DE3689802T2

DE3689802T2 - "Hervorrufung somatischer Veränderungen in Pflanzen durch Verwendung von minussträngigen RNAs".

Info

Publication number: DE3689802T2
Application number: DE3689802T
Authority: DE
Inventors: Kenneth A Barton; Francis P Mccormick; William F Swain
Original assignee: Agracetus Inc
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1985-10-16
Filing date: 1986-10-10
Publication date: 1994-11-17
Anticipated expiration: 2006-10-11
Also published as: BR8605043A; AU6392486A; US6617496B1; AU607122B2; DE3689802D1; EP0223399A1; ATE104699T1; EP0223399B1; CA1341556C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Anwendung rekombinanter DNA-Technologie zur genetischen Transformation von höheren Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Strategie zur Hervorrufung somatischer Veränderungen in höheren Pflanzen durch Verwendung von RNA-Minussträngen, um die Genexpression in Pflanzen zu kontrollieren oder um andere nützliche somatische Effekte zu erzielen, wie Resistenzen gegenüber Krankheiten.
Es ist nunmehr möglich geworden, Fragmente genetischen Materials, d. h. DNA, in vitro zu konstruieren und diese Fragmente zur Transformation in Plasmide einzuschleusen, die in Bakterien enthalten sind. Es ist ebenfalls möglich geworden, in bakteriellen Plasmiden klonierte Fragmente zu verwenden oder vollständige Gene zu klonieren, wobei die Plasmide als Vektoren bekannt sind, die solche Fragmente oder Gene in andere Zellen einschleusen können. Es sind geeignete Vektoren entwickelt worden, die verwendet werden können, um individuelle Pflanzenzellen genetisch zu transformieren, aus denen vollständige intakte Pflanzen regeneriert werden können. Es ist dokumentiert worden, daß fremde Gene stabil in das Genom von Pflanzenzellen insertiert werden können, und daß aus diesen vollständige, intakte, somatisch normale und hinsichtlich der Reproduktion kompetente Pflanzen regeneriert werden können. K.A. Barton et al., Regeneration of Intact Tobacco Plants Containing Full-Length Copies of Genetically Engineered T-DNA, and Transmission of T-DNA to R1 Progeny, Cell, 32, 1033 (April 1983). Forscher haben berichtet, daß sie in der Lage gewesen sind, vollständige Fremdgene in Pflanzenzellen einzuführen und in diesen Pflanzenzellen eine Genexpression zu erreichen in der Erwartung, daß die Zellen sich an vollständigen, intakten Pflanzen regenerieren lassen. Europäische Patentanmeldung EP-A-0 126 546; PCT-Anmeldungen Nr. WO84/02920 und WO84/02913, beide eingereicht am 16. Januar 1984 (Fraley). Im allgemeinen werden insertierte Gene in Pflanzen lediglich dann ihre Funktion entfalten, wenn sie mit pflanzeneigenen, für Pflanzensysteme geeigneten Genkontrollregionen als chimäre Insertionen konstruiert werden.
Die meisten der gegenwärtig zur Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen angewendeten Strategien beinhalten die Modifikation von Pflanzenzellen auf zellulärer Ebene durch Anwendung bis natürlichen Pflanzen-transformierenden Agens Agrobacterium tumefaciens, das die natürliche Fähigkeit besitzt, dikotyle Pflanzen zu infizieren und einen bestimmten Bereich der DNA (bezeichnet mit T-DNA) von A. tumefaciens in die Pflanzenzelle zu übertragen. Es sind andere Techniken zur Transformation individueller Pflanzenzellen wie insbesondere Protoplasten von sowohl dikotylen als auch monokotylen Pflanzen vorgeschlagen worden, bei denen A. tumefaciens nicht eingesetzt wird. Das grundsätzliche Hindernis bei der erfolgreichen gentechnischen Veränderung einer großen Zahl von Pflanzenspezies liegt derzeit in der Schwierigkeit, viele Pflanzenspezies ausgehend von einer Kallus-Kultur oder von Protoplasten zu regenerieren. Bei denjenigen Spezies, für die gegenwärtig Regenerationstechniken zur Verfügung stehen, kann eine genetische Transformation von kultivierten Zellen zu einer vollständigen Fremdgen-Expression in intakten und ansonsten normalen Pflanzen erfolgen. Bei Pflanzen- Spezies, für die derzeit noch keine Regenerationstechniken zur Verfügung stehen, wird eine regelmäßige genetische Transformation von intakten Pflanzen dieser Pflanzenspezies eine übliche Praxis werden, sobald diese Techniken entwickelt worden sind.
Sobald es möglich ist, eine Pflanzenspezies gentechnisch zu verändern, stellt sich die Frage, welche logischen genetischen Transformationen in der Pflanze erreicht werden können, um die Pflanze für die normalerweise vorgesehenen Anwendungen in der Landwirtschaft oder im Gartenbau geeigneter zu machen. Eine übliche Strategie zur Nutzbarmachung der Gentechnologie bei Pflanzen ist die Einführung exogener Proteingene in Pflanzen, um in der Pflanze die Expression eines Proteins herbeizuführen, das für ein oder mehrere Ziele geeignet ist, wie Krankheitsresistenz, Insektenresistenz, enzymatische Aktivität, Nützlichkeit als Nahrungsinhaltsstoff, etc.
