JPH09168383A - アンチセンスｒｎａを有する耐ウイルス性植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウイルスmRNAに相補的なRNAの合成を指示す
る植物発現外来遺伝子を含有するべく植物の形質転換を
行うことによって、ウイルス抵抗性植物を生成する手段
を提供しすること。あるいは、このような植物発現RNA
を運搬する植物形質転換原核プラスミドベクター、およ
びこのようなベクターによって形質転換された植物細胞
を提供すること。 【解決手段】 目標の植物ウイルスのmRNAに相補的なア
ンチセンスRNA（aRNA）を含有する植物細胞を製造法す
る。ここで、aRNAを含有する植物細胞の製造に有用な方
法およびDNA分子が用いられる。さらに、aRNA遺伝子の
構築およびaRNA遺伝子を植物細胞へ移入する。ここで、
該細胞を、aRNAを含有していない細胞と比較すれば、目
標のウイルスによる感染に対するかなりの耐性を有す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学および
植物農業分野に関する。特に、ウイルスmRNAに相補的な
RNAの合成を指示する植物発現外来遺伝子を含有するべ
く植物の形質転換を行うことによって、ウイルス抵抗性
植物を生成する手段を提供する。さらに、このような植
物発現RNA を運搬する植物形質転換原核プラスミドベク
ター、およびこのようなベクターによって形質転換され
た植物細胞も提供する。

【０００２】

【従来の技術】

アグロバクテリウムの概論 グラム陰性属のアグロバクテリウム（Agro-bacterium）
のビルレント株は、A.tumefaciens 中にTi（腫瘍また
は、形質転換を引き起こす）プラスミド(pTi）を、そし
てA.rhizogenes中にRi（根を誘発する）プラスミド(pR
i）として知られている大きなプラスミドを有する。こ
れらはしばしば、それらが代謝したり、あるいは合成が
ひきおこされるオピンにより分類される。TiおよびRiプ
ラスミドは、両者共、T-DNA（転移DNA）として知られて
いるDNA 配列を含有している。これは、腫瘍中において
は、宿主植物のゲノムへ組み込まれることがわかってい
る。いくつかのT-DNA遺伝子は、構造上正準形の真核生
物プロモーターと類似しているT-DNA プロモーターの調
節下にある。これらのプラスミドもまた、T-DNA領域外
で、遺伝子を運搬する。TiおよびRiプラスミドは、数多
くの目的において、機能的に同等である。

【０００３】Agrobacterium により引き起こされる疾
患、植物形質転換、遺伝子工学および遺伝子発現につい
ての総論は、次の文献を含み、もしくは次の文献中に見
出される：Merlo DJ(1982) Adv. Plant Pathol. １：13
9-178 ；Ream LW およびGordonMP(1982) Science 218:8
54-859; Bevan MWおよびChilton M-D(1982)Ann. Rev. G
enet. 16:357-384；Kahl GおよびSchell J(1982)Molecu
lar Biology of Plant Tumors ；Barton KA およびChil
ton M-D (1983) Meth. Enzymol. 101 :527-539;Depicke
r A ら、（1983）、Genetic Engineering of Plants:an
Agricultural Perspective, eds. ：Kosuge Tら、pp.
143-176;Caplan Aら、（1983）Science 222 ：815-821;
Hall TC ら、ヨーロッパ特許出願第126,546 号；Binns
AN(1984) Oxford Surveys Plant Mol.Cell Biol.１：13
0-160; Hall TC(1985)Oxford Surveys Plant Mol. Bio
l. ２：329-338;Hooykaas PJJおよびSchilperoort RA
(1985)Trends Biochem. Sci. 10：307-309; Thomas TL
およびHall TC(1985)Bioassays ３：149-153 ; Weissbach A および Weissbach H, eds.
(1986) Meth. Enzymol.118 （特に、Rogers SG ら、p
p. 627-640 を参照されたい);Puhler A, ed.(1983) Mol
ecular Genetics of the Bacteria-Plant Interactio
n；およびSchilperoort RA(1984) in Efficiency in Pl
ant Breeding(Proc. 10th Congr. Eur. Assoc. Res. Pl
ant Breeding), eds.：Lange W ら、pp. 251-285。

【０００４】アグロバクテリウム(Agrobacterium）によ
る植物の形質転換 植物細胞は、既知のいくつかの方法を用いて、Agrobact
erium により形質転換され得る。最近の研究の総論で
は、Syono K(1984) Oxford Surveys Plant Mol.Cell Bi
ol.１：217-219 を参照されたい。

【０００５】Agrobacterium の植物組織への感染は、当
業者に既知の単純な方法である。典型的には、植物に傷
を付けた後、バクテリアの懸濁液を植物に接種する。あ
るいは、例えば、葉板(Horsch RBら.(1985) Science 22
7 :1229-1231）により組織片に接種を行う。野生型のAg
robacterium を用いた誘導後、腫瘍は、植物ホルモン非
依存性成長が可能となる。伝統的な接種および培養技術
は、ホルモン非依存性成長ができない無防備のT-DNA ベ
クターを使用するために、修正され得る（例えば、Zamb
ryski P ら、(1984)in Genetic Engineering, Princip
les, and Methods, ６、eds.：Hollaender AおよびSetl
ow J, pp. 253-278 を参照されたい）。

【０００６】Agrobacterium はまた、単離細胞、培地中
で生長した細胞、カルス細胞、および単離プロトプラス
トを感染させることが可能である（例えば、Fraley RT
ら（1984）Plant Mol. Biol.３：371-378 ；Fraley RT
および Horsch RB (1983) 、Genetic Engineering of P
lants:an Agricultural Perspective, eds.：KosugeT
ら、pp. 177-194; Muller A ら、(1983) Biochem. Biop
hys. Res. Comm. 123 :458-462）。接種されたカルス片
の形質転換頻度は、オピンまたはオピン前駆体の添加に
より上昇し得る（Cello LMおよびOlsen WL, 米国特許第
4,459,355 号）。

【０００７】クラウンゴール発生の宿主域は、onc 遺伝
子のようなT-DNA-コード化機能によって影響を受け得る
（Hoekema A ら (1984) J. Bacteriol. 158:383-385;Ho
ekema A ら(1984) EMBO J.３：3043- 3047 ; Buchholz
WCおよびThomasshow MF(1984) 160 :327-332;Yanofsky
M(1985) Mol. Gen. Genet. 201:237-246）。Vir遺伝子
もまた、宿主域に影響を与える（Yanofsky, 前出）。Au
sich RL,ヨーロッパ特許出願第 108,580号には、A.tume
faciens からのT-DNA の緑藻細胞への転移およびそこに
おけるocs およびTn５カナマイシン抵抗遺伝子の発現が
報告されている。Hooykaas-van Slogteren GMS ら、（1
984）Nature 311:763-764, およびHernalsteens J-P
ら、（1984）EMBO J. ３：3039-3041は、通常の腫瘍形
成を伴うことのないAgro-bacterium による単子葉植物
細胞の形質転換について述べている。

【０００８】形質転換された植物のT-DNA 、無防備の(d
isarmed) T-DNA 、および機能的外来遺伝子は、通常
は、優生的に密接に連鎖した、メンデルの法則で外観的
には変化せずに、減数分裂により子孫に伝達される（例
えば、Horsch RB ら、(1984) Science 223: 496-498;Te
pfer D (1984) Cell 37：959-967; DeBlock M ら、(19
84) EMBO J.３：1681-1689; Wostemeyer Aら、(1984)Mo
l. Gen. Genet. 194: 500-507;Wallroth Mら、(1986).
Mol. Gen. Genet. 202:6-15 を参照されたい）。２つの
非結合T-DNA は、単一細胞を形質転換させることが可能
であり、植物再生後、F1世代において分離され得る（de
Framond AJら、(1986) Mol. Gen. Genet.202 : 125-13
1)。

【０００９】TiプラスミドDNA T-DNAは、しばしば核の複数の部位において、宿主DNAへ
組み込まれる（すなわち、挿入される）。側面に位置す
る植物 DNAは、繰り返し、あるいは低コピー数配列であ
り得る。組み込まれたT-DNA は、直接もしくは逆方向直
列配列において見出され、スペーサーで分離され得る。
T-DNA もまた、葉緑体を形質転換させ得る（De Block M
ら、(1985) EMBO J. ４：1367-1372 ; Flavell RB（198
5）Bioassays ３：177-178 による総論を参照された
い）。

【００１０】ATCC 15955, pTi15955に見出されるオクト
ピン型プラスミドのT-DNA の完全な配列については、pT
iAch5 の TL 領域（Gielen Jら、(1984) EMBO J. ３：8
35-846)と同様に報告されている(Barker RFら、（198
3）Plant Mol. Biol.２：335-350)。発表されたT-DNA
遺伝子は、イントロンを含まない。正準形の真核生物プ
ロモーター要素およびポリアデニレーション部位に類似
した配列が認められ得る。

【００１１】オクトピンTiプラスミドは、オクトピンシ
ンターゼ（リソピンデヒドロゲナーゼ）をコードするoc
s 遺伝子を運搬する。Koncz C ら、(1983)EMBO J. ２：
1597-1603 は、ocs の機能的分析を提供している。Dhae
se Pら、(1983)EMBO J. ２：419-426,は、“転写７”(B
arker R ら、（前出）のORF3）およびocsによる種々の
ポリアデニレーション部位の利用を報告している。組織
中の酵素オクトピンシンターゼの存在は、アミノエチル
システインのようなさまざまなアミノ酸類似物の毒性効
果から、この組織を保護し得る(Dahl GAおよびTempe J
(1983) Theor.Appl. Genet.66：233-239;Koziel MGら、
(1984) J. Mol. Appl. Genet．２：549-562)。

【００１２】ノパリンTiプラスミドは、ノパリンシンタ
ーゼ遺伝子（nos ）をコードする(Depicker A ら、(198
2) J. Mol. Appl. Genet.１：561-573 により配列決定
された）。Shaw CH ら、（1984）Nucl. Acids Res.12：
7831-7846,は、nos の機能的分析を提供している。tms
およびtmr と同等な遺伝子は、ノパリン型プラスミド上
において確認されている（Willmitzer Lら、(1983) Cel
l 32：1045-1056)。

