsvektoren mit CMV-C- und WMV-2-Hüllprotein-Genen enthaltende Kürbispflanzen wurden entweder mit den CMV-Stämmen V27, V33 oder V34 beimpft (wegen weiterer Information wird auf die ebenfalls anhängige Patentanmeldung der Rechtsnachfolger der Anmelder mit der Serien-Nr. 08/366 881 mit dem Titel „Papaya Ringspot Virus Coat Protein Gene", eingereicht am 30. Dezember 1994, inzwischen fallengelassen, verwiesen), die zur Infektion transgener, das CMV-C-Hüllprotein exprimierender Pflanzen in der Lage sind. Eine Mehrheit transgener Pflanzen war beim Immunitätstest mit diesen heterologen CMV-Stämmen resistent, anders als die ein CMV-C-Hüllprotein allein tragenden transgenen Zell-Linien. Die verbleibenden Pflanzen, die infiziert waren, hatten weitgehend reduzierte Symptome in Relation zu transgenen Pflanzen mit dem CMV-C-Hüllprotein allein.
  • CZW-Konstrukte
  • Die Linie CZW-3 wurde aus einer mit CMV73/ZYMV72/WMBN22 transformierten Ro-Pflanze herangezogen. Sie verblieb in Feldversuchen asymptomatisch bei Infektion mit CMV-C, ZYMV-FL oder WMV-2, gleichgültig, ob die Beimpfung jeweils einzeln oder in einem alle drei Viren enthaltenden Cocktail erfolgte (Tabelle 2).
  • Die Linie CZW-40 wurde aus einer mit CWL41./ZWMV-72/WMBN22 transformierten Ro-Pflanze herangezogen. Sie konnte keinerlei Schutz vor Infektion bereitstellen, wenn sie entweder mit CMV-C, ZYMV-FL oder WMV-2 NY beimpft wurde (Tabelle 2). TABELLE 2
    Symptomentwicklung auf Kürbispflanzen nach Beimpfung mit einer 1/10 w/v-Verdünnung von CMV-C, ZYMV-FL oder WMV-2 NY
    Linie NTP II Immunitätstest mit Symptomatisches Erkrankungseinstufung
    Verhältnis % Blätter Früchte
    CZW-3 + – CMV-C 1/13 6/6 0,7 100 0,4 8,5 0,0) --
    CZW-40* + – CMV-C 4/4 11/11 100 100 5,0 9,0 -- --
    CZW-3 + – ZYMV-FL 0/14 4/4 0 100 0,0 8,0 0,0 7,0
    CZW-40* + – ZYMV-FL 9/9 5/5 100 100 9,0 7,0 -- --
    CZW-3 + – WMV-2-NY 0/40 15/15 0 100 0,0 7,0 0,0 7,0
    CZW-40* + – WMV-2-NY 11/11 3/3 100 100 7,0 7,0 -- --
    • * Screenen im Gewächshaus
  • Die Früchte und Blätter hatten Krankheitseinstufungen von 0. Im Gegensatz dazu entwickelten 100% der Hüllprotein-Segreganten schwere Symptome der Virusinfektion sowohl auf ihren Blättern als auch auf ihren Früchten. Die Krankheitseinstufungen für Hüllprotein-Segreganten lagen im Bereich zwischen 7,0 und 9,0 (Tabelle 3). Dieser Versuch zeigte, dass durch Einbringen der Hüllprotein-Gene in Kombination Resistenz gegen gleichzeitige Infektion durch verschiedene Viren sowohl in Reinzucht- als auch in Hybrid-Linien erhalten werden kann. TABELLE 3
    Freiland-Versuch 3 Ergebnisse Symptomentwicklung auf Kürbispflanzen 55 Tage nach gleichzeitiger Beimpfung mit einer 1/10 w/v-Mischung von CMV-C, ZYMV-FL und WMV-2 NY
    Linie CP Symptomatisches Krankheitseinstufung
    Verhältnis % Blätter Früchte
    Dixie CZW-3 + – 0/27 30/30 0 100 0,0 8,4 0,0 7,0
    Pavo CZW-3 + – 0/27 33/33 0 100 0,0 7,0 0,0
    YS20CZW-3 + – 0/40 15/15 0 100 0,0 7,0 0,0 7,0
