DE3751393T2

DE3751393T2 - Pflanzen, resistent gegen den Anti-sens RNS aufweisenden Virus.

Info

Publication number: DE3751393T2
Application number: DE3751393T
Authority: DE
Inventors: Nancy P Jarvis; Sue L Loesch-Fries; Donald J Merlo
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1986-04-02
Filing date: 1987-04-01
Publication date: 1996-02-22
Anticipated expiration: 2007-04-02
Also published as: JPS62285790A; ES2076143T3; JPH09168383A; US5316930A; EP0240332A2; GR3017682T3; EP0240332B1; AU612972B2; AU7093587A; ATE124993T1; NZ219834A; DE3751393D1; EP0240332A3

Description

GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und des Ackerbaus und stellt insbesondere Mittel zur Verfügung, um eine virusresistente Pflanze herzustellen, indem eine Pflanze mit dem Ziel transformiert wird, daß sie ein pflanzenexprimierbares Fremdgen enthält, das die Synthese einer zur viralen mRNA komplementären RNA lenkt. Ebenso werden pflanzentransformierende prokaryotische Plasmidvektoren zur Verfügung gestellt, die eine derartige pflanzenexprimierbare RNA tragen, sowie Pflanzenzellen, die mit einem solchen Vektor transformiert sind.

HINTERGRUND

Überblick über Agrobakterium

Virulente Stämme der Gram-negativen Gattung Agrobakterium beherbergen große Plasmide, die als Ti-(Tumor induzierende oder Transformation induzierende) Plasmide (pTi) in A. tumefaciens und als Ri- (Wurzel induzierende) Plasmide (pRi) in A. rhizogenes bekannt sind und oft durch das Opin klassifiziert werden, das sie katabolisieren oder dessen Synthese sie verursachen. Sowohl Ti- als auch Ri-Plasmide enthalten DNA-Sequenzen, die als T-DNA (transferierte DNA) bekannt sind und von denen gefunden wurde, daß sie in das Genom der Wirtspflanze integriert sind. Mehrere T-DNA-Gene stehen unter der Kontrolle von T-DNA-Promotoren, die in der Struktur kanonischen eukaryotischen Promotoren ähnlich sind. Diese Plasmide tragen auch außerhalb der T- DNA-Region Gene. Ti- und Ri-Plasmide sind für viele Zwecke funktionell äquivalent.
Übersichtsartikel über Krankheiten, die von Agrobakterium verursacht sind, über Pflanzentransformation, Gentechnik und Genexpression umfassen oder sind zu finden in Merlo D.J. (1982) Adv. Plant Pathol. 1:139-178, Ream L.W. und Gordon M.P. (1982) Science 218:854-859; Bevan M.W. und Chilton M.-D. (1982) Ann. Rev. Genet. 16:357-384; Kahl G. und Schell J. (1982) Molecular Biology of Plant Tumors; Barton K.A. und Chilton M.-D. (1983) Meth. Enzymol. 101:527-539; Depicker A. et al. (1983) in Genetic Engineering of Plants: an Agricultural Perspective, Herausg.: Kosuge T. et al., S. 143-176; Caplan A. et al. (1983) Science 222:815-821; Hall T.C. et al., Europ. Patentanmeldung 126.546; Binns A.N. (1984) Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 1.130 160, Hall T.C. (1985) Oxford Surveys Plant Mol. Biol. 2.329 338, Hooykaas P.J.J. und Schilperoort R.A. (1985) Trends Biochem. Sci. 10.307 309, Thomas T.L. und Hall T.C. (1985) Bioassays 3:149-153; Weissbach A. und Weissbach H., Herausg. (1986) Meth. Enzymol. 118 (vgl. insbesondere Rogers S.G. et al., S. 627-640); Pühler A., Herausg. (1983) Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction; und Schilperoort R.A. (1984) in Efficiency in Plant Breeding (Proc. 10th Congr. Eur. Assoc. Res. Plant Breeding), Herausg.: Lange W. et al., S. 251-285.

Transformation von Pflanzen durch Agrobakterium

Pflanzenzellen können durch Agrobakterium in verschiedenen allgemein in der Fachwelt bekannten Verfahren transformiert werden. Hinsichtlich eines überblicks über neuere Arbeiten vgl. Syono K. (1984) Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 1: 217-219.
Die Infektion von Pflanzengewebe durch Agrobakterium ist eine einfache Teehnik, die dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt ist. In der Regel wird eine Pflanze, nachdem sie verletzt wurde, mit einer Suspension der Bakterien inokuliert. Andernfalls werden Gewebsstücke inokuliert, z.B. Blattscheiben (Horsch R.B. et al. (1985) Science 227:1229-1231). Nach der Induktion mit Agrobakterium vom Wild-Typ sind die Tumore zu Phytohormon-unabhängigem Wachstum befähigt. Die traditionellen Inokulations- und Kulturverfahren können zur Verwendung von entwaffneten T-DNA- Vektoren, die zu Hormon-unabhängigem Wachstum nicht befähigt sind, modifiziert werden (vgl. z.B. Zambryski P. et al. (1984) in Genetic Engineering, Principles and Methods, 6, Herausg.: Hollaender A. und Setlow J., S. 253-278).
Agrobakterium ist auch imstande, isolierte Zellen, in Kultur gezüchtete Zellen, Kallus-Zellen und isolierte Protoplaste zu infizieren (z.B. Fraley R.T. et al. (1984) Plant Mol. Biol. 3:371-378; Fraley R.T. und Horsch R.B. (1983) in Genetic Engineering of Plants: an Agricultural Perspeetive, Herausg.: Kosuge T. et al., S. 177-194; Muller A. et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 123:458-462). Die Transformationsfrequenz von inokulierten Kallus-Stücken kann durch Zusatz eines Opins oder von Opin-Vorstufen gesteigert werden (Cello L.M. und Olsen W.L., US-PS 4,459.355).
Der Wirtsbereich der Krongallen-Pathogenese kann durch T-DNA-codierte Funktionen, wie etwa onc-Gene, beeinflußt werden (Hoekema A. et al. (1984) J. Bacteriol. 158:383-385; Hoekema A. et al. (1984) EMBO J. 3:3043-3047; Buchholz W.C. und Thomasshow M.F. (1984) 160:327-332; Yanofsky M. (1985) Mol. Gen. Genet. 201: 237-246). Vir-Gene beeinflussen ebenfalls den Wirtsbereich (Yanofsky, s.o.). Ausich R.L., Europäische Patentanmeldung 108.580 berichtet den Transfer von T-DNA aus A. tumefaciens auf Grünalgen-Zellen und darin stattfindende Expression von ocs- und Tn5-Kanamycinresistenz-Genen. Hooykaas-van Slogteren GMS et al. (1984) Nature 311:763-764 und Hernalsteens J.-P. et al. (1984) EMBO J. 3:3039-3041, zeigten die Transformation von monocoten Zellen durch Agrobakterium ohne die übliche Tumorgenese.
T-DNA, entschäfte T-DNA und funktionelle Fremdgene von transformierten Pflanzen werden üblicherweise durch Meiose offensichtlich unverändert in einer dominanten, eng verbundenen Mendel'schen Art und Weise an die Nachkommenschaft übertragen (vgl. z.B. Horsch R.B. et al. (1984) Science 223:496-498; Tepfer D. (1984) Cell 37:959-967; Deßlock M. et al. (1984) EMBO J. 3:1681-1689; Wöstemeyer A. et al (1984) Mol. Gen. Genet. 194:500-507; Wallroth M. et al. (1986) Mol. Gen Genet. 202: 6-15). Zwei unverbundene T-DNAs können eine einzelne Zelle transformieren und können sich nach der Regeneration der Pflanze in der F1-Generation ausscheiden (de Framond A.J. et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:125-131).

Ti-Plasmid-DNA

T-DNA wird in Wirts-DNA oft an mehreren Stellen in dem Nukleus integriert (d.h. eingesetzt). Flankierende Pflanzen-DNA kann entweder wiederholt werden oder in Sequenzen mit niedriger Kopienzahl vorliegen. Die integrierte T-DNA kann entweder in direkter oder in umgekehrter Tandem-Anordnung festgestellt werden und kann durch Spacer getrennt sein. Die T-DNA kann auch Chloroplasten transformieren (De Block M. et al. (1985) EMBO J. 4:1367-1372; vgl. Überblick von Flavell R.B. (1985) Bioassays 3:177-178).
Die vollständige Sequenz der T-DNA eines Plasmids vom Octopin-Typ, das in ATCC 15955 gefunden wurde, pTi15955, wurde berichtet (Barker R.F. et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2:335-350) und weist die TL-Region von pTiAch5 auf (Gielen J. et al. EMBO J. 3:835-846). Veröffentlichte T-DNA-Gene enthalten keine Introns. Sequenzen, die kanonischen eukaryotischen Promotor-Elementen und Polyadenylierungsstellen ähnlich sind, können erkannt werden.
Octopin Ti-Plasmide tragen ein ocs-Gen, das für Octopin-Synthase (Lysopin-Dehydrogenase) codiert. Koncz C. et al. (1983) EMBO J. 2:1597-1603 stellen eine funktionelle Analyse von ocs zur Verfügung. Dhaese P. et al. (1983) EMBO J. 2:419-426 berichteten über die Verwendung verschiedener Polyadenylierungsstellen durch "Transkript 7" (ORF3 von Barker R. et al., s.o.). und ocs. Die Anwesenheit des Enzyms Octopin-Synthase innerhalb eines Gewebes kann dieses Gewebe vor der toxischen Wirkung verschiedener Aminosäure-Analoga, z.B. Aminoethylcystein, schützen (Dahl G.A. und Tempe J. (1983) Theor. Appl. Genet. 66:233-239; Koziel M.G. et al. (1984) J. Mol. Appl. Genet. 2:549-562).
Nopalin-Ti-Plasmide codieren für das Nopalin-Synthase-Gen (nos) (sequenziert von Depicker A. et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573). Shaw C.H. et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7831-7846 stellen eine funktionelle Analyse von nos zur Verfügung. Gene, die zu tms und tmr äquivalent sind, wurden auf einem Plasmid des Nopalin-Typs identifiziert (Willmitzer L. et al. (1983) Cell 32:1045-1056).
Ti- und Ri-Plasmid-Gene außerhalb der T-DNA-Region umfassen die vir- Gene, die, wenn sie mutiert sind, zu einem avirulenten Ti-Plasmid führen. Die vir-Gene wirken in trans, wobei sie befähigt sind, die Transformation von Pflanzenzellen mit der T- DNA eines unterschiedlichen Plasmid-Typs hervorzurufen und physisch auf einem anderen Plasmid lokalisiert sind. Derartige Anordnungen sind als binäre Systeme bekannt und die T-DNA-tragenden Plasmide sind im allgemeinen als Mikro-Ti-Plasmide bekannt. Geoffenbarte binäre Systeme und Mikro-Ti-Plasmide umfassen die folgenden: Hoekema A. et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:85-89; Deblaere R. et al. (1985) Nucl. Acids Res. 13:4777-4788; van den Elzen P. et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:149-154; Anderson D.M. US-PS 4,536.475; de Framond A.J. et al. (1983) Biotechnol. 1:262-269, Hoekema. A. et al. (1983) Nature 303:179-180; Hille J. et al. (1984) J. Bacteriol. 158:754-756; Hoekema A. et al. (1984) J. Bacteriol. 158:383-385; An G. et al. (1985) EMBO J. 4:277-284; Anderson D.M., US-PS 4,536.475; Klee H.J. et al. (1985) Biotechnol. 3:637-642); de Framond A.J. et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:125-131; Dahl G.A. et al., Europ. Patentanmeldung 140.556; und Bevan M. (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711-8721. Die T- DNA muß nicht auf einem Plasmid vorliegen, um eine Pflanzenzelle zu transformieren; auch chromosomal lokalisierte T-DNA ist funktionell (Hoekema A. et al. (1984) EMBO J. 3:2485-2490). Die T-DNA hat direkte Wiederholungen von etwa 25 Basenpaaren in Kombination mit den linken und rechten Rändern, d.h. mit den Verbindungen von T- DNA/Pflanzen-DNA, die sowohl beim Transfer von Agrobakterium als auch bei der Integration in das Wirtsgenom beteiligt sind. Ti-Plasmid-determinierte Eigenschaften wurden zusammengefaßt von Merlo, s.o. (vgl. insbesondere Tabelle II) und Ream und Gordon, s.o..