【００１３】T-DNA 領域外のTiおよびRiプラスミド遺伝
子は、vir 遺伝子を含有しており、これは、変異すると
無発病性のTiプラスミドとなる。trans におけるvir 遺
伝子機能は、異なったプラスミド型のT-DNA と共に、植
物細胞の形質転換をひきおこし得、これは、物理的に他
のプラスミド上に局在している。このような配置は、二
元システムとして知られ、T-DNA を有するプラスミド
は、一般的にミクロTiプロモーターとして知られてい
る。この二元システムおよびミクロTiプラスミドには、
次のものが包含される：Hoekema A ら、(1985) Plant M
ol. Biol. ５：85-89; Deblaere R ら、(1985) Nucl. A
cids Res.13：4777-4788;van den Elzen Pら、(1985) P
lant Mol. Biol. ５：149-154;Anderson DM,米国特許第
4,536,475号; de FramondAJら、(1983) Biotechnol.
１：262-269;Hoekema A ら、(1983) Nature 303 ;179-1
80;Hille Jら、(1984) J. Bacteriol.158 : 754-756 ;
Hoekema A ら、(1984) J. Bacteriol. 158 : 383-385;A
n G ら、(1985) EMBO J.４：277-284 ; Anderson DM 、
米国特許第4,536,475 号；Klee HJ ら、（1985）Biotec
hnol. ３：637-642)；de Framond AJ ら、(1986) Mol.
Gen. Genet . 202: 125-131;Dahl GA ら、ヨーロッパ特
許出願第140,556号；およびBevan M(1984) Nucl.Acids
Res. 12：8711-8721。T-DNA は、植物細胞を形質転換す
るために、プラスミド上にある必要はない；染色体に局
在しているT-DNA は、機能的である（Hoekema A ら、(1
984) EMBO J. ３：2485-2490)。T-DNA は、左および右
縁に関連する（例えば、T-DNA ／植物 DNA連結に関連す
る）約25の塩基対の直接的な繰り返しを有する。これ
は、Agrobacterium からの転移、あるいは宿主ゲノムへ
の組み込みのどちらかを包含し得る。Tiプラスミド決定
特性については、Merlo(前出）（特に、表IIを参照）、
および、Reamおよび Gordon(前出）により総論が述べら
れている。

【００１４】外来遺伝子発現 豆ファセオリンをコードする遺伝子は、転移され、ヒマ
ワリ腫瘍中に発現される(Murai Nら、（1983）Science
222 ：476-482)。このファセオリン遺伝子は、タバコの
種子を発育させる上で、高レベルで発現された（Sengup
ta-Gopalan Cら、（1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82：3320- 3324) 。同様な結果が、相同遺伝子、大豆
bata−コングリシニンについても観察されている（Beac
hyRNら、(1985)EMBO J. ４：3047-3053)。単子葉植物 Z
ea maysからの、胚乳タンパクゼインの遺伝子は、ヒマ
ワリのカルス組織中で転写される（Matzke MA ら、(198
4)EMBO J. ３：1525-1531)。豆RuBP-Case 小サブユニッ
ト遺伝子の発現は、形質転換されたペチュニア細胞中に
おいて光調節される。この生成された豆の小サブユニッ
トタンパクは、葉緑体内で正しくプロセッシングされ、
配列決定される（Broglie R ら、(1984) Science224 ：
838-843)。この光誘導性を包含する配列、および最大発
現に必要な配列は同定されている（Morelli Gら、(198
5) Nature 315：200-204 ; Nagy Fら、(1985) EMBO J.
４：3063-3068;Timko MPら、(1985) Nature 318 :579-5
82) 。小麦クロロフィルａ／ｂ結合タンパク遺伝子の発
現は、形質転換されたタバコ植物において、光調節さ
れ、そして器官特異的である（Lamppa Gら (1985) Natu
re 316 :750-752) 。大豆ヒートショック遺伝子は、ヒ
マワリの組織中において温度誘導性である（Schoffl F
およびBaumann G (1985) EMBO J.４：1119-1124)。（Dr
osophila melanogaster ヒートショックプロモーターも
同様に、タバコ組織において機能的である(Spena Aら、
(1985)EMBO J. ４：2739-2743)）。

【００１５】T-DNAプロモーターを有するキメラ遺伝子 nosプロモーターは、形質転換された植物細胞の選択に
有用な薬剤抵抗性構造遺伝子の発現を導くことができ
る。抵抗遺伝子は、カナマイシン（Bevan MWら、(1983)
Nature 304 :184-187;Fraley RTら、(1983) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 80：4803-4807;Herrera-Estrella L
ら、(1983)EMBO J. ２：987-995), メトトレキセート(H
errera-Estrella ら、（前出))、クロラムフェニコール
(Herrera-Estrellaら、(1983) Nature 303 :209-213),
ヒグロマイシンＢ（van den ElzenPJM ら、(1985) Plan
t Mol. Biol.５：299-302)に対してつくり出された。He
lmer Gら、(1984) Biotechnol.２：520-527 は、プロモ
ーターとE. coliベータ−ガラクトシダーゼ(lacZ)へ配
列融合された nosの構造遺伝子の5'−末端とを有する融
合遺伝子とをつくり出した。このスクリーニング可能な
マーカーを用いて形質転換された植物組織は、適切な色
素産生基質上で生育された場合、特徴的な色によって認
められ得る。

【００１６】osc構造遺伝子（これもまた、プロモータ
ーに与えられた）と、ヒグロマイシンＢ抵抗性およびフ
ァセオリン抵抗性のための構造遺伝子間の融合タンパク
がつくり出された。これらは機能的である（Waldron C
ら、(1985) Plant Mol. Biol.５：103-108, Murai N
ら、(1983) Science 222 : 476- 482)。ocs から誘導さ
れるグリフォセート遺伝子が構築されている(Comai L
ら、(1985) Nature 317 :741-744)。

【００１７】オクトピン TL 遺伝子ORF24 およびORF25
のプロモーターもまた、構造遺伝子の発現を誘導する(V
elten J ら、(1984) EMBO J.３：2723-2730;Velten Jお
よびSchell J (1985) Nucl. Acids Res.13：6981-6998;
Gelvin SB ら、(1985) Mol.Gen. Genet. 199 :240-248;
Comai L ら、(1985)Nature 317:741-744)。

【００１８】植物プロモーターを有するキメラ遺伝子 キメラRuBP-Case 小サブユニット／カナマイシン抵抗性
タンパクは、葉緑体内へ転移された(Vanden Broeck G
ら、(1985) Nature 313 :358-363) 。この遺伝子のプロ
モーターは、クロラムフェニコールおよびカナマイシン
抵抗性遺伝子に対するカルスにおいて光誘導性発現を与
える（Herrera Estrella Lら、(1984) Nature 310 :115
-120； Facciotti D ら、(1985) Biotechnol.３：241-2
46)。カルコンシンターゼプロモーターもまた、カナマ
イシン抵抗性遺伝子の光誘導性発現を誘導した（Kaulen
Hら、(1986) EMBO J.５：1-8)。クロロフィルａ／ｂ結
合タンパクプロモーターは、ocs およびカナマイシン抵
抗性構造遺伝子を発現するのに用いられてきた（Jones
JDG ら、(1985) EMBO J. ４：2411-2418 ; Simpson J
ら、(1985) EMBO J. ４：2723-2729)。

【００１９】ウイルス性プロモーターを有するキメラ遺
伝子 カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)プロモーターの制
御下におけるカナマイシン抵抗性遺伝子は、T-DNA によ
り形質転換された植物細胞中において発現された（Kozi
el MG ら、(1984) J. Mol. Appl. Genet.２：549-56
2)。CaMV 35Sプロモーターの背後のメソトレキセート抵
抗遺伝子は、メソトレキセート抵抗性与えた（Brisson
N ら(1984) Nature 310:511-514) 。タバコモザイクウ
イルス被覆タンパクは、CaMVプロモーターの制御下で、
形質転換されたタバコ組織中に発現されている（Bevan
MWら、(1985) EMBO J.４：1921-1926)。Odell JTら、(1
985)Nature 313:810-812, は、転写に必要なCaMV 35S
プロモーターの配列を地図化した。

【００２０】植物のAgrobacterium を用いない形質転換 植物細胞中への DNAの直接的な転移については、最近総
説が出されている（Jones MGK(1985) Nature 317 :579-
580;Potrykus I ら, (1985) Plant Mol. Biol.Reptr.
３：117-128;Howe C (1985) Trends Genet.１：38-39,
Paszkowski J および Saul MW (1986) Meth. Enzymol.
118:659-668;Power JB ら、(1986) Meth. Enzymol. 1
18 :578-594) 、双子葉および単子葉植物細胞のいずれ
もが、 nosあるいはCaMVプロモーターのどちらかの制御
下において、カナマイシン選択性マーカーにより、直接
的に形質転換され得る（Paszkowski Jら, (1984) EMBO
J.３：2717-2722;Gardner RCら, (1984) Plant Mol. Bi
ol. Reporter ２：3-8;Hain Rら, （1985) Mol. Gen. G
enet. 199 ; 161-168 ; Potrykus Iら, (1985) Mol.
Gen. Genet. 199 ：183-188;Lorz Hら, (1985) Mol. Ge
n. Genet. 199 :178-182;Shillito RDら, (1985) Biote
chnol. ３：1099-1103;Meyer P ら, (1985)Mol. Gen. G
enet.201 :513-518) 。異なった DNA分子は、植物細胞
中へ共形質転換され得る；混合物中のひとつの DNAが、
選択可能なマーカーを運搬するというのは有利なことで
ある（Peerbolte R ら, (1985) PlantMol. Biol.５：23
5-246)。このような形質転換された細胞から再生された
植物の子孫は、単一の優生のメンデルの特性として、こ
の形質転換ハイブリッド遺伝子を受け継ぐ（Potrykus
ら, Mol. Gen. Genet.,（前出）。

【００２１】CaMVは、植物形質転換ベクターとして有用
であることが証明されている（Brisson N ら, (1984) N
ature 310:511-514 ; Brisson NおよびHohn T(1986) Me
th.Enzymol. 118 : 659-668)。チャヒキ（Bromegrass）
モザイクウイルス(BMV),RNAウイルスもまた、外来構造
遺伝子を発現するために、植物中で使用され得る（Fren
ch Rら, (1986) Science 231：1294-1297)。

【００２２】エレクトロポレーション（Electroporatio
n)法は、一時的な発現システムにおける植物細胞中へ、
キメラ遺伝子を導入するために有用であることが証明さ
れている（Fromm Mら、(1985) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 82：5824-5828)。そして、トウモロコシ細胞の安
定した形質転換のためにも有用であることが証明されて
いる（Fromm MEら, (1986)Nature 319:791-793)。

【００２３】細胞は、膜で囲まれたDNAを取り入れ得
る。DNA（pTi DNA を包含する）は、リポソームにより
（例えばDeshayes Aら, (1985) EMBO J.４：2731-273
7),あるいは植物とバクテリア細胞のそれぞれの細胞壁
を除去した後、それらを融合することによって（例え
ば、Ham R ら, (1984) Plant Cell Rept.３：60-64)導
入され得る。植物プロトプラストは、細胞壁で区画され
たAgrobacterium細胞を取り込むことができる。T-DNA
は、融合された葉緑体から再生された組織へ転移され得
る。

【００２４】DNAは、微量注入（マイクロインジェクシ
ョン）により、植物ゲノム中へ安定して組み込まれ得る
（Crossway Aら, (1986) Mol. Gen. Genet. 202 : 179-
185)。

【００２５】受精あるいは受粉中の植物細胞への DNAの
導入については、Onta Y (1986) Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 83：715-719,およびZhou G-Yら, (1983) Meth.
Enzymol.101 :433-481によって、それぞれ、トウモロ
コシおよび綿について報告されている。