    Dixie + – -- 14/14 -- 100 -- 8,7 -- 7,0
    Pavo + – -- 24/24 -- 100 -- 8,9 -- 7,0
    • CP = Hüllprotein
  • Für die dritte Test-Saison einer R2-Generation von CZW-3 wurde durch Befruchtung mit eigenem Blütenstaub eine hüllprotein-positiver R1-Generation eines CZW-3-Segregant herangezogen. Zwei transgene Hybrid-Linien, äquivalent zu Asgrows kommerziell erhältlichen Hybriden Pavo und Dixie, wurden ebenfalls unter Verwendung dieser transgenen reinerbigen Linie als ein Elternteil herangezogen. Die Nachkommen der selbstbestäubten, reinerbigen Linie zeigten das erwartete Segregationsverhältnis (basierend auf NPT II-ELISA) von 3:1 für das eingefügte Gen, wohingegen beide Hybrid-Linien das erwartete Verhältnis von 1:1 zeigten. Die transgenen reinerbigen und Hybrid-Nachkommen wurden mit einer eine 1/10 w/v-Verdünnung aller drei Viren CMV-C, WMV-2-NY und ZYMV-FL enthaltenden Impfmischung beimpft. Tabelle 3 zeigt, dass Segreganten vollständig resistent gegenüber der Infektion durch alle drei Viren waren.
  • Die hier präsentierten Ergebnisse bestätigten, dass Hüllprotein-Gene virale Multi-Resistenz verleihen, wenn sie in Kombination eingefügt sind. Die transgene Linie CZW-3 bleibt zum Beispiel in allen drei Virus-Versuchen (CMV, ZYMV und WMV-2) asymptomatisch, sowohl bei denjenigen, bei denen sie mit jeweils einem Virus einzeln beimpft als auch bei denjenigen, bei denen sie mit allen drei Viren gleichzeitig beimpft wurde. Die Fähigkeit, Linien mit Resistenz gegen mehrfache Virus-Infektion zu erhalten, ist wesentlich für die Entwicklung einer kommerziell nützlichen Kürbiskultursorte, da es unter kommerziellen Freilandbedingungen üblich ist, während der Wachstumssaison Infektion durch mehr als ein Virus zu vorzufinden.
  • In diesen Versuchen wurde ebenfalls beobachtet, dass bei Einfügung mehrerer Hüllprotein-Gene in ein einziges Konstrukt, alle Gene in dem Konstrukt ähnliche Wirksamkeitspegel bereitstellen. Die Linie CZW-3, die einen hohen Resistenzpegel gegen CMV-C bereitstellt, stellt ebenfalls einen hohen Resistenzpegel gegen ZYMN-FL und gegen WMV-2-NY bereit. In konstruierten transgenen Zell-Linien wie zum Beispiel ZW-19, die nur eine moderate Resistenz (d.h. mildere Symptome durch Resistenzentwicklung) gegenüber WMV-2 aufweist, zeigt ebenfalls nur moderate Resistenz gegenüber ZYMV. Weiterhin zeigte Screenen der transgenen Zell-Linie CZW-40, die keine Resistenz gegenüber CMV-C vermitteln konnte, im Gewächshaus, dass diese Linie auch keine Resistenz gegenüber ZYMV-FL und WMV-2-NY vermitteln konnte. Dieser koordinierte Wirkpegel zwischen Genen in einem Konstrukt mit mehreren Genen könnte die Wirkung der Anordnung innerhalb des Pflanzengenoms widerspiegeln, in das die Gene eingefügt wurden. Auf jeden Fall stellt dieses Phänomen ein Verfahren zur starken Erhöhung der Auffindungs-Wahrscheinlichkeit einzelner transgener Linien mit hohen Resistenzpegeln gegenüber mehreren Viren bereit.