Fremdgen-Expression

Ein für Bohnen-Phaseolin codierendes Gen wurde in Sonnenblumen- Tumore übertragen und dort exprimiert (Murai N. et al. (1983) Science 222:476-482). Das Phaseolin-Gen wurde mit einem hohen Expressionsgrad in sich entwickelnden Tabaksamen exprimiert (Sengupta-Gopalan C. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-3324). Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem homologen Gen, dem beta-Conglycinin von Sojabohnen beobachtet (Beachy R.N. et al. (1985) EMBO J. 4:3047-3053). Ein Gen für das Endosperm-Protein Zein aus dem monocoten Zea mays wird in Sonnenblumen-Kallus transkribiert (Matzke M.A. et al. (1984) EMBO J. 3:1525-1531). Die Expression des kleinen Untereinheits-Gens von Erbsen RuBP-Case wird in transformierten Petunien-Zellen durch Licht reguliert; das produzierte Protein der kleinen Untereinheit der Erbse wird korrekt prozessiert und innerhalb von Chloroplasten sequestriert (Broglie R. et al. (1984) Science 224:838-843). Die an dieser Lichtinduzierbarkeit beteiligten Sequenzen und jene, die für maximale Expression erforderlich sind, wurden identifiziert (Morelli G. et al. (1985) Nature 315:200-204; Nagy F. et al. (1985) EMBO J. 4:3063-3068; Timko M.P. et al. (1985) Nature 318:579-582). Die Expression eines Gens für Weizen-Chlorophyll a/b Bindungsprotein wird durch Licht reguliert und ist organspezifisch in transformierten Tabakpflanzen (Lamppa G. et al. (1985) Nature 316:750-752). Ein Sojabohnen- Hitzeschock-Gen ist in Sonnenblumengewebe durch Wärme induzierbar (Schöffl F. und Baumann G. (1985) EMBO J. 4:1119-1124). (Ein Hitzeschock-Promotor von Drosophila melanogaster ist in ähnlicher Weise in Tabakgewebe funktionell (Spena A. et al. (1985) EMBO J. 4:2739-2743).)

Chimärische Gene mit T-DNA-Promotoren

Der nos-Promotor kann die Expression von Strukturgenen der Drogenresistenz, die zur Selektion von transformierten Pflanzenzellen wertvoll sind, antreiben. Resistenz-Gene wurden für Kanamycin (Bevan M.W. et al. (1983) Nature 304:184-187; Fraley R.T. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-4807; Herrera-Estrella L. et al. (1983) EMBO J. 2:987-995), Methotrexat (Herrera-Estrella et al., s.o.), Chloramphenicol (Herrera-Estrella L. et al. (1983) Nature 303:209-213), Hygromycin B (van den Elzen P.J.M. et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:299-302) geschaffen. Helmer G. et al. (1984) Biotechnol. 2:520-527 entwickelten ein Fusionsgen, bei dem der Promotor und das 5'-Ende des Strukturgens von nos an E. coli beta-Galaktosidase-(lacZ)-Sequenzen fusioniert ist. Pflanzengewebe, die mit diesem durch Screenen feststellbaren Marker transformiert sind, können an einer charakteristischen Farbe erkannt werden, wenn sie auf dem geeigneten chromogenen Substrat gezüchtet werden.
Gene für Fusionsproteine zwischen dem ocs-Strukturgen, das auch Promotoren zur Verfügung stellt, und Strukturgenen für Hygromycin B-Resistenz sowie Phaseolin wurden geschaffen und sind funktionell (Waldron C. et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Murai N. et al. (1983) Science 222:476-482). Ein ocs-getriebenes Glyphosat- Gen wurde konstruiert (Comai L. et al. (1985) Nature 317:741-744).
Promotoren für Octopin TL-Gene ORF24 und ORF25 könnten ebenfalls die Expression von Strukturgenen antreiben (Velten J. et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730; Velten J. und Schell J. (1985) Nucl. Acids Res. 13:6981-6998; Gelvin S.B. et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:240-248; Comai L. et al. (1985) Nature 317:741-744).

Chimärische Gene mit Pflanzen-Promotoren

Ein chimärisches Protein aus kleiner Untereinheit von RuBP- Case/Kanamycinresistenz wurde in den Chloroplast transloziert (Van den Broeck G. et al. (1985) Nature 313:358-363). Der Promotor dieses Gens bewirkt lichtinduzierbare Expression im Kallus zu Chloramphenicol- und Kanamycinresistenz-Genen (Herrera- Estrella L. et al. (1984) Nature 310:115-120; Facciotti D. et al. (1985) Biotechnol. 3: 241-246). Ein Chalcon-Synthase-Promotor trieb auch die lichtinduzierbare Expression eines Kanamycinresistenz-Gens an (Kaulen H. et al. (1986) EMBO J. 5:1-8). Promotoren von Chlorophyll a/b Bindungsprotein wurden zum Antreiben der Expression von ocs und des Kanamycinresistenz-Strukturgens verwendet (Jones J.D.G. et al. (1985) EMBO J. 4: 2411-2418; Simpson J. et al. (1985) EMBO J. 4:2723-2729).

Chimärische Gene mit viralen Promotoren

Ein Kanamycinresistenz-Gen unter der Kontrolle eines Blumenkohl- Mosaikvirus- (CaMV)- Promotors wurde in Pflanzenzellen exprimiert, die mit T-DNA transformiert waren (Koziel M.G. et al. (1984) J. Mol. Appl. Genet. 2:549-562). Ein Methotrexatresistenz Gen hinter dem CaMV 355 Promotor verlieh Methotrexatresistenz (Brisson N. et al. (1984) Nature 310:511-514). Das Hüllprotein des Tabak-Mosaikvirus wurde in transformiertem Tabakgewebe unter der Steuerung eines CaMV Promotors exprimiert (Bevan M.W. et al. (1985) EMBO J. 4:1921-1926). Odell J.T. et al. (4985) Nature 313:810-812 kartierten die Sequenzen des für die Transkription erforderlichen CaMV 35S Promotors.

Transformation von Pflanzen ohne Agrobakterium

Ein Uberblick über den direkten Transfer von DNA in Pflanzenzellen wurde in letzter Zeit herausgegeben (Jones M.G.K. (1985) Nature 317:579-580; Potrykus I. et al. (1985) Plant Mol. Biol. Reptr. 3:117-128; Howe C. (1985) Trends Genet. 1:38-39; Paszkowski J. und Saul M.W. (1986) Meth. Enzymol. 118:659-668; Power J.B. et al. (1986) Meth. Enzymol. 118:578-594). Sowohl dicote als auch monocote Zellen können direkt mit Kanamycin-selektierbaren Markern unter der Steuerung entweder eines nos oder eines CaMV-Promotors transformiert werden (Paszkowski J. et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722; Gardner R.C. et al. (1984) Plant Mol. Biol. Reporter 2:3-8; Hain R. et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161-168; Potrykus I. et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188; Lörz H. et al. (1985) Mol Gen. Genet. 199:178-182; Shillito R.D. et al. (1985) Biotechnol. 3.1099-1103; Meyer P. et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 201:513-518). Deutlich unterschiedliche DNA-Moleküle können in eine Pflanzenzelle co-transformiert werden; es ist vorteilhaft, wenn eine DNA in der Mischung einen selektierbaren Marker trägt (Peerbolte R. et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:235-246). Die Nachkommen von Pflanzen, die aus solchen transformierten Zellen regeneriert wurden, erben das transformierte Hybrid-Gen als ein einziges dominantes Mendel'sches Merkmal (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., s.o.).
Es erwies sich, daß CaMV als ein Pflanzentransformationsvektor verwendbar war (Brisson N. et al. (1984) Nature 310:511-514; Brisson N. und Hohn T. (1986) Meth. Enzymol. 118:659-668). Bromgras-Mosaikvirus (BMV), ein RNA-Virus, kann ebenfalls in Pflanzen verwendet werden, um Fremdstrukturgene zu exprimieren (French R. et al. (1986) Science 231:1294-1297).
Es erwies sich, daß die Elektroporation für die Einführung von chimärischen Genen in Pflanzenzellen in einem transienten Expressionssystem (Fromm M. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-5828) und zur stabilen Transformation von Mais-Zellen (Fromm M.E. et al. (1986) Nature 319:791-793) verwendbar war.
Die Zellen können DNA, die von Membranen umgeben ist, aufnehmen. DNA, inklusive pTi-DNA, kann über Liposome eingeführt werden (z.B. Deshayes A. Qt al. (1985) EMBO J. 4:2731-2737) oder durch Fusion von pflanzlichen und bakteriellen Zellen nach Abtrennung ihrer jeweiligen Zellwände (z.B. Hain R. et al. (1984) Plant Cell Rept. 3:60-64). Pflanzen-Protoplasten können durch Zellwände abgegrenzte Agrobakterium-Zellen aufnehmen. Die T-DNA kann an ein Gewebe übertragen werden, das aus fusionierten Protoplasten regeneriert wurde.
Die DNA kann nach der Mikro-Injektion stabil in ein Pflanzengenom integriert werden (Crossway A. et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185).
Die Einführung einer DNA in Pflanzenzellen während der Befruchtung oder Pollenbildung wurde bei Mais (corn) und Baumwolle berichtet von Ohta Y. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:715-719, bzw. Zhou G.-Y. et al. (1983) Meth. Enzymol. 101:433-481.

Überblick über AMV

Alfalfa-Mosaikvirus (AMV) ist eine Klasse von Pflanzenviren, die ein dreiteiliges, einzelstrangiges, plus-strangiges RNA-Genom hat. Das Genom (wobei die subgenomischen RNA-Moleküle ausgeschlossen sind) ist in drei RNA-Moleküle unterteilt. Diese Klasse umfaßt: die gruppe der Alfalfa-Mosaikviren (AMV), die Ilarviren, die Bromoviren, die Cucumoviren und die Hordeiviren (van Vloten-Doting L. et al. (1981) Intervirol. 15:198-203; Matthews REF (1982) Classification and Nomenclature of Viruses). Die Genom-Segmente sind unabhängig voneinander in bazilliforme Partikel verschiedener Länge eingekapselt. Neben den drei genomischen RNA-Komponenten (RNA1, RNA2 und RNA3) wird eine vierte subgenomische RNA (RNA4) in den Virus- Präparaten gefunden. Eine Mischung der drei Genom-RNAs gemeinsam mit einer geringen Menge von Hüllprotein oder dessen Boten, RNA4 (Bol J.F. et al. (1971) Virol. 46: 73-85) ist zur Initiation einer Infektion erforderlich.
Die komplette Sequenz von AMV RNA4 wurde geoffenbart (Brederode F.T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. 8:2213-2223). Die RNA4 hat eine Länge von 881 Nukleotiden. Die Codierungsregion weist 660 Nukleotide auf (wobei das Initiations- und Terminationscodon nicht umfaßt sind), die durch eine 5'-untranslatierte Region von 39 Nukleotiden und eine 3'-untranslatierte Region von 182 Nukleotiden flankiert sind. Die Sequenz der RNA4 ist in dem 3'-Ende der RNA3 vorliegend und dort lokalisiert (Gould A.R. und Symons R.H. (1978) Eur. J. Biochem. 91:269-278).
Die vollständige Nukleotid-Sequenz von AMV RNA3 wurde geoffenbart (Barker R.F. et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11:2881-2891). Eine 5'-nicht-codierende Region von 240 Basen geht einem offenen Lese-Rahmen (ORF) von 903 Nukleotiden voran. An diesen ORF schließt eine intercistronische Region von 49 Basen und ein ORF An das Hullprotein schließt eine 3 untranslatierte Sequenz von 179 Basen an. Die AMV RNA4 ist ident mit dem 3 Ende der RNA3 und ist durch dieses determiniert, wobei sie 36 Nukleotide der intercistronischen Region, das Hüllprotein Strukturgen und die 3' untranslatierte Sequenz enthalt.
Die vollstandige Nukleotid Sequenz von AMV RNA1 wurde erhalten (Cornelissen B.J.C. et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11.1253 1265). RNA1 hat eine Lange von 3645 Nukleotiden und enthalt einen langen ORF fur ein Protein mit dem Mr 125.685, das von einer 5'-untranslatierten Sequenz mit 99 Nukleotiden und einem 3'-untranslatierten Bereich von 163 Nukleotiden flankiert ist.
Der Vergleich der 3'-terminalen Sequenzen aller vier AMV RNAs. zeigt eine ausgedehnte Homologie zwischen den 3'-terminalen Nukleotiden 140 bis 150 (Houwing C.J. und Jaspars E.M.J. (1978) Biochem. 17:2927-2933). Es liegen etwa 20 Basensubstitutionen in den 145 3'-terminalen Nukleotiden der AMV RNAs vor; diese sind entweder in den Schleifen der Basen-gepaarten Strukturen lokalisiert oder sie wandeln in den Stämmen der sekundären Struktur-Haarnadeln die A-U-Basenpaare in G-C- Basenpaare um (Koper-Zwarthoff E.C. et al. (1979) Nucl. Acids Res. 7:1887-1900).

