DE3650756T2

DE3650756T2 - Vom parasit abgeleiteter widerstand

Info

Publication number: DE3650756T2
Application number: DE3650756T
Authority: DE
Inventors: A. Johnston; C. Sanford
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1985-03-21
Filing date: 1986-03-17
Publication date: 2001-10-04
Anticipated expiration: 2006-03-18
Also published as: EP0215907A4; WO1986005516A1; EP0215907B1; DE3650759D1; ATE202139T1; JPS62502863A; EP0477994A1; DE3650759T2; EP0477994B1; DE3650756D1; ATE201444T1; EP1213348A2; JP2000300254A; EP0215907A1

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren, mit denen Wirtsorganismen eines Parasiten Resistenz gegenüber diesen Parasiten, wie z. B. Viren, verliehen wird. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Resistenz gegenüber Parasiten, die durch genetische Veränderung des Wirtsorganismus erreicht wird.

Stand der Technik

Eine potentiell wichtige Anwendung biotechnologischer Verfahren liegt auf dem Gebiet des Erzeugens von Resistenz gegenüber Parasiten. Die Vorschläge im Stand der Technik, die systemisch und weit anwendbar sind, fokussierten sich auf das Herausfinden eines Gens, das innerhalb eines Stamms der Wirtsart oder innerhalb einer verwandten Art Resistenz verleiht und auf das Transformieren des Gens in das Genom des empfindlichen Wirts. Dieser Ansatz mag effektiv sein, hat jedoch mehrere verschiedene Nachteile. Es kann sein, dass es keine resistenten Formen des Wirts gibt oder dass es sehr schwierig ist, diese für jede neue Parasitenrasse, die entsteht, herauszufinden. Eine derartige Resistenz kann polygen sein, was das Clonieren und den Transfer der Resistenzgene schwierig macht. Wird die Resistenz von einem Gen codiert, gibt es üblicherweise bereits Stämme des Parasiten, die Virulenzgene entwickelt haben, um derartige vom Wirt abgeleitete Resistenzen in einer Gen-für-Gen-Weise zu überwinden (Flor 1971). Schließlich wird das Problem der Identifikation und des Isolierens des Resistenzgens aus einem großen Wirtsgenom im allgemeinen sehr schwierig bleiben. Deshalb wird eine alternative Strategie benötigt, die diesen Problemen Rechnung trägt.
Es gab auch eine Reihe von Vorschlägen und entsprechende Arbeiten dazu, Gene von Organismen zu verwenden, die entweder mit dem Wirt oder dem Parasiten nicht verwandt sind und die durch einen glücklichen Zufall Genprodukte besitzen, die für einen spezifischen Parasiten schädlich sind. Das Gen, das für das Endotoxin von Bacillus thuringensis codiert (für Lepidopterus-Insekten toxisch) wäre hierfür ein Beispiel (Held et al., 1982). Während dieser Ansatztyp in einigen speziellen Fällen von Nutzen sein kann, stellt er sicherlich im Gegensatz zu einer systematischen Methode, die sehr breit angewendet werden kann, einen opportunistischen Ansatz für das Problem dar.
Es gibt bereits einige Beispiele von Genen, Genderivaten oder Genprodukten eines Parasiten, die eine negative Interaktion mit sich selbst oder einem verwandten Genotyp erzeugen können. Studien bezüglich der Suszeptibilität (Empfindlichkeit) von Pflanzen gegenüber einer Infektion durch Viren haben gezeigt, dass eng verwandte Pflanzenviren oder verschiedene Stämme des gleichen Virus einen Wirtsorganismus kreuzweise schützen (Hamilton, 1980). Mit anderen Worten ist eine Pflanze, die von einem ersten Virus infiziert ist, oft nicht Gegenstand einer Infektion durch einen zweiten Stamm desselben Virus oder eines verwandten Virus. In Bezug auf tierische Viren wurde ein ähnliches Phänomen beobachtet, und es wurde mit dem Begriff "intrinsische Interferenz" (Marcus und Carrier, 1967) bezeichnet. Vom Gesichtspunkt der Parasitenresistenz des hier diskutierten Grundtyps sind die Schlüsselproteine, die bei den intrinsischen Interferenzphänomenen beteiligt sind, die viralen Replikaseproteine (Marcus und Zuckerbraun, 1970). Die gleichen Autoren schlugen vor, dass die Replikaseproteine des primären infizierenden Virus die Replikation des zweiten Virus durch Bindung an seine Replikase-Anheftungsstellen verhindern (Marcus und Zuckerbraun, 1969). Ein ähnlicher Vorschlag wurde gemacht, um die Kreuzprotektion in Pflanzen zu erklären (Gibbs, 1969). In ähnlicher Weise haben Experimentatoren, die mit mit Bakteriophagen 434 infizierten E. coli arbeiteten, gefunden, dass infizierte Bakterien gegenüber anderen Phagen immun sind (Lauer et al., 1981; Flashman, 1978; Roberts et al., 1979). Andere Forscher haben beobachtet, dass sowohl endogene als auch experimentell eingeführte komplementäre Oligonukleotide mit mRNA in einer möglicherweise schädlichen Weise interagieren können. Simons und Mitarbeiter (1983) schlugen vor, dass die Hybridisierung eines kleinen Antisens-Transkripts an die E. coli-Tn10-mRNA bei der Regulation der Transposition dieses Elements mitwirkt. Stephenson und Zamecnik (1978) und Zamecnik und Stephenson (1978) zeigten, dass synthetische Oligonukleotide, die komplementär zu den terminalen Repetitionen des Rous-Sarkoma-Virus sind, die normale virale Infektion verschwinden lassen und die virale RNA-Translation in vitro inhibieren. Diese Entdeckungen wurden jedoch bei der Erzeugung einer Wirtsresistenz gegenüber einem Parasiten nicht angewendet.
Palukaitis et al. (1984) definieren die Kreuzprotektion als einen Fall, bei dem die Infektion in einer Pflanze in direkter Weise mit der Replikation eines zweiten Virus interferiert. Diese Autoren schlagen ein Modell vor, um das Kreuzprotektionsphänomen durch Pflanzenviren und Viroide zu erklären, das der Beobachtung Rechnung trägt, die Kreuzprotektion erfordert, dass sich ein induzierendes und ein herausforderndes Virus (oder Viroid) in der gleichen Zelle treffen.
Sequeira L. (1984) diskutiert die Charakteristika der Kreuzprotektion, ihre Verwendung für die Krankheitskontrolle und den Mechanismus, der für seine Erklärung vorgeschlagen wurde. Alle genannten Mechanismen beinhalten eine erste Infektion durch ein intaktes induzierendes Virus, das den Schutz gegenüber einem zweiten herausfordernden Virus fördert, was die Existenz eines Kandidatengens zur Kreuzprotektion von einem milden Stamm des gleichen Virus impliziert.
Trotz des fragmentarischen Wissens im Stand der Technik gibt es immer noch die Notwendigkeit für eine vollständig entwickelte Technik zum Erzeugen einer Resistenz gegenüber Parasiten, die nicht auf den traditionellen Verfahren des Verwendens eines Resistenzgens aus einem immunen Stamm des Wirts basiert.

Beschreibung der Erfindung

Somit ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem einem Wirt eines Parasiten Resistenz gegenüber dem Parasiten verliehen wird, wobei das Verfahren keine Identifikation und Isolierung eines Resistenzgens aus einem immunen Stamm des Wirts erfordert. Dieses Ziel und andere Ziele der Erfindung, die im folgenden ersichtlich werden, wurden dadurch erreicht, dass ein Verfahren bereitgestellt wurde, welches einem pflanzlichen oder bakteriellen Wirt eines viralen Parasiten Resistenz gegenüber diesem Parasiten verleiht, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst:
a) Isolieren einer viralen Nukleotidsequenz, die für ein virales Protein, ein modifiziertes virales Protein oder eine virale Proteinkomponente des genannten viralen Parasiten codiert, wobei das Produkt der viralen Nukleotidsequenz in der Lage ist, die Infektion des Wirts durch den genannten viralen Parasiten zu unterbrechen;
b) Einführen der viralen Nukleotidsequenz oder eines DNA- oder RNA-Segments, das im wesentlichen zu wenigstens einem Teil der viralen Nukleotidsequenz homolog ist, oder einer DNA- oder RNA-Sequenz, die in Bezug auf die virale Nukleotidsequenz funktionell äquivalent ist, in den pflanzlichen oder bakteriellen Wirt, dadurch, dass eine rekombinante DNA oder RNA oder ein funktionell äquivalenter Vektor, der in der Lage ist, in die Wirtschromosomen so zu integrieren, dass er in stabiler Weise repliziert oder als ein Episom aufrechterhalten wird, erzeugt wird; und
c) Expression der genannten Nukleotidsequenz oder der genannten DNA- oder RNA-Sequenz in Zellen des genannten pflanzlichen oder bakteriellen Wirts, wobei essentielle Funktionen, die unter der Kontrolle der Gene des Parasiten stehen, durch das Vorhandensein des Expressionsproduktes im Wirt zerstört werden und wobei dieses Expressionsprodukt dysfunktional ist, im Überschuss vorliegt oder in falschem Kontext erscheint oder bei einer falschen Entwicklungsstufe im Lebenszyklus des Parasiten auftaucht.