【００２６】AMVについての考察 アルファルファモザイクウイルス（AMV)は、３分割一本
鎖、正鎖RNA ゲノムを有する植物ウイルスのクラスのひ
とつである。このゲノム（サブゲノムRNA 分子を除く）
は、３つのRNA 分子に分けられる。このクラスには、次
のものが包含される：アルファルファモザイクウイルス
（AMV)群、アイラーウイルス（ilarviruses), ブロモウ
イルス（bromoviruses）、ククモウイルス（cucumoviru
ses)およびホルデイウイルス(hordei-viruses)（ van V
loten-Doting L ら, (1981)Intervirol. 15：198-203;M
atlhews REF (1982) ウイルスの分類および体系）。こ
のゲノム分節は、別々に、異なった長さのバチルス型粒
子に囲まれている。３つのゲノムRNA 成分（RNA1, RNA2
およびRNA3）の他に、ウイルス標本中に、４番目のサブ
ゲノムRNA (RNA4)が見出される。３つのゲノムRNA の混
合物および少量の被覆タンパクまたはそのメッセンジャ
ーとともに、感染を開始させるのにRNA4（Bol JFら（19
71）Virol.46：73-85)が必要である。

【００２７】完全な配列の AMV RNA4 が開示されている
（Brederode FTら, (1980). AcidsRes.８：2213-222
3)。RNA4は、その長さが 881ヌクレオチドである。コー
ド領域は、39ヌクレオチドの5'−未翻訳領域および 182
ヌクレオチドの3'−未翻訳領域が、側面に位置する 660
ヌクレオチドである（開始および終止コドンを含まな
い）。RNA4の配列は、RNA3の3'−末端に存在し、位置す
る（Gouold AR およびSymons RH(1978) Eur. J. Bioche
m. 91：269-278)。

【００２８】AMV RNA3の完全なヌクレオチド配列が開示
されている（Barker RFら, (1983)Nucl. Acids Res. 1
1：2881-2891)。 240塩基5'−非コード領域は、 903の
ヌクレオチド読み取り枠（ORF)に先行している。このOR
F の次には、49の塩基シストロン内領域および 666のヌ
クレオチドORF がある。この後者のORF は、AMV 被覆タ
ンパクをコードする。この被覆タンパク遺伝子の次に
は、179 塩基3'−未翻訳配列がある。AMV RNA4は、RNA3
の3'末端と同一であり、それによって決定され、シスト
ロン内領域の36ヌクレオチド、被覆タンパク構造遺伝
子、および3'−未翻訳配列を有する。

【００２９】AMV RNA1の完全なヌクレオチド配列が開示
されている(Cornelissen BJCら, (1983) Nucl. Acids R
es. 11：1253-1265)。RNA1は、その長さが3645ヌクレ
オチドであり、99ヌクレオチドの5'−未翻訳配列および
163ヌクレオチドの3'−未翻訳領域が側面に位置する M
r 125,685 のタンパクのORF を含有する。

【００３０】これらの４つのAMV RNA すべての3'−末端
配列の比較は、3'末端 140〜150 ヌクレオチド間で大き
な相同性を示す（Houwing CJおよびJaspars EMJ (1978)
Biochem. 17：2927-2933)。AMV RNA の3'−末端 145ヌ
クレオチドにおいて、およそ20の塩基置換がある；これ
らは、塩基対構造のループ中に位置するか、または、A-
U 塩基対が、二次構築ヘアーピンの幹におけるG-C 塩基
対へ変換されている（Koper-Zwarthoff ECら, (1979) N
ucl. Acids Res.７：1887-1900)。

【００３１】アンチセンス RNA Sequeira L (1984) Trends Biotechnol. 2 :25- 29は、
交叉防御および誘導抵抗性について論評している。Steb
bing N (1979) Pharmac. Ther. 6 :291-332 は、ウイル
ス RNAの配列に基づく抗ウイルス剤の設計および一本鎖
核酸の抗ウイルス効果について論評している。Weintran
b H ら（1985）Trends Genet. 1 : 22-25 は、遺伝分析
に対してアンチセンス RNAを用いた報告で公表されたも
のおよび未公表のものについて論評している。Travers
A (1984) Nature 311 : 410 および Laporte DC (1984)
Trends Biochem. Sci. 9 : 463はアンチセンス RNA
（aRNA）の調節に関する役割について論評している。

【００３２】自然界において、アンチセンス RNAまたは
相補RNAは調節的に機能し得る。E.coliにおいて、174 b
ompC RNAはompF発現を調節する。アンチセンス RNA
は、リポソームと接触しそうなmRNA領域におそらく結合
するであろうが、遺伝子発現を減少させるのに最も効果
的であると思われた。（Mizuno Tら（1984）Proc. Nat
l.Acad. Sci. USA 81 :1966-1970 ; Coleman J ら（19
84）Cell 37 : 429-436)相補 RNAは DNAの複製を抑制
し得る。（Tomizawa J ら（1981）Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 78 :1421-1425 ; Tomizawa Jおよび Itoh T
(1982) Cell31 : 575-583）。

【００３３】インビトロでは、E. coli 16Sリポソーム
RNAの3'末端領域の５程度のわずかなヌクレオチドに相
補的なオリゴヌクレオチドは、細菌ウイルスのmRNAの翻
訳開始を抑制し得る。（Eckhardt Hおよび Luhrmann R
(1979) J. Biol. Chem. 254: 11185-11188 ; Jayaraman
K ら（1981）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 1537
-1541 ; Taniguchi TおよびWeissmann C (1978) Nature
275 : 770-772)。

【００３４】mRNAのインビトロ翻訳は、mRNAが相補 DNA
（cDNA）と混合され、核酸のアニーリング条件を受ける
ならば、抑制され得る；mRNAおよびcDNAのアニールされ
ていない混合物は翻訳され得る（Paterson BM ら（197
7）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 4370-4374) 。
植物のウイルス RNA断片のインビトロ複製は、この RNA
断片がcDNAと混合され、アニーリング条件を受けるなら
ば、抑制され得る； RNA断片およびcDNAのアニールされ
ていない混合物は複製され得る。（Ahlquist Pら（198
4）Plant Mol. Biol. 3 : 37-44)。

【００３５】ニワトリ肉腫ウイルスの複製および細胞の
形質転換は、5'末端および3'末端リピートの13ヌクレオ
チドに相補的なオリゴヌクレオチドの添加により抑制さ
れる。（Zamecnik PC およびStephenson ML (1978) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 75:280-284)。

【００３６】グロビンaRNAはグロビンmRNAとともに卵母
細胞の細胞質に注入された場合、グロビンmRNAの翻訳を
抑制した。このaRNAは、mRNAとともに注入された場合ま
たはそれ以前に翻訳を抑制した。aRNA：mRNAハイブリッ
ドは、全長の二重鎖として期待されるよりも非常に短い
にもかかわらず、卵母細胞中で形成されるようであった
（Melton DA (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82
: 144-148）。結果は二次構造がハイブリッドを形成す
る核酸の領域を限定し得ることを示唆している。

【００３７】ウイルスのアンチセンス RNA配列の生産
は、対応するバクテリオファージによる感染に対して部
分的に保護されたE. coli細胞について示されている。
リポソーム結合部位に相補的な配列は、構造遺伝子の3'
末端および3'未翻訳領域に相補的な配列より効果的な抑
制遺伝子であった。（Coleman Jら（1985）Nature 315:
601-603）。

【００３８】アンチセンス RNAはマウス細胞の一過性発
現系統における遺伝子の発現を減少させ得る。単純疱疹
ウイルス（HSV)チミジンキナーゼ（TK）遺伝子およびこ
の遺伝子に対して 100倍以上の修飾を有する遺伝子（こ
れらはフリップしたタンパクコード化配列を持ち、従っ
て TK aRNAがコード化される）が、TK- 細胞にともに注
入された場合、TK活性は４倍低下することが観測され
た。（Izant JGおよび Weintraub H (1984) Cell 36 :
1007-1015）。

【００３９】マウス細胞におけるラック（Lac)遺伝子発
現は、aRNA遺伝子とともに１：１またはより高い比率
（遺伝子：aRNA遺伝子）で形質転換された場合、10倍低
下することが観測された。（Rubenstein JLRら（1984）
C. R. Acad. Sci., Paris 299:271-274)。

【００４０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物におけ
るウイルス感染の発生および経済的に重要な植物種にお
けるこれらの感染に対して奮闘する園芸家および農学者
の努力に関する。ウイルス感染は、すべての既知の植物
種において発生し、そしてすべての農業的および園芸的
植物種の収穫および品質に著しい減少をもたらす。この
ようなウイルスによって起こる損害を免れる植物産業
は、世界中のいかなる国にもみられず、またこのような
ウイルス感染を処理したり、あるいは防御したりする一
貫した治療法も知られていない。例えば、ケニヤのカサ
ヴァ植物の90％は、カサヴァモザイクウイルスに感染し
ており、そのことにより収穫が75％減少していると推定
されている。別の例としては、ガーナにおける最近のウ
イルス性伝染病で１億以上のカカオの木が、スウォーレ
ンシュート（swollen shoot)ウイルスの感染によって失
われた。ウイルス性伝染病および感染が、大きな経済的
重要性を有することを明らかに得る他の例が数多く存在
する。食糧作物の収穫の減少も、着実に増加する世界の
人口およびすでに存在する慢性的な栄養不良に関連して
いる。従って、耐ウイルス性植物遺伝子型を生成する方
法およびその結果得られる植物自体の両方が、世界の自
給自足の能力を増大させるために、極めて有用であるこ
とは明らかである。

【００４１】特に、アルファルファモザイクウイルス
が、作物収穫の重大な減少をもたらすことが示されてい
る。AMV は、アルファルファおよび他の一年生マメ科作
物を感染させる。このことは、経済的に重要なことであ
る；合衆国だけでも約３千万エーカーにアルファルファ
が植えられている。アルファルファモザイクウイルス
は、さらに胡椒、馬鈴薯、セロリ、エンドウ豆およびイ
ンゲン豆のような作物植物において、経済的に重大な病
気をもたらす。アルファルファは、ありまきがウイルス
を運搬する越年性の宿主であり得る。このありまきの感
染の形成に続いて、この病気は、さらにアルファルファ
から他の品種植物へと広がる。多くの場合、AMV に感染
した植物は、何ら症状を示さないため、この病気の発生
およびその拡がりを検出するのが困難である。その他の
場合、このモザイク病は明らかになるが、それまでにこ
のウイルスは、ほとんど確実に田畑の大部分の植物に広
がっている。

【００４２】感染した植物の除去、およびウイルスを運
搬するありまきを殺すための殺虫剤の使用は別にして、
AMV の広がりを防ぐために開発された実際的な方法はな
い。従って、耐 AMV性遺伝子型を生成する方法およびそ
の結果得られる植物の両方であれば、数多くの作物の農
業的生産性を高めるために極めて有用であることは明ら
かである。

【００４３】従って、新規の耐ウイルス性遺伝子を有す
る植物を提供すること、特に AMV感染に対して耐性を有
する植物を提供することが、本発明の目的である。この
目標に向けて、耐ウイルス性遺伝子を生成するための方
法、特にウイルス複製のアンチセンスRNA による抑制が
提供される。さらに、耐ウイルス性発現型を有する植物
材料のもとになるaRNA遺伝子を含有する植物、植物細
胞、植物組織および植物種子が提供される。さらに、こ
のような耐ウイルス性植物を生成するために有用なDNA
分子についても述べられる。本発明は、アルファルファ
モザイクウイルスの被覆タンパクのメッセンジャー RNA
に相補的なaRNA遺伝子をタバコに挿入することにより例
証される。