  • BEISPIEL II
  • Einführung von Kassetten mit mehreren Hüllproteinen in Cantaloupe
  • 1. Cantaloupe-Transformation
  • Reinerbige Cantaloupe-Linien wurden mit den oben aufgeführten Konstrukten mit mehreren Genen transformiert, wobei eine Modifikation des Verfahrens von Fang und Grumet, Molec. Plant Microbe Interactions 6, 358, 1993 verwendet wurde. Bewurzelte transformierte Pflanzen wurden in das Gewächshaus überführt und R1 herangezogen.
  • Pflanzenanalyse/Beimpfungsverfahren
  • Transgene Pflanzen wurden analysiert und wie im oben aufgeführten Beispiel 1 beimpft.
  • 2. Ergebnisse
  • ZW-Konstrukte: Die Linie CA76-ZW-102-29 vermittelte Resistenz gegen Infektion sowohl durch ZYMV-FL als auch durch WMV-2-NY. Im Gegensatz dazu konnten alle anderen Linien sowohl gegen ZYMV als auch gegen WMV-2 keine Resistenz vermitteln (Tabelle 4). TABELLE 4
    Symptomentwicklung an transgenen Cantaloupe-Pflanzen nach Beimpfung mit einer 1/10 w/v-Verdünnung von ZYMV-FL oder WMV-2-NY
    Linie NPT II Immunitätstest mit Symptomatisches Krankheitseinstufung
    Verhältnis %
    CA-ZW-102-29 + – ZYMV-FL 0/30 0 0,0
    + – WMV-2-NY 0/9 2/2 0 100 0,0 5,0
    CA-ZW-115-38 + – ZYMV-FL 0/30 0 0,0
    + – WMV-2-NY 9/17 6/8 0 75 0,0 4,0
  • PCZW-Konstrukt: Linie CA95 PXZW-1 vermittelte Resistenz gegen Infektion durch CMV-C, ZYMV-FL und WMV-2. Die Linie hat traditionelle Resistenz gegen PRV, so dass die Wirksamkeit der PRV-Insertion nicht bestätigt werden konnte. Im Gegensatz dazu konnten zahlreiche transgene PCZW-Linien keine Resistenz gegen CMV-C oder ZYMV-FL vermitteln. Die Beimpfung dieser Linien mit WMV-2-NY dauert noch an (Tabelle 5). TABELLE 5
    Symptomentwicklung auf trangenen Cantaloupe-Linien nach Beimpfung mit einer 1/10 w/v Verdünnung von ZYMV-FL, WMV-2-NY oder CMV-C
    Linie NPT II Immunitätstest mit Symptomatisches Krankheitseinstufung
    Verhältnis %
    CA95-PCZW-93351-1 + – CMV-C 1/12 3/3 (08) (100) 0,6 6,3
    + – WMV-2-NY 1/9 2/2 (11) (100) 0,5 5,0
    + – ZYMV-FL 6/8 6/6 (75) (100) 4,2 9,0
    CA95-PCZW-93356-1 + – CMV-C 9/9 4/4 (100) (100) 7,0 7,0
    + – ZYMV 10/10 5/5 (100) (100) 7,0 7,0
    CA95-PCZW-93356-6 + – CMV-C 9/9 1/1 (100) (100) 7,0 9,0
    + – ZYMV 10/10 1/1 (100) (100) 7,0 7,0
  • SWZPC-Konstrukt: Obwohl diese Linien bisher nicht auf Resistenz bewertet wurden, hat PCR-Analyse bestätigt, dass 27/36 (75%) der mit diesem Produkt erzeugten Cantaloupe-Linien alle 6 Hüllprotein-Gene plus das selektierbare NPT II-Marker-Gen enthielten. Dies zeigt, dass durch Agrobacterium vermittelte Transformation für den Transfer von mindestens 7 (aber wahrscheinlich von viel mehr) verknüpften Genen in einem binären Plasmid Pflanzenzellen mit nachfolgender Gewinnung von intakten Insertionen mit allen 7 Genen enthaltenden Pflanzen verwendet werden kann.