Beste Art und Weise, die Erfindung durchzuführen

Das Konzept der Parasiten-abgeleiteten Resistenz ist, dass die Wirtsresistenz gegenüber einem speziellen Parasiten in effektiver Weise durch Einführen eines Gens, eines Genfragments oder modifizierten Gens oder Genfragments des Pathogens in den Wirt manipulativ verändert werden kann. Dieser Ansatz basiert auf der Tatsache, dass es bei jeder Parasiten-Wirt- Interaktion bestimmte Parasitencodierte celluläre Funktionen (Aktivitäten) gibt, die für den Parasiten, nicht jedoch für den Wirt essentiell sind. Eine essentielle Funktion ist eine, die im Parasiten funktionieren muss, falls dieser überleben soll oder sich vermehren soll. Diese Funktionen stellen die Achillessehne des Parasiten dar. Wird eine dieser Funktionen zerstört, so wird der parasitische Prozess angehalten. Der Begriff "Dysfunktion" oder "Zerstörung" bezieht sich auf jegliche Veränderung, die das Überleben, die Reproduktion oder die Infektiosität des Parasiten verringert. Derartige essentielle Funktionen, die unter der Kontrolle von Parasitengenen sind, können durch das Vorhandensein eines entsprechenden Genprodukts im Wirt zerstört werden, wobei das Genprodukt (1) dysfunktional ist, (2) im Überschuss vorliegt oder (3) im falschen Kontext oder bei einer falschen Entwicklungsstufe im Lebenszyklus des Parasiten erscheint. Wenn derartige fehlerhafte Signale in spezifischer Weise für die parasitische Zellfunktion entwickelt/designed werden, dann werden sie auf den Wirt nur einen geringen Einfluss haben. Deshalb kann die Resistenz gegenüber einem speziellen Pathogen durch Clonierung des geeigneten Parasitengens, falls notwendig durch die Modifikation seiner Expression, und durch die Transformation dieses Gens in das Wirtsgenom erreicht werden. Unter "Resistenz" wird jegliche Reduktion der Virulenz der Parasiteninfektion oder jegliche Reduktion der Suszeptibilität des Wirts gegenüber dem Parasiten verstanden.
Dieser Ansatz für die Entwicklung und Erzeugung einer Resistenz hat wichtige Vorteile:
1) Die Quelle und der Ursprung der Resistenzgens wäre niemals fraglich, da jeder Parasit diese mit den Genen, die zum Ableiten der Resistenz notwendig sind, mitbringen würde.
2) Die Stabilität der Parasiten-abgeleiteten Resistenz wird im allgemeinen größer sein als die Stabilität von einfach vererbten Formen der Wirtsresistenz und zwar aus Gründen, die im weiteren detaillierter diskutiert werden.
3) Die Schwierigkeiten, die mit dem Clonieren von Genen aus Wirtsorganismen, die im allgemeinen im Vergleich zu ihren Pathogenen größere Genome besitzen, assoziiert sind, werden vermindert.
4) Die Parasiten abgeleitete Resistenz wird auf den Wirt einen minimalen Effekt haben und sollte keine Substanzen bilden, die für den Menschen schädlich sind.
Das allgemeine Konzept der Parasiten-abgeleiteten Resistenz wurde trotz des zuvor diskutierten Standes der Technik zuvor noch nicht entwickelt. Hierfür gibt es mehrere Gründe. Zunächst waren die Beispiele der negativen Interaktion im allgemeinen zufällige, glückliche Beobachtungen eines natürlichen Effekts und wurden als Sonderfälle isoliert betrachtet. Zweitens wurden die negativen Interaktionen im allgemeinen aus einer akademischen Perspektive betrachtet, mit geringer Erörterung der praktischen Anwendungen. Dies wird am deutlichsten bei den oben erwähnten Artikeln über komplementäre Oligonukleotide, in denen keiner der Autoren irgendeine Verbindung zwischen ihrer eigenen Arbeit und Wirts/Parasiten-Beziehungen oder einer möglichen biotechnologischen Erzeugung einer Resistenz herstellt. Ebenso erwähnt eine jüngste Zusammenfassung während eines Symposiums bezüglich der Verwendung von Antisenssträngen die Anwendung dieses Ansatzes für Wirts-Parasiten-Systeme in keinster Weise (Science, 1984, 225: 819). Drittens basiert das allgemeine Konzept einer Parasiten-abgeleiteten Resistenz auf einer anderen Perspektive als der üblichen Weisheit. Nach Kenntnis der Erfinder hat niemand in absichtlicher, überlegter Weise irgendeine, von einem Parasiten abgeleitete Resistenz erzeugt.
Die Vorsätzlichkeit ist Teil der beanspruchten Erfindung, wie durch die Wortwahl gezeigt wird, nach der das "Isolieren" und die "Insertion" von Genfragmenten notwendig ist.
Zusätzlich hat eine Zusammenfassung der Literatur das Fehlen jeglichen Stands der Technik in Bezug auf die folgenden Bereiche ergeben:
1) Verwendung von viralen Genen im Wirt, die für regulatorische Proteine codieren, wie z. B. Hüllproteine, um mit der viralen Reproduktion zu interferieren.
2) Verwendung von Derivaten eines viralen Replikasegens oder eines viralen reversen Transkriptasegens in dem Wirt zum Zwecke der Interferenz mit der viralen Reproduktion.
3) Verwendung von Lysegenen, die von einem Parasiten abgeleitet sind, zur Verwendung als induzierbare "selbst-zerstörende" Gene für die Entwicklung einer Hypersensitivität im Wirt.
4) Verwendung von Avirulenzgenen eines Parasiten in dem Wirt, um diese über die Virulenzgene in virulenten Stämmen des Parasiten zu setzen.
5) Verwendung von Parasitengenen, die bei der Biosynthese von schlüsselregulatorischen Molekülen beteiligt sind, für den spezifischen Zweck des Entwickelns der gleichen biosynthetischen Fähigkeiten in den Wirt, so dass der Wirt Hormone, Neurotransmitter, Pheromone oder ähnliche Moleküle bildet, die für den Parasiten zerstörerisch sind.
Als Beispiel dafür, wie Krankheitsresistenz durch diesen Ansatz erzeugt werden kann, wird die Diskussion unten im Detail darlegen, wie Gene des Bakteriophagen Qβ-verwendet werden können, um E. coli gegenüber einer Qβ-Infektion resistent zu machen. Dieses Beispiel soll nicht dazu dienen, die Erfindung zu beschränken, sondern ist ein Beispiel für die Leichtigkeit, mit der die Erfindung, die nun beschrieben wird, praktisch durchgeführt werden kann.
Die Biologie von Qβ und anderen RNA-Phagen wurde in extensiver Weise dokumentiert (Zinder, 1975) und die cDNA-Sequenz des Genoms wurde bestimmt. Das Qβ-Genom hat drei Hauptcistrons. Diese codieren für ein Reifungsprotein (das bei der Lyse und der Phagenbindung an Wirtspili beteiligt ist), ein Hüllprotein und eine Untereinheit des Replikaseenzyms. (Ein viertes Genprodukt ist ein "minor coat protein", bei dem es sich um ein Durchleseprodukt des Hüllcistrons handelt.)
Der Lebenszyklus von Qβ ist im wesentlichen wie folgt. Der Phage beginnt durch Bindung an die Sexpili von F'-E. coli über die er in die Zelle eindringt und beginnt seine Replikaseuntereinheit zu translatieren. Seine Replikaseuntereinheit polymerisiert mit drei Wirtsuntereinheiten, die normalerweise bei der Wirtproteintranslation beteiligt sind. Das entstandene hybride tetramere Enzym hat eine RNA-Replikase-Aktivität, die für Qβ spezifisch ist. Die Spezifität ist auf die Affinität zwischen der Qβ-Untereinheit der tetrameren Replikase und einem kurzen Segment auf dem Qβ-Genom innerhalb des Replikasecistrons zurückzuführen. Die Replikase bindet an die Qβ-RNA an dieser Bindungsstelle und repliziert die virale RNA. Spät im Lebenszyklus von Qβ akkumuliert das Hüllprotein und das Reifungsprotein in den Wirt. Das Hüllprotein bindet dann an das Replikasecistron und reprimiert dadurch die Translation der Replikaseuntereinheit. Die Termination der Replikation ermöglicht den viralen Zusammenbau, und das Reifüngsprotein lysiert schließlich den Wirt, der eine neue Population infektiösen Qβ freisetzt.
Ausgehend von konventionellen (durch den Stand der Technik nahegelegten) Perspektiven legt der Lebenszyklus der Qβ zwei mögliche Mechanismen für die Entwicklung einer Resistenz nahe. Eine Wirts-abgeleitete Resistenz kann durch (1) Blockieren der Qβ-Bindung an Geschlechtspili (sex pili) oder (2) durch Bildung von varianten Wirtsuntereinheiten, denen eine Affinität gegenüber der Qβ-Replikaseuntereinheit fehlt, entwickelt werden. Tatsächlich ist die Blockade der Qβ-Bindung ein bekannter Mechanismus zur Bildung einer Qβ-Resistenz, da Nicht-F'-Mutanten, denen die Pili fehlen, gegenüber einer Infektion immun sind (Silverman, Rosenthal, Mobach und Valentine, 1968). Diese Strategie zerstört jedoch in klarer Weise einen Mechanismus, der für die Funktionsfähigkeit des Wirts als eine Spezies notwendig ist. Die Selektion varianter Formen der Wirtsuntereinheiten, die dabei behilflich sind, dass das Replikaseenzym gebildet wird, können ebenfalls ein natürlich vorkommender Resistenz-verleihender Mechanismus sein. Da der Wirt drei der vier Untereinheiten der viralen Replikase bereitstellt, könnte man Mutationen innerhalb dieser Gene erwarten, die Resistenz verleihen. Das Ausmaß, in welchem diese Wirtsuntereinheiten verändert werden können, ist jedoch deutlich beschränkt, da diese Untereinheiten für die Proteinsynthese des Wirts und das Überleben des Wirts essentiell sind. Die meisten Varianten dieser Wirtsuntereinheiten wären wahrscheinlich für den Wirt läthal oder subläthal. Es ist wahrscheinlich, dass selbst nicht-läthale Varianten für die Proteintranslationseffizienz suboptimal sind. Somit würden beide der von dem Qβ-Lebenszyklus nahegelegten Wirts-abgeleiteten Resistenzmechanismen zur Zerstörung wichtiger Wirtsfunktionen führen.
Die Aussicht, in der Lage zu sein, Gene von einem Parasiten auf den Wirt zu übertragen, stellt einen neuen Resistenzansatz dar. Unter diesem Gesichtspunkt können von dem Lebenszyklus von Qβ mindestens genauso viele Mechanismen einer pathogen abgeleiteten Resistenz wie Mechanismen der Wirts-abgeleiteten Resistenz abgeleitet werden. Mehrere Strategien werden als vielversprechend betrachtet: (1) Ableiten einer Resistenz von dem Qβ-Hüllprotein und (2) Ableiten einer Resistenz von einer modifizierten Qβ-Replikase. Eine andere Strategie, die das Reifungsprotein beinhaltet, erscheint ebenfalls machbar.