【００４４】アンチセンス RNAは、いくつかの非植物系
において遺伝子発現に影響を及ぼすことが示されている
が、植物において影響を及ぼすことは全く示されていな
い。ウイルスaRNAの存在が植物をウイルス感染から保護
し得ない多くの理由が存在する。ウイルスaRNAは、核中
に本来見い出されないRNA である；ウイルスaRNAはその
ような環境では安定に存在し得ない。aRNAの蓄積のレベ
ルが非常に低く感染を抑制し得ない。aRNAはウイルス感
染が開始されるかまたは継続されるような細胞の一部分
に蓄積し得ない。ウイルスaRNAは植物の細胞質中で安定
に存在し得るが、ウイルスaRNAはウイルス感染していな
い植物の細胞質中では安定に存在し得ない。ウイルス感
染は、aRNAがウイルス RNAにアニールするより速く確立
されるようになり得る。ウイルスの生活環を干渉するの
に十分なレベルまでウイルスのaRNA分子を蓄積すること
は、植物細胞に対して有毒であり得る。実際、aRNA遺伝
子の存在は植物に対して障害であり得る。

【００４５】

【課題を解決するための手段】本発明のDNA 分子は、プ
ロモーター、ウイルスcDNAをコードするaRNAおよび転写
ターミネーターを有するDNA 分子であって、該プロモー
ター、該cDNAおよび該ターミネーターは該プロモーター
および該ターミネーターの制御のもとで該aRNAが動物細
胞内で転写されるような相互の位置および方向を有す
る。

【００４６】本発明のバクテリア細胞は上記DNAを含有
する。

【００４７】本発明の植物細胞、植物組織、植物種子ま
たは植物は、上記DNA を含有する。この植物細胞、植物
組織、植物種子または植物は、ウイルスに感染せず、該
ウイルスのmRNAに対するaRNAを含有する。

【００４８】本発明の耐ウイルス性植物を生産する方法
は、該方法はaRNAをコードするウイルスcDNA分節を作る
こと、および該cDNA分節をプロモーターDNA分節に連結
することを包含し、該プロモーター、該cDNAおよびター
ミネーターは該プロモーターの制御のもとでaRNAが転写
されるような相互の位置および方向を有する。

【００４９】本発明の植物細胞、植物組織、植物種子ま
たは植物は、上記方法によって生産される。

【００５０】

【発明の実施の形態】本明細書および特許請求の範囲に
おけるその利用の意図または範囲に対して不明確さをな
くすために、以下の定義が与えられる。

【００５１】プロモーター：プロモーターとは、転写の
開始に関与する構造遺伝子の5'末端における配列を言
う。植物−発現性プロモーターは、少なくともひとつの
発生段階における少なくともひとつの型の植物細胞にお
いて、転写を行い得るプロモーターである。真核プロモ
ーター配列は、通常、正準型5'・・・ TATAA ・・・ 3'
（約10〜30塩基対（bp））、すなわちmRNAの5'末端の5'
位（キャップ部位）、に対して相同なDNA 配列の存在に
よって、認識される。約30bpを有する TATAA（別のプロ
モーター配列）の5'位が正準型5'・・・ CCAAT ・・・
3'と相同なDNA 配列の存在によって認識されることがし
ばしば見出されている。

【００５２】転写ターミネーター：転写ターミネーター
とは、ここでは、転写の3'末端の位置を決定し得る核酸
配列を言う。転写ターミネーターDNA 断片は、それ自体
が、天然に存在するかあるいは合成的、原核性あるいは
真核性の複数の起源から導かれる断片の複合物であり、
かつゲノムDNA またはmRNA由来cDNAからのものであり得
る（mRNA：メッセンジャーRNA)。転写終了部位には、ポ
リアデニル化部位およびリボソームRNA (rRNA)、移入RN
A (tRNA)および非ポリアデニル化mRNAの3'末端を決定す
る部位が含まれている（例えば、ヒストンmRNA；Krieg
PAおよび Melton DA (1984) Nature 308:203-206）。

【００５３】ポリアデニル化部位は、真核生物における
転写のポリアデニル化と相関する核酸配列である。すな
わち、転写終了後にポリアデニル酸“尾”を、mRNA前駆
物質に添加する。転写の5'から3'末端までの長さの変
化、部分的“読み過ごし”および多重の縦性正準型配列
は珍しくないが、ポリアデニル化部位は一般的に正準型
5'・・・ AATAAA ・・・ 3' に対する相同体の存在によ
って認識される。転写3'末端から下流に20および35bp間
のDNA 配列が、必要であると思われる（McDevittMA
ら、(1984) Cell 37: 993-999)。正準な“ポリアデニ
ル化部位”は、実際には、mRNAの3'末端の位置を決定し
得そしてポリアデニル化自身を決定し得ないということ
が認識されるべきである（ Proudfoot N (1984) Nature
307: 412-413; Birnstiel MLら、(1985) Cell 41: 34
9-359 ）。

【００５４】配列を制御する転写：配列を制御する転写
とは、構造遺伝子の側面に位置するプロモーター／転写
ターミネーター部位の組み合わせを言う。特定の外来構
造遺伝子の側面に位置するプロモーターおよびターミネ
ーターDNA 配列は、同じ起源遺伝子（例えば、２つの異
なるT-DNA 転写の対合）あるいは同じ分類上の起源（例
えば、植物、動物、菌類、酵母、真核ウイルス、バクテ
リアおよび合成配列のような非T-DNA 起源の配列を有す
るT-DNA の対合配列）に由来する必要はない。

【００５５】アンチセンスRNA (aRNA)：アンチセンスRN
A とは、ここでは少なくとも一つの目標ウイルスのmRNA
（センス）配列に対して一部または全部が相補的である
ようなRNA を言う。目標ウイルスは、それに対して耐性
が望まれるようなウイルスである。aRNAによって補足さ
れてなる目標ウイルス配列は、全長の目標ウイルスのmR
NAまたはその一部分からなり得る。この一部分はコード
化領域、翻訳開始部位および／または5'領域、3'領域ま
たは内部の未翻訳領域からなる。aRNAは、複数の異なる
ウイルスに対して相補的な配列を含有し、そのことによ
り複数のウイルスの各々に対する耐性を授与する。aRNA
自身はmRNAとして機能してもしなくてもよい。

【００５６】アンチセンスRNA 遺伝子（aRNA遺伝子）：
アンチセンスRNA 遺伝子とは、ここではプロモーター、
aRNA（ウイルスcDNA）を決定するDNA 配列および転写タ
ーミネーターのことを言う。これらのプロモーター、ウ
イルスcDNAおよびターミネーターは、プロモーターの制
御の下でaRNAが植物細胞内で転写され得るような相互の
位置および方向を有する。言い換えれば、aRNA遺伝子
は、ウイルスmRNAに相補的なRNA からなるRNA を表す。
aRNA遺伝子は、天然に存在するかまたは合成的な複数の
起源から導かれる断片の混合物であり得る。aRNA遺伝子
の転写は、原核DNA 、真核DNA 、エピソームDNA 、プラ
スミドDNA 、プラスチドDNA 、ゲノムDNA 、cDNA、ウイ
ルスDNA 、化学的に合成されたDNA などから全体または
部分的に導かれた配列を含み得る。さらに、aRNA遺伝子
が転写制御配列、転写された配列またはウイルスcDNAの
いずれかにおいて１またはそれ以上の修飾を含み得るこ
とが期待される。これらの配列またはウイルスcDNAは、
上記aRNAの生物学的活性または化学的構造、発現率また
は発現制御の方法に影響を及ぼし得る。このような修飾
は、１またはそれ以上のヌクレオチドの突然変異、挿
入、欠失および置換、そしてaRNAの機能は変更しないが
aRNAの細胞間の局在化、輸送または安定性に影響を及ぼ
す修飾を含むが、これらに限定されることはない。aRNA
をコードするDNAは、連続的なaRNA配列を決定し得る。
あるいは適当な植物−機能的接合部分によって結合した
１またはそれ以上のイントロンを含み得る。これらのイ
ントロンは、合成的または天然に存在する起源から得ら
れる。

【００５７】cDNA（相補DNA ）：この用語は、当該技術
分野において良く理解されているが、次にあげる２つの
意味を有する。1)cDNAは、RNA （例えば、ウイルスmRN
A）に相補的な単鎖DNA であり得る。2)cDNAは、二重鎖D
NA 断片であり得る。この二重鎖のうちの一方はRNA に
相補的であり、他方は上記RNA と同等の配列を有する鎖
である（ＵをＴに置き換えたもの）。一般的に、二重鎖
cDNAは、単鎖cDNAから導かれる。しかしながら、ここで
定義されるように、mRNA配列をコードする二重鎖DNA 、
例えば構造遺伝子のDNA は、cDNAという用語の中に包含
される。特許請求の範囲内でcDNAは常に二本鎖の形で言
及する（意味2)）。この明細書においては、cDNAの意味
は、前後関係から定義され、当業者によって良く理解さ
れる。

【００５８】正鎖ウイルス：正鎖ウイルスとは、ウイル
スのmRNAの配列と同等の配列を持つゲノムを有するウイ
ルスのことを言う。すなわち、ウイルス粒子中に見出さ
れるRNA は、ウイルスmRNAに相補的ではない。正鎖ウイ
ルスのウイルスRNA は、しばしばmRNAとして働き得る。
AMV は、正鎖ウイルスのひとつの例である；AMV ビリオ
ン中に見出される４つのRNA の各々が、mRNAとして働き
得る。

【００５９】トリパータイトRNA ゲノム：トリパータイ
ト（Tripartite）RNA ゲノムとは、RNA ゲノムとは、ウ
イルスの遺伝物質の構成のことを言う。“ゲノム”と
は、ウイルスの全遺伝物質のことを言う。“RNA ゲノ
ム”とは、ビリオン中（ウイルス粒子）に存在するよう
に、ゲノムがRNA 型であることを言う。トリパータイト
は、ゲノムが３つの独立したRNA 分子に分離されること
を示す。トリパータイトRNA ゲノムを有するウイルスの
一例はAMV である。AMV のゲノムは、AMV RNA 1, 2およ
び３によって運搬される。RNA ４の配列は、完全にRNA
３に含有され、RNA ４は、複製されない；従って、RNA
４は、サブゲノムRNA と呼ばれ、ゲノムRNA のひとつと
してはみなされない。

【００６０】翻訳開始部位：翻訳開始部位とは、ここで
は、構造遺伝子の5'末端における5'AUG3' 翻訳開始コド
ン、AUG に続くヌクレオチドおよび AUGに先行する３ヌ
クレオチドのことを言う（Kozak M (1983) Microbiol.
Rev.47: 1-45, およびKozak M (1984) Nucl.Acids Res.
12: 857-872 を参照のこと）。