Anti-sense (entgegengesetzt gerichtete) RNA

Sequeira L. (1984) Trends Biotechnol. 2:25-29 gibt einen überblick über Kreuz-Protektion und induzierte Resistenz. Stebbing N. (1979) Pharmac. Ther. 6:291-332 gibt einen überblick über das Design von antiviralen Mitteln auf der Basis von viralen RNA-Sequenzen und der antiviralen Wirkung von einzelstrangigen Nukleinsäuren. Weintraub H. et al. (1985) Trends Genet. 1:22-25 geben einen überblick über veröffentlichte und unveröffentlichte Ergebnisse bei der Verwendung von anti-sense RNA für die genetische Analyse. Travers A. (1984) Nature 311:410 und Laporte D.C. (1984) Trends Biochem. Sci. 9:463 geben einen Überblick über die regulatorischen Rollen von antisense RNA (aRNA).
In der Natur kann die anti-sense oder komplementäre RNA in regulatorischer Weise funktionell sein. In E. coli reguliert eine 174b ompC RNA die Expression von ompF. Anti-sense RNA, die am ehesten an mRNA-Regionen bindet, voraussichtlich um in Kontakt mit Ribosomen zu kommen, schien bei der Absenkung der Genexpression am wirksamsten zu sein (Mizuno T. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1966-1970; Coleman J. et al. (1984) Cell 37:429-436). Die komplementäre RNA kann die DNA-Replikation inhibieren (Tomizawa J. et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1421-1425; Tomizawa J. und Itoh T. (1982) Cell 31:575-583).
In vitro kann ein Oligonukleotid, das zu nur fünf Nukleotiden der 3'-terminalen Region der ribosomalen RNA von E coli 165 komplementär ist, die translationelle Initiation von bakteriellen Virus-mRNAs inhibieren (Eckhardt H. und Lührmann R. (1979) J. Biol. Chem. 254:11185-11188; Jayaraman K. et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1537-1541; Taniguchi T. und Weissmann C. (1978) Nature 275:770-772).
Translation in vitro von mRNA kann inhibiert werden, wenn die mRNA mit einer komplementären DNA (cDNA) gemischt und den Bedingungen von Nukleinsäure-Annealing unterworfen wird; eine nicht-annealte Mischung von mRNA und cDNA kann translatiert werden (Paterson B.M. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 4370-43 74). In vitro Replikation von pflanzenviralen RNA-Fragmenten kann inhibiert werden, wenn die RNA-Fragmente mit einer cDNA gemischt und den Bedingungen von Annealing unterworfen werden; eine nicht-annealte Mischung der RNA-Fragmente und der cDNA kann repliziert werden (Ahlquist P. et al. (1984) Plant Mol. Biol. 3:37-44).
Die Replikation des Rous-Sarcom-Virus und die Zelltramsformation wird durch Zusatz eines Oligonukleotids, das mit den 13 Nukleotiden einer 5'- und 3'-terminalen Wiederholung komplementär ist, inhibiert (Zameenik P.C. und Stephenson M.L. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:280-284).
Globin-aRNA inhibierte die Translation von Globin-mRNA, wenn diese gemeinsam in das Cytoplasma von Frosch-Oozyten injiziert wurden. Die aRNA inhibierte die Translation, wenn sie mit oder vor der mRNA injiziert wurde. aRNA:mRNA-Hybride schienen sich innerhalb der Oozyten zu bilden, obwohl die Hybride wesentlich kürzer waren, als für Duplexe der vollen Länge erwartet wurde (Melton D.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:144-148). Die Eergebnisse deuten darauf hin, daß die sekundäre Struktur die Regionen der Nukleinsäuren, die die Hybride bildeten, begrenzten.
Die Bildung von viralen anti-sense RNA-Sequenzen erwies sich als teilweiser Schutz für E. coli-Zellen gegen die Infektion durch den entspreehenden Bakteriophagen. Komplementäre Sequenzen zu Ribosom-Bindungsstellen waren wirksamere Inhibitoren als eine Sequenz, die zu dem 3'-Ende eines Strukturgens und der 3'-untranslatierten Region komplementär war (Coleman J. et al. (1985) Nature 315:601-603).
Die anti-sense RNA kann die Genexpression in einem transienten Expressionssystem in Mauszellen herabsetzen. Wenn ein Thymidin-Kinase (TK) Gen von Herpes Simplex Virus (HSV) und ein 100-facher Überschuß einer Modifikation dieses Gens, bei der die Protein-codierende Sequenz geflippt war, sodaß Codierung für eine TKaRNA vorlag, gemeinsam in TK- Zellen injiziert wurden, wurde beobachtet, daß die TK- Aktivität um das 4-Fache abfiel (Izant J.G. und Weintraub H. (1984) Cell 36:1007-1015).
Es wurde beobachtet, daß die Expression von Lac-Gen in Mauszellen um das 10-Fache herabgesetzt war, wenn mit einem aRNA-Gen in einem Verhältnis von Gen:aRNA-Gen von 1:1 oder höher co-transformiert wurde (Rubenstein J.L.R. et al. (1984) C. R. Acad. Sci., Paris 299:271-274).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung beschäftigt sich mit dem Auftreten von Virusinfektionen in Pflanzen und mit den Bemühungen der Pflanzenzüchter und Agronomen zur Bekämpfung dieser Infektionen bei wirtschaftlich bedeutenden Pflanzenarten. Virusinfektionen treten bei allen bekannten Pflanzenarten auf und verursachen signifikante Minderungen von Ausbeute und Qualität bei allen landwirtschaftlichen und gärtnerischen Pflanzenarten. Die industrielle Pflanzenzucht in keinem Land der Welt ist von solchen durch Viren verursachten Schädigungen ausgenommen und es ist keine einheitliche Behandlung bekannt, um solche Virusinfektionen zu behandeln oder zu verhindern. Zum Beispiel sind 90 % der Cassava-Pflanzen in Kenya von dem Cassava-Mosaikvirus befallen, was zu einer geschätzten Herabsetzung der Ausbeute um 75 % führt. Ein weiteres Beispiel ist eine vor kurzem aufgetretene Virusepidemie in Ghana, bei der mehr als 100 Millionen Kakaobäume durch eine Infektion mit dem Swollen Shoot Virus verloren wurden. Es könnten viele andere Beispiele gegeben werden, die es eindeutig machen, daß Virusepidemien und -infektionen eine sehr weitreichende wirtschaftliche Bedeutung besitzen. Die Herabsetzung der Ausbeute bei Nahrungsmittel-Ernteprodukten ist auch für die ständig wachsende menschliche Weltbevölkerung und hinsichtlich der chronischen Unterernährung der bereits lebenden Menschen von Bedeutung. Daher ist es eindeutig, daß sowohl die Mittel zur Schaffung virusresistenter Pflanzen-Genotypen als auch die entstehenden Pflanzen selbst sehr wertvoll wären, um die Möglichkeit zur Lösung der Welternährungsprobleme zu verbessern.
Insbesondere erwies sich das Alfalfa-Mosaikvirus als die Ursache ernster Abnahmen von Ernte-Ausbeuten. AMV befällt Alfalfa und andere einjährige Gemüsepflanzen. Das ist von wirtschaftlicher Bedeutung; in den Vereinigten Staaten allein sind etwa 30 Millionen Acres mit Alfalfa bepflanzt. Alfalfa-Mosaikvirus verursacht auch wirtschaftlich wichtige Krankheiten bei Erntepflanzen, wie etwa Pfeffer, Kartoffel, Sellerie, Erbsen und Bohnen. Alfalfa kann ein Wirt zur überwinterung sein, von welchem die Blattläuse das Virus weitertragen. Die Krankheit wird auch im Anschluß an einen Aufbau von Blattlaus-Befall von Alfalfa an andere Arten von Erntepflanzen übertragen. In vielen Fällen zeigen die durch AMV befallenen Pflanzen keine Symptome, sodaß es schwierig ist, das Auftreten und die Verbreitung der Krankheit festzustellen. In anderen Fällen ist die Mosaik-Krankheit eindeutig, doch hat sich das Virus zu diesem Zeitpunkt bereits vollständig über eine große Fläche von Pflanzen auf einem Feld ausgebreitet.
Abgesehen von der Abtrennung der infizierten Pflanzen und der Verwendung von Insektiziden zur Abtötung der Blattläuse, die das Virus übertragen, existieren praktisch keine Methoden, die zur Verhinderung der Ausbreitung von AMV entwickelt worden wären. Daher ist es eindeutig, daß sowohl die Mittel zur Schaffung von AMV-resistenten Genotypen als auch die entstehenden Pflanzen sehr wesentlich zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität einer Anzahl von Erntepflanzen wesentlich wäre.
Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die neue Virusresistenz-Gene aufweisen, und insbesondere Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die gegenüber einer AMV-Infektion resistent sind. Im Hinblick auf diesen Endzweck werden Verfahren zur Schaffung von Virusresistenz-Genen, insbesondere anti-sense RNA-Genen, die für die virale Replikation inhibitorisch sind, zur Verfügung gestellt. Ebenso zur Verfügung gestellt werden Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzensamen, die aRNA-Gene enthalten, die für jene Pflanzenmaterialien verantwortlich sind, die einen Phenotyp mit Virusresistenz darstellen. Außerdem werden auch DNA-Moleküle, die zur Schaffung solcher virusresistenter Pflanzen verwendbar sind, beschrieben. Die vorliegende Erfindung wird beispielhaft belegt, indem ein aRNA-Gen, das komplementär zu einer Boten-RNA von Alfalfa-Mosaikvirus-Hüllprotein ist, in Tabak eingeführt wird.
Es hat sich nie gezeigt, daß anti-sense RNA die Genexpression in Pflanzen beeinflußt, obwohl es sich sehr wohl gezeigt hat, daß sie dies in manchen nicht-pflanzlichen Systemen tut. Es gibt eine Anzahl von Gründen, warum die Anwesenheit von viraler aRNA eine Pflanze nicht vor einer Virusinfektion schützen könnte. Virale aRNA ist eine RNA, die natürlicherweise in dem Nukleus nicht gefunden wird; virale aRNA könnte in dieser Umgebung instabil sein. Das Ausmaß der Anreicherung von aRNA könnte zur Verhinderung einer Infektion zu niedrig sein. Die aRNA könnte sich in einem Teil einer Zelle, wo die Virusinfektionen initiiert oder aufrechterhalten werden, nicht anreichem. Obwohl virale aRNA in Pflanzen-Cytoplasma stabil sein kann, könnte eine aRNA in einem Pflanzen-Cytoplasma in Abwesenheit einer Virusinfektion instabil sein. Eine Virusinfektion könnte rascher errichtet werden, als sich aRNA an die virale RNA annealt. Anreicherung von viralen aRNA-Molekülen in Mengen, die zur Beeinflussung des Lebenszyklus eines Virus ausreichen, könnten für Pflanzenzellen toxisch sein. Tatsächlich könnte die Anwesenheit eines aRNA-Gens für Pflanzen schädlich sein.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Definitionen werden angegeben, um Zweideutigkeiten hinsichtlich ihrer Bedeutung oder des Umfangs ihrer Verwendung in der Beschreibung und den Ansprüchen zu vermeiden.

Promotor:

Bezieht sich auf Sequenzen am 5'-Ende eines an der Initiation der Transkription beteiligten Strukturgens. Ein pflanzenexprimierbarer Promotor ist ein beliebiger Promotor, der die Transkription in mindestens einer Art von Pflanzenzellen in mindestens einem Entwicklungszustand antreiben kann. Eukaryotische Promotor-Sequenzen werden normalerweise durch die Anwesenheit von DNA-Sequenzen erkannt, die zu der kanonischen Form 5'...TATAA. .3' etwa 10-30 Basenpaare (bp) 5'- von der Stelle des 5'-Endes der mRNA (Kappenstelle) homolog sind. Etwa 30 bp 5'- zu dem TATAA wird oft eine andere Promotor-Sequenz gefunden, die durch die Anwesenheit von DNA-Sequenzen erkannt wird, die mit der kanonischen Form 5'...CCAAT...3' homolog sind.

Transkript-Terminator:

Bezieht sich hier auf eine beliebige Nukleinsäure- Sequenz, die imstande ist, die Position des 3'-Endes eines Transkripts zu determinieren. Das DNA-Segment des Transkript-Terminators kann selbst aus Segmenten zusammengesetzt sein, die von einer Vielzahl von Quellen, natürlich vorkommenden oder synthetischen, prokaryotischen oder eukaryotischen, stammen und kann von einer genomischen DNA oder einer von mRNA stammenden cDNA (mRNA: Boten-RNA) stammen. Transkript-Terminationsstellen umfassen Polyadenylierungsstellen und Stellen, die das 3'- Ende ribosomaler RNAs (rRNAs), Transfer-RNAs (tRNAs) und nicht-polyadenylierter mRNAs (z.B. Histon-mRNA; Krieg P.A. und Melton D.A. (1984) Nature 308:203-206) determinieren.
Eine Polyadenylierungsstelle ist eine Nukleinsäure-Sequenz, die mit der Polyadenylierung von mRNA in Eukaryoten in Zusammenhang steht, d.h. nach der transkriptionellen Termination werden Polyadenylsäure-"Schwänze" an das 3'-Ende von mRNA-Vorstufen angesetzt. Die Polyadenylierungsstellen werden im allgemeinen durch das Auftreten von Homologie mit der kanonischen Form 5'...AATAAA.. .3' erkannt, obwohl auch Veränderungen der Distanz von 5'- zu dem 3'-Ende des Transkripts, teilweises "Durchlesen" und mehrfache kanonische Tandem-Sequenzen nicht unüblich sind. DNA- Sequenzen zwischen 20 und 35 bp stromabwärts von dem 3'-Ende des Transkripts scheinen notwendig zu sein (McDevitt M.A. et al. (1984) Cell 37:993-999). Es sollte beachtet werden, daß eine kanonische "Polyadenylierungsstelle" tatsächlich die Lokalisation des 3'-Endes der mRNA bestimmt und nicht die Polyadenylierung per se (Proudfoot N. (1984) Nature 307:412-413; Birnstiel M.L. et al. (1985) Cell 41:349-359).