Resistenz, die von dem Hüllprotein abgeleitet ist

Es ist bekannt, dass das Qβ-Protein sowohl eine regulatorische als auch eine strukturelle Rolle spielt. In dem späten Phagen-Lebenszyklus bindet das Hüllprotein an das Cistron, das für die Qβ-Replikaseuntereinheit codiert, und reprimiert diese, wodurch die Replikation angehalten wird und der virale Zusammenbau ermöglicht wird (Bernardi und Spahr, 1972). Wird die cDNA der Hüllprotein-translationellen Sequenz mit einem E. coli-Promotor verbunden und in E. coli eingeführt, so wird das Hüllprotein im Wirt erzeugt. Die Expression des Hüllproteins (in ausreichender Menge) im Wirt wird die Replikation jeglichen infizierenden Qβ reprimieren, wodurch der transformierten Zelle Resistenz verliehen wird.

Resistenz, abgeleitet von einem Derivat des Replikasegens

Die Qβ-Replikaseuntereinheit hat eine duale Affinität für ein Segment des Qβ-Genoms und für die drei Wirt-Replikaseuntereinheiten (Kamen, 1970; Meyer, Webster und Weissmann, 1981). Wird das Qβ-Replikasegen cloniert (als cDNA) und mutagenisiert, so werden einige variante Formen in der Lage sein, an die Qβ-Replikasestelle zu binden und sie werden zu der gleichen Zeit nicht in der Lage sein, mit den Wirtsuntereinheiten zu polymerisieren; was eine Voraussetzung für die Bildung einer funktionellen Replikase ist. Alternativ kann ein Teil des Replikasegens so cloniert werden, dass es ein Polypeptid bildet, das die funktionelle Domäne für die Bindung der Replikasestelle enthält, jedoch nicht in der Lage ist, mit den Wirtsuntereinheiten zu interagieren. Ein transformierter Wirt, der eine derartig modifizierte Replikaseuntereinheit bildet, wäre Qβ-resistent, wenn die modifizierte Qβ-Replikaseuntereinheit oder ein Teil davon an die Replikationsstellen-infizierenden Qßs bindet und in effektiver Weise mit nativer Qβ-Replikase für die Bindungsstellen kompetiert, wodurch die Qβ-Replikation zerstört wird.

Resistenz, abgeleitet von Oβ-Reifungsprotein

Obwohl die Weise, in der das Reifungsprotein wirkt, bis jetzt noch nicht gut verstanden ist (Karik und Billeter, 1983; Winter und Gold, 1983) scheint es auch eine mögliche Quelle einer pathogen abgeleiteten Resistenz zu sein. Ein modifiziertes Reifungsprotein im Wirt kann die Lyse blockieren. Alternativ kann im Wirt ein reprimiertes Operon erzeugt werden, das ein Wildtyp-Reifungsgen enthält, das durch eine Qβ-Infektion aktiviert werden würde. Dies würde eine vorzeitige Lyse einer Wirtszelle nach anfänglicher Infektion durch Qβ evozieren, und stellt (auf der Ebene der Population) eine Form der Hypersensitivität dar.
Obwohl die oben beschriebenen Beispiele, die Verfahren beschrieben, mit welchen Bakterien gegenüber dem Bakteriophagen Qβ geschützt werden können, im wesentlichen auf ein spezifisches Wirts/Parasiten-System gerichtet sind, können die Techniken in einfacher Weise bei anderen Systemen verwendet werden, wie z. B. bei dem Schutz anderer Organismen gegenüber sowohl viralen als auch nicht-viralen Infektionen. Techniken, mit denen diese Ergebnisse erzielt werden können, werden in den folgenden Absätzen detaillierter beschrieben.

Virusresistenz

Die wahrscheinlichsten frühen Anwendungen des Konzeptes der Parasiten- abgeleiteten Resistenz ist die Erzeugung einer Virusresistenz. Dies deshalb, da das virale Genom klein ist und der größte Teil des Genoms bei der Pathogenizität beteiligt ist, da das Virus sich lediglich im Wirt vermehrt. Teile des viralen Genoms können cloniert werden, und ihr Potential in Bezug auf das Verleihen einer Resistenz kann leicht bestimmt werden. Alternativ können Resistenzverleihende Gene empirisch durch Austesten des biologischen Effektes verschiedener DNA-Restriktionsfragmente auf das virale Genom entdeckt werden. Die meisten Virus- abgeleiteten Resistenzen werden wahrscheinlich einen Replikationsblock beinhalten. Die Verfahren für die Entwicklung einer Resistenz gegenüber Qβ sind in direkter Weise auf jedes Virus anwendbar, das a) für ein Protein codiert, das dabei hilft, die Virusreproduktion zu regulieren; b) spezifische Bindungsstellen in seinem Genom besitzt; c) seine eigene Replikase oder reverse Transkriptase synthetisiert; oder d) durch komplementäre reverse Nukleinsäurestrangsequenzen gebunden ist. Mit anderen Worten sollten diese Verfahren für im wesentlichen alle Viren anwendbar sein.
Wenngleich es unter den Biochemikern einige Kontroversen gab, ob Pflanzenviren ihre eigene Replikase codieren, scheint es nun wahrscheinlich, dass die meisten Pflanzenviren für ihre vollständigen Replikasen oder einen Teil davon codieren (Hall, Miller und Bujarski, 1982; Dorssers, Van der Meer, Kamen, Zabel, 1983). Das erste Pflanzenvirus, dessen Replikationsmechanismus charakterisiert wurde, nämlich das "turnip yellow mosaic virus" erwies sich als analog zu Qβ (Mouches, Candresse und Bove, 1984). Es wurde gezeigt, dass dieses Virus eine hybride Replikase besitzt, wobei seine eigene Untereinheit eine spezifische Bindung an sein eigenes Genom bewirkt. Dies zeigt, dass der für die Qβ-Replikase beschriebene Ansatz auch in Bezug auf dieses Virus anwendbar wäre. Es ist wahrscheinlich, dass die meisten oder alle RNA- Pflanzenviren entweder für ihre eigene Replikase, eine Untereinheit der Replikase oder ein Protein, das die Spezifität der Wirt-RNA-Polymerase modifiziert, codieren. Dies bedeutet, dass die Replikase-abgeleitete Resistenzstrategie, die für Qβ beschrieben wurde, in direkter Weise für einen großen Bereich der Pflanzenviren anwendbar sein wird. In Bezug auf diese genetische Struktur wurden bisher noch nicht viele Viren analysiert. Die sehr geringe Größe des viralen Genoms und die Verschiedenheit der möglichen Resistenzmechanismen zeigen jedoch deutlich, dass ein Virus-abgeleitetes Resistenzgen, ausgehend von jedem Virus, abgeleitet werden kann, einfach dadurch, dass Standard-Shotgun-Clonierungsverfahren und direktes Screening in Bezug auf eine nachfolgende Resistenz gegenüber dem Virus verwendet werden.