  • BEISPIEL III
  • Einführung einer Kassette mit mehreren Hüllprotein-Genen in Gurke
  • 1. Transformation von Gurke
  • Reinerbige Gurken-Linien werden mit den oben aufgeführten, mehrere Hüllprotein-Gene enthaltenden Konstrukten unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Sarmento et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 31, 185, 1992 transformiert. Bewurzelte Pflanzen wurden ins Gewächshaus überführt und R1-Samen herangezogen. Die transgenen Pflanzen wurden analysiert und beimpft wie oben in Beispiel 1 beschrieben.
  • 2. Ergebnisse
  • CZW-Konstrukte: Die Linien GA715 CZW 7, 95, 33, 99 waren sowohl gegen ZYMV-FL als auch WMV-2-NY resistent (diese Linien sind traditionell auf Resistenz gegen CMV-C gezüchtet worden, daher konnte die Wirksamkeit der CMV-Hüllprotein-Insertion nicht bestätigt werden) (Tabelle 6). TABELLE 6
    Symptomentwicklung auf transgenen Gurken-Linien nach Beimpfung mit einer 1/10 w/v-Verdünnung von ZYMV-FL, ZYMV-CA oder WMV-2-NY
    Linie NPT II Immunitätstest mit Symptomatisches Krankheitseinstufung
    Verhältnis %
    GA715 CZW-7 + – ZYMV-FL 0/8 7/7 0 100 0,0 6,4
    + – WMV-2-NY 0/5 8/9 0 89 0,0 4,4
    GA715-CZW-33 + – ZYMV-FL 0/6 9/9 0 100 0,0 6,9
    + – WMV-2-NY 0/6 8/8 0 100 0,0 4,3
    GA715-CZW-95 + – ZYMV-FL 0/11 2/2 0 100 0,0 5,0
    + – WMV-2-NY 0/10 2/2 0 100 0,0 5,0
    GA715-CZW-99 + – ZYMV-F 0/8 6/6 0 100 0,0 6,7
    + – WMV-2-NY 0/7 5/5 0 100 0,0 3,0
  • PNIa CZW-Konstrukt: Die Linie GA715 PNI1a CZW-21 war gegenüber CMV-C, ZYMV-FL und PRV-P-HA resistent, während die Linie GA715 PNIaCZW-15 anfällig für ZYMV-FL und WMV-2-NY war (Tabelle 7). TABELLE 7
    Symptomentwicklung auf transgenen Gurken-Linien nach Beimpfung mit einer 1/10 w/v-Verdünnung von ZYMV-FL, WMV-2-NY oder PRV-P-HA
    Linie NPT II Immunitätstest mit Symptomatisches Krankheitseinstufung
    Verhältnis %
    GA715 PNIaCZW-21 + – ZYMV-FL 0/7 2/2 0 100 0,0 7,0
    + – CMV-Carna-5 0/4 4/11 0 44 0,0 2,2
    + – WMV-2-NY NT NT NT NT NT NT
    + – PRV-P-HA 0/3 6/6 0 100 0,0 3,0
    GA715 PNIa CZW-15 + – ZYMV-FL 2/2 12/12 100 100 3,0 5,0
    + – WMV-2-NY 4/4 10/10 100 100 3,0 3,0
    + – PRV-P-HA NT NT NT NT NT NT
    CMV-C-Carna-5 NT NT NT NT NT NT
    • NT = nicht getestet
  • BEISPIEL IV
  • Einführung einer Kassette mit mehreren Hüllprotein-Genen in Wassermelone
  • 1. Transformation der Wassermelone
  • Reinerbige Wassermelonen-Linien wurden mit den oben aufgeführten, mehrere Hüllprotein-Gene enthaltenden Kassetten unter Verwendung einer Modifikation des von Choi et al., Plant Cell Reports 344, 1994, beschriebenen Verfahrens transformiert.