Transkriptionssteuernde Sequenzen:

Bezieht sich auf eine Stellenkombination aus Promotor/Transkript-Terminator, die ein Strukturgen flankiert. Die Promotorund Terminator-DNA-Sequenzen, die ein spezielles Fremdstrukturgen flankieren, müssen nicht aus der gleichen Gen-Quelle (z.B. der Paarung von zwei unterschiedlichen T-DNA- Transkripten) oder der gleichen taxonomischen Quelle (z.B. der Paarung von Sequenzen aus T-DNA mit Sequenzen aus Nicht-T-DNA-Quellen, wie etwa Pflanzen, Tieren, Pilzen, Hefen, eukaryotischen Viren, Bakterien und synthetischen Sequenzen) stammen.

Anti-sense (entgegen gerichtete) RNA (aRNA):

bezieht sich hier auf eine RNA, die teilweise oder zur Gänze mit mindestens einer sense (gerichteten) Sequenz einer mRNA des Ziel-Virus komplementär ist. Ein Ziel-Virus ist ein Virus, gegen das man Resistenz anstrebt. Die Sequenz des Ziel-Virus, die als Komplement von der aRNA umfaßt ist, kann aus einer mRNA des Ziel-Virus mit der vollen Länge oder aus einem Teil derselben bestehen, wobei der Teil aus einer Codierungsregion, einer translationellen Initiationsstelle und/oder einer 5'-, 3'- oder internen untranslatierten Region stammt. Eine aRNA kann Sequenzen enthalten, die zu einer Vielzahl verschiedener Viren komplementär sind, wodurch sie jedem aus der Vielzahl dieser Viren Resistenz verleihen kann. Die aRNA selbst kann oder kann nicht als eine mRNA wirken.

Anti-sense RNA-Gen (aRNA-Gen):

Bezieht sich hier auf einen Promotor, eine DNA-Sequenz, die eine aRNA (virale cDNA) determiniert, und einen Transkript- Terminator, wobei der Promotor, die virale cDNA und der Terminator eine solche Position und eine solche Orientierung zueinander einnehmen, daß, wenn sie in einer Pflanzenzelle vorliegen, eine aRNA uiiter der Steuerung des Promotors transkribiert werden kann. Mit anderen Worten exprimiert ein aRNA-Gen eine RNA, die eine zu einer viralen mRNA komplementäre RNA umfaßt. Ein aRNA-Gen kann eine Zusammensetzung von Segmenten sein, die aus einer Vielzahl von Quellen, natürlichen oder synthetischen Ursprungs, stammen. Ein aRNA-Gen-Transkript kann Sequenzen einschließen, die zur Gänze oder teilweise von prokaryotischer DNA, eukaryotischer DNA, episomaler DNA, Plasmid-DNA, Plastid-DNA, genomischer DNA, cDNA, viraler DNA, viraler cDNA, chemisch synthetisierter DNA oder dergleichen stammen. Weiters wird in Betracht gezogen, daß ein aRNA-Gen eine oder mehrere Modifikationen entweder in den Transkriptions-Steuerungssequenzen, in den transkribierten Sequenzen oder der viralen cDNA enthalten kann, was die biologischen Aktivität oder chemische Struktur der aRNA, die Expressionsrate oder die Art und Weise der Expressionssteuerung beeinflussen könnte Derartige Modifikationen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Mutationen, Insertionen, Deletionen und Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide sowie Modifikationen, die die aRNA-Funktion nicht verändern, jedoch die interzellulare Lokalisation, den Transport oder die Stabilität der aRNA beeinflussen. DNA, die für eine aRNA codiert, kann eine ununterbrochene aRNA-Sequenz determinieren oder sie kann ein oder mehrere Introns enthalten, die von den geeigneten Pflanzen-funktionellen Spleißverbindungen begrenzt sind, die aus einer synthetischen oder natürlich vorkommenden Quelle erhalten werden können.

cDNA (Komplementäre DNA):

Obwohl dieser Ausdruck in der Fachwelt allgemein verstanden wird, hat er zwei Bedeutungen. (1) Eine cDNA kann eine einzelstrangige DNA sein, die zu einer RNA (z.B. einer viralen mRNA) komplementär ist. (2) Eine cDNA kann auch ein doppelstrangiges DNA-Segment sein, wobei ein Strang desselben komplementär zu einer RNA ist und der andere Strang eine Sequenz aufweist, die zu dieser RNA äquivalent ist (wobei T anstelle von U steht). Im allgemeinen stammt eine doppelstrangige cDNA aus einer einzelstrangigen cDNA. Wie es jedoch hierin definiert ist, ist eine doppelstrangige DNA, die für mRNA-Sequenzen codiert, z.B. die DNA eines Strukturgens, von dem Ausdruck cDNA umfaßt. In den Ansprüchen bezieht sich cDNA immer auf die doppelstrangige Form (Bedeutung (2)). An anderen Stellen dieser Beschreibung ist die Bedeutung der cDNA im Zusammenhang definiert und wird von dem Fachmann auf diesem Gebiet gut verstanden werden.

Plus-strangig:

Bezieht sich auf Viren, die Genome mit Sequenzen aufweisen, die der der mRNA der Viren äquivalent sind; d.h. RNA, die in Viruspartikeln gefunden wird, ist zu viraler mRNA nicht komplementär. Oft kann die virale RNA von plusstrangigen Viren als eine mRNA dienen. AMV ist ein Beispiel für ein plus-strangiges Virus; jeder der vier in AMV-Virionen gefundenen RNAs ist imstande, als eine mRNA zu dienen.

Dreiteiliges RNA-Genom:

Bezieht sich auf die Organisation des genetischen Materials eines Virus. "Genom" bezieht sich auf das gesamte genetische Material des Virus. "RNA-Genom" gibt an, daß bei Vorliegen in Virionen (Viruspartikeln) das Genom in der RNA-Form vorliegt. "Dreiteilig" bedeutet, daß das Genom in drei voneinander getrennte RNA-Moleküle unterteilt ist. Ein Beispiel eines Virus mit einem dreiteiligen RNA-Genom ist AMV. Das Genom von AMV wird von den AMV-RNAs 1, 2 und 3 getragen. Die Sequenz der RNA4 ist zur Gänze in RNA3 enthalten und RNA4 wird nicht repliziert; daher wird die RNA4 als eine subgenomische RNA bezeichnet und ist nicht als eine der genomischen RNAs gerechnet.

Translations-Initiationsstelle:

Bezeichnet hierin das translationelle Startcodon 5'AUG3' am 5'-Ende eines Strukturgens, das dem AUG folgende Nukleotid und die 3 Nukleotide, die dem AUG vorangehen (vgl. Kozak M. (1983) Mikrobiol. Rev. 47:1-45, und Kozak M. (1984) Nucl. Acids Res. 12:857-872).

5'-untranslatierte Sequenz:

Bezeichnet hierin jenen Teil einer mRNA zwischen deren 5'-Ende oder der "Kappenstelle" und dem Translations-Startcodon.

3'-konservierte Sequenz:

Bezeichnet hierin eine Sequenz am 3'-Ende eines mehrteiligen nicht-polyadenylierten RNA-Genoms, die für alle Genom-Bestandteile die gleiche ist. Die AMV 3'-konservierte Sequenz erstreekt sich über etwa 145 Nukleotide von dem 3'-Ende aller vier AMV RNAs.

cDNA von im wesentlichen voller Länge:

Bezeichnet hierin eine cDNA, die zu einer gesamten mRNA komplementär ist, wobei möglicherweise einige wenige (z.B. fünf) Nukleotide an einem der beiden Enden dieser mRNA-Sequenz ausgenommen sind.

Pflanzen-exprimierbarer selektierbarer oder durch Sereenen feststellbarer Marker:

Bezeichnet hierin einen genetischen Marker, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist. Ein selektierbarer Marker (z.B. ein Kanamycinresistenz-Gen) ermöglicht, daß Zellen, die diesen Marker enthalten und exprimieren, unter Bedingungen wachsen, die für das Wachstum von Zellen, die diesen Marker nicht exprimieren, ungünstig sind. Ein durch Screenen feststellbarer Marker (z.B. ein Beta-Galaktosidase-Gen) erleichtert die Identifikation von Zellen, die diesen Marker exprimieren.

Transformierung:

Bezeichnet den Akt der Ursache dafür, daß eine Zelle ein Nuklein-Molekül oder eine Nuclein-Sequenz, die ursprünglich nicht Teil dieser Zelle war, enthält.

Pflanzengewebe:

Umfaßt differenzierte und undifferenzierte Pflanzengewebe, die ihrerseits umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf Wurzeln, Sprossen, Pollen, Samen, Tumorgewebe, wie etwa Krongallen, und verschiedene Formen von Aggregationen von Pflanzenzellen in Kultur, wie etwa Embryonen und Kalli. Das Pflanzengewebe kann in planta oder in einem Organ, Gewebe oder einer Zellkultur vorliegen.

Pflanzenzelle:

Wie der Ausdruck hier verwendet wird, umfaßt er Pflanzenzellen in planta und Pflanzenzellen und Protoplasten in Kultur.
Die folgenden Ausdrücke sind in der Fachwelt allgemein bekannt und müssen nicht speziell oder eigens hier definiert werden: einzelstrangig, Genom, Alfalfa- Mosaikvirus-Gruppe (vgl. Matthews REF (1982) Classification and Nomenclature of Viruses, S. 177), Tobamovirus (vgl. Matthews, s.o., S. 158-159), CaMV 195 Promotor (vgl. Hohn T. et al. (1982) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96:193-236), T-DNA vom Octopin-Typ (Positionen, Orientierungen und offene Leserahmen (ORFS) sind definiert nach der Bezeichnung von Barker RF et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2:335-350), T-DNA- Randwiederholung, Transkription unter der Steuerung eines Promotors, Ligation, absteigend und Strukturgen.
Die Produktion einer genetisch modifizierten Zelle, die ein aRNA-Gen exprimiert, vereinigt die speziellen Lehren der vorliegenden Offenbarung mit einer Vielzahl von Verfahren und Hilfsmitteln, die in der Fachwelt bekannt sind. In den meisten Fällen existieren andere Hilfsmittel für jede Stufe des Gesamtprozesses. Die Auswahl der Hilfsmittel hängt von Variablen ab, wie etwa der Auswahl des speziellen Virus, gegen den Resistenz erwünscht ist, dem grundlegenden Vektor-System für die Einführung und stabile Aufrechterhaltung des aRNA-Gens, der Pflanzengattung, die modifiziert werden soll, und der gewünschten Regenerationsstrategie, den speziellen verwendeten transkriptionellen Steuerungssequenzen, den speziellen viralen Sequenzen, die von dem aRNA-Gentranskript umfaßt sind, und dergleichen, die alle alternative Verfahrensschritte darstellen, die der durchschnittliche Fachmann auf diesem Gebiet imstande ist, auszuwählen und zur Erzielung eines gewünschten Ergebnisses zu verwenden. Da neue Mittel zur stabilen Einsetzung und Transkription von Fremd-DNA in Pflanzenzellen entwickelt werden, wird der durchschnittliche Fachmann auf diesem Gebiet imstande sein, unter diesen anderen Verfahrensschritten eine Auswahl zu treffen, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen. Die fundamentalen Aspekte der Erfindung sind die Natur des aRNA-Gens und dessen Verwendung, um den damit transformierten Pflanzen Widerstandsfähigkeit gegen Virusinfektionen zu verleihen. Andere Aspekte umfassen die Natur und Struktur der aRNA-Sequenz und ihre Mittel zum Einsetzen und zur Expression in einem Pflanzengenom. Die verbleibenden Schritte der bevorzugten Ausführungsform zur Gewinnung einer genetisch modifizierten Pflanze umfassen das Einsetzen des aRNA-Gens in T-DNA, die Übertragung der modifizierten T-DNA auf eine Pflanzenzelle, in welcher die modifizierte T- DNA als Teil des Pflanzenzellgenoms stabil integriert wird, die Verfahren zur in vitro Züchtung und anschließenden Regenerierung zu ganzen Pflanzen, wobei Schritte zur Auswahl und Feststellung transformierter Pflanzenzellen und Schritte zur Übertragung des eingesetzten aRNA-Gens aus dem ursprünglich transformierten Stamm in wirtschaftlich vertretbare Kultivare umfaßt sein können, sowie die überwachung der Expression in transformierten Pflanzen.
Ein Ausgangspunkt für die Konstruktion eines aRNA-Gens ist die Gewinnung von DNA-Klonen viraler Sequenzen. Wenn das Virus ein DNA-Virus ist, sind die DNA-Klone unter Verwendung von Methoden erhältlich, die auf dem Fachgebiet der rekombinanten DNA allgemein bekannt sind. Wenn das Virus ein RNA-Virus ist, muß ein cDNA-Klon aus der gewünschten viralen Sequenz gemacht werden. Eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung von cDNA-Klonen ist auf dem Fachgebiet der rekombinanten DNA bekannt; die Auswahl der Methoden wird von Variablen abhängen, wie etwa der Polyadenylierung, der RNA-Länge, der Vorkenntnis über die RNA-Sequenz, der Vorpräparierung in dem speziellen Laboratorium hinsichtlich anderer cDNA-Klonierungsversuche und dergleiche. Geklonte virale Sequenzen sind ein notwendiger Bestandteil eines aRNA-Gens.
Ein prinzipielles Merkmal der vorliegenden Erfindung in deren bevorzugter Ausführungsform ist die Konstruktion eines T-DNA-Derivats, das ein eingesetztes Gen unter der Steuerung von pflanzenexprimierbaren Transkriptions-Steuerungssequenzen aufweist, d.h. zwischen einem Promotor und einem Transkript-Terminator, gemäß der oben angegebenen Definition dieser Ausdrücke. Die aRNA-codierende DNA muß in korrekter Position und Orientierung im Hinblick auf den Promotor eingesetzt sein. Die Position betrifft die Tatsache, an welcher Seite des Promotors die aRNA-codierende DNA eingesetzt wird. Es ist bekannt, daß die Hauptmenge der Promotoren die Initiation der Transkription und Translation in nur einer Richtung entlang der DNA steuern. Die unter der Steuerung des Promotors liegende Region der DNA wird als "stromabwärts" oder anders als "hinter" oder "3' zu" dem Promotor bezeichnet. Um daher durch den Promotor gesteuert zu werden, muß die korrekte Position eines aRNA-codierenden DNA-Inserts "stromabwärts" des Promotors liegen. Der Ausdrück Orientierung bezieht sich auf die Gerichtetheit des Strukturgens. Jener Teil einer aRNA-codierenden DNA, der komplementär zu der viralen mRNA ist, die den Amino-Terminus eines viralen Proteins codiert, wird als das 3'-Ende der aRNA-codierenden DNA bezeichnet, während jenes Ende, das der viralen mRNA, die für Aminosäuren nahe dem Carboxylende des Proteins codiert, komplementär ist, als das 5'-Ende der aRNA-codierenden DNA bezeichnet wird. Mit anderen Worten codierten das 5'-Ende bzw. das 3'-Ende der aRNA-codierenden DNA jeweils für das 3'- Ende und das 5'-Ende der viralen mRNA. Die korrekte Orientierung der aRNA-codierenden DNA ist die, daß das 5'-Ende derselben nächst dem Promotor liegt. Ähnlich der Promotor-Region muß der Transkript-Terminator in korrekter Position und Orientierung in bezug auf die aRNA liegen, wobei er dem 3'-Ende der aRNA zunächst liegt. Unterschiede in der Expressionsgeschwindigkeit des aRNA-Gens oder der entwicklungsmäßigen Steuerung können in Abhängigkeit von den speziellen aRNA-Bestandteilen, den Promotoren, Transkript-Terminatoren, flankierenden DNA-Sequenzen oder Einsatzstellen in das Genom der transformierten Pflanze beobachtet werden. aRNA-Anreicherung kann auch weitgehend von den Details der sekundären aRNA-Struktur, insbesondere von Stamm- Schleifen-Strukturen, beeinflußt werden. Verschiedene Eigenschaften, die die Eigenschaften der Stabilität, intrazellulären Lokalisation, des post-transkriptionellen Prozessierens und andere funktionelle Eigenschaften der exprimierten aRNA selbst umfassen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind, können beobachtet werden, wenn aRNA-Genbestandteile verändert werden. Alle diese Variationen stellen zahlreiche Gelegenheiten zur Manipulation und Steuerung der funktionellen Eigenschaften des Phenotyps der Virusresistenz dar, in Abhängigkeit von den gewünschten physiologischen Eigenschaften innerhalb der Pflanzenzelle, des Pflanzengewebes und der gesamten Pflanze.
Das fundamentale Prinzip der vorliegenden Erfindung ist, daß die Anwesenheit von anti-sense RNA-Sequenz in einer Pflanzenzelle imstande ist, dieser Zelle zumindest ein gewisses Ausmaß an Virusresistenz zu verleihen. Die Anforderungen hinsichtlich der viralen Sequenzsegmente, die in einer aRNA eingeschlossen sein sollen, werden am besten in Ausdrücken der Funktionalität formuliert. Die Anwesenheit einer aRNA in einer Zelle verleiht Virusresistenz, indem sie mit einer oder mehreren Virusfunktionen interferiert. Solche Funktionen können die Translation viraler Proteine, die Replikation von viralen RNAs, die Einkapselung von viraler Nukleinsäure etc. umfassen. aRNA interferiert voraussichtlich durch Annealing mit einem viralen plus-strangigen Segment oder durch Bindung von mindestens einem an dem Lebenszyklus des Virus beteiligten Protein. Die vorliegende Erfindung ist nicht durch die Art und Weise oder den Mechanismus der Interferenz beschränkt. Die aRNA muß nicht die virale Sequenz in voller Länge umfassen; jedes Sequenz-Segment, das einem viralen plus-strangigen Segment komplementär und imstande ist, mit einer viralen Funktion zu interferieren, ist ausreichend. Mit anderen Worten ist die Anwesenheit mindestens einer viralen Sequenz, die zur Interferenz mit viralen Funktionen befähigt ist, in einer aRNA erforderlich und jedes virale Sequenz-Segment, das zu einer Interferenz nicht befähigt ist, kann weggelassen werden, vorbehaltlich Bedenken hinsichtlich der RNA-Stabilität, der zellulären Lokalisation und dergleichen. Virale Sequenzen von verschiedenen unterschiedlichen Viren, wobei jede Sequenz zur Funktion als eine aRNA befähigt ist, können zur Bildung einer aRNA kombiniert werden, die antivirale Wirksamkeit gegen jedes der mehreren Viren zeigt.
Gemäß der Definition kann eine aRNA nicht-virale Sequenzen enthalten. Selbst in Fällen, wo eine virale Sequenz voller Länge enthalten ist, kann eine aRNA nichtvirale Sequenzen enthalten. üblicherweise werden diese nicht-viralen Sequenzen an dem 5'- und 3'-Ende der aRNA vorliegen. Oft werden diese nicht-viralen Bestandteile von Promotor- oder Transkript-Terminator-DNA-Segmenten stammen. Der Einschluß verschiedener nicht-viraler Sequenzen kann die RNA-Stabilität, die Lokalisation der aRNA in der Zelle, die post-transkritionelle Prozessierung und dergleichen beeinflussen. Es ist in der Fachwelt bekannt, daß RNA-Stabilität durch die Endstrukturen, wie etwa die 5'-Kappenbildung und die 3'-Polyadenylierung, und durch die Erstreckung der internen Struktur, d.h. die intramolekulare Basenpaarung, beeinflußt wird. Eine aRNA kann innerhalb einer Zelle angeordnet sein, z.B. wird eine aRNA, die eine translatierbare Sequenz aufweist, die für ein ein Signalpeptid enthaltendes Polypeptid codiert, dazu neigen, an rauhes endoplasmatisches Reticulum gebunden zu werden. Es kann ein Intron in einer aRNA enthalten sein, sofern, wenn die Spleißstellen von zwei verschiedenen Genen abgeleitet sind, die Intron-Spleißstellen kompatibel sind.
Beim Design einer aRNA müssen mehrere biologische Faktoren im Auge behalten werden. Eine sekundäre RNA-Struktur kann die antivirale Aktivität ebenso wie die Stabilität und die Prozessierung beeinflussen. Insbesondere dürfen Sequenzen, die an einer intramolekularen Basenpaarung beteiligt sind und mit den viralen Funktionen interferieren, nicht so stark sein, daß ein Annealing an virale mRNA ausgeschlossen ist. Ein aRNA-Transkript sollte nicht dazu befähigt sein, durch die virale Replikationsmaschinerie in eine funktionelle gerichtete (sense) virale Komponente umgewandelt zu werden, die imstande ist, die Schwere der Virus-Erkrankung zu steigern. Die Produktion von sense- Strang kann durch Einschluß von nicht-viralen Sequenzen in der aRNA blockiert werden, insbesondere an einem oder beiden Enden der aRNA, die mit der Replikase-Funktion interferieren. Soll die Plus-Strang-Produktion nicht behindert werden, können andere Schritte erfolgen. Die Deletion eines Protein-codierenden Sequenzsegments oder die Einführung einer geeignet positionierten Rahmenverschiebungs-Mutation können die Ursache dafür sein, daß das virale Protein, für das der sense-Strang die Schablone ist, nicht funktionell ist. Rahmenverschiebungs-Mutationen werden üblicherweise durch Öffnung eines viralen cDNA-tragenden Plasmids an einer einzigartigen, klebrige Enden hervorrufenden Restriktionsstelle, Entfernen der klebrigen Enden und Religation eingeführt. In Abhängigkeit von dem verwendeten Enzym und den verwendeten Methoden werden dadurch zwei oder vier Basenpaare deletiert oder eingesetzt, wodurch eine Rahmenverschiebung geschaffen wird (und auch diese Restriktionsstelle eliminiert wird).
Eine wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Inhibierung der Virus-Vermehrung, die durch die Bindung einer cDNA von im wesentlichen voller Länge (z.B. bis innerhalb von 5 Nukleotiden von jedem Ende der mRNA-Sequenz) an eine virale mRNA verursacht wird. Eine cDNA voller Länge hat vier wichtige Regionen: eine 5'-untranslatierte Sequenz, eine translationelle Initiationsstelle, ein Strukturgen und eine 3'-konservierte Sequenz. Die Bindung einer aRNA an eine 5'-untranslatierte Sequenz kann mit der translationellen Initiation interferieren, indem sie mit dem Preinitiations-Scanning der mRNA hinsichtlich translationeller Initiationsstellen durch 405 ribosomale Untereinheiten interferiert (vgl. Kozak M. (1983) Microbiol. Rev. 47:1-45). Die Bindung an eine translationelle Initiationsstelle kann die translationelle Initiation stören. Die Bindung an die Strukturgen-Sequenz, d.h. die Protein-codierende Sequenz, kann die translationelle Wirksamkeit herabsetzen. Die Bindung an die 3'-konservierte Sequenz kann mit der Initiation der Replikation interferieren.
Die Kombination von DNA-Segmenten, inklusive viraler, nicht-viraler, Promotor- und Transkript-Terminator-Sequenzen, zur Bildung eines aRNA-Gens wird durch Mittel erreicht, die dem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie bekannt sind und von ihm verstanden werden. Die Auswahl des Promotors hängt von der gewünschten entwicklungsmäßigen Regulierung ab. Die Verwendung von entwicklungsmäßig regulierten Promotoren zur Genexpression in Pflanzen ist in dem Kapitel "Hintergrund" beschrieben. T-DNA- oder CaMV-Promotoren sind vorteilhaft, da sie konstitutiv sind. Der Promotor der kleinen Untereinheit von RuBP-Case kann zur Expression in grünen Geweben einer mit aRNA-Gen transformierten Pflanze verwendbar sein. Bei den bevorzugten Ausführungsformen ist der Transkript-Terminator eine Polyadenylierungsstelle. Die Pflanzengen-Quelle der Polyadenylierungsstelle ist nicht wesentlich, sofern die Polyadenylierungsstelle, der Promotor und die aRNA zur Transkription und post-transkriptionellen Prozessierung kompatibel sind.
Wie fur den durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet ersichtlich, kann die aRNA-Gen-Kombination zwischen beliebige Restriktionsstellen eingesetzt werden, die zur Entfernung der Kombination aus dem Plasmid gunstig sind, es wird fortgetragen und ist zur Einsetzung in den ausgewählten Pflanzentransformationsvektor geeignet. Zum Beispiel ist die Anordnung der aRNA-Gen-Insertionsstelle innerhalb der T-DNA solange nicht kritisch, als die Transfer-Funktion der Sequenzen, die unmittelbar an die T-DNA- Ränder angrenzen, nicht unterbrochen wird, da gemäß Studien des Stands der Technik diese Regionen zur Einsetzung der modifizierten T-DNA in das Pflanzengenom wesentlich zu sein scheinen. Die Kombination wird in den Pflanzentransformationsvektor durch Standardverfahren eingesetzt, die dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind. Die Orientierung des zusammengebauten aRNA-Gens im Hinblick auf die Richtung von Transkription und Translation der endogenen Vektor-Gene ist in der Regel nicht kritisch; im allgemeinen ist jede der beiden Möglichkeiten der Orientierung funktionell.