Vorteile und Begrenzungen der Pathogen-abgeleiteten Resistenz

Die Parasiten abgeleitete Resistenz stellt einen systemischen und in breiter Weise relevanten Ansatz für das Problem dar, wie Krankheits-Resistenz genetisch erzeugt werden kann. Die großen Möglichkeiten dieses Ansatzes werden durch die Tatsache illustriert, dass es drei verschiedene Strategien zum Ableiten von Resistenz aus dem Qβ-Bakteriophagen gibt, bei dem es sich um einen Parasiten handelt, der lediglich drei Gene besitzt. Es gibt mehrere verschiedene Vorteile der Parasiten-abgeleiteten Resistenz.
Eines der attraktivsten Merkmale der Parasiten-abgeleiteten Resistenz ist, dass jeder neue Parasit oder jede Parasitenrasse, die zum Problem wird, gleichzeitig die spezifischen Gene mitbringt, die benötigt werden, um die Resistenz gegen sich selbst zu erzeugen. Diese Gene können in systematischer Weise im Genom des Parasiten identifiziert werden. Sobald derartige Gene identifiziert wurden, werden homologe Gene in anderen Parasitenrassen oder in verwandten Parasiten in schneller Weise durch DNA-Hybridisierungstechniken identifizierbar. Dadurch wird die Notwendigkeit eliminiert, wiederholte und aufwendige Forschungen in den Keimplasmapools des Wirtes vorzunehmen, um nach seltenen Wirts-Resistenzgenen zu suchen.
Ein anderer Hauptvorteil dieser Strategie ist, dass sie für die Wirtsfunktionen im allgemeinen nicht zerstörerisch sein sollten. Unter Verwendung von evolutionären Argumenten und Daten aus dem Bereich der Populationsgenetik hat von der Plank (1978) argumentiert, dass es Wirtsgene gibt, die die Suszeptibilität kontrollieren, da sie für die Wirtsfunktionen essentiell sind. Die meisten Wirte sind dagegen genetisch suszeptibel, da das Empfindlichkeitsallel in Bezug auf seine natürliche Funktion optimal ist. Wirts-abgeleitete Resistenzallele neigen deshalb dazu, die optimale Funktionsweise des Wirtes zu zerstören. In dem Ausmaß, in dem dies wahr ist, greifen verschiedene Wirts-abgeleitete Resistenzen das Pathogen indirekt dadurch an, dass ein optimales Wirtgenprodukt durch ein nicht-optimales Wirtsgenprodukt ersetzt wird, was für den Parasiten sich als nicht kompatibel erweist. Dies wird im Qβ-System beobachtet, in dem die Wirts- abgeleitete Resistenz wahrscheinlich dadurch erreicht wird, dass die Geschlechtspilibildung zerstört wird oder dass die Proteinsynthesemaschinerie des Wirtes beeinflusst wird. Eine ähnliche Situation liegt bei der Sichelzellenanämie vor, die für Menschen schädlich ist, wenn sie ausgebildet ist, die jedoch eine Resistenz gegenüber Malaria in den Personen hervorruft, die sowohl ein rezessives Sichelzellengen als auch ein normales Hämoglobingen besitzen. Die Ästhetik des Konzeptes der Pathogen-abgeleiteten Resistenz ist die, dass lediglich pathogene Zellfunktionen angegriffen werden und dass diese direkt angegriffen werden, was einen minimalen nachfolgenden Effekt auf den Wirt hat. Die Spezifität der Parasiten-abgeleiteten Resistenz ist nicht nur in Bezug darauf wünschenswert, dass sie nicht für den Wirt zerstörerisch ist, sondern auch dahingehend, dass sie für den Menschen nicht schädlich ist. Es wurde gezeigt, dass die Resistenz, die auf der Bildung von allgemein toxischen Verbindungen beruht, wie z. B. die natürlichen Pestizide vieler resistenter Pflanzentaxa, für den Menschen möglicherweise durch Aufnahme dieser Verbindungen schädlich ist (Ames, 1983). Die Spezifität der Parasiten-abgeleiteten Resistenz sollte in großem Ausmaß eine derartige Schädigung des Menschen ausschließen.
Es gibt Gründe anzunehmen, dass die Parasiten abgeleitete Resistenz im Vergleich zu der Wirts-abgeleiteten Resistenz relativ dauerhaft ist. Die Fähigkeit von Parasiten, Wirts- erzeugte allgemeine toxische Verbindungen zu umgehen, ist gut bekannt. Zusätzlich werden die spezifischen Wirts-abgeleiteten Resistenzgene häufig durch passende Gen-für-Gen-Mutationen in Bezug auf die Virulenz in Parasiten (Flor, 1971) überwunden. Im Falle der Wirts-abgeleiteten Qβ-Resistenz werden Veränderungen in den Wirts-Replikaseuntereinheiten (die sie mit der viralen Untereinheit inkompatibel machen, wodurch die Resistenz verliehen wird) einfach durch Mutationen in der Qβ-Replikaseuntereinheit ausgeglichen, die die Untereinheiten-Kompatibilität wiederherstellen, was eine Mutation in Richtung Virulenz darstellt. Derartige Gen-für-Gen- Mutationen, mit denen die Resistenz überwunden wird, sollten im Falle der Parasitenabgeleiteten Resistenz relativ selten sein. In diesem Fall hätte der Parasit üblicherweise mit einer neuen Resistenzform zu tun, die in seiner Evolution zuvor noch nicht auftauchte. Es ist wahrscheinlich, dass diese Resistenztypen vom Parasiten sehr schwierig überwunden werden können, insbesondere dann, wenn regulatorische Gene beteiligt sind. Wurde beispielsweise die Resistenz gegenüber Qβ von dem Qβ-Hüllprotein abgeleitet, könnte ein neuer virulenter Qβ-Stamm nur dadurch entstehen, dass zunächst eine neue Bindungsstelle im Replikasecistron durch Mutation entsteht (ohne dass die Replikasefunktion zerstört wird), an die das native Hüllprotein nicht binden würde. Gleichzeitig müsste ein neues Hüllprotein durch Mutation entstehen (ohne dass die Hüllproteinfunktion zerstört wird), das an die neue Bindungsstelle bindet. Eine derartige gleichzeitige und komplementäre Mutationsreihe (bei der sowohl die Hüll- als auch die Replikasefunktionen beibehalten werden) sollte extrem selten sein.
Schließlich sollte die Entwicklung einer Parasiten-abgeleiteten Resistenz auf einer molekularen Ebene beträchtlich einfacher sein als das Erzeugen einer vom Wirt abgeleiteten Resistenz. Hierfür gibt es eine Vielzahl von Gründen: (1) diese Strategie würde im allgemeinen auf der Molekularbiologie relativ einfacher Organismen mit kurzen Lebenszyklen basieren; (2) sie würde im allgemeinen lediglich die Identifikation und Isolation individueller Gene von kleinen Genomen erfordern; (3) die nicht-regulierte konstitutive Expression der Parasiten-abgeleiteten Resistenzgene würde üblicherweise effektiv sein; und (4) sie würde die komplexen multigenen Biosynthesewege vermeiden, die wahrscheinlich die Basis vieler existierender Wirts-abgeleiteter Resistenzen sind.
In Bezug auf den Parasiten-abgeleiteten Ansatz für eine Resistenz scheint es keinerlei offensichtliche Nachteile zu geben, mit der Ausnahme, dass die Anwendung der Strategie auf nicht-virale Parasiten nur dann möglich ist, wenn ein Mechanismus für einen makromolekularen Austausch zwischen Wirt und Parasit existiert. Die meisten Formen des Parasitismus, insbesondere diejenigen Formen, die eine Gen-für-Gen-Resistenz zeigen, weisen viele Möglichkeiten für Genprodukt-Interaktionen auf und werden für die Entwicklung und Erzeugung Parasiten- abgeleiteter Resistenz geeignet sein.