【００６１】5'未翻訳配列：5'未翻訳配列とは、ここ
で、mRNA、またはその5'末端（または“キャップ部
位”）および翻訳開始コドン間の転写のことを言う。

【００６２】3'保留配列：3'保留配列とは、ここではす
べてのゲノム成分に対して同一であるような非ポリアデ
ニル化分節DNA ゲノムの3'末端にある配列のことを言
う。AMV 3'保留配列は、すべての４AMV RNA の3'末端か
ら約 145のヌクレオチドを拡張している。

【００６３】本質的な全長cDNA：本質的な全長cDNAと
は、ここでは、全mRNAに相補的であるcDNAを言うが、お
そらくmRNA配列のいずれかの末端における数個の（例え
ば、約５つの）ヌクレオチドは除かれる。

【００６４】植物−発現性選択可能またはスクリーン可
能なマーカー：このマーカーは、ここでは、植物細胞に
おいて機能的な遺伝マーカーのことを言う。選択可能な
マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子）は、その
マーカーを含みそして発現する細胞をそのマーカーを発
現しない細胞の生長には好ましくない条件下で生長させ
る。スクリーン可能なマーカー（例えば、ベーターガラ
クトシダーゼ遺伝子）は、このマーカーを発現する細胞
の同定を容易にする。

【００６５】形質転換：形質転換とは、細胞にその本来
の部分ではない核酸分子または配列を含有するようにさ
せる作用のことを言う。

【００６６】植物組織 植物組織は、植物の分化および未分化組織を含む。この
植物は、根、苗条、花粉、種子、腫瘍組織（例えば、根
頭癌腫）および、栽培中の植物細胞のさまざまな形の集
合体（例えば、胚および癒合組織）を包含するが、これ
らに限定されるものではない。

【００６７】植物細胞：ここで用いられているように、
植物細胞はインプランタの植物細胞および栽培中の植物
細胞およびプロトプラストを包含する。

【００６８】以下の言葉は、当該技術分野で既知であ
り、ここでは、詳細にまたは特別に定義されていない：
単鎖、ゲノム、アルファルファモザイクウイルス群（Ma
tthewsREF (1982) Classification and Nomenclature o
f Viruses, P.177を参照のこと）、Tobamovirus (Matth
ews 、前出、PP.158-159を参照のこと）、CaMV 19Sプロ
モーター（Hohn Tら (1982) Curr. Top. Microbiol. Im
munol.96: 193-236 を参照のこと）、オクトピン型T-DN
A （位置、配向およびORFsは、Barker RF ら (1983) Pl
ant Mol. Biol. 2: 335-350 によって命名されたように
定義されている）、T-DNA ボーダー反復、プロモーター
の制御下の転写、結合、子孫、および構造遺伝子。

【００６９】aRNAを発現する遺伝学的に修飾された細胞
を生成するには、本発明に開示の特異的な方法が、当業
者に公知の種々の方法および手段と組み合わされる。ほ
とんどの場合、全過程の各段階に、代わりの手段が存在
する。手段の選択は、次のような変動要因に依存する。
すなわち、この変動要因には、抵抗性が必要な特別なウ
イルスの選択、被覆タンパク遺伝子の導入およびその安
定な維持のための基準ベクターシステム、修飾され得る
植物品種、所望の再生戦略、用いられる特定の転写制御
配列、aRNA遺伝子の転写によってなる特定のウイルス配
列などがある。これらの全てが、別の過程段階に存在す
る。所望の結果を達成するために、この段階は、当業者
が選択され得、使用可能である。植物細胞における外来
DNA の安定した挿入および転写のために、新しい方法が
開発されると、当業者は、所望の結果を達成するため
に、これらの代わりの過程段階の間で選択され得るだろ
う。本発明の根本的な局面は、形質転換された植物のウ
イルス感染に対する抵抗性を与えるためのaRNAの性質お
よびその使用である。他の局面では、aRNA遺伝子配列の
性質や構造、および植物ゲノムにおけるその挿入手段や
発現手段が含まれる。遺伝的に修飾された植物を得るた
めのより好ましい実施態様の残りの段階には、aRNAをT-
DNA に挿入すること、修飾されたT-DNA を植物細胞に転
移すること、が含まれる。この植物細胞では、修飾され
たT-DNA は、植物細胞ゲノムの一部として安定に組み込
まれる。インビトロ培養および全植物への最終的な再生
のための方法には、形質転換された植物細胞の選択段階
および検出段階、導入されたaRNAを、最初に形質転換さ
れた株から、市販の適当な栽培品種に移植させる段階、
および、形質転換された植物における発現を検査する段
階が含まれている。

【００７０】aRNAの構築のための出発点は、ウイルス配
列のDNA クローンを得ることである。このウイルスがDN
A ウイルスであれば、このDNA クローンは、公知の組換
え型DNA 方法を用いて得られる。このウイルスがRNA ウ
イルスであれば、cDNAクローンは、所望のウイルス配列
から作られるべきである。cDNAクローンを作るための数
多くの方法が組換え型DNA 技術において公知である。方
法の選択は、ポリアデニル化、RNA の長さ、RNA 配列に
ついてあらかじめわかっている情報、他のcDNAクローニ
ング実験に関する特別な研究についての前調製などのよ
うな変動要因に依存すると思われる。クローン化ウイル
ス配列はaRNA遺伝子の必要な成分である。

【００７１】より好ましい実施態様における本発明の主
な特徴は、植物−発現性の転写を制御する配列（すなわ
ち、これらの用語が前記で定義されているように、プロ
モーターと転写ターミネーターとの間での転写）の制御
下において、挿入された遺伝子を有するT-DNA 誘導体の
構築である。aRNAコード化DNA は、このプロモーターに
関して、正しい位置および方向に挿入されなければなら
ない。位置は、aRNAコード化DNA が挿入される側の位置
に関連している。大部分のプロモーターが、DNA に沿っ
た方向のみにおいて、転写および翻訳の開始を制御する
ことが知られている。プロモーター制御下に存在するDN
A の領域は、“下流側制御”あるいは、プロモーターの
“背部”もしくは“3'方向に”のどちらかで存在すると
言われている。従って、プロモーターによって制御され
るように、aRNAコード化DNA の正しい位置は、プロモー
ターから“下流側”とされるべきである。方向とは、構
造遺伝子の方向性を意味する。ウイルス性被覆タンパク
のアミノ末端をコードするウイルスmRNAに相補的なaRNA
コード化DNA の部分は、aRNAコード化DNA の3'−末端で
終了する。他方、このタンパクのカルボキシル末端近く
のアミノ酸をコードするウイルスmRNAに相補的な末端
は、aRNAコード化DNA の5'−末端で終了する。言い換え
れば、aRNAコード化DNA の5'末端および3'末端は、それ
ぞれウイルスのmRNAの3'末端および5'末端をコード化し
た。DNA をコードするaRNAコード化DNAの正しい方向
は、プロモーターに対する5'−末端基部とともにある。
同様に、このプロモーター領域に対して、転写ターミネ
ーターは、aRNAと関連する正しい位置および方向に位置
ぎめされるべきである。この位置および方向はこのaRNA
の3'−末端に対する基部である。aRNA遺伝子発現あるい
は発生制御の速度の相違は、特定のaRNA成分、プロモー
ター、転写ターミネーター、側面のDNA 配列、あるいは
形質転換された植物ゲノムへの挿入部位に依存して、観
察され得る。aRNA転写の蓄積も、aRNA二次構造の詳細、
特に幹ループ（stem-loop)構造によって、大きく影響さ
れ得る。発現されたaRNA自体の安定性、細胞内局在化、
転写後のプロセッシングのような特性、および他の機能
的な特性を含む（しかし、これに限定されない）異なっ
た特性は、aRNA遺伝子の成分を変えた場合に観察され得
る。このような変化は、全て、植物細胞、植物組織およ
び全植物中の所望の物理学的特性に依存して、ウイルス
抵抗発現型の機能的特性を処理し、制御する多くの機会
を提供する。

【００７２】本発明の根本的原理は、植物細胞中のアン
チセンスRNA 配列の存在が、その細胞に対する少なくと
もあるレベルのウイルス抵抗性を与え得ることである。
ウイルス配列の分節をaRNAに含めるべき要求は、機能上
の言葉で最もよく言い表される。細胞中にaRNAが存在す
れば、１またはそれ以上のウイルス機能を干渉すること
により耐ウイルス性が授与される。このような機能は、
ウイルスタンパクの翻訳、ウイルスRNA の転写、ウイル
ス核酸のエンキャップシデーション（encapsidation)な
どを包含し得る。aRNAは、おそらくウイルスの正鎖分節
に対してアニールするかまたはウイルスの生活環に含ま
れる少なくとも１つのタンパクを結合させることにより
干渉する。aRNAは全長のウイルス配列を含む必要はな
い；ウイルスの正鎖分節に相補的であり、ウイルスの機
能を干渉することが可能な配列分節で十分である。言い
換えれば、ウイルスの機能を干渉することが可能な少な
くとも１つのウイルス配列の存在がaRNA中に要求され
る。そしてこのような干渉が不可能なウイルスの配列分
節はRNA の安定性、細胞の局在化などについて議論すれ
ば不要となり得る。いくつかの異なるウイルスからのウ
イルス配列（各配列はaRNAとして機能し得る）を組み合
わせて、これらのいくつかのウイルスの各々に対して抗
ウイルス活性を有するaRNAを形成し得る。

【００７３】定義されたように、aRNAは、非ウイルス性
配列を含み得る。十分な長さのウイルス性配列が含まれ
ている場合でさえ、aRNAは、非ウイルス性配列を含有し
得る。ふつうは、これらの非ウイルス性配列は、このaR
NAの5'−末端および3'−末端に存在する。しばしば、こ
れらの非ウイルス性成分は、プロモーターあるいは転写
ターミネーターのDNA 分節から誘導される。種々の非ウ
イルス性配列の介在物は、RNA 安定性、aRNAの細胞局在
性、転写後のプロセッシングなどに影響を及ぼし得る。
RNA の安定性は、5'−カップリングおよび3'−ポリアデ
ニル化のような末端構造によって、および内部構造の広
がり（すなわち、分子内塩基対）によって影響を受ける
ことは当業者に既知である。aRNAは、細胞内に局在化し
得る。例えば、単一ペプチド含有ポリペプチドをコード
する翻訳可能な配列を有するaRNAは、表面のあらい小胞
体へ結合される傾向にある。イントロンは、aRNA中に含
有され得る。ただし、このスプライス部位が２つの異な
った遺伝子から誘導されるならば、イントロンのスプラ
イス部位は和合可能である。