Wie im Kapitel "Hintergrund" (Ti-Plasmid-DNA) zusammengefaßt wurde, kann die T-DNA von Mikro-Ti-Plasmiden aus einem Agrobakterium-Stamm auf eine Pflanzenzelle übertragen werden, sofern der Agrobakterium-Stamm bestimmte trans-wirkende Gene enthält, deren Funktion es ist, die übertragung von T-DNA auf eine Pflanzenzelle zu bewirken. Mikro-Ti-Plasmide sind insfern vorteilhaft, als sie sehr klein und relativ leicht direkt zu manipulieren sind, wobei die Notwendigkeit vermieden wird, das Gen aus einem Shuttle-Vektor durch homologe Rekombination auf die T-DNA zu übertragen. Nachdem das gewünschte aRNA-Gen eingesetzt wurde, können sie leicht direkt in eine Agrobakterium-Zelle, die trans-wirkende vir-Gene enthält, eingeführt werden, wobei die vir-Gene in der Regel auf einem "Helfer-Plasmid" vorliegen, das den T-DNA-Transfer bewirkt. Die Einführung in einen Agrobakterium-Stamm erfolgt günstigerweise entweder durch Transformation des Agrobakterium-Stammes oder durch konjugalen Transfer von einer Donor-Bakterienzelle, wobei der durchschnittliche Fachmann auf diesem Gebiet die Verfahren dafür gut kennt. Zum Zweck der Einführung von neuen DNA-Sequenzen in ein Pflanzengenom sollten Ti-Plasmide, Ri-Plasmide, Mikro-Ti-Plasmide und in Chromosome integrierte T-DNA als funktionell äquivalent erachtet werden.
T-DNA, die ein aRNA-Gen aufweist, kann auf Pflanzenzellen durch ein beliebiges in der Fachwelt bekanntes Verfahren übertragen werden. Zum Beispiel wird diese übertragung sehr günstig durch gemeinsame Züchtung des Agrobakterium-Stammes mit Pflanzenzellen oder mit Pflanzengeweben erreicht. Unter Verwendung dieser Verfahren wird ein bestimmter Anteil der Pflanzenzellen transformiert, das heißt, daß er T-DNA in sich übertragen und in das Pflanzenzellgenom eingesetzt enthält. In beiden Fällen müssen die transformierten Zellen selektiert oder gescreent werden, um sie von nicht-transformierten Zellen zu unterscheiden. Die Selektion wird am besten dadurch erreicht, daß ein selektierbarer Marker zusätzlich zu dem aRNA-Gen in die T-DNA eingesetzt wird. Beispiele von künstlichen Markern umfassen solche, die in dem Kapitel "Hintergrund" (vgl. die Abschnitte über chimärische Gene) zusammengefaßt sind. Zusätzlich dazu stellt die T-DNA endogene Marker zur Verfügung, wie etwa ein oder mehrere Gene, das bzw. die die abnormale Morphologie von Ri-induzierten Tumorwurzeln kontrollieren, sowie ein oder mehrere Gene, das bzw. die die Resistenz gegen toxische Verbindungen, wie etwa Aminosäure-Analoga, kontrollieren, wobei diese Resistenz durch ein Opin-synthetisierendes Enzym (z.B. ocs) zur Verfügung gestellt wird. Screening-Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Assays hinsichtlich der Opinproduktion, spezifische Hybridisierung an charakteristische Nukleinsäure-Sequenzen (z.B. aRNA oder T-DNA) oder immunologische Assays für spezifische Proteine. Zusätzlich dazu kann ein Phenotyp eines exprimierten aRNA-Gens (z.B. Resistenz gegen ein Ziel-Virus) zur Identifikation von transformiertem Gewebe verwendet werden. Ein Assay auf virale Resistenz kann nach einer aus einer Reihe von Methoden erfolgen, die auf dem Fachgebiet der Pflanzen- Virologie allgemein bekannt sind, inklusive Feststellung der Abnahme der Produktion einer Virus-Komponente (z.B. einer viralen RNA oder eines viralen Proteins), Abnahme der Infektivität nach der Prüfung durch Protoplast-Infektion oder lokale Lesions-Assays, Abnahme der Produktion der Virus-Nachkommenschaft und dergleichen.
Obwohl sich die bevorzugten Ausführungsformen der Verwendung von Mikro-Ti-Plasmiden bedienen, können andere Vektor-Systeme auf der Basis von T-DNA, die in der Fachwelt bekannt sind, leicht anstelle dessen verwendet werden. Außerdem sind, obwohl die bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ein Agrobakterium-vermitteltes System auf der Basis von T-DNA zum Einbau des aRNA-Gens in das Genom der Pflanze, die transformiert werden soll, verwendet, andere Mittel zur übertragung und zum Einbau des aRNA-Gens ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung eingeschlossen. Andere Mittel zum stabilen Einbau des aRNA-Gens in ein Pflanzengenom umfassen weiters, sind jedoch nicht beschränkt auf die Verwendung von Vektoren auf der Basis viraler Genome, von Mini-Chromosomen, Transposonen und homologen oder nicht-homologen Rekombinationen in Pflanzenchromosome. Andere Formen zur Lieferung dieser Vektoren in eine Pflanzenzelle umfassen zusätzlich, sind jedoch nicht beschränkt auf die Fusion mit Vektor-enthaltenden Liposomen oder bakteriellen Sphäroplasten, Mikroinjektion, Einkapselung in virales Hüllprotein mit anschließendem infektionsartigem Prozeß sowie direkte Aufnahme der DNA, möglicherweise nach der Induktion von Plasmalemma-Permeabilität durch einen elektrischen Impuls, einen Laser oder ein chemisches Mittel. Mittel zum vorübergehenden Einbau und/oder zur Expression sind ebenfalls innerhalb des Rahmens dieser Erfindung vorgesehen. Systeme auf der Basis von Agrobakterium-Zellen und T-DNAs können zur Transformation von Angiospermen, inklusive Dicotylen und Monocotylen, durch Transfer der DNA von einem Bakterium in eine Pflanzenzelle verwendet werden; Systeme auf der Basis anderer Vektoren oder Mittel zur Vektor-Anlieferung können zur Transformierung von Gymnospermen und Angiospermen verwendet werden.
Die Regeneration von transformierten Zellen und Geweben wird unter Zuhilfenahme bekannter Verfahren erreicht. Ein Ziel der Regenerierungsstufe ist es, eine gesamte Pflanze zu erhalteii, die normal wächst und sich reproduziert, jedoch die integrierte T-DNA beibehält. Die Regenerationsverfahren variieren einigermaßen je nach den in der Fachwelt bekannten Prinzipien und können von dem Pflanzentransformationsvektor und der Art der transformierten Pflanze abhängen. Die Regeneration von transformierten Tabak-Pflanzen, Petunia-Pflanzen und Pflanzen verwandter Arten ist in der Fachwelt allgemein bekannt. Da Mittel zur Regenerierung anderer Pflanzenarten entwickelt wurden, wird der Fachmann ohne Durchführung unnötiger Experimente verstehen, wie diese in letzter Zeit entdeckten Mittel zur Regenerierung von Pflanzen aus transformierten Pflanzenzellen und transformierten Pflanzengeweben anzupassen sind.
Der Genotyp des transformierten Pflanzengewebes wird oft im Hinblick auf die Leichtigkeit, mit welcher dessen Zellen gezüchtet und in vitro in Kultur regeneriert werden können, und im Hinblick auf die Empfindlichkeit auf die verwendeten selektiven Mittel ausgewählt. Sollte ein Kultivar von landwirtschaftlichem Interesse für diese Manipulationen ungeeignet sein, wird zuerst eine besser verwendbare Varietät transformiert. Nach der Regenerierung kann das neu eingeführte aRNA-Gen leicht auf den gewünschten agronomischen Kultivar durch Verfahren übertragen werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Pflanzenzüchtung und Pflanzengenetik allgemein bekannt sind. Geschlechtliche Kreuzungen von transformierten Pflanzen mit den landwirtschaftlich interessanten Kultivaren führen zu Initialhybriden. Diese Hybride können dann mit Pflanzen des gewünschten genetischen Hintergrunds rückgekreuzt werden. Die Nachkommenschaft wird kontinuierlich gesichtet und/oder auf die fortdauernde Anwesenheit von integrierter aRNA-Gen-DNA, T-DNA oder auf einen neuen Phenotyp, der aus der Expression des aRNA-Gens oder anderer Gene, die von der eingesetzten DNA getragen werden, stammt, selektiert. Auf diese Weise können nach einer Anzahl von Runden der Rückkreuzung und Selektion Pflanzen produziert werden, die einen im wesentlichen identen Genotyp mit den landwirtschaftlich gewünschten Parenten mit Zusatz der eingesetzten DNA-Sequenzen aufweisen.
Eine Alternative zum Einbau eines aRNA-Gens in ein Pflanzengenom zur Herstellung einer aRNA-enthaltenden Pflanzenzelle besteht darin, eine Pflanze mit einer viralen RNA als Vektor zu infizieren, die zur Aufrechterhaltung in dieser Pflanze befähigt ist, wobei die virale RNA aRNA-Sequenzen zu einem unterschiedlichen Ziel-Virus (d.h. einem Virus, gegen das man Schutz anstrebt) aufweist. In der Regel werden doppelstrangige cDNA-Sequenzen des Vektor-Virus und des Ziel-Virus unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie manipuliert. Nach dem Zusammenbau einer DNA-Sequenz, die der der gewünschten Vektor-RNA/Ziel-aRNA-Kombination entspricht, kann die Kombination aus Pflanzen-virale Vektor-cDNA/aRNA-cDNA hinter einem Promotor eingesetzt werden, der die in vitro Transkription antreibt. Beschreibungen solcher Vektoren und Bedingungen für deren Verwendung sind u.a. Melton D.A. et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035-7056, Krieg P.A. und Melton D.A. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7057- 7070, Ahlquist P. und Janda M. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2876-2882, und French R. et al. (1986) Science 231:1294-1297. Nachdem eine solche Kombination aus viralem Vektor/aRNA/in vitro-Transkriptionsvektor zusammengebaut wurde, kann eine Kombination aus viraler Vektor-RNA/Ziel-aRNA durch in vitro Transkription produziert und mit beliebigen anderen viralen RNA-Komponenten, die zur Aufrechterhaltung des viralen Vektors in einer Pflanzenzelle notwendig sind, gemischt werden. Infektion durch eine Kombination von Vektor/aRNA einer Pflanzenzelle kann durch bekannte Verfahren vorgenommen werden und, nach Inokulation mit dem Ziel-Virus oder der Ziel-Virus- RNA, kann die Inhibierung der Infektion oder Produktion einer viralen Komponente durch an sich in der Fachwelt bekannte Verfahren geprüft werden.
In ähnlicher Weise können pflanzliche virale DNA-Vektoren zur Einsetzung eines aRNA-Gens in eine Pflanzenzelle verwendet werden. Die Verwendbarkeit solcher Vektoren wurde durch Brisson N. et al. (1984) Nature 310:511-514 demonstriert. Die Mittel zur Schaffung funktioneller aRNA-Gene, wie sie von der vorliegenden Erfindung gelehrt werden, können mit der Verwendung von Vektoren auf der Basis von Pflanzen-DNA-Viren durch den durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet kombiniert werden. Nach der Infektion einer geeigneten pflanzlichen Wirtszelle kann die Inhibierung der Ziel-Virus-Infektion nach obiger Beschreibung überprüft werden.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sind zum Zweck der Erläuterung spezieller Ausführungsformen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung angegeben, ohne den Rahmen derselben zu begrenzen, wobei dieser Rahmen durch die Ansprüche definiert ist. Zahlreiche Veränderungen werden leicht für den durchschnittlichen Fachmann auf diesem Gebiet erkennbar sein.
Die Beispiele verwenden viele Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der Manipulation von T-DNA und Agrobakterium allgemein bekannt und zugänglich sind; diese Verfahren sind in einer oder mehreren der oben angegebenen Literaturstellen vollständig beschrieben, sofern sie nicht im Detail hierin angegeben sind. Alle zitierten Literaturstellen in dieser Beschreibung sind hiebei als Referenz aufgenommen. Die Enzyme werden aus handelsübliche Quellen erhalten und sind gemäß den Angaben des Verkäufers und anderen Variationen, die in der Fachwelt bekannt sind, verwendet. Reagenzien, Puffer und Züchtungsbedingungen sind dem Fachmann auf diesem Gebiet ebenfalls bekannt. Literaturstellen, die solche Standardverfahren betreffen, sind u.a. die folgenden: Wu R., Hg. (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu R. et al., Hg. (1983) Meth. Enzymol. 100 und 101; Grossman L. und Moldave K., Hg. (1980) Meth. Enzymol. 65; Weissbach A. und Weissbach H., Hg. (1986) Meth. Enzymol. 118 (vgl. vor allem Rogers S.G. et al., S. 627-640); Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics; Davis R. et al. (1980) Advanced Bacterial Genetics; Schleif R.F. und Wensink P.C. (1982) Practical Methods in Molecular Biology; Walker J.M. und Gaastra W. Hg. (1983) Techniques in Molecular Biology; und Maniatis T. et al. (1982) Molecular Cloning. Zusätzlich dazu geben Lathe R.F. et al. (1983) Genet. Engin. 4:1-56 wertvolle Kommentare hinsichtlich der DNA-Manipulation.
Die im Text erfolgende Verwendung des Namens einer Restriktionsendonuklease an isolierter Stelle, z.B. "BclI" bezieht sich auf die Verwendung dieses Enzyms in einem enzymatischen Abbau, ausgenommen in einem Diagramm, wo sie sich auf die Stelle einer Sequenz beziehen kann, die gegenüber der Wirkung dieses Enzyms empfindlich ist, z.B. einer Restriktionsstelle. In dem Text werden die Restriktionsstellen durch zusätzliche Verwendung des Wortes "Stelle" bezeichnet, z.B. "BclI-Stelle". Die zusätzliche Verwendung des Wortes "Fragment", z.B. "BclI-Fragment", bedeutet ein lineares doppelstrangiges DNA-Molekül mit Enden, die durch die Wirkung des genannten Enzyms hervorgerufen sind (z.B. ein Restriktionsfragment). Ein Ausdruck, wie etwa "BclI/SmaI-Fragment" bedeutet, daß das Restriktionsfragment durch die Wirkung von zwei verschiedenen Enzymen hervorgerufen wurde, hier durch BclI und SmaI, wobei die beiden Enden durch die Wirkung verschiedener Enzyme entstehen.
Plasmide und nur Plasmide werden mit einem vorangehenden "p" gekennzeichnet, z.B. pTi15955 oder pH400, und Stammbezeichnungen in Klammern bedeuten ein darin beherbergtes Plasmid, z.B. A. tumefaciens (pTi15955) oder E. coli H802 (ph400). Die folgenden Stämme wurden hinterlegt und sind für die Fachwelt nach Erteilung der Patenturkunden zugänglich:
E. coli MC1061 (pH400A41) NRRL B-18062
E. coli K802 (pH4-1) NRRL B-18009
A. tumefaciens (pTi15955) ATCC 15955
E. coli CSH52 (pSUP106) NRRL B-15486
E. coli SM10 NRRL B-15481
E. coli S17-1 NRLL B-15483
(ATCC: American Type Culture Colleetion, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852 USA; NRRL: ARS Patentsammlung, Northern Regional Research Center, 1815 N. University St., Peoria, IL 61614 USA.) Andere Plasmide und Stämme sind allgemein zugänglich und für den Fachmann erhältlich.