Techniken für die Erzeugung resistenter Wirte

Selbstverständlich ist es Fachleuten auf dem Gebiet der Gentechnologie möglich, mit Hilfe von Standardtechniken der Biotechnologie die hier beschriebenen Ziele zu erreichen. Beispielsweise kann der Schutz eines Wirtes gegenüber einem Virus einfach erzielt werden. Aufgrund der oben beschriebenen Gründe ist es nicht notwendig, das in den Wirt insertierte Gen zu identifizieren, obwohl die Identifikation des Gens die Anwendung des Verfahrens leichter macht. Im allgemeinen wird genetische Information (DNA oder RNA) von jeglichem Virus unter Verwendung von Standardverfahren isoliert und in Stücke verschiedener Längen, vorzugsweise enthaltend wenigstens 20 Nukleotide, wenn die DNA in einer Antisens-Richtung transkribiert werden soll oder wenigstens ein funktioneller Teil oder vorzugsweise ein gesamtes Gen, wenn das Gen exprimiert werden soll, gespalten. DNA-Fragmente werden typischerweise unter Verwendung von Restriktions-Endonukleaseenzymen erhalten. Das gleiche Enzym (oder die gleichen Enzyme) wird dann verwendet, um einen Vektor zu spalten, der in der Lage ist, in den Wirt zu replizieren, oder in der Lage ist, sich in ein Chromosom des Wirtes zu insertieren. Der Vektor kann ein natürlich vorkommendes Plasmid oder Transposon sein oder irgendein Teil davon, der in der Lage ist, im Wirt zu replizieren und, falls gewünscht, ein Genprodukt aus dem exogenen Parasitengenfragment zu bilden. Vektoren, die von Plasmiden abgeleitet sind, und andere Vektoren, die normalerweise in dem Wirt vorhanden sind, werden bevorzugt. Die virale DNA wird in den Vektor unter Verwendung von Standardtechniken entweder in einer Sens-Richtung (wenn die Expression eines Genproduktes gewünscht wird) oder einer Antisens-Richtung insertiert. Die geeignete Anordnung flankierender Sequenzen des Genfragmentes im Vektor (z. B. unter Verwendung geeigneter 5'- und 3'-flankierender Sequenzen, um die Regulation, die Transkription und die Translation in gewünschtem Maße sicherzustellen) wird in einfacher Weise unter Verwendung von Standardtechniken erreicht, insbesondere wenn eine einfache konstitutive Expression gewünscht wird, wie es in den meisten Fällen einer Parasiten-abgeleiteten Resistenz günstig ist. In der in dieser Anmeldung verwendeten Bedeutung umfasst der Begriff "Genfragment" sowohl ganze Gene, DNA-Segmente, die ein ganzes Gen oder ein Teil davon enthalten, und DNA- Segmente, die unvollständige Teile eines einzelnen Gens sind. Das Wort "Gen" umfasst sowohl DNA-Sequenzen, die für ein Peptidgenprodukt codieren, als auch andere DNA-Sequenzen, die einen funktionellen Teil auf einem Chromosom oder Plasmid bilden.
Obwohl diese Beschreibung sich im allgemeinen auf DNA alleine bezieht, wenn genetische Information, Vektoren oder dergleichen beschrieben werden, wird dies lediglich zur Vereinfachung getan. Jegliche Referenz auf DNA, wenn sie nicht explizit auf DNA und nicht auf RNA beschränkt ist, ist gleichermaßen auf RNA anwendbar. Zum Beispiel können pathogene RNA-Viren die Quelle/der Ursprung des Parasitengenfragments sein, und nicht-virulente RNA- Viren können als Vektoren dienen. In vielen Fällen ist es jedoch einfacher, mit DNA zu arbeiten als mit RNA (z. B. sind mehr DNA-Restriktionsendonukleaseenzyme bekannt), und die Verwendung von cDNA, die aus RNA hergestellt wird, ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, wenn die Resistenz gegenüber einem RNA-Virus erzeugt wird.
Nachdem ein Genfragment isoliert wurde, kann die DNA-Sequenz bestimmt und modifiziert werden, um, falls erwünscht, ähnliche DNA-Segmente zu erzeugen, die wie die gleichen oder ähnliche Genprodukte exprimiert werden können. Zum Beispiel können ein oder mehrere Codons durch äquivalente Codons ersetzt werden, um künstliche DNA-Fragmente zu erzeugen, die für das identische Genprodukt codieren. Alternativ kann ein Codon durch ein Codon ersetzt werden, das für eine ähnliche Aminosäure codiert (z. B. ein Codon für Leucin kann durch ein Codon für Isoleucin ersetzt werden oder ein Codon für Glutaminsäure kann durch ein Codon für Asparaginsäure ersetzt werden). Eine größere Modifikation des Genfragmentes ist möglich, wenn ein Genprodukt des Parasitengens gebildet wird. Zum Beispiel werden künstliche DNA- Sequenzen, die eine Reihe von Codons enthalten, die im wesentlichen äquivalent zu der Codonsequenz im Parasitengenfragment sind (d. h. die für die gleiche Aminosäure codieren) als vollständig äquivalent zu dem Parasitengenfragment erachtet, da sie das gleiche Genprodukt erzeugen werden, obwohl die DNA-Sequenz wesentlich verschieden sein kann. Genprodukte, die nicht identisch zum natürlichen Genprodukt sind, die jedoch die Fähigkeit beibehalten, ein Genprodukt zu bilden, das in der Lage ist, eine essentielle Aktivität des Parasiten zu zerstören, können durch systematische Modifikation von Codons (und somit der exprimierten Genprodukte), gefolgt von einem Austesten im Hinblick auf die Parasiten resistent erzeugt werden. Derartig modifizierte DNA-Segmente müssen im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil des isolierten Genfragmentes oder einer DNA-Sequenz, die funktionell dazu äquivalent ist, sein, um als Parasiten abgeleitete Resistenz betrachtet zu werden. Unter dem Begriff "substantielle Homologie" wird eine Identität zwischen der fraglichen DNA-Sequenz und der Sequenz, mit der diese verglichen wird, von wenigstens 80%, vorzugsweise wenigstens 90% und am meisten bevorzugt wenigstens 95%, verstanden. Identische Sequenzen werden mit dem gleichen Begriff abgedeckt. Vergleiche zum Zweck der Bestimmung von Homologie werden vorzugsweise über eine Sequenz von wenigstens 15 und mehr bevorzugt von wenigstens 21 Nukleotiden gemacht.
Der Begriff "Isolierung eines Genfragmentes" in der in dieser Anmeldung verwendeten Bedeutung bezieht sich auf das Verfahren zum Erhalt eines Genfragmentes, das verwendet wird, um Resistenz in einer nützlichen Form zu bilden. Das Genfragment muss nicht gereinigt oder in anderer Weise von anderen cellulären Komponenten abgetrennt werden, obwohl dies in vielen Verfahrensstufen stattfindet. Stattdessen wird der Begriff "isoliert" dazu verwendet, anzugeben, dass ein Gen in einer nützlichen Form in einem absichtlichen Prozess erhalten wurde. Zum Beispiel kann ein "isoliertes Genfragment" in einem Gemisch von Fragmenten aus der DNA eines Parasiten, das in einem shotgun-Clonierungsverfahren zu verwenden ist, existieren. Ein Genfragment ist also immer noch "isoliert", wenn es in Form eines rekombinanten Plasmids vorhanden ist, das in einem Bakterium vorhanden ist, das in einem shotgun-Clonierungsverfahren verwendet wird, um Produzenten der gewünschten Parasiten-Genprodukte zu identifizieren (zum Beispiel durch Verwendung monoclonaler Antikörper). Ebenso wird auch ein Segment einer gereinigten DNA, umfassend ein Parasiten-Gensegment und Enden von einem Clonierungsvektor (erhalten z. B. durch Clonieren eines Parasiten-Genfragmentes in ein bakterielles Plasmid vor der Insertion in den endgültigen Wirt) von diesem Begriff mit umfasst. Andere verwendbare Formen an Genfragmenten werden den Fachleuten auf dem Gebiet der Gentechnologie schnell bekannt werden.
Die Insertion des Parasiten-Genfragmentes in einen Wirt wird in einfacher Weise dadurch erreicht, daß der Wirt ein Bakterium oder ein anderer einzelliger Organismus ist, da die Hauptfortschritte, die jüngst in der Gentechnologie erzielt wurden, im allgemeinen die Insertion von Vektoren, enthaltend exogene Gene, in einzellige Wirte (insbesondere Bakterien und Hefen) beinhaltete. Dies ist in direkter Art und Weise für die vorliegende Methode anwendbar. Der Begriff "Insertion" umfasst jegliche Mittel zur Einführung genetischer Information in einen Wirtsorganismus, der mit den in dieser Beschreibung diskutierten Beschränkungen kompatibel ist. Eine Insertion auf eine Weise, mit der ein vererbbares Kennzeichen bereitgestellt wird, wird jedoch bevorzugt. In einzelligen Organismen kann dies in einfacher Weise unter Verwendung vererbbarer Plasmide oder durch Insertion des Parasiten-Genfragmentes in das Wirtsgenom erreicht werden. Diese Beispiele sind nicht begrenzend und andere Verfahren zur Insertion vererbbarer genetischer Information, egal ob in einzellige oder höhere Organismen, sind für die Durchführung dieser Erfindung in gleicher Weise anwendbar.
Nachgewiesene Verfahren zur Insertion neuer Gene in höhere Organismen können nun in der reichhaltigen aktuellen Literatur gefunden werden. Es existieren vier Grundverfahren, um dies durchzuführen (Baserga, Crose und Povera, Hrs., 1980): (1) direkte Aufnahme von DNA oder DNA-enthaltenden Teilchen durch die Zelle, (2) Zellfusion mit anderen Zellen oder Geistzellen, (3) Mikroinjektion und (4) infektiöse Transformation. Ein fünftes Verfahren wurde entwickelt, das die Verwendung beschleungter Hochgeschwindigkeitsteilchen einer Größe von einem Mikron, mit denen DNA in Zellen und Gewebe eingebracht wird, beinhaltet.
Die Aufnahmemechanismen schließen die folgenden ein: (1) Induktion einer erhöhten Membranpermeabilität durch Verwendung von Ca&spplus;&spplus; und Temperaturschock (Mandel und Higa, 1970; Dityakin et al., 1972); (2) Verwendung von Oberflächenbindungagentien, wie z. B. PEG (Chang und Cohen, 1970; Krens et al., 1982) oder Ca(PO&sub4;)&sub2; (Graham und von der Eb, 1973; Wigler et al., 1979); und (3) Phagocytose von Teilchen, wie Liposomen (Uchimaya et al., 1982), Organellen (Potrykus, 1973) oder Bakterien (Cocking, 1972) in die Zelle. Diese Aufnahmemechanismen beinhalten im allgemeinen die Suspension einzelner Zellen, wobei jegliche existierenden Zellwandmaterialien enzymatisch entfernt wurden. Die Aufnahmeprotokolle sind im allgemeinen ziemlich einfach und ermöglichen die Behandlung einer großen Anzahl von Zellen in Masse. In derartigen Systemen sind die meisten Zellen nicht betroffen, jedoch sind Zell- Selektionsverfahren verfügbar, um die seltenen Zellen zu ermitteln, die transformiert wurden (Powers und Cocking, 1977).
Die Fusionsmechanismen inkorporieren neues genetisches Material in eine Zelle dadurch, dass sie ihnen ermöglichen, mit anderen Zellen zu fusionieren. Eine Variation dieses Themas betrifft die Verwendung von Geistzellen. Man ermöglicht es der Membran getöteter Zellen, sich mit einer gegebenen DNA-Lösung anzufüllen, dass durch die Zellfusion die DNA von der Trägerzelle" in die lebende Zelle inkorporiert wird. Die Zell-Zell-Fusion kann mit Hilfe derartiger Dinge, wie z. B. PEG (Bajaj, 1982) und Sendal-Virusteilchen (Uchida et al., 1980) induziert werden. Wie auch für den Aufnahmemechanismus basieren die Fusionstechnologien auf der Verwendung von Einzelzellsuspensionen, wobei Zellen enzymatisch von jeglichen Zellwandsubstanzen befreit werden. Wenngleich die Fusionstechnologien in Bezug auf die Anzahl der betroffenen Zellen relativ gute Effizienzen haben, können die Probleme der Zellselektion komplexer sein, und die entstandenen Zellen zeigen typischerweise eine erhöhte Ploidität.