Die vorliegend beschriebene Erfindung stellt eine alternative Strategie bereit zur Anwendung der Gentechnologie bei Pflanzen, um nützliche somatische Veränderungen in Pflanzen hervorzurufen, ohne irgendwelche exogenen Proteine zu exprimieren, sondern stattdessen die Expression eines endogenen Proteins oder das Verhalten eines Proteingens oder eines anderen DNA- oder RNA- Faktors zu kontrollieren, die auf natürliche Weise durch äußere Agenzien wie Krankheitserreger oder infektiöse Agenzien in die Pflanzenzellen eingeführt worden sind.
Es ist zuvor erkannt worden, daß künstlich hergestellte Minusstrang-RNAs in vivo mit komplementären RNAs hybridisieren. Dieses Phänomen ist genutzt worden, um die regulatorischen Mechanismen der Genexpression in E. coli zu untersuchen. Mizuno et al., Regulation of Gene Expression by a Small RNA Transcript (mic RNA) in Escherichia coli K-12, 10 Proc. Japan Acad. 59, Ser. B, Seiten 335-338 (1983); Mizuno et al., A Unique Mechanism Regulating Gene Expressions: Translational Inhibition by a Complementary RNA Transcript (mic RNA), 81; Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Seiten 1966-1970 (1984).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung nützlicher genetischer Transformationen von Pflanzen, um in diesen Pflanzen sinnvolle somatische Veränderungen hervorzurufen, ohne in spezifischer Weise exogene Proteine zu exprimieren. Das Verfahren beinhaltet das Einführen von DNA-Sequenzen in das Pflanzengenom, die konstruiert worden sind für die Transkription von Minusstrang-RNA, welche im wesentlichen komplementär ist gegenüber endogenen Target- oder auf natürliche Weise eingeführten RNA-Strängen, deren Funktion inhibiert werden soll, um entweder die Expression eines endogenen Proteingens oder die Funktion einer auf natürliche Weise eingeführten RNA oder DNA zu verhindern, wie es bei bestimmten Typen von parasitären oder krankheitserregenden Infektionen der Fall ist.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung einer Strategie zur gentechnischen Veränderung von Pflanzen, um Pflanzen mit nützlichen somatischen Eigenschaften zu schaffen, ohne notwendigerweise die Expression exogener Proteine hervorzurufen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Kontrolle der endogenen Genexpression in Pflanzen im allgemeinen.
Andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
Bei den Zeichnungen ist:
Fig. 1 ein schematisches Diagramm, in dem die Restriktionsenzymkarte für das Plasmid pOM5H2, einem Ausgangsmaterial in einem der erfindungsgemäßen Beispiele, dargestellt ist;
Fig. 2 ein schematisches Diagramm der RNA des Tabakmosaikvirus;
Fig. 3 ein schematisches Diagramm, in dem die Plasmidmanipulationen gemäß eines im folgenden Beispiel 1 detailliert dargelegten Verfahrens dargestellt sind;
Fig. 4 ein schematisches Diagramm, in dem die Plasmidmanipulationen gemäß einer im folgenden Beispiel 1 detailliert ausgeführten alternativen Methode dargestellt sind; und
Fig. 5 ein schematisches Diagramm, in dem die im folgenden Beispiel 2 detailliert dargelegten Plasmidmanipulationen dargestellt sind.
Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Erfindung eine verallgemeinerte Strategie zur Hervorrufung von somatischen Veränderungen in höheren Pflanzen durch Verwendung von DNA-Sequenzen, die in das Genom der Pflanzen eingeführt worden sind, um die Transkription spezifischer RNA-Minusstränge zu verursachen, die mit ausgewählten RNA-Targetsträngen hybridisieren, um die Translation, die Reverse Transkription, oder eine andere Wirkung oder Funktion der RNA-Targetsequenz selektiv zu inhibieren. Die Hybridisierung des RNA-Minusstranges mit der Target-RNA kann direkt angewendet werden zur Kontrolle (d. h. Hemmung) der Expression eines endogenen Gens, wenn der RNA-Targetstrang ein mRNA-Transkript eines in einer Pflanzenzelle normalerweise exprimierten Gens ist. Diese Erfindung kann ebenfalls angewendet werden zur Hemmung bestimmter Krankheitsabläufe, wie die Reverse Transkription, Translation, oder Replikation einer viralen RNA- Sequenz. Sie kann sich ferner nützlich erweisen als ein Genregulator zur Regulation der Genexpression über die Hybridisierung mit RNA-Strängen, die sonst bei dem Prozessieren der RNA mit Promotoren oder Supressoren oder anderen Regulatoren hybridisieren können.
Unter normalen, nukleären Bedingungen in vivo ist die DNA doppelsträngig, und die Transkription der DNA zur Bildung der RNA ist im allgemeinen asymmetrisch. Die Asymmetrie bedeutet, daß der Transkriptionspromotor in bezug auf ein Ende einer DNA-Kodierungssequenz in der Weise orientiert ist, daß lediglich ein Strang der DNA transkribiert wird. Die durch eine derartige normale Transkription gebildete RNA ist vermutlich für den Organismus nützlich und wird mit RNA-Plusstrang bezeichnet. Die RNA- Sequenz, die das Basenpaar-Komplement eines RNA-Plusstranges ist, wird mit RNA-Minusstrang bezeichnet. Der RNA-Minusstrang kann gebildet werden durch Transkription des in bezug auf den normalerweise transkribierten Strang gegenüberliegenden DNA- Stranges. Aufgrund der Asymmetrie der Promotor-Transkriptionsinitiation wird der gegenüberliegende DNA-Strang natürlicherweise nicht transkribiert. Die Herstellung eines RNA-Minusstranges beinhaltet daher die Bildung chimärer Gene, die Transkriptionsregulierende Signale auf einer doppelsträngigen DNA-Sequenz in der entgegengesetzten oder umgekehrten Orientierung in bezug auf diejenige aufweisen, die normalerweise den RNA-Plusstrang bildet.