Beispiel 1: Herstellung von AMV RNA4 cDNA

pSP65A4 (Loesch-Fries L.S. et al. (1985) Virol. 146:177-187) trägt eine cDNA-Kopie mit voller Länge von AMV RNA4. pSP6SA4 DNA, die mit EcoRI und SmaI abgebaut wurde, wurde der Agarosegel-Elektrophorese unterworfen und ein Fragment mit 0,89 kpb wurde aus dem Gel eluiert. Dieses Fragment wird mit der linearisierten pSP64 DNA gemischt und damit legiert und in MC1061 transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden durch Hybridisierung an eine AMV RNA4 Sonde herausgefunden. Es wurde eine Kolonie identifiziert, die ein Plasmid mit der Bezeichnung pSP64A4I beherbergte, das eine AMV RNA4 cDNA mit voller Länge trug.
pSP64 und pSP6S werden zur in vitro Transkription unter der Steuerung eines Bakteriophagen SP6 Promotors (Melton D.A. et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035-7056; Krieg P.A. und Melton D.A. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7057-7070) entworfen. pSP6SA4 bzw. pSP64A4I lenken die Synthese von AMV RNA4 plus-strangigen Sequenzen und AMV RNA4 aRNA Sequenzen. Wenn die beiden Plasmide jeweils mit SmaI und ECORI geschnitten werden, sind die Ablauf-Transkripte in vitro im wesentlichen eine Hüllprotein-mRNA-Sequenz mit voller Länge sowie das Komplement dazu. AMV cDNA EcoRI/SmaI Fragmente von pSP6SA4 und pSP64A4I sind ident.

Beispiel 2: In vitro Tests der aRNA-Inhibierung der AMV-Infektion

Alfalfa- und Tabak-Protoplasten wurden in vitro mit RNAs im wesentlichen nach der Beschreibung von Samac D.A. et al. (1983) Virol. 131:455-462) infiziert; dabei ist die hauptsächliche Modifikation die, daß RNA in einem kleinen Volumen (z.B. 10 ul) zu dem Protoplast-Pellet zugesetzt wird, das anschließend in restlichem überstand neuerlich suspendiert wird, bevor Polyethylenglykol (PEG) zugesetzt wird. Diese Veränderung der Methode von Samac et al. mit dem Zusatz von RNA zu dem PEG vor der Kombination mit den Protoplasten führt zu einer etwa fünfzig-fachen Verminderung der für eine Infektion erforderlichen RNA-Menge. Es wird angenommen, daß die Bedingungen der Inokulierung für die Bildung von sense-strangigen:anti-sense-strangigen Düplexen außerhalb einer Zelle ungünstig sind.
Synthetische RNAs wurden im wesentlichen nach der Beschreibung von Melton et al., s.o. und nach dem Protokoll des Händlers der SP6 Polymerase durchgeführt. 5'-gekappte RNAs wurden durch Einschluß von 0,5 mM &sup7;mG&sup5;'ppp&sup5;'G und Herabsetzung der GTP-Konzentration von 0,5 mM auf 0,025 mM synthetisiert. Die Schablone für synthetische AMV RNA4 war SmaI-linearisiertes pSP6SA4 und die Schablone für synthetische AMV RNA4 aRNA war EcoRI-linearisiertes pSP64A4I.
Bei einem typischen Versuch unter Verwendung von sowohl Alfalfa- als auch Tabak-Protoplasten führten natürliche AMV RNAI, RNA2 und RNA3 in Mischung mit synthetischer gekappter RNA4 zu Infektionen bei etwa zwei Drittel der inokulierten Protoplasten. Der Einschluß einer gleichen Menge im Verhältnis zu der synthetischen RNA4 an gekappter RNA4 aRNA führte zumindest einer 100-fachen Abnahme des Infektionsniveaus und häufig zu nicht feststellbarer Infektion.

Beispiel 3: Herstellung von CaMV transkriptionssteuernden Sequenzen

pDOB512, das Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) transkriptionssteuernde Sequenzen trug (erhalten von Dr. Ken Richards, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Biologie Moleculaire et Cellulaire, 15, rue Descartes, F-67084 Straß burg, Frankreich) wurde wie folgt konstruiert: (hinsichtlich eines Uberblicks uber CaMV vgl. Hohn T. et al. (1982) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96.193-236.) Ein HindIII Fragment, das die CaMV 19S RNA Promotor Region tragt (CaMV Nukleotide 5376- 5851), wurde in pBR322 eingesetzt und zurückgeschnitten auf einen Bereich innerhalb eines Basenpaares der 195 Transkript-Kappenstelle. Ein HincII Fragment, das den CaMV 195 Transkript-Terminator trägt (CaMV Nukleotide 7018-7794), zu welchem BamHI- Linker zugesetzt worden waren, wurde dann hinter den 195 Promotor eingesetzt; das entstehende Plasmid hat die Bezeichnung pDOB412. pDOB412 DNA wurde mit BglII und SalI abgebaut, mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I aufgefüllt und religiert, wobei eine DNA, die die Bamhl- und HindIII-Stellen enthält, zwischen der CaMV Position 7644 BglII Stelle und der pBR322 Position 650 SalI Stelle deletiert und eine BglII Stelle regeneriert wurde. Das entstehende Plasmid hatte die Bezeichnung pDOB512.
Die klebrigen Enden von HindIII-linearisierter pDOB512 DNA wurden mit Klenow-Fragment (oder andererseits T4 DNA Polymerase) aufgefüllt. Die stumpfendige pDOB512 DNA wurde mit im Handel erhältlichen BglII-Linkern gemischt und ligiert, worauf durch Abbau mit BglII rückgeschnitten und religiert wurde. Der Ligations- Mix wurde dann in E. coli K802 transformiert und eine Ampicillin-resistente Transformante, die ein Plasmid mit der Bezeichnung pDOB513 beherbergte, wurde isoliert. pDOB513 hat CaMV 195 transkriptionssteuernde Sequenzen auf einem BglII-Fragment. Die SmaI- und Bamin-Stellen finden sich zwischen den DNA-Segmenten, die den Promotor und die Polyadenylierungsstelle enthalten, sowohl in pDOB412, pDOB512 und pDOB513, wodurch ein günstiger Ort zum Einsetzen einer Fremd-DNA geschaffen wird, die eine Schablone für ein Transkript sein soll.

Beispiel 4: Plazierung von AMV cDNA hinter dem CaMV Promotor

pSP6SA4 DNA wurde mit EcoRI und SmaI abgebaut und die 0,89 kb AMV cDNA wurde durch Eluierung aus einem Agarose-Gel nach elektrophoretischer Auftrennung gereinigt. Die EcoRI klebrigen Enden wurden durch Inkubieren mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I auf stumpf-endig umgewandelt. Nachdem SmaI-linearisierte pDOB513-DNA mit der stumpf-endigen cDNA gemischt und ligiert war, wurden die Ligationsprodukte in MC1061 transformiert. Die Plasmid-DNAs, die aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert waren, wurden durch Hybridisierung von Kolonie-Blots an eine AMV RNA4-Sonde gesichtet. Es wurde eine Kolonie identifiziert, die ein Plasmid mit der Bezeichnung pDOBA4I beherbergte und AMV cDNA zwischen den CaMV 19S transkriptionssteuernden Sequenzen eingesetzt hatte, die so orientiert waren, daß bei der Transkription eine aRNA synthetisiert werden würde; d.h. daß dds EcoRI Ende und eine interne BamHI Stelle distal zu dem Promotor und nachstliegend an den Transkript Terminator vorliegen. Eine Kombination von CaMV transkriptionssteuernden Sequenzen/AMV aRNA kann aus pDOBA4I auf einem 1,92 kbp Bgl II- Fragment entnommen werden.

Beispiel 5: Konstruktion von pH400, eines Mikro-Ti-Plasmids

pH4-1 ist ein Mikro-Ti-Plasmid, das von E. coli K802 (pH4-1) beherbergt wird, welches als NRRL B-18009 hinterlegt ist. pH4-1 ist von Sutton D.W. et al., US-Patentanmeldung Ser.Nr. 778.384 geoffenbart, vgl. auch Gray, L.E. et al., Plant Science (1986) 47:45-55, die hierin als Referenz angegeben sind, sowie von Merlo D. et al. (1985) Abstracts, 1st Int. Cong. Plant Mol. Biol., Hg.: Galau G.A.. pH4-1 enthält zwei T-DNA- Fragmente, ein HindIII Fragment, das die Positionen 602 und 2.290 überspannt (nach der Definition von Barker R.F. et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2:335-350) und den linken Rand von TL sowie Promotorsequenzen, die mit ORF1 assoziiert sind, trägt, und ein SmaI/BclI- Fragment, das die Positionen 11.207 bis 14.711 überspannt und ein 3'-deletiertes tml, ein intaktes ocs und einen rechten Rand von TL aufweist. Zwischen der HindIII-Stelle an der Position 3.390 und der SmaI-Stelle an der Position 11.207 (diese SmaI-Stelle war durch Einsetzen von BglIII-Linkern in eine BglII-Stelle umgewandelt worden) dieser beiden Fragmente befindet sich ein pflanzenexprimierbarer selektierbarer Marker. Dieser Marker hat einen Camv 195 Promotor, ein Tn5 Kanamycinresistenz-Strukturgen, das für Neomycin-Phosphortransferase II codiert, sowie zwei Polyadenylierungsstellen, eine von CaMV und eine andere von T-DNA ORF26, die von einem T-DNA-Fragment stammt, das die HincII-Stellen an den Positionen 21.727 und 22.440 überspannt. Das Kanamycinresistenz-Gen ist parallel zu ocs und tml und anti-parallel zu dem ORF1 Promotor orientiert. Die Kombination aus T-DNA/selektierbarem Marker wird in die HindIII-Stelle von pSUP106 eingesetzt, ein Plasmid mit einem 11 kbp weiten Wirtsbereich, das zur Aufrechterhaltung sowohl in E. coli als auch in Agrobakterium befähigt ist (Priefer U.B. et al. (1985) J. Bacteriol. 163:324-330; E. coli CSH52 (pSUP106) ist als NRRL B-15486 hinterlegt). Die T-DNA ist innerhalb des pSUP106 so orientiert, daß der TL rechte Rand nächst der pSUP106 EcoRI-Stelle liegt, die innerhalb des pSUP106 Chloramphenicolresistenz-Gens vorliegt.
pH4-1 hat zwei BglII Stellen, von denen beide den selektierbaren kan- Marker flankieren. Eine der All Stellen wurde wie folgt entfernt, wodurch eine singuläre BglII Stelle zurückblieb, die zur Einsetzung von externer Codierungs-DNA verwendbar war. pH4-1 DNA wurde durch teilweisen Abbau mit BglII linearisiert und lineare DNA mit voller Länge wurde elektrophoretisch isoliert. Die klebrigen Enden von BglII wurden dann durch Inkubieren mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA Polymerase I entfernt. Die entstehende stumpf-endige DNA wurde mit sich selbst ligiert und in E. coli transformiert. Die aus den Chloramphenicol-resistenten Transformanten isolierten Plasmid-DNAs wurden durch Restriktionsanalyse gesichtet und es wurde eine Kolonie identifiziert, die ein Plasmid mit der Bezeichnung ph400 beherbergte. ph400 war mit pH4-1 identisch mit der Ausnahme der Abwesenheit der BglII Stelle zwischen dem kan-Gen und dem ORF1-Promotor, wobei die singuläre ph400 BglII Stelle zwischen dem kan Gen und dem ocs-Gen angeordnet war.