Mikroinjektionstechnologien verwenden extrem feine, ausgezogene Kapillarröhrchen, die Mikroelektroden genannt werden. Diese können ausreichend klein gemacht werden, so dass sie als Spritzennadel zur direkten Injektion biologischer Substanzen in bestimmte Typen individueller Zellen verwendet werden können (Diacumakos, 1973; Graessmann und Graessmann, 1983). Eine Modifikation der Mikroinjektion beinhaltet das Einstechen mit einer ausgezogenen Nadel aus festem Glas, die biologische Lösungen, die die Zellen baden, trägt (Yamomoto et al., 1981). Eine andere Modifikation wird Ionophorese genannt (Purres, 1981; Ocho et al., 1981); diese verwendet die Elektrophorese von Substanzen aus der Mikroelektrode heraus und in die Zeile hinein, und zwar als Alternative zu dem Hochdruck-Volumenfluss. Die Mikroinjektionsverfahren können extrem hohe Effizienzen bezüglich der Zufuhr in die Zelle ergeben. Deshalb wurde die Mikroinjektion bei der Transformation von individuellen Eizellen erfolgreich verwendet.
Bei einem anderen Beispiel wurde fremde DNA erfolgreich in die Baumwollpollenschläuche injiziert, ohne dass der Pollen beschädigt wurde oder seine Keimung inhibiert wurde. Obwohl dazu ein Resistenzgen von einer anderen Pflanze statt eines Parasitengens verwendet wurde, kann die gleiche Technik bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die DNA wurde in den Nukleus von Baumwollpollenkörnern, die auf Cellophan keimten, unter Verwendung von Mikromanipulatoren und eines Mikroinjektionssystems injiziert. Dieser Arbeitsvorgang wurde auf der fixierten Stufe eines invertierten Forschungsmikroskops durchgeführt, das mit einer Nomarski-differentiellen Interferenzoptik ausgestattet war. Fremd-DNA in einem rezipienten Nukleus wurde durch Epifluoreszens nach der Inkorporation eines Fluoreszensmarkers in das injizierte Material nachgewiesen. Die DNA wurde unter Verwendung eines "quickfill"-Röhrchens, das auf einen Spitzendurchmesser von 0,5 Mikron ausgezogen war, eingeführt, und die DNA wurde in den Nukleus ionophoretisch injiziert. Der keimende Pollen wurde zurückgegeben, wo er weiter wuchs und das Ei befruchtete. Pro Tag können 20 Injektionen durchgeführt werden. Samen von den mikroinjizierten Pflanzen wurden gepflanzt, und die Keimlinge wurden groß gezogen und durchgemustert. Die Durchmusterung kann durch Austesten des Vorhandenseins des Fremdgens mittels Southern Blotting oder des Vorhandenseins des Genprodukts durch Enzyminhibitionsassays durchgeführt werden. Andere Pflanzen können auf die gleiche Art und Weise behandelt werden.
Die infektiöse Transformation verwendet nicht-verletzende infektiöse Agentien des Wirts, wie z. B. Viren, die natürlicherweise einen Teil ihres Genoms in den Wirt übertragen. Bei Pflanzen ist die Hauptart und -weise der Transformation, die heute angewendet wird, die Verwendung des infektiösen Agens Agrobacterium tumefaciens. Dieses Bakterium kolonisiert natürlicherweise Zellen jeglicher dikotyledonen Pflanzen und überträgt eine spezifische "T-Region" seines Ti-Plasmids in das Pflanzenchromosom. In ähnlicher Weise können andere Pflanzensektoren, die für die Transformation von Pflanzen nützlich sind, verwendet werden. Die interessierenden Gene können nun mit Routineverfahren in die T-Region gentechnologisch eingebracht werden und können durch das Bakterium in die Pflanze übertragen werden (vergleiche Fraley et al., 1983). Es hat sich gezeigt, dass eine einfache Coinkubation (Kultivieren von Pflanzenzellen und Bakterienzellen zusammen) bei der Transformation von Pflanzenprotoplasten und Blattscheiben extrem effektiv ist, und in einer Vielzahl von Pflanzenarten wurden nunmehr ganze transformierte Pflanzen regeneriert (vergleiche Horsch et al., 1984).
Parasiten zur Verwendung im Rahmen dieser Erfindung sind Viren, wobei die Viren DNA- oder RNA-Viren sind.
Da im evolutionären Schema ein Wirt normalerweise höher steht als der Parasit, umfasst der Begriff "Wirt" kein Virus, das in dem evolutionären Schema unten steht. Jedoch kann jeglicher höherer Organismus von einem Parasiten infiziert werden. Die Erfindung ist z. B. einfach und sofort für Bakterien anwendbar, die in Kultur wachsen und die vor einer Infektion durch Bakteriophagen geschützt werden müssen. Zusätzlich können auch Pflanzen in schneller Weise vor Viren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Methode geschützt werden. Beispiele für Wirte schließen ein: Bakterien, leguminose Pflanzen (z. B. Sojabohnen), Getreide und Futterpflanzen (z. B. Mais, Weizen, Reis und Alfalfa), Nahrungspflanzen (z. B. Tomaten, Kartoffeln, Salat und Zwiebeln), Zierpflanzen (z. B. Rosen, Wacholder und Orchideen), Bäume (z. B. Kiefern, Fichten und Walnussbäume).
Beispiele für Wirts/Parasiten-Systeme, in denen entweder der Wirt oder der Parasit ein einzelliger Organismus ist (die am häufigsten vorkommende Situation) können in einer Vielzahl von mikrobiologischen Lehrbüchern und Nachschlagewerken gefunden werden, wie z. B. dem CRC Handbook of Microbiology, Condensed Edition, Laskin und Lechevalier (Hrs.), CRC Press, Cleveland, Ohio, 1974. Weitere Beispiele für Wirts/Parasiten-Systeme werden unten gezeigt, zusammen mit Beispielen, wie eine Resistenz gegenüber dem Parasiten in diesem System dem Wirt verliehen werden kann. Diese Beispiele sind nicht beschränkend, und viele andere Verfahren sind möglich, um eine Resistenz für jedes der aufgelisteten Systeme zu erzielen.
1) Es gibt eine Vielzahl von Bakterien, die bei industriellen Fermentationsprozessen wichtig sind, wie z. B. Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris und Lactobacillus-Arten. Während der Fermentation ist die Infektion durch verschiedene Bakteriophagen ein häufiger Grund für das Scheitern der Fermentation. Eine bakterielle Resistenz gegenüber derartiger Bakteriophageninfektion kann durch Verfahren erzielt werden, die exakt zu den oben beschriebenen Verfahren zur Erzeugung einer Resistenz gegenüber dem Qβ-Bakteriophagen in E. coli analog sind.
2) Es gibt Hunderte signifikanter Pflanzen-RNA-Viren, und im wesentlichen alle Feldfruchtarten werden von einem oder mehreren derartigen Viren befallen. Eine Resistenz gegenüber derartigen Viren kann auf eine Art und Weise erhalten werden, die der Qβ-Resistenz in Bakterien eng analog ist, und zwar dadurch, dass Fragmente der Viren in Pflanzentransformierende Vektoren, wie z. B. ein modifiziertes Ti-Plasmid, cloniert werden und die geeigneten Pflanzen transformiert werden. Pflanzen, die durch verschiedene Genfragmente transformiert wurden, können dann im Hinblick auf die Resistenz durchgemustert werden, indem etablierte Pflanzen-Züchtungstechniken verwendet werden. Einige weniger relevante Viren beinhalten das Alfalfa-Mosaikvirus, das Brom-Mosaikvirus, das Barley-yellow-dwarf-Virus, das Beet-yellow-Virus, das Cucumer-Mosaikvirus, das Lettuce-necrotic-yellows-Virus, das Maizechlorotic-dwarf-Virus, das Pea-enation-Virus, die Kartoffelviren S, X und Y, das Southernbean-Mosaikvirus, das Tomato-ringspot-Virus, das Tobacco-ringspot-Virus, das Tobacco- Mosaikvirus, das Tobacco-streak-Virus, das Turnip-yellow-Mosaikvirus und das Wundtumorvirus.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen allgemeinen Verfahren, die zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle und transformierter einzelliger Organismen gemäß der Durchführung dieser Erfindung verwendet werden können, können andere bekannte Techniken und Modifikationen davon verwendet werden, um die Erfindung praktisch durchzuführen. Insbesondere entwickelten sich Techniken, betreffend die genetische Manipulation in jüngster Vergangenheit in explosiver Art und Weise. Viele aktuelle U.S. Patente beschreiben Plasmide, genetisch modifizierte Mikroorganismen und Verfahren zum Durchführen genetischer Manipulationen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Zum Beispiel beschreibt das U.S. Patent 4 273 875 ein Plasmid und ein Verfahren zur Isolation desselben. Das U.S. Patent 4 304 863 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Bakterien durch genetische Manipulation, bei dem ein hybrides Plasmid konstruiert wird und verwendet wird, um einen bakteriellen Wirt zu transformieren. Das U.S. Patent 4 419 450 beschreibt ein Plasmid, das als Clonierungsvehikel bei der rekombinanten DNA-Arbeit von Nutzen ist. Das U.S. Patent 4 362 867 beschreibt rekombinante cDNA-Konstruktionsmethoden und Hybridnukleotide, die dadurch hergestellt werden, und die bei Clonierungsverfahren von Nutzen sind. Das U.S. Patent 4 403 036 beschreibt genetische Reagentien, um Plasmide zu erzeugen, die multiple Kopien an DNA-Segmenten enthalten. Das U.S. Patent 4 363 877 beschreibt rekombinante DNA- Transfervektoren. Das U.S. Patent 4 356 270 beschreibt ein rekombinantes DNA- Clonierungsvehikel und dieses Patent ist eine besonders nützliche Beschreibung für diejenigen mit beschränkter Erfahrung auf dem Gebiet der genetischen Manipulation/Biotechnologie, da es viele der Begriffe, die in der genetischen Manipulation/Biotechnologie verwendet werden, und die Grundverfahren definiert. Das U.S. Patent 4 336 336 beschreibt ein fusioniertes Gen und ein Verfahren, um dieses herzustellen. Das U.S. Patent 4 349 629 beschreibt Plasmidvektoren und deren Herstellung und Verwendung. Das U.S. Patent 4 332 901 beschreibt einen Clonierungsvektor, der bei rekombinanter DNA von Nutzen ist. Obwohl einige dieser Patente auf die Bildung eines bestimmten Genprodukts ausgerichtet sind, das nicht im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt, so können doch die darin beschriebenen Verfahren in einfacher Weise für die Durchführung der in dieser Beschreibung beschriebenen Erfindung durch die Fachleute auf dem Gebiet der genetischen Manipulation/der Biotechnologie modifiziert werden.
Alle Patente und andere Publikationen, die in dieser Beschreibung zitiert werden, zeigen das Ausmaß des Könnens und der Kenntnisse der Fachleute auf dem Gebiet, in dem die vorliegende Erfindung liegt.
Zusätzlich zu dem Verfahren und zur Herstellung einer Resistenz gegenüber einem Parasiten, das oben im Detail beschrieben wurde, umfasst diese Erfindung Wirtszellen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden, wie auch rekombinante Vektoren und andere Produkte biotechnologischen Arbeitens, die für die Durchführung der Erfindung von Nutzen sind.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird dieselbe unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele besser verstanden werden; diese Beispiele werden hier nur zum Zweck der Darstellung aufgenommen und dienen nicht dazu, die Erfindung oder irgendeine Ausführungsform der Erfindung zu beschränken, wenn nicht anders angegeben.