Der hier verwendete Begriff des RNA-Minusstranges bezieht sich auf einen von einer in spezieller Weise konstruierten DNA-Sequenz kodierten spezifischen RNA-Strang, der eine wesentliche Komplementarität gegenüber einem zuvor ausgewählten RNA-Targetstrang aufweist. Der komplementäre Bereich des RNA-Minusstranges muß in ausreichender Länge und mit ausreichender Komplementarität zu der RNA-Targetsequenz vorliegen, damit unter normalen cytoplasmatischen Bedingungen eine Sequenzerkennung der ausgewählten RNA-Targetsequenz erfolgt. Die Sequenzerkennung wird normalerweise in Form einer Hybridisierung der RNA-Plus- und -Minusstränge erfolgen, um den RNA-Plusstrang zu inaktivieren, kann aber auch andere RNA/RNA-Interaktionen einschließen, die dazu dienen, mit der Aktivität des RNA-Plusstranges zu interferieren.
Der hier verwendete Begriff einer Minus-RNA/DNA-Sequenz betrifft eine chimäre DNA-Sequenz, die in spezifischer Weise konstruiert und daran angepaßt ist, in einem Pflanzentranskriptionsvektor verwendet zu werden, um eine Pflanze dahingehend zu transformieren, daß sie veranlaßt wird, einen vorher ausgewählten RNA-Minusstrang zu transkribieren. Die Minus-RNA/DNA-Sequenz erfordert einen Promotor, um die Transkription der RNA-Minussequenz zu initiieren. Die Transkription selbst erfolgt auf normale Weise, obgleich der dem gewöhnlich transkribierten Strang gegenüberliegende DNA-Strang transkribiert wird. Die Minus-RNA/DNA-Sequenz kann Polyadenylierungs- oder Ribosomenbindungssequenzen einschließen oder auch nicht. Sofern gewünscht wird, daß die reversen RNA-Sequenzen im Cytosol der Pflanzenzellen konstitutiv sind, kann ein Polyadenylierungssignal oder eine andere Form eines Signals zum Prozessieren oder Terminieren des 3'-Endes geeignet sein.
Die erfindungsgemäß verwendete Target-RNA bezieht sich auf endogene oder natürlicherweise vorkommende RNA-Sequenzen. Die endogenen Sequenzen werden typischerweise mRNA-Sequenzen sein, die während der Expression eines in dem Pflanzengenom enthaltenen endogenen oder gentechnisch hergestellten Gens gebildet werden. Andere endogene RNA-Sequenzen schließen snRNAs, scRNAs, rRNAs, tRNAs, etc. ein. Andere natürlicherweise auftretende RNA-Targetsequenzen sind - der Verwendung des Begriffes entsprechend - RNA-Sequenzen, die in die Pflanzenzelle über natürliche biologische Mechanismen wie Parasitismus oder Krankheit eingeführt worden sind. Beispiele schließen die RNA von Viren und RNAs ein, die durch DNA bakteriellen Ursprungs gebildet werden.
Die dargelegten Beispiele zur Ausführung der vorliegenden Erfindung beziehen sich in spezifischer Weise auf Tabakpflanzen und Expressionsvektoren, die in dikotylen Pflanzen arbeiten. Tabak wurde ausgewählt als Modellsystem für diese Beispiele in erster Linie aufgrund der gegebenen Möglichkeit zur Regeneration von Tabakpflanzen aus transformierten individuellen Tabakzellen auf mittlerweile bekannte Weise. Die hier eingesetzten Expressionsvektoren sind nachweislich in der Lage, in Zellen vieler dikotylen Pflanzen sowohl in Gewebekultur als auch in vollständigen Pflanzen zu operieren. Die hier dargelegte Erfindung ist demgemäß bei dikotylen Spezies ausführbar, um individuelle Pflanzenzellen zu transformieren, und um vollständige, intakte Pflanzen dikotyler Pflanzenspezies zu erhalten, die aus transformierten Pflanzenkalli regeniert werden können. Auf diejenigen Spezies, die derzeit nicht regenerierbar sind, ist die vorliegende Erfindung vollständig anwendbar, sobald die Techniken für eine derartige Regenerierung entwickelt worden sind. Hinzu kommt, daß chimäre Expressionsvektoren ebenfalls bekannt und in der Literatur dahingehend beschrieben worden sind, daß sie ihre Funktion in Zellen einiger monokotyler Pflanzen ausüben können, insbesondere in Mais oder Getreide zumindest in der Gewebekultur. Es ist daher vernünftig davon auszugehen, daß diese Vektoren auch in vollständigen monokotylen Pflanzen arbeiten werden, sobald die Techniken zur Regenerierung dieser Pflanzen entwickelt sind. Die vorliegende Erfindung ist demnach sowohl auf monokotyle als auch dikotyle Pflanzen anwendbar. Es liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die Aktivität des RNA-Minusstranges eine somatische Veränderung in der regenerierten vollständigen Pflanze und ihren Nachkommen hervorrufen soll. Diese somatische Veränderung kann morphologisch sein, wie bei der Hemmung der Expression eines endogenen Gens, oder sie kann eine somatische Veränderung sein, die sich lediglich auf dem Wege einer Provokation der Pflanze ausprägt, wie zum Beispiel Resistenzen gegenüber Krankheit, Trockenheit oder anderen Streßfaktoren.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche beispielhaft aber nicht beschränkend sein sollen, besser verständlich.