Beispiel 6: Einsetzung eines AMV4 aRNA Gens in pH400

pDOBA4I DNA wurde mit BglII abgebaut und dann mit BglII-linearisierter ph400 DNA gemischt und ligiert. Nach der Transformierung in MC1061 und der Selektion auf Chloramphenicolresistenz wurden Kolonien geblottet und mit einer AMV RNA4 Sonde hybridisiert. Es wurde eine Kolonie identifiziert, die ein Plasmid mit der Bezeichnung pH400A4I beherbergte, und die ein aRNA-Gen in der pH400 BglII Stelle eingesetzt enthielt. pH400A4I hat ein aRNA-Gen, das AMV RNA4 Sequenzen voller Länge enthält, wobei das Gen parallel zu dem 3'-deletierten tml-Gen, dem ocs und dem selektierbaren Kanamycin-Marker orientiert war.

Beispiel 7: Pflanzentransformation

pH400A4I wurde auf A. tumefaciens L8A4404, (Ooms G. et al. (1981) Gene 14:35-50), einen ein vir-Gen beherbergenden Mikro-Ti-mobilisierenden Stamm, übertragen durch das triparentale Paarungsverfahren (Ruvkun G.B. und Ausubel F.M. (1981) Nature 289:85-88), das in der Fachwelt allgemein bekannt ist, oder durch Paarung aus einem mobilisierenden Stamm von E. coli, z.B. SM10 (NRRL B-15481) oder S17-1 (NRRL B-15483) (Simon R. et al. (1982) Biotechnol. 1:784-791). Tabakblattgewebe wurde von 4 Wochen oder 5 Wochen alten XanthiNC Pflanzen, die axenisch in Magenta- Boxen gezüchtet wurden, erhalten. Die Inokulierung erfolgte in einer Modifizierung des Verfahrens von Horsch R.B. et al. (1985) Science 227:1229-1231. Die Inocula wurden hergestellt, indem zwei Schleifen voll Agrobakterien in 10 ml L-Brühe eingebracht wurden. Nach der Suspendierung durch kräftiges Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette konnten die Inocula unmittelbar anschließend verwendet werden. Die Blätter wurden ausgeschnitten und die Mittelrippen entfernt; die eingeschnittenen Oberflächen wurden mit L- Brühe benetzt, um die Blätter feucht zu halten. Die BlaLtstücke hatten eine Breite von etwa 2-4 mm und eine Länge von etwa 7-10 mm. Die Blattstücke wurden 5 bis 10 Minuten in das Inoculum getaucht, obwohl bei manchen Versuchen die Blattstücke nur kurz in das Inoculum eingetaucht oder mit dem Inoculum in einer Vakuum-Flasche infiltriert wurden. Die Stücke wurden dann trocken auf sterilem Filterpapier geblottet und mit der Unterseite nach oben auf Fütterplatten aufgelegt, die mit einer Xanthi Suspensionskultur hergestellt worden waren. Die Fütterplatten hatten ein SMPi-Medium (SMPi: Mx&supmin; ergänzt mit 0,1 mg/l p-Chlorphenoxyessigsäure (pCPA) und 7,5 mg/1 6-(8,8-Dimethylallylamino)-purin (2ip); MX&supmin;: 1,65 g/l NH&sub4;NO&sub3;, 1,9 g/l KNO&sub3;, 440 mg/l CaCl&sub2;.2H&sub2;0, 370 mg/l MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 170 mg/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,83 mg/l KI, 6,2 mg/l H&sub3;BO&sub3;, 22,3 mg/l MnSO&sub4;.4H&sub2;0, 8,6 mg/l ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,25 mg/l Na&sub2;MoO&sub4;.2H&sub2;O, 0,025 mg/l CuSO&sub4;.5H&sub2;0, 0,025 mg/l CoCl&sub2;.6H&sub2;O, 1 g/l Inositol, 50 mg/l Nicoti nsaure, 50mg/l Pyroxidin HCl, 50 mg/l Thiamin HCl, 30 g/l Saccharose, pH 5,8, verfestigt mit 8 g/l Agar). Die Blattstucke wurden von den Futterplatten nach 4-6 Tagen abgenommen und auf SMPi-Medium, das erganzt war mit 500 mg/l Carbenicillin, 50 mg/l Cloxacillin und 100-300 mg/l Kanamycin (Optimum 200 mg/l), aufgebracht. Die entstehenden Sprossen wurden abgeschnitten und auf MX&supmin; Medium, das mit 100-300 mg/l Kanamycin (Optimum 200 mg/l) ergänzt war, aufgebracht.

Beispiel 8: Expression in Pflanzen

Regenerierte Tabakpflanzen, die Nachkommen von mit A. tumefaciens L8A4404 (pH400A4I) transformierten Zellen waren, waren selbstbefruchtend. Die entstehenden Samen wurden auf MX&supmin;, das mit 100-300 mg/l Kanamycin (Optimum 200 mg/l) ergänzt worden war, keimen gelassen, um Pflanzen auszuwählen, die die aRNA-Gen-tragende T-DNA enthielten. Die Anwesenheit von pH400A4I T-DNA wurde durch Southern Blot Analyse bestätigt. Die Anwesenheit von aRNA wurde durch Northern Blot Analyse bestätigt. Nicht-transformierte Vergleichs-Tabakpflanzen und aRNA-Gen-enthaltende Pflanzen werden durch Inokulieren mit allen vier AMV RNAs nach Abrasion der Blätter mit Carborundum, einer in der Fachwelt gut bekannten Methode, angegriffen. Unter diesen Bedingungen ist die Translation der AMV RNA4 Moleküle, die in dem Inoculum vorliegen, zur Errichtung einer AMV-Infektion notwendig. Beim Vergleich mit den Kontrollpflanzen wurde beobachtet, daß Pflanzen mit einem aRNA-Gen je nach dem Ausmaß der aRNA-Expression in den Geweben einer speziellen Pflanze gegen die AMV-Infektion resistent waren oder verminderte oder verzögerte Symptome aufwiesen.

Claims

1. Eine virusresistente Pflanzenzelle, ein solches Pflanzengewebe, ein solcher Pflanzensamen oder eine solche Pflanze, die uninfiziert durch ein Virus sind und ein stabil integriertes DNA-Molekül umfassen, das seinerseits einen Promotor, eine cDNA, codierend für anti-sense RNA zu mindestens einem Teil eines RNA Genoms eines Pflanzenvirus, das ein einzelstrangiges, plusstrangiges, dreiteiliges RNA-Genom aufweist, und einen Transkript-Terminator umfaßt, wobei die genannte cDNA für eine anti-sense RNA codiert, die imstande ist, einer Pflanze Virusresistenz zu verleihen, und wobei der Promotor, die cDNA und der Transkript-Terminator eine solche Position und Orientierung im Hinblick zueinander aufweisen, daß die anti-sense RNA in einer Pflanzenzelle unter der Steuerung des Promotors und des Terminators transkribiert werden kann.

2. Eine virusresistente Pflanzenzelle, ein solches Pflanzengewebe, ein solcher Pflanzensamen oder eine solche Pflanze, die uninflziert durch ein Virus sind und ein stabil integriertes DNA-Molekül umfassen, das seinerseits einen Promotor, eine cDNA, codierend für anti-sense RNA bis RNA4 von einem Pflanzenvirus, das ein einzelstrangiges, plusstrangiges, dreiteiliges RNA-Genom aufweist, und einen Transkript-Terminator umfaßt, wobei die genannte cDNA für anti-sense RNA codiert, die imstande ist, einer Pflanze Virusresistenz zu verleihen, und wobei der Promotor, die cDNA und der Transkript-Terminator eine solche Position und Orientierung zueinander haben, daß die anti-sense RNA in einer Pflanzenzelle unter der Steuerung des Promotors und des Terminators transkribiert werden kann.

3. Eine virusresistente Pflanzenzelle, ein solches Pflanzengewebe, ein solcher Pflanzensamen oder eine solche Pflanze, die uninfiziert durch ein Virus sind und ein stabil integriertes DNA-Molekül umfassen, das seinerseits einen Promotor, eine cDNA, codierend für anti-sense RNA bis RNA1, RNA2 oder RNA3 von einem Pflanzenvirus, das ein einzelstrangiges, plusstrangiges, dreiteiliges RNA-Genom aufweist, und einen Transkript- Terminator umfaßt, wobei die genannte cDNA für anti-sense RNA codiert, die imstande ist, einer Pflanze Virusresistenz zu verleihen, und wobei der Promotor, die cDNA und der Transkript-Terminator eine solche Position und Orientierung zueinander haben, daß die anti-sense RNA in einer Pflanzenzelle unter der Steuerung des Promotors und des Terminators transkribiert werden kann.

4. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der Anspruche 1, 2 oder 3, worin das Virus aus der Alfalfa -Mosaikvirus -Gruppe ist.

5. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach Anspruch 4, worin das Pflanzenvirus AMV ist.

6. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach Anspruch 4, worin das Pflanzenvirus AMV Stamm 425 ist.

7. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin das Pflanzenvirus aus der Gruppe bestehend aus einem Ilarvirus, einem Bromovirus, einem Cucumovirus und einem Hordeivirus ausgewählt ist.

8. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die anti-sense RNA komplementär zu einer viralen 5'-untranslatierten Sequenz ist.

9. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die anti-sense RNA komplementär zu einer viralen Translationsinitiationsstelle ist.

10. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die anti-sense RNA komplementär zu einer viralen 3'-konservierten Sequenz ist.

11. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die cDNA im wesentlichen eine cDNA voller Länge ist.

12. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Transkript-Terminator eine Polyadenylierungsstelle ist.

13. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach Anspruch 12, worin die Polyadenylierungsstelle eine CaMV Polyadenylierungsstelle ist.

14. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das genannte DNA-Molekül außerdem einen pflanzenexprimierbaren, selektierbaren oder durch Screening erfaßbaren Marker umfaßt.

15. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach Anspruch 14, worin der selektierbare Marker für Neoinycin-Phosphotransferase codiert.

16. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das genannte DNA-Molekül außerdem ein ocs-Gen umfaßt.

17. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das DNA-Molekül außerdem eine T-DNA- Randwiederholung umfaßt.

18. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach Anspruch 17, worin die T-DNA die T-DNA von pH400 ist, wobei pH400 durch Abtrennen der BglII-Stelle zwischen dem Kan-Gen und dem ORF1-Promotor durch partiellen Abbau von pH4-1 und Behandlung des volle Länge aufweisenden linearen pH4-1 mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA Polymerase I und anschließende stumpfendige Selbstligation gewinnbar ist.

19. Die Pflanzenzelle, das Pflanzengewebe, der Pflanzensamen oder die Pflanze nach Anspruch 18, worin die T-DNA die T-DNA von pH400A4I (NRRL B-18062) ist.

20. Die Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 19, um einer Pflanzenzelle, einem Pflanzengewebe, einem Pflanzensamen oder einer Pflanze Virusresistenz zu verleihen.

21. Die Verwendung eines DNA-Moleküls nach Anspruch 20, worin die Virusresistenz Resistenz gegen das AMV-Virus ist.

22. Die Verwendung eines DNA-Moleküls nach Anspruch 20, worin die Virusresistenz Resistenz gegen ein Virus ist, das aus der Gruppe bestehend aus einem Ilarvirus, einem Bromovirus, einem Cucumovirus und einem Hordeivirus ausgewählt ist.

23. Ein Verfahren zur Herstellung einer gegen ein Pflanzenvirus resistenten Pflanze, welches Verfahren die Transformation einer Pflanzenzelle mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 19 umfaßt.