BEISPIEL

Die Durchführbarkeit des oben beschriebenen Systems wurde mit Experimenten bewiesen, bei denen der Bakteriophage Qβ und sein Wirt, E. coli, verwendet wurde. Unter Verwendung von Qβ-cDNA-Clonen (Qβ ist ein RNA-Phage) wurden zuerst Plasmide konstruiert oder erhalten, die Teile der Qβ-cDNA in E. coli exprimieren und eine Resistenz verleihen.
Hüllprotein: Das Plasmid, das für die Bildung des Hüllproteins verwendet wurde, war pGL101 und wurde von R. B. Winter (Cell 33, 877) erhalten. Dieses Plasmid exprimiert das Hüllprotein unter der Kontrolle des lac-Operators, so dass seine Expression durch IPTG induziert werden kann (obwohl es auch eine konstitutive Expression gibt). Dieses Plasmid, wie auch die anderen unten beschriebenen Plasmide, enthält das Gen, das für ampr codiert.
Testen im Hinblick auf die Resistenz: Der Stamm GM1 (von R. W. Webster bereitgestellt) wurde mit pUR222 oder einem der oben beschriebenen Testplasmide transformiert. Diese Stämme wurden angezüchtet, kompetent gemacht, mit Qβ inkubiert und dann in Softagar ausplattiert. Die Anzahl der Plaques und die Größen der Plaques wurden bestimmt, um zu ermitteln, ob sich eine Resistenz entwickelt.
In einem anfänglichen Experiment zur Austestung des Hüllproteins wurden GM1 + pUR222 und GM1 + pGL101 in 10 ml L-Brühe, enthaltend Ampicillin, in IPTG kultiviert. Bei der stationären Phase wurden die Kulturen pelletiert und in 4 ml 50 mM YCaCl&sub2; resuspendiert. Ein kleiner Teil, 0,1 ml, dieser Ausplattierungskultur wurde während 60 Minuten mit 107 plaquebildenden Einheiten Qβ inkubiert. Dann wurde auf YT-AMP-Platten in 3 ml Softagar mit IPTG ausplattiert. Die Ergebnisse waren, dass die GM1 + pUR222-Platten tausende von Plaques hatten, die bald (24 Stunden) die Platte überfluteten; die GM1 + pGL101-Platte zeigte zunächst keine Plaques, jedoch entwickelten sich später viele sehr kleine Plaques.
Um die Möglichkeit zu überprüfen, dass die GM1-Stamm + pGL101-Resistenz auf den Verlust des F'-Elementes zurückzuführen war, wurden die Stämme im folgenden auf Minimalmedium kultiviert, dem Prolin fehlte, um die Selektion für das F' aufrechtzuerhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Hüllproteinplasmide konnten eine Resistenz gegenüber Qβ-Infektion verleihen. Dieses Experiment wurde zweimal mit im wesentlichen den gleichen Ergebnissen wiederholt. Nach kontinuierlicher Passage rearrangierten jedoch die Plasmide, die Qβ-cDNA-Sequenzen enthielten, oder aber diese Plasmide gingen verloren. Zusätzlich wurde pGL101 bei höherem Titer (10¹¹ plaquebildende Einheiten) getestet; es führte immer noch zur Resistenz. Die auf die Hülle zurückzuführende Resistenz von den RNA-Phagen f1 und f2 wurde getestet. GM1 mit pGL101 war resistent gegenüber f2, nicht jedoch gegenüber f1, wie man, betrachtet man ihre Infektionsweisen, hätte erwarten können. Tabelle 1