【００７４】aRNAはいくつかの生物学的要因によって設
計しなければならない。RNA の２次構造は、安定性およ
び加工のみならず抗ウイルス活性にも影響を及ぼし得
る。特に、ウイルス機能を干渉する配列を含有する分子
内の塩基対合は、ウイルスmRNAに対するアニールを妨げ
るほど強くてはいけない。aRNA転写は、ウイルス病の激
しさを増大させ得る、機能的に意味のあるウイルス成分
へ、ウイルスの複製機構によって変換され得るべきであ
る。センス鎖の生産は、非ウイルス配列のaRNAに含める
ことにより、特に片方または両方のaRNA末端において阻
害され得る。このaRNA末端はレプリカーゼ機能を干渉す
る。正鎖の生産が阻害されなければ、他の段階を取り得
る。タンパクコード化配列部分の欠失または適当に位置
づけされたフレームシフト突然変異の導入は、非機能的
であるべきセンス鎖によってテンプレートされたウイル
スタンパクを生じ得る。フレームシフト突然変異は、プ
ラスミドを運搬するウイルスcDNAを、粘性末端を発生さ
せる唯一の制限部位において開放し、この粘性末端を取
り除き、そして再結合することにより便宜的に導入され
る。用いられた酵素および方法に依存して、これは２ま
たは４の塩基対を欠失または挿入し、それによってフレ
ームシフトを発生させる（そしてまた上記制限部位を除
去する。） 本発明の重要な実施態様は、本質的な（例えば、mRNA配
列のどちらかの末端の５つのヌクレオチド以内までの）
全長cDNAをウイルスmRNAに結合させることによって引き
起こされるウイルスの増殖抑制である。全長cDNAは４つ
の重要な領域を有する：5'未翻訳配列、翻訳開始部位、
構造遺伝子および3'保留配列。aRNAを5'未翻訳配列に結
合させると、翻訳開始を干渉し得るが、これは40S リポ
ソームサブユニットによる翻訳開始部位に対する開始前
のmRNA走査を干渉することによってなされる。（Kozak
M(1983) Microbiol. Rev. 47：1-45を参照のこと）翻訳
開始部位への結合は、翻訳開始を干渉し得る。構造遺伝
子配列、すなわちタンパクコード化配列への結合は、翻
訳の能率を低下させ得る。3'保留配列への結合は、複製
の開始を干渉し得る。

【００７５】aRNAを形成すべく、ウイルス性、非ウイル
ス性、プロモーターを含有するDNA分節と、転写ターミ
ネーター配列とを組み合わせることは、組換え型DNA 技
術における通常の技術により理解され知られている方法
によって、達成される。プロモーターの選択は、所望の
発生規制に依存する。植物における遺伝子発現のために
発生的に規制されたプロモーターの使用は、従来技術の
章に記述されている。このT-DNA プロモーターまたはCa
MVプロモーターは、構成要素であるときに有用である。
この RuBP-Case小サブユニットプロモーターは、aRNA遺
伝子で形質転換された植物の緑色組織における発現のた
めに有用とされ得る。より好ましい実施態様では、この
転写ターミネーターは、ポリアデニル化部位である。こ
のポリアデニル化部位、プロモーターおよび被覆タンパ
ク構造遺伝子が、転写および転写後のプロセッシングに
対し和合可能であるなら、ポリアデニル化部位の植物遺
伝子源は重要ではない。

【００７６】この技術分野における当業者には明らかな
ように、aRNA遺伝子の組み合わせは、プラスミド（これ
で遺伝子が運搬される）からのこの組み合わせを取り除
くのに都合よく、しかも選択の植物形質転換ベクターに
挿入するのに都合の良い制限部位間に配置され得る。例
えば、T-DNA 内のaRNA遺伝子挿入部位の配置は、T-DNA
縁部をすぐに取り囲む配列の移入機能が分断されない限
り、重大ではない。従来技術での研究において、これら
の領域が、修飾されたT-DNA を植物ゲノムに挿入するた
めに不可欠なことは明らかだからである。この組み合わ
せは、当業者に公知の標準的な技術により、植物形質転
換ベクターへ挿入される。集められたaRNA遺伝子の方向
は、内因性のベクター遺伝子の転写および翻訳の方向に
関して、ふつうは重大ではない。一般に、この２つの可
能な方向のいずれかが目的に合っている。

【００７７】背景の章（TiプラスミドDNA ）において再
考察したように、アグロバクテリウム（Agrobacterium)
株が、ある種の trans−作用遺伝子を含み、その機能が
T-DNA の植物細胞への移入を促進し得るなら、ミクロ−
TiプラスミドのT-DNA は、アグロバクテリウム（Agroba
cterium)株から植物細胞に移入し得る。ミクロ−Tiプラ
スミドは、小さくかつ直接処理するのが比較的容易であ
る点で有利である。このプラスミドは、相同性の組み換
えによって、シャトルベクターからT-DNA に遺伝子を移
入させる必要性を取り除く。所望の被覆タンパク遺伝子
が挿入された後、それらは、 trans−作用vir 遺伝子を
含有するアグロバクテリウム（Agro- bacterium)細胞へ
直接、容易に導入され得る。この vir遺伝子は、ふつう
は“ヘルパー プラスミド”上にあり、それはT-DNA 移
入を促進する。アグロバクテリウム（Agrobacterium)株
への導入は、アグロバクテリウム（Agrobacterium)株の
形質転換、またはドナーバクテリア細胞からの対移入
（conjugal transfer)のいずれかにより、うまく達成さ
れる。この技術は、通常の当業者に公知である。植物ゲ
ノム中に新規なDNA 配列を導入するために、Tiプラスミ
ド、Riプラスミド、ミクロ−Tiプラスミドおよび染色体
に組み込まれるT-DNA は、機能的に同等であると考える
べきである。

【００７８】aRNA遺伝子を有するT-DNA は、ある公知技
術により、植物細胞に移入され得る。例えば、この移入
は、アグロバクテリウム（Agrobacterium)株と植物細胞
あるいは植物組織との共培養により最もうまく達成され
る。これらの方法を用いて、植物細胞のある部分が形質
転換され（すなわち、ここで移入されるT-DNA を有す
る）、植物細胞ゲノム中に挿入される。いずれかの場
合、この形質転換された細胞は、非形質転換細胞から区
別するために、選択あるいはスクリーンされなければな
らない。選択は、aRNA遺伝子に加えて、T-DNA に組み入
れられた選択可能なマーカーを供給することにより、最
も容易に達成される。人工的マーカーの例には、背景で
再考察されたマーカーが含まれている（キメラ遺伝子の
章を参照のこと）。さらに、このT-DNA は、Ri−誘導腫
瘍根の異常形態を制御する遺伝子、およびアミノ酸類似
物のような毒性化合物に対する耐性（このような耐性
は、オピン合成酵素、例えば ocsによって供給される）
を調節する遺伝子のような内因性マーカーを供給する。
当業者に公知のスクリーニング方法には、オピン生成の
検定、核酸配列を特徴づけるための特異的なハイブリダ
イゼーション（例えば、aRNAあるいはT-DNA）または特
定のタンパクに関する免疫学的検定が含まれる。さら
に、発現されたaRNA遺伝子の発現型（例えば、標的ウイ
ルスに対する抵抗性）は、形質転換された組織を同定す
るのに用いられ得る。ウイルス耐性の検定は、植物ウイ
ルス学の分野で公知の多くの方法のうちのひとつによっ
て実施され得る。この検定は、ウイルス成分（例えば、
ウイルスRNA あるいはウイルスタンパク）の生成減少の
検出、プロトプラスト感染または局部的なレッション
（lession)検定によって検定されるような感染性の減少
の検出、子孫ウイルスの生成減少の検出なども含まれ
る。

【００７９】好ましい実施態様では、ミクロ−Tiプラス
ミドの使用が含まれているが、当該分野で既知の他のT-
DNA 基準ベクターは、容易に置換される。さらに、本発
明の好ましい実施態様では、aRNA遺伝子の組み込みのた
めのT-DNA 基準アグロバクテリウム（Agrobacterium)−
媒介系を、形質転換されるべき植物のゲノムへ組み込ん
でいるが、aRNA遺伝子を移入し、そして組み込むための
他の方法も、本発明の範囲内に含まれる。aRNA遺伝子の
植物ゲノムへの安定した組み込みのための方法はさら
に、ウイルスゲノム、ミニ染色体、トランスポゾンの使
用、さらに、植物染色体への相同性あるいは非相同性組
み換えも含んでいる。植物細胞へのこれらのベクターの
もうひとつの形の供給には、ベクターを含有するリポソ
ームあるいはバクテリアのスフェロプラストとの融合、
微注射法、感染様工程の前のウイルス被覆タンパクにお
けるエンカプシデーション(encapsidation) 、およびお
そらく、電気パルス、レザーもしくは化学薬品による形
質膜透過性の誘発後のDNA の直接的な取込みが含まれる
が、これらに限定されない。一過性の組み込みおよび／
または発現の方法も本発明の範囲内に含まれる。アグロ
バクテリウム（Agrobacterium)細胞およびT-DNA に基づ
く系は、バクテリアから植物細胞へDNA を移入させるこ
とによって、双子葉および単子葉植物を含む被子植物を
形質転換させるために使用され得る。ベクターあるいは
ベクター供給のための方法に基づくシステムは、裸子植
物および被子植物を形質転換させるために用いられ得
る。

【００８０】形質転換された細胞および組織の再生は、
公知の技術によって達成される。再生段階の目的は、正
常に生育しそして再生産するが、組み込まれたT-DNA を
保持する植物全体を得ることである。再生技術は、当該
分野に既知の原理に従って幾分変化し、そして植物形質
転換ベクターおよび形質転換された植物の品種に依存し
得る。形質転換されたタバコ植物、ツクバネアサガオ植
物および関連品種植物の再生は、当該分野に既知であ
る。他の植物品種の再生のための方法が開発されたた
め、当業者は、過度の実験を行うことなく、形質転換さ
れた植物細胞および植物組織からの植物の再生のため
に、これらの新しく開発された方法の適用法を理解でき
る。

【００８１】形質転換された植物組織の遺伝子型が、そ
の細胞が、試験管内培地において容易に生育し、そして
再生されるため、および、使用する選択的薬剤に対する
感受性のために、度々選択される。農耕法の栽培品種が
これらの操作に不適切であれば、より修正可能な品種が
まず形質転換される。再生後、新しく導入されたaRNA遺
伝子は、植物の品種改良や遺伝の分野における当業者に
良く知られている技術を用いて、所望の農業品種へ容易
に移入されうる。農業品種を用いて、形質転換された植
物の交配を行うことによって、最初の雑種が得られる。
これらの雑種は、この後、所望の遺伝的背景の植物を用
いて、もどし交配され得る。組み込まれたaRNA遺伝子DN
A、T-DNAの連続した存在に対して、もしくはaRNAまたは
（挿入されたDNAによって運ばれた）他の遺伝子発現の
結果として生じる新しい発現型に対して、子孫は、連続
的にスクリーンおよび／または選択される。このように
して、このもどし交配および選択を繰り返してのち、挿
入されたDNA 配列の添加を用いて、農学的に所望の両親
と基本的には同一の遺伝子型を有する植物が生成され得
る。