  • 2. Pflanzenanalyse/Beimpfungsverfahren
  • Transgene Pflanzen wurde analysiert und wie oben in Beispiel 1 beschrieben beimpft.
  • 3. Ergebnisse
  • WZ-Konstrukt: Die Linien WA3WZ-20-14 waren gegenüber ZYMV-FL und WMV-2-NY resistent (Tabelle 8). TABELLE 8
    Symptomentwicklung auf transgenen Wassermelonen-Linien nach Beimpfung mit einer 1/10 w/v-Verdünnung von ZYMV-FL oder WMV-2-NY
    Linie NPT II Immunitätstest mit Symptomatisches Krankheitseinstufung
    Verhältnis %
    WA3, WZ-20-14 + – ZYMV-FL 0/14 11/11 0 100 0,0 9,0
    + – WMV-2-NY 0/13 1/10 0 100 0,0 9,0

Claims (11)

  1. Verfahren zur Verleihung einer Multivirus-Resistenz bei einer gegenüber Viren anfälligen Pflanze, worin die Expression der kodierenden DNA-Sequenzen im Wesentlichen gleiche Resistenzpegel gegenüber der Infektion durch jedes der Viren verleiht, umfassend (a) Transformieren von Zellen der anfälligen Pflanze mit einem chimären rekombinanten, mindestens drei tandemartig verbundene DNA-Sequenzen umfassenden DNA-Molekül, wobei jedes einen in Zellen dieser Pflanzen funktionellen Promotor umfasst und in funktionsfähiger Weise mit einer für ein Hüllprotein kodierenden DNA eines Virus verbunden ist, das zur Infektion der Pflanze in der Lage ist, worin besagte Viren aus der Gruppe bestehend aus Potyviren, Cucumoviren und Comoviren ausgewählt sind, (b) Regenerieren der Pflanzenzellen zur Bereitstellung einer differenzierten Pflanze, (c) Identifizieren einer transformierten Pflanze, die die kodierenden DNA-Sequenzen exprimiert, um so die Pflanze gegenüber Infektion durch die Viren resistent zu machen, und (d) Identifizieren einer transformierten Pflanze, die beim Animpfen mit jedem der Viren einzeln im Wesentlichen dasselbe Ausmaß viraler Resistenz aufweist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Expression von mindestens einer der kodierenden DNA-Sequenzen Resistenz gegenüber einer Vielzahl der besagten Viren verleiht.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das DNA-Molekül Teil eines binären Ti-Plasmids ist und die Pflanzenzellen durch A. tumefaciens vermittelte Transformation transformiert werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenzen weiterhin ein selektierbares Marker-Gen oder ein Reporter-Gen enthalten, das die Identifizierung der transformierten Pflanze ermöglicht.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenzen weiterhin mindestens zwei der Hüllprotein-Gene des Wassermelonenmosaikvirus II, des Gurkenmosaikvirus oder des Zucchinigelbmosaikvirus umfassen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die anfällige Pflanze ein Mitglied der Familie der Cucurbitacea ist.
  8. Eine nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellte transformierte Pflanze.
  9. Eine transformierte Pflanzenzelle der nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellten transformierten Pflanze.
  10. Ein transformierter Samen der nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellten transformierten Pflanze.
  11. Eine aus der Pflanze nach Anspruch 8 hergestellte Hybrid-Pflanze, die gegenüber einer Infektion durch besagte Viren resistent ist.
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