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Claims

1. Verfahren, um einem pflanzlichen oder bakteriellen Wirt eines viralen Parasiten Resistenz gegenüber diesem viralen Parasiten zu verleihen, umfassend die folgenden Stufen:

a) Isolierung einer viralen Nukleotidsequenz, die für ein virales Protein, ein modifiziertes virales Protein oder eine virale Proteinkomponente des genannten viralen Parasiten codiert, wobei das Produkt der viralen Nukleotidsequenz in der Lage ist, die Infektion des Wirts durch den viralen Parasiten zu zerstören;

b) Insertion der viralen Nukleotidsequenz oder eines DNA- oder RNA-Segments, das im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der viralen Nukleotidsequenz ist, oder einer DNA- oder RNA-Sequenz, die funktionell äquivalent zu der viralen codierenden Sequenz ist, in den pflanzlichen oder bakteriellen Wirt, durch Erzeugung einer rekombinanten DNA oder RNA oder eines funktionell äquivalenten Vektors, der in der Lage ist, in die Wirtschromosomen zu integrieren, so dass er in stabiler Weise repliziert oder als Episom erhalten bleibt; und

c) Expression der viralen Nukleotidsequenz oder der DNA- oder RNA-Sequenz in Zellen des pflanzlichen oder bakteriellen Wirts, wobei essentielle Funktionen, die unter der Kontrolle der Parasitengene stehen, durch das Vorhandensein des Expressionsproduktes im Wirt zerstört werden, wobei das Expressionsprodukt dysfunktional ist, im Überschuss vorliegt oder in falschem Kontext erscheint oder in einer falschen Entwicklungsstufe im Lebenszyklus des Parasiten erscheint.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Insertion die Transformation des pflanzlichen oder bakteriellen Wirts mit einem Vektor, der die Nukleotidsequenz enthält, umfasst, wobei der Vektor in der Lage ist, in stabiler Weise im Wirt zu replizieren, oder die Nukleotidsequenz in der Lage ist, in das Chromosom des Wirts zu insertieren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt ein Bakterium ist und der Parasit ein Virus ist, das in der Lage ist, das Bakterium zu infizieren.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Plasmid oder Transposon, das in dem Wirt gefunden wird, oder ein Teil des Plasmids oder Transposons, das in der Lage ist, als Vektor zu wirken, ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirt eine Pflanze ist und dass der Parasit ein virulentes Virus ist, das in der Lage ist, die Pflanze zu infizieren.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Plasmid, ein transponierbares Element oder ein nicht-schädliches Virus ist, das in dem Wirt gefunden wird, oder ein Teil des Plasmids, transponierbaren Elementes oder Virus, das in der Lage ist, die Pflanze zu infizieren.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens oder ein Teil davon, der in der Lage ist, als Vektor für die Transformation einer Pflanze zu wirken, ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die virale Nukleotidsequenz, die in den Stufen a), b) bzw. c) isoliert, insertiert bzw. exprimiert wird, eine Sequenz ist, die für ein modifiziertes virales Protein oder eine virale Proteinkomponente codiert.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die virale Nukleotidsequenz oder ein DNA- oder ein RNA-Segment, das im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der viralen Nukleotidsequenz ist, oder eine DNA- oder RNA-Sequenz, die funktionell äquivalent zu der viralen Nukleotidsequenz ist, die in den Stufen b) bzw. c) insertiert bzw. exprimiert wird, eine Sequenz ist, die für ein virales Hüllprotein oder eine modifizierte virale Replikase codiert.

10. Zellen eines pflanzlichen oder bakteriellen Wirts, die gegenüber einem viralen Parasiten des pflanzlichen oder bakteriellen Wirts resistent sind, wobei eine virale Nukleotidsequenz, die aus dem viralen Parasiten isoliert wurde und die für ein virales Protein, ein modifiziertes virales Protein oder einen viralen Proteinbestandteil codiert, wobei das Produkt der viralen Nukleotidsequenz in der Lage ist, die Infektion des Wirts durch den viralen Parasiten zu zerstören, oder ein DNA- oder RNA-Segment, das im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der genannten viralen Nukleotidsequenz ist, oder eine DNA- oder RNA-Sequenz, die funktionell zu der viralen Nukleotidsequenz äquivalent ist, unter Erzeugung einer rekombinanten DNA oder RNA oder eines funktionell äquivalenten Vektors, der in der Lage ist, in das Wirtschromosom zu integrieren, insertiert wurde, so dass er in stabiler Weise repliziert oder als Episom aufrechterhalten wird und die virale Nukleotidsequenz oder das DNA- oder RNA-Segment oder die DNA- oder RNA-Sequenz exprimiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressionsprodukt der insertierten viralen Nukleotidsequenz oder eines DNA- oder RNA-Segments, das im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der viralen Nukleotidsequenz ist, oder einer DNA- oder RNA-Sequenz, die im wesentlichen äquivalent zu der viralen Nukleotidsequenz ist, essentielle Funktionen zerstört, die unter der Kontrolle der Gene des Parasiten stehen, wobei das Expressionsprodukt dysfunktional ist, im Überschuss vorliegt oder im falschen Kontext oder in einer falschen Entwicklungsstufe im Lebenszyklus des Parasiten erscheint.

11. Zellen eines pflanzlichen oder bakteriellen Wirts nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die virale Nukleotidsequenz oder ein DNA- oder RNA- Segment, das im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der viralen Nukleotidsequenz ist, oder eine DNA- oder RNA-Sequenz, die im wesentlichen äquivalent zu der viralen Nukleotidsequenz, die in den Wirt insertiert wurde und in diesen exprimiert wird, ist, eine Sequenz ist, die für ein virales Hüllprotein oder eine modifizierte virale Replikase codiert.

12. Pflanze, die gegenüber einem viralen Parasiten der Pflanze resistenz ist, wobei eine virale Nukleotidsequenz, die von dem viralen Parasiten isoliert wurde und die für ein virales Protein, ein modifiziertes virales Protein oder eine virale Proteinkomponente codiert, wobei das Produkt der viralen Nukleotidsequenz in der Lage ist, die Infektion der Pflanze durch den viralen Parasiten zu zerstören oder ein DNA- oder RNA-Segment im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der viralen Nukleotidsequenz ist oder eine DNA- oder RNA-Sequenz, die funktionell äquivalent zu der viralen Nukleotidsequenz ist, unter Bildung einer rekombinanten DNA oder RNA oder eines funktionell äquivalenten Vektors, der in der Lage ist, in das Pflanzenchromosom so zu integrieren, dass er in stabiler Weise repliziert oder als Episom aufrechterhalten wird, insertiert wurde und die virale Nukleotidsequenz oder das DNA- oder RNA-Segment oder die DNA- oder RNA-Sequenz exprimiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Expressionsprodukt der insertierten viralen Nukleotidsequenz oder das DNA- oder RNA-Segment, das im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der viralen Nukleotidsequenz ist, oder die DNA- oder RNA-Sequenz, die funktionell äquivalent zu der viralen Nukleotidsequenz ist, essentielle Funktionen zerstört, die unter Kontrolle der Gene des Parasiten stehen, wobei das Expressionsprodukt dysfunktional ist, im Überschuss vorliegt, im falschen Kontext erscheint oder zu einer falschen Entwicklungsstufe im Lebenszyklus des Parasiten erscheint.

13. Pflanze nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die virale Nukleotidsequenz oder ein DNA- oder RNA-Segment, das im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der viralen Nukleotidsequenz ist, oder eine DNA- oder RNA-Sequenz, die funktionell äquivalent zu der viralen Nukleotidsequenz ist, die insertiert wurde und in der Pflanze exprimiert wird, eine Sequenz ist, die für ein virales Hüllprotein oder eine modifizierte virale Replikase codiert.