Beispiel 1

Krankheitsresistenz

Tabakmosaikvirus-RNA

Dieses Beispiel bezieht sich auf die Hemmung des zellulären Krankheitsprozesses, der durch Invasion des Tabakmosaikvirus ausgelöst wird. Das Tabakmosaikvirus (TMV) ist ein Pflanzenvirus mit einem RNA-Plusstrang, dessen RNA während des Krankheitsverlaufs in der infizierten Zelle translatiert und repliziert wird. Der RNA-Plusstrang von TMV wird in das Cytosol einer infizierten Pflanzenzelle injiziert. Zwei Gene auf dem RNA-Plusstrang werden anschließend translatiert, um zwei Proteinprodukte zu bilden, die wiederum die Produktion eines minussträngigen Komplements der TMV-RNA auslösen. Der Komplementstrang dient als Matrize für die Replikation des Plusstranges, während zwei weitere subgenomische RNA-Plusstränge in andere Proteine translatiert werden, wovon eines das Hüllprotein ist. Die replizierten RNA-Plusstränge werden von den Hüllproteinen verpackt, um neue TMV zu bilden.
Die Strategie dieses Beispiels liegt in der Transformation von Pflanzenzellen, damit sie in konstitutiver Weise RNA-Minusstränge transkribieren, die mit dem RNA-Targetstrang hybridisieren, wobei der RNA-Targetstrang in diesem Falle die TMV-RNA selbst (der Plusstrang) ist. Die Target-RNA von TMV wird durch Hybridisieren in effektiver Weise neutralisiert, so daß sie entweder durch die TMV-Wirtsfunktionen nicht repliziert oder durch die Wirtsfunktionen nicht translatiert wird. Auf diese Weise ist es beabsichtigt, die pflanzliche Resistenz gegenüber einer Infektion mit Tabakmosaikvirus zu verstärken und ein Modell zu schaffen zur Induktion ähnlicher Resistenzen in Pflanzen gegenüber einer Virusinfektion oder jedweder Pathogenese, bei der das Funktionieren einer pathogenen Nukleinsäure in einer Zelle der Wirtspflanze eine Rolle spielt.
Es ist ein Plasmid beschrieben worden, das eine cDNA-Sequenz enthält, die das reverse Transkript eines großen Teils der RNA des Tabakmosaikvirus ist. Dieses Plasmid ist bekannt als pOM5H2 (Meshi et al., Virology, 118 : 64-65 (1982)). Eine Restriktionenzymkartierung des Plasmids pOM5H2 ist in der Fig. 1 dargestellt. Die Beziehung zwischen der cDNA-Sequenz von pOM5H2 und der vollständigen TMV-RNA ist in Fig. 2 dargestellt. Das cDNA-Segment ist ungefähr 2 kilobasen lang und enthält ungefähr 1/3 der vollständigen viralen Sequenz, beginnend vom 3'-Ende. Die cDNA-Sequenz schließt die 3' nicht-kodierende Region ein, über die im Zusammenhang mit anderen verschiedenen, aber ähnlichen Viren berichtet worden ist, daß sie spezifische, einmalige strukturelle Merkmale aufweist, die für die virale Replikation in der infizierten Zelle wesentlich sind (Ahlquist et al., Plant Mol. Biol., 3 : 37-44 (1984).). Aus der Position der Restriktionsstellen im Plasmid pOM5H2, die aus dem Verfahren zur Herstellung des Plasmids und von der aus anderen cDNA-Klonen von TMV-Sequenzen abgeleiteten TMV-Sequenz bestimmt werden können, wird deutlich, daß durch Verdau mit der Restriktionsendonuklease Pst I das vollständige cDNA-Insert erhalten wird, welches somit intakt aus dem Plasmid herausgelöst werden kann. Alternativ führt ein Verdau des Plasmids mit dem Restriktionsenzym Hinf I zu mehreren Fragmenten. Eines der Fragmente aus dem Verdau mit Hinf I, bezeichnet mit Hinf IB (dargestellt in Fig. 1), repräsentiert die Nukleotidposition 5698 bis 6365 der Sequenz des Genoms vom Tabakmosaikvirus und enthält die für das Hüllprotein kodierende Region, 11 Nukleotide am 5'-Ende der Sequenz, die nicht-kodierend sind, und einen signifikanten Bereich (174 von 203 Basenpaaren) der nicht-kodierenden Replikationssequenz am 3'-Ende der kodierenden Region. Damit wurden ausgehend vom Vektor pOM5H2 zwei alternative Techniken angewendet, um RNA-Minusstränge zu erhalten, die geeignet sind zur Hemmung einer erfolgreichen Invasion einer Wirtspflanzenzelle durch ein eindringendes TMV- Virus. Eine Technik bestand darin, die Konstruktion eines Minus- Transkripts des Pst I-Fragments herbeizuführen, welches demgemäß ein 2 kb langer Minusstrang sein würde, der mit dem 1/3 der 3' gelegenen viralen RNA in der Zelle hybridisieren könnte. Die andere Technik bestand darin, daß Hinf IB-Fragment zu verwenden, um die Konstruktion eines Minustranskripts der für das Hüllprotein kodierenden Region zu veranlassen, damit es während der Proteinsynthese mit dem Hüllprotein-Bereich der viralen RNA oder mit der mRNA für das Hüllprotein hybridisiert. Beiden Techniken wurden angewendet.

RNA-Minusstrang des Hüllproteins

Das durch Verdau von pOM5H2 mit Hinf I geschaffene Hinf IB-Fragment wurde von dem Hinf I-Verdau durch Elektrophorese abgetrennt. Das Fragment wurde anschließend mit T4 DNA-Polymerase behandelt, um Fragmente mit glatten Enden herzustellen. Die resultierenden Fragmente mit glatten Enden wurden dann glattendig mit dem Plasmid pUC12 ligiert, welches zuvor mit Hinc II verdaut worden war. Das Produkt dieser glattendigen Ligation ist ein Plasmid pCMC1050, das das pOM5H2 Hinf IB-Fragment, flankiert von mehreren einmaligen Restriktionsstellen, enthielt. Die allgemeine Vorgehensweise ist in Fig. 3 veranschaulicht.
Das rekombinante Plasmid pCMC1050 wurde anschließend mit den Restriktionsenzymen Pst I und Bam HI gespalten, um zwei Fragmente zu schaffen, von denen das kleinere für die Ligation mit pCMC66 ausgewählt und isoliert wurde. Das Plasmid pCMC66 ist ein intermediärer Expressionsvektor mit der Promotorsequenz und der Polyadenylierungssequenz des Nopalinsynthasegens von A. tumefaciens, welches in Pflanzen funktionell ist, insertiert in einen Vektor, der über geeignete einmalige Restriktionsstellen verfügt, die neben der Promotor- und der Polyadenylierungssequenz lokalisiert sind. Der Vektor pCMC66 war zuvor mit Pst I und Bgl II gespalten worden. Die Ligation führte zu einem mit pCMC1054 bezeichneten Plasmid, welches das TMV Hinf IB-Fragment in einer in bezug auf die Leserichtung der Nopalinsynthasepromotor- und Polyadenylierungssequenzen umgekehrten Orientierung trägt. Die Orientierung des Hinf IB-Fragments in pCMC1054 wird festgelegt durch die auf dem Fragment verbliebenen Restriktionsstellenenden, die eine Ligation mit dem gespaltenen pCMC66 lediglich in der gewünschten umgekehrten Orientierung erlauben. Mit "umgekehrt" ist hier gemeint, daß die normale Leserichtung des TMV-Fragments gegenüber der normalen Transkriptionsrichtung von sowohl der Promotor- als auch der Polyadenylierungssequenz des Wirtsvektors entgegengesetzt orientiert ist. Das Plasmid pCMC1054 ist ein intermediäres Transkriptions- und Expressionsplasmid, welches konstruiert wurde, um die Transkription eines RNA-Minusstranges zu ermöglichen, der gegenüber dem von der Kodierungsregion des TMV-Genoms für das Hüllprotein kodierten RNA-Target-Transkript komplementär ist. Ferner enthält das von diesem Vektor kodierte RNA-Minusstrang-Transkript ebenfalls eine Region, die gegenüber einem wesentlichen Bereich der 3' nichtkodierenden Region des TMV-Genoms komplementär ist.
Um den intermediären Expressionsvektor pCMC1054 für den Transfer in ein Pflanzengenom herzustellen, wurde das Plasmid mit dem Restriktionsenzym Sal I gespalten, und ein Transfervektor pCMC92 wurde ebenfalls mit Sal I geschnitten. Der Transfervektor pCMC92 enthält die T-DNA-Borderregionen aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens und enthält ferner ein für Kanamycinresistenz kodierendes Gen (APH 3' II), das in Pflanzen und Pflanzenzellen in der Weise wirkt, daß Pflanzenzellen aufgrund einer Kanamycinresistenz selektiert werden können, die die transformierende DNA stabil auf genommen und exprimiert haben. Die T-DNA-Borderregionen sind in den Fig. 3-5 durch Pfeile und die Bezeichnungen RB (rechte Borderregion) und LB (linke Borderregion) angegeben. Das Plasmid pCMC92 schließt ferner eine Reihe von Restriktionsstellen (SstI, SmaI/Xmal, BamHI, XbaI, SalI) stromaufwärts des APH 3' II-Gens ein. Das APH 3' II-Gen in pCMC92 beinhaltet eine geeignete Promotor (Nopalinsynthase)- und Terminationssequenz (ebenfalls Nopalinsynthase). Die beiden Fragmente werden miteinander ligiert, um einen Pflanzenexpressionsvektor zu bilden, der mit pCMC1060 bezeichnet ist und in der Fig. 3 unten veranschaulicht wird. Der Expressionsvektor pCMC1060 enthält das Antibiotikaresistenzgen (APH 3' II) zusammen mit einer Expressionskassette, die aus der Nopalinsynthase (Nos)-Promotor- und Polyadenylierungssequenz besteht, welche in umgekehrter Orientierung zur TMV-Sequenz einschließlich der kodierenden Region für das Hüllprotein vorliegen. Zusätzlich enthält der Vektor natürlich die Borderregionen der T-DNA des Ti-Plasmids von A. tumefaciens.
Nach Bestätigung der Struktur von pCMC1060 wurden das Plasmid enthaltende E. coli-Zellen mit dem A. tumefaciens-Stamm LBA4404 konjugiert, und es erfolgte eine bevorzugte Auswahl von A. tumefaciens-Konjugauten, die das Plasmid pCMC1060 beinhalteten. Der resultierende A. tumefaciens-Stamm wurde eingesetzt zur Transformation von Tabakgewebe der Varietät Havanna 425 mittels bekannter Stengelinokulation. Die Selektion von mittels Stengelinokulation transformierten Tabakzellen erfolgte hinsichtlich der Resistenz gegenüber Kanamycin in Gewebekultur. Die resultierenden Kulturen wurden nachfolgend analysiert und zeigten eine Expression des durch den Antibiotikaresistenzmarker (Aminoglycosid 3'-Phosphotransferase II) exprimierten Gens. Die Kulturen wurden hinsichtlich des Transformationsmarkerproteins erfolgreich analysiert, und es wurden anschließend Kalluskulturen dieser transformierten Zellen unter Anwendung üblicher Techniken zu vollständigen, intakten Pflanzen regeneriert.
Zehn der durch Transformation mit pCMC1060 hergestellten regenerierten Tabakpflanzen wurden anschließend einer Provokation mit Tabakmosaikvirus ausgesetzt. Die Pflanzen wurden mittels einer standardisierten Vorgehensweise mit einem üblichen TMV-Stamm inokuliert. Das Virus wurde in einer wäßrigen Lösung in einem Puffer vermischt. Feines Korund wurde anschließend als Schleifmittel mit dem Virus vermischt. Ein Tupfer wurde dann in die Mischung aus Virus und Schleifmittel getaucht und an einer Hälfte eines Blattes der Tabakpflanze gerieben. Die Dichte der Viren in der Pufferlösung wurde experimentell auf einen Level eingestellt, durch den ungefähr 100 Läsionen pro Blatt einer nichttransformierten Havanna 425 Kontrolltabakpflanze hervorgerufen werden. Diese Dichte entspricht etwa einer optischen Dichte. Mehrere Blätter einer jeden Pflanze wurden inokuliert. Havanna- Tabakpflanzen sind normalerweise TMV-Wirte mit lokalen Läsionen, was bedeutet, daß eine Infektion zu kleinen lokalisierten Läsionen führt. Es war demgemäß die Absicht, die Pflanzen mit TMV zu inokulieren und über die Gesamtzahl und Größe der Läsionen eine Messung der quantitativen Wirksamkeit der pflanzlichen Resistenz gegenüber TMV sicherzustellen. Von den 24 regenerierten transformierten und auf diese Weise exponierten Pflanzen zeigten die meisten eine Anzahl von Läsionen, die mit derjenigen von Kontrollpflanzen vergleichbar ist, d. h. im Bereich von 100 pro Blatt. Es wäre zu erwarten gewesen, daß die transformierten Pflanzen hinsichtlich ihrer Wirksamkeit der Expression des chimären Gens aufgrund der zufälligen Natur der Insertion des chimären Gens in das pflanzliche Genom in hohem Maße variieren würden. Acht Pflanzen zeigten eine ungewöhnliche Reaktion auf die Inokulation, was auf ein Ausmaß einer quantifizierbaren Resistenz gegenüber einer Infektion durch das Virus hinweist.
Diese acht Pflanzen zeigten Läsionszahlen, die verglichen mit den Kontrollpflanzen im Durchschnitt nur 1/10 so hoch (d. h. im Bereich von 10) lagen. Dies ist ein Hinweis darauf, daß diese acht Regenerate eine Maßnahme der Resistenz gegenüber TMV aufzeigten. Diese Regenerate werden gegenwärtig vermehrt, um sicherzustellen, daß die Eigenschaft vollständig vererbbar ist.

Alternativer RNA-Minusstrang für TMV

Ein ähnliches Verfahren wurde ebenfalls für das Pst I-Fragment von pOM5H2 angewendet. Das Plasmid pOM5H2 wurde mit Pst I gespalten, und das kleinere der resultierenden Fragmente wurde mit dem Expressionsplasmid pCMC66 ligiert, welches zuvor ebenfalls mit Pst I gespalten worden war. Zwei Plasmide wurden durch diese Vorgehensweise erhalten, die sich lediglich in der Richtung ihrer Orientierung des TMV-Fragments in bezug auf den Wirtsbereich von pCMC66 unterschieden. Die beiden Plasmide wurden mit pCMC1052 und pCMC1053 bezeichnet. Beide Plasmide wurden einer Restriktionskartierung unterzogen, die ergab, daß pCMC1052 das TMV-Fragment in bezug auf die Nopalinsynthase-Promotorregion und die Polyadenylierungssequenz in umgekehrter Richtung aufwies. Mit anderen Worten war wiederum beabsichtigt, daß der Promotor in bezug auf die normale Leserichtung des Gens entgegengesetzt orientiert ist, so daß die Transkription des Gens zu einem RNA- Minusstrang führt, der gegenüber dem natürlichen viralen RNA- Strang komplementär ist.
Nach Erhalt von pCMC1052 waren die resultierenden Plasmidmanipulationen identisch mit den zuvor für pCMC1050 beschriebenen, wobei pCMC1050 und seine Nachkommen durch pCMC1052 und dessen Nachkommen ersetzt wurden, wodurch ein Pflanzenexpressionsvektor geschaffen wurde, der mit pCMC1061 bezeichnet wurde. Die resultierenden transformierten Pflanzen sind regeneriert worden und werden in einer ähnlichen Weise analysiert, wie zuvor für die mit pCMC1060 transformierten Pflanzen beschrieben.

Beispiel 2

Hemmung der endogenen Genexpression - Nopalinsynthase

Zum Nachweis der Fähigkeit, die Expression eines endogenen Gens zu hemmen, wurden Tabakpflanzen ausgewählt, die ein endogenes Gen für Nopalinsynthase (Nos) aufwiesen. Dieses Gen ist normalerweise in Tabakpflanzen nicht vorhanden, es ist aber auf dem Wege der genetischen Manipulation in eine Linie von somatisch normalen, fertilen, stabilen Tabakpflanzen eingeführt worden, die das intakte Nopalinsynthasegen auf ihre Nachkommen über die normale genetische Vererbung übertragen (Barton et al., Cell, 32 : 1033-1043 (1983)). Demgemäß kann dieses Gen und seine Expression für die Zwecke des Aufzeigens dieses Prinzips als in dieser Pflanzenlinie endogen vorhanden betrachtet werden. Um die Hemmung der phenotypischen Expression dieses endogenen Modellgens aufzuzeigen, wurde ein chimäres Gen konstruiert, das die Synthese eines RNA-Minusstranges steuert, der gegenüber einem großen Bereich der mittleren Region der Nopalinsynthase-Boten RNA (mRNA) komplementär ist. Das ausgewählte Fragment wies eine Länge von 824 Basenpaaren auf. Dieses chimäre Gen wurde konstruiert und in das Genom von Zellen dieser Pflanzenlinie eingeführt, welche als HADH-Pflanzen bezeichnet werden.
Die Konstruktion des chimären Gens und des Transferplasmids zur Transformation von Pflanzenzellen mit dem Gen ist in Fig. 5 dargestellt. Ein Fragment des Nopalinsynthasegens wurde aus einem Plasmid pCMC1 durch doppelten Verdau mit Cla I und Sph I hergestellt. Das Fragment wird von den anderen Genfragmenten mittels Elektrophorese abgetrennt und mit dem Plasmid pUC18 ligiert, das zuvor mit Acc I und Sph I gespalten worden war. Das mit pUCNos bezeichnete Ergebnis dieser Ligation enthielt das Nopalinsynthase-Fragment, flankiert von mehreren geeigneten und für das Plasmid einmaligen Restriktionsstellen. Das Fragment des Nopalinsynthasegens enthielt innerhalb des repräsentierten Plasmids mehr als die Hälfte der Gesamtlänge des Nopalinsynthasegens.
Das Plasmid pUCNos wurde anschließend mit Hind III und Sma I gespalten, um zwei Fragmente zu ergeben, von denen das kleinere ausgewählt wurde. Das Fragment wurde in einer Orientierungsspezifischen Weise mit dem Expressionsvektor pCMC60 ligiert, welcher zuvor mit Hind III und Sma I gespalten worden war, um eine mit pCMC60Nos bezeichnete intermediäre Expressionskassette für einen RNA-Minusstrang zu ergeben, der gegenüber der Nos mRNA komplementär ist.
Um den Vektor zur Transformation von Pflanzenzellen herzustellen, wurde das Plasmid pCMC60Nos mit Xho I gespalten. Das resultierende Fragment wurde mit zwei Vektoren, nämlich pCMC91 und pCMC92, ligiert, welche zuvor mit Sal I gespalten worden waren. Da es zwei Richtungen gibt, in denen das Nos-Gen in jeden der beiden Vektoren insertiert werden könnte, wurden vier Transfervektoren hergestellt und mit 91 NosRA, 91NosRB, 92NosRA bzw. 92NosRB bezeichnet, wobei sich die Zahlen 91 und 92 auf den bei der Konstruktion eingesetzten Transfervektor beziehen. Die Angaben A und B beziehen sich auf die beiden möglichen Orientierungen des Nos-RNA-Minusstranges, der von der Expressionskassette gebildet wird, in bezug auf die Orientierung des dominanten selektierbaren Markers (Kanamycin-Resistenzgen-APH 3' II).
Tabakstengel der Varietät HADH wurden inokuliert und Transformanten wurden hinsichtlich einer Kanamycinresistenz wie im obigen Beispiel 1 beschrieben ausgewählt. Es wurden Transformantenkulturen hergestellt und identifiziert, die vermutlich durch das chimäre Gen transformiert worden sind, das für den RNA-Minusstrang für das Nos-Gen kodiert. Diese Kulturen wurden alle hinsichtlich der Produktion von Nopalin analysiert, und es stellte sich heraus, daß sie kein Nopalin produzierten.
Die folgenden Plasmide sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke der Patentverfahren und der damit zusammenhängenden Bestimmungen (Budapester Vertrag) hinterlegt worden und werden demgemäß aufrechterhalten und stehen gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages zur Verfügung. Die Verfügbarkeit derartiger Stämme bedeutet jedoch keine Lizenz zur Ausführung der Erfindung und verstößt gegen die Rechte, die von den Behörden jeder Regierung in Übereinstimmung mit deren Patentgesetzen erteilt worden sind.
Der Hinterlegung von Plasmiden sind die angegebenen ATCC-Hinterlegungsnummern zugeordnet worden. Die Plasmide sind ebenfalls bei der Master Culture Collection (CMCC) der Cetus Corporation, Emeryville, California, USA, hinterlegt und mit den folgenden CMCC-Hinterlegungsnummern bezeichnet worden. Plasmid CMCC-Hinterlegungs-Nr. ATCC-Hinterlegungs-Nr.
Die oben angegebenen Plasmide pCMC1060 und pCMC1061 veranschaulichen nicht nur die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, sondern lassen sich auch zur Verwendung als Vektoren zur Ausführung der hier für andere RNA-Targetstränge dargelegten Methode anpassen. Zum Beispiel kann das Plasmid pCMC1061 in einfachster Weise mit Sal I gespalten werden, um zwei kleinere Plasmide pCMC1052 und pCMG92 zu erhalten, was eine Umkehr des letzten Schrittes der Fig. 4 bedeutet. Das Plasmid pCMC66 kann durch Verdau mit Pst I aus pCMC1052 gewonnen werden. Die beiden Plasmide pCMC66 und pCMC92 können dann mit jedweder DNA-Sequenz, die für eine interessierende Target-RNA kodiert, verwendet werden, um ein Expressions- und Transferplasmid zu konstruieren, welches in der Lage ist, die Transkription des gewünschten RNA-Minusstranges in Pflanzenzellen herbeizuführen.
Die Erfindung erfaßt ferner eine in morphologischer Hinsicht normale Pflanze, die Zellen umfaßt, welche in ihrem Genom eine chimäre DNA-Sequenz aufweisen, die die Transkription eines RNA- Minusstranges verursacht, der ausreichend komplementär gegenüber einem RNA-Targetstrang ist, damit sich der RNA-Minusstrang in spezifischer Weise mit dem RNA-Targetstrang assoziiert, um die Aktivität des RNA-Targetstranges in den Pflanzenzellen zu inhibieren.
Der RNA-Targetstrang kann eine Boten-RNA sein und die inhibierte Aktivität ist die Expression eines endogenen Gens in den Pflanzenzellen. Alternativ kann der RNA-Targetstrang mindestens ein Teil der RNA eines Virus sein.
Die chimäre DNA-Sequenz in den Pflanzenzellen kann einen normalerweise in Pflanzenzellen arbeitenden Promotor und eine 3' vom Promotor lokalisierte DNA-Kodierungssequenz umfassen, die für mindestens einen Teil des DNA-Targetstranges kodiert, wobei die DNA-Kodierungssequenz in bezug auf den Promotor entgegengesetzt zu ihrer normalen Leserichtung orientiert ist. Die chimäre DNA- Sequenz kann ferner eine Polyadenylierungssequenz umfassen, die normalerweise in Pflanzen arbeiten kann und 3' von der transkribierten Sequenz lokalisiert ist.
Die von diesen Pflanzen produzierten Samen liegen ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung.

Claims

1. Verfahren zur Hervorrufung von somatischen Veränderungen in höheren Pflanzen, umfassend die folgenden Schritte:

- Einführen einer DNA-Sequenz einschließlich eines normalerweise in Pflanzenzellen arbeitenden Promotors und einer 3' vom Promotor lokalisierten kodierenden Sequenz in eine Pflanze, wobei die kodierende