【００８２】aRNA遺伝子を含む植物細胞を作るために、
植物ゲノムへのaRNA遺伝子の組み込みの別法は、この植
物中において維持され得るベクターウイルス性RNAを用
いて、植物を感染させることである。このウイルスRNA
は、標的ウイルス（すなわち、防御が望まれるウイル
ス）に対して被覆タンパクをコードする配列を有する。
代表的には、ベクターウイルスおよび標的ウイルスの二
本鎖cDNA配列は、組み換えDNA 技術を用いて、処理され
る。所望のベクターRNA ／標的aRNAの組み合わせのDNA
配列に相当するDNA 配列の集合の後、植物ウイルス性ベ
クターcDNA／aRNAcDNA の組み合わせが、試験管内転写
を行い得るプロモーターの後に位置され得る。その使用
のための、このようなベクターおよび条件の説明につい
ては、Melton DAら（1984）Nucl. Acids Res.12: 7035-
7056, Krieg PA and Melton DA (1984) Nucl. Acids Re
s. 12: 7057-7070, Ahlquist P and Janda M (1984)Mo
l.Cell.Biol. 4 : 2876-2882, and French R ら（1986)
Science 231 : 1294-1297 に含まれている。そのよう
なウイルス性ベクター／標的aRNA／試験管内転写ベクタ
ーの組み合わせが集められた後、ウイルス性ベクターRN
A ／標的aRNA配列の組み合わせが、試験管内転写によっ
て生成され、植物細胞中のウイルス性ベクターの維持に
必要な他のあらゆるウイルス性RNA成分と混合されう
る。植物細胞のベクター／aRNA配列の組み合わせによる
感染は、次いで既知方法により行われ、そして標的ウイ
ルスあるいは標的ウイルスRNAを用いた接種後、感染の
抑制やウイルス性成分の生成が当該分野で周知の方法に
よって検定されうる。

【００８３】同様に、植物ウイルス性DNAベクターは、
植物細胞への被覆タンパク遺伝子の導入のために用いら
れる。そのようなベクターの利用については、Brisson
Nら（1984) Nature 310:511-514によって検討されてい
る。本発明により教示されるように、機能的な被覆タン
パク遺伝子をつくるための方法は、当業者による植物DN
Aウイルス−基準ベクターの使用と組み合わせられう
る。適当な植物宿主細胞の感染後、標的の抑制、ウイル
ス感染が上記のように検定されうる。

【００８４】

【実施例】次の例は本発明の範囲内の特定の実施例を説
明する目的で提示したもので、範囲を制限するためのも
のではなく、範囲は特許請求の範囲で規定されている。
当業者には容易に種々の変更を行うことができるだろ
う。

【００８５】実施例は分子生物学の技術や T-DNAとAgro
bacterium の操作に精通した当業者にはなじみ深い広く
知られた技術を使っている：その方法は、ここで詳細に
説明されていなければ１か所以上の引用した参考文献に
詳しく記載されている。この明細書の中で引用した参考
文献は総じて参考文献の項に掲載されている。酵素は一
般商業経路を通じて得たもので業者の奨めに従って使用
され、他の変更は技術的には広く知られている。試薬、
緩衝液、および培養条件もまた、当業者にはよく知られ
ている。この標準技術を含め参考となる研究は次の通り
である：Wu R,ed. (1979) Meth. Enzymol. 68 ; Wu R
ら、eds. (1983) Meth. Enzymol. 100 and 101 ;Grossm
an L and Moldave K, eds. (1980) Meth. Enzymol. 65
; Weissbach A and WeissbachH, eds. (1986) Meth. E
nzymol. 118 (Rogers SGら、pp.627-640 を特に参照の
こと）; Miller JH (1972) Experiments in Molecular
Genetics ; Davis R ら、(1980) Advanced Bacterial G
enetics ; Schleif RF andWensink PC (1982) Practica
l Methods in Molecular Biology ; Walker JM and Gaa
stra W, eds. (1983) Techniques in Molecular Biolog
y ; and ManiatisTら (1982) Molecular Cloning 。さ
らに、Lathe RFら (1983) Genet. Engin. 4: 1-56も DN
A操作に有用な注意を与えてくれる。

【００８６】制限エンドヌクレアーゼの名前を分離して
原文通りで使用している場合、例えば“ BclI"は酵素消
化にその酵素を使用したことを意味している、しかしそ
の酵素の作用を受けやすい配列部位、例えば制限部位、
をさし示す図解は除く。テキストの中で、制限部位は作
用“部位”をさらにつけることによって、例えば“ Bcl
I 部位”のように示される。さらに“断片”をさらにつ
け加えると、例えば“BclI 断片”は、指名された酵素
の作用によって生じた末端を有する直線状二本鎖 DNA分
子を示す（例：制限断片）。“ BclI ／ SmaI 断片”と
いうような語句は制限断片が２つの異なった酵素、ここ
では BclI と SmaI 、の作用によって生じた、すなわち
２つの末端が異なった酵素の作用で生じたことを示して
いる。

【００８７】プラスミドには、さらに言えばプラスミド
のみに、“p"を前につける（例：pTi15955あるいは pH4
00）、そしてかっこを使った菌種の表示でその中に繁殖
しているプラスミドを示している、例：A.tumefaciens
(pTi15955)あるいはE.coli K802(pH400)。次の菌種は寄
託されており、特許になれば当業者に入手可能となる。

【００８８】 E. coli MC1061 (pH400A4） NRRL B-18061 E. coli K802 (pH4-1） NRLL B-18009 A. tumefaciens (pTi15955) ATCC 15955 E. coli CSH52（pSUP106) NRRL B-15486 E. coli SM10 NRRL B-15481 E. coli S17-1 NRRL B-15483 （ATCC : American Type Culture Collection, 12301 P
arklawn Dr., Rockville, MD 20852 USA ; NRRL :ARS P
atent Collection, Northern Regional ResearchCente
r, 1815 N. University St., Peoria, IL 61614 USA.）
他のプラスミドと菌種は一般に広く利用され得、当業者
には入手可能である。

【００８９】実施例１：AMV RNA4 cDNA の調製 pSP65A4 (Loesch-Fries LSら (1985) Virol.146 : 177-
187)は pSP65内にAMVRNA4の完全な長さのcDNAを運搬す
る。 EcoRIおよび SmaI で分解されたpSP65A4DNAに対し
アガロースゲル電気泳動を行い、0.89kbp 断片をゲルか
ら溶離した。この断片を直線化されたpSP65A4 DNA と混
合して結合させ、そしてMC1061に形質転換させた。耐ア
ンピシリン（Ampicillin）性の形質転換体をAMV RNA4プ
ローブに対してハイブリダイズさせることによってスク
リーニングした。コロニーは、pSP64A4Iと命名され、全
長のAMV RNA4cDNAを運搬するプラスミドを含むことが同
定された。pSP64およびpSP65はバクテリオファージ SP6
プロモーターの制御の下でインビトロ転写を行うように
設計される（Melton DAら (1984) Nucl. Acids Res. 1
2: 7035-7056 ;Krieg PA and Melton DA(1984) Nucl. A
cids Res.12:7057-7070）。pSP65A4 および pSP64AI
は、それぞれAMV RNA4正鎖配列の合成および AMV RNA4
aRNA配列を指図する。２つのプラスミドがインビトロで
SmaIと EcoRIによりそれぞれ切断されるとき、転写は実
質的に完全な長さの被覆タンパクmRNA配列およびそれに
相補的なものである。pSP65A4およびpSP64AI の AMV cD
NA EcoRI／SmaI断片は同一である。

【００９０】実施例２：AMV 感染のaRNA抑制に関するイ
ンビトロ試験 アルファルファおよびタバコのプロトプラストを本質的
にはSamac DAら（1983）Virol. 131：455-462により記
述されているようにRNA を用いてインビトロに感染させ
た；主な変更はRNA がプロトプラストのペレットに少量
（例えば、10^TMｌ）添加されることである。次いで、こ
のペレットはポリエチレングリコール（PEG)を添加する
前に残存の上澄みに再懸濁させた。プロトプラストと組
み合わせる前にRNA をPEG に添加するSamac S の方法を
このように変更すれば、感染に必要なRNA の量が約50倍
減少する。感染の条件は、細胞の外部でセンス鎖：アン
チセンス鎖の二重鎖を形成するには不都合であると考え
られる。

【００９１】合成 RNAを本質的にはMeltonら（前出）に
よって記述されているように、そして SP6ポリメラーゼ
販売者のプロトコルによって調製した。 0.5mMの7mG 5'
ppp5'G を含め、 GTP濃度を 0.5mMから 0.025mMに減少
させることによって、5'キャップ化 RNAを合成した。合
成AMV RNA4は SamI 線形化pSP65A4 によってテンプレー
トされ、そして合成AMV RNA4 aRNA は EcoRI線形化pSP6
5A4Iによってテンプレートされた。

【００９２】アルファルファまたはタバコのプロトプラ
ストを用いた代表的な実験では、天然のAMV RNA1, RNA2
およびRNA3を合成キャップ化RNA4と混合させると接種さ
れたプロトプラストの約2/3 が感染した。合成RNA4に比
較して等量のキャップ化RNA4aRNA を含めると、感染レ
ベルが少なくとも 100倍減少し、しばしば、感染が検出
し得なかった。

【００９３】実施例３：CaMV転写制御配列の調製 pDOB512（これはカリフラワーモザイクウイルス（CaM
V）転写制御配列（Dr. Ken Richards, Centre National
de la Recherche Scientifique, Institute deBiologi
e Moleculaire et Cellulaire, 15, rue Descartes, F-
67084 Strasbourg, France から得られた）を運搬す
る）は、次のようにして構築された：（CaMVについての
総説は Hohn T ら（1982） Curr. Top. Microbiol. Imm
unol. 96 :193-236.) CaMV 19S RNAプロモーター領域
（CaMVヌクレオチド 5376-5851）を運ぶ HindIII断片は
pBR322に挿入され、19S 転写キャップ部位の塩基対１個
以内に刈り整えられた。CaMV 19S転写ターミネーター
（CaMVヌクレオチド 7018-7794）を運ぶ HincII断片に
BamHIリンカーを添加し、次に 19Sプロモーターの後に
挿入した；その結果生じたプラスミドをpDOB412 と指定
した。pDOB412 DNA を BglIIと SalI で消化し、E. co
li DNAポリメラーゼＩのクレノー断片で充填し、次に再
連結し、それによって DNAを削除し（これはCaMV位置76
44 BglII部位とpBR322位置 650 SalI 部位とのあいだに
BamHIと HindIII部位を含有している）、そして BglII
部位を再生している。この結果生じたプラスミドは pDO
B512と指定された。

【００９４】この HindIII直線化 pDOB512 DNAの粘性末
端をクレノー断片（または代わりにT4 DNA ポリメラー
ゼ）によって充填した。この平滑末端を有する pDOB512
DNAを市販の BglIIリンカーと混合してこれと連結す
る。このリンカーは、 BglIIを用いた分解により整形さ
れ、そして再結合されたものである。次にこの連結混合
物をE. coli K802 に形質転換し、そして pDOB513と指
定されたプラスミドを内在させているアンピシリン抵抗
性形質転換体を単離した。 pDOB513は BglII断片上にCa
MV 19S転写制御配列を持っている。 SmaI 部位と BamHI
部位が pDOB412、pDOB512, pDOB513のプロモーターをも
つ DNA分節とポリアデニル化部位のあいだに存在し、こ
れにより転写のための型となるべき外来 DNAの挿入に都
合の良い位置を提供し得る。

【００９５】実施例４：CaMVプロモーターの後に AMV c
DNA を配置する pSP65A4 DNA を EcoRIと SmaI で消化し、0.89kbp AMV
cDNAを電気泳動法で分離したのちアガロースゲルから溶
出させることにより精製した。 EcoRIの粘性末端をE.
coli DNA ポリメラーゼＩのクレノー断片とインキュベ
ートすることにより平滑末端に変換した。 SmaI 直線状
化 pDOB513 DNAを平滑末端cDNAと混合してこれと連結し
たのち、この連結生成物をMC1061に形質転換した。アン
ピシリン抵抗性形質転換体をAMV RNA4プローブに対する
コロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニン
グした。コロニーは、pDOBA4と指定されたプラスミドを
包含しCaMV 19S転写制御配列間に挿入されたAMV cDNAを
もって同定された。この転写制御配列は、（転写された
ときaRNAが合成される：すなわち、 EcoRI末端と BamHI
部位がプロモーターに遠位で転写ターミネーターには近
位である）ように方向づけられた。CaMV転写制御配列／
AMV aRNAコンビネーションは、1.92kbp BglII断片上に
て、pDOBA4I から取り除かれ得る。

【００９６】実施例５：pH400,ミクロTiプラスミドの構
築 pH4-1はE. coli K802(pH4-1)に包含されているミクロ
−Tiプラスミドで、これは NRRL B-18009 として蓄えら
れている。 pH4-1は Sutton DWら、米国特許出願第 77
8,384号（これは参考文献としてここに挿入されてい
る）、および MerloDら（1985）Abstracts, 1st Int. C
ong.Plant Mol. Biol.,ed. : Galau GA. pH4-1 は２個
の T-DNA断片、602 と 2,290の位置に橋をかけ（Barker
RF ら（1983）Plant Mol. Biol. 2 : 335-350によって
定義されている）、T_Lの左のボーダーおよびORF1と関連
のあるプロモーター配列を運搬している HindIII断片を
１個、および11,207と14,711の位置に橋をかけ、3'−欠
失 tml、完全 ocs、T_Lの右のボーダーを持っている Sma
I ／ BclI 断片１個を含有している。これらの２つの断
片の位置3,390 HindIII部位と位置11,207 SmaI 部位
（この SmaI 部位は BglIIリンカーの部位挿入によって
BglIIにすでに転換されている）のあいだは植物発現性
の選択可能マーカーである。このマーカーは、CaMV 19S
プロモーター１個、ネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼIIをコードするTn５カナマイシン抵抗性の構造遺伝
子１個、および位置21,727と22,440で HincII部位に橋
をかけているT-DNAによって供与された２個のポリアデ
ニル化部位（そのうちの１個はCaMV由来、もう１個は T
-DNA ORF26由来である）を持っている。カナマイシン抵
抗性遺伝子は ocsと tmlに平行でORF1プロモーターに反
平行の向きを示している。 T-DNA／選択可能マーカーの
組合せは、 pSUP106（すなわち E. coliとAgrobacter
ium の両方で維持可能な11kbp 巾広宿主領域プラスミ
ド）の HindIII部位に挿入された（Priefer UBら (198
5) J. Bacteriol. 163 :324-330 ; E. coli. CSH52
(pSUP106) は NRRL B-15846 として蓄えられている）。
この T-DNAは、 pSUP106内でT_L右ボーダーが pSUP106ク
ロラムフェニコール抵抗性遺伝子内に存在するpSUP106
EcoRI部位に近位になるように方向づけられている。

【００９７】pH4-1は BglII部位２個をもち、これらは
いずれも kan選択可能マーカーの側面をかためている。
BglII部位の一方が次のように取り除かれ、それにより
次のようにして体外コード化 DNAの挿入にとって有用な
特異な BglII部位を残すことができる：pH4-1 DNAを B
glIIで部分消化させ、完全長の直線状DNA を電気泳動法
により単離した。次に粘性末端を、E. coli DNAポリメ
ラーゼIのクレノー断片と一緒に培養することにより取
り除いた。その結果生じた平滑末端 DNAをそれ自身に連
結し、E. coliに形質転換した。クロラムフェニコール
に抵抗性の形質転換体から単離したプラスミドDNAを、
制限分析でスクリーニングした結果、 pH400と指定され
たプラスミドを包含するコロニーが確認された。pH400
は、 BglII部位が kan遺伝子と ORF１プロモーターのあ
いだにはなく、かつ特異なpH400 BglII部位が kan遺伝
子と ocs遺伝子の間に存在すること以外は、 pH4-1と同
一であった。

【００９８】実施例６：AMV4 aRNA 遺伝子の pH400への
挿入 pDOBA4 DNA を BglIIで消化し、次にBglII−直線化脱燐
化された pH400 DNAと混合してこれと連結した。MC1061
に形質転換し、クロラムフェニコール抵抗に対して選択
されたのち、コロニーはブロットされ、AMV RNA4プロー
ブとハイブリダイズされた。コロニーは pH400 BglII部
位に挿入されているaRNA遺伝子を有し、pH400A4Iと指定
されたプラスミドを包含していることが確認された。こ
のpH400A4Iは完全長の AMV RNA4 配列をもつaRNA遺伝子
を有し、この遺伝子は3'−欠失 tml遺伝子、ocs、およ
びカナマイシン選択可能マーカーに平行に方向づけられ
ている。

【００９９】実施例７：植物形質転換 pH400A4Iを当該分野で広く知られている３親交配法（Ru
vkun GB and AusubelFM (1981) Nature 289 : 85-88)、
またはE. coli、例えばSM10（NRRLB-15481)またはS17-
1(NRRL B-15483）（Simon R ら (1982) Biotechnol. 1
: 784-791）の可動菌種から交配によってA. tumefacie
ns LBA4404（Ooms Gら（1981）Gene14 : 33-50）、vir
遺伝子包含ミクロ−Ti可動菌種に移入した。タバコ葉組
織はMagenta箱内で無菌的に生育した生育４週間または
５週間の Xanthi^NC植物から採取した。接種は Horsch R
Bら (1985) Science 227 :1229-1231の方法の改良法に
よった。接種剤はL-ブロス10mlにアグロバクテリア２ル
ープを植えつけて調製した。パスツールピペットを用い
た強制的なピペット移入により懸濁させた後、接種剤を
直ちに適用した。葉を切り取り、中筋を取り除いた；切
断表面をL-ブロスで湿らし、葉が湿った状態を保つよう
にした。葉片は巾約２〜４mmで長さ約７〜10mmであっ
た。葉断片を接種剤に５〜10分漬けた。しかしある実験
では、葉片を簡単に接種剤に漬けた場合や真空フラスコ
中で接種剤に浸潤した場合もある。次に葉片を滅菌濾紙
上で吸い取って乾燥し、Xanthi懸濁培養液から調製した
培養皿（feeder plate)上で逆さまに置いた。培養皿に
はSMPi培養基が入れられている（SMPi：0.1mg／ｌ p−
クロロフェノキシ酢酸（pCPA）と7.5mg／ｌ 6-（8,8-ジ
メチルアリルアミノ）プリン（２iP）を追加したMX-；M
X-：1.65ｇ／ｌ NH₄NO₃、 1.9ｇ／ｌ KNO₃, 440mg／ｌ
CaCl₂・2H₂O, 370 mg／ｌ MgSO₄・7H₂O、 170mg／ｌ KH
₂2PO₄, 0.83 mg／ｌ KI, 6.2mg／ｌ H₃BO₃、22.3mg／ｌ
MnSO₄・4H₂O、8.6mg／ｌ ZnSO₄・7H₂O、0.25mg／ｌ Na
2MoO₄・2H₂O、 0.025mg／ｌ CuSO₄・5H₂0、 0.025mg／
ｌ CoCl₂・6H₂O、１ｇ／ｌ イノシトール、50mg／ｌニ
コチン酸、50mg／ｌ ピロキシジン・HCl, 50 mg／ｌ チ
アミン・HCl、30ｇ／ｌ 蔗糖、pH5.8、８ｇ／ｌ カンテ
ンで固化）。４〜６日後葉片を培養皿から取り出し、 5
00mg／ｌ カルベニシリン、50mg／ｌ クロキサシリン、
100〜 300mg／ｌ カナマイシン（最適 200mg／ｌ）を
追加したSMPi培養基の上に置いた。この結果生じた分枝
を切り取り 100〜300mg／ｌ カナマイシン（最適 200mg
／ｌ）を追加したMX^-培養基の上に置いた。

【０１００】実施例８：植物における発現 再生されたタバコ植物はA. tumefaciens LBA4404 （pH
400A4)によって形質転換された細胞の系統をひくもの
で、自己培養されたものである。得られた種子を100〜3
00 mg／ｌ（最適には 200mg／ｌ）のカナマイシンを補
ったMX^-上で発芽させ、aRNA遺伝子を生むT-DNA を含有
する植物を選別した。pH400A4I T-DNA の存在はサザン
分析により確認した。aRNAの存在はノーザン分析により
確認した。aRNAの存在はノーザンブロット検定によって
確認された。形質転換されていない対照のタバコ植物お
よびaRNA遺伝子を含有する植物を、葉をカーボランダム
で表皮剥脱した後、すべての４つのAMV RNA を接種させ
ること、すなわち当該技術分野で既知の方法により誘発
させた。このような条件下では、接種物中に存在するAM
V RNA4分子を翻訳するには、AMV 感染を確立する必要が
ある。対照植物にくらべてaRNA遺伝子をもっている植物
は、AMV 感染に対して抵抗力があるかまたは症状の程度
が低いかまたは遅れて現れ、そしてそれはその植物の組
織中のaRNA発現の程度に依存していることが観察され
た。

【０１０１】

【発明の効果】本発明は、特に、ウイルスmRNAに相補的
な RNAの合成を指示する植物発現外来遺伝子を含有する
べく植物の形質転換を行うことによって、ウイルス抵抗
性植物を生成する手段を提供する。さらに、このような
植物発現RNA を運搬する植物形質転換原核プラスミドベ
クター、およびこのようなベクターによって形質転換さ
れた植物細胞も提供する。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ナンシー ピー．ジャーヴィス アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53704 マディソン，ウィラード ストリート 2806 (72)発明者 ドナルド ジェイ．マーロ アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53714 マディソン，ケヴィンズ ウェイ 5214

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ウイルスに感染せず、そしてプロモータ
   ー、一本鎖で正鎖構造の３分節系RNAゲノムを有する植
   物ウイルスのRNAゲノムの少なくとも一部分に対するア
   ンチセンスRNAをコードするcDNA、および転写ターミネ
   ーターを有する安定に組み込まれたDNA分子を含む耐ウ
   イルス性植物細胞であって、該cDNAが、植物に対する耐
   ウイルス性を与え得るアンチセンスRNAをコードし、そ
   して該プロモーター、該cDNA、および該転写ターミネー
   ターが、該アンチセンスRNAが該プロモーターおよび該
   ターミネーターの制御の下で植物細胞内で転写され得る
   ような相互の位置および方向を有する、耐ウイルス性植
   物細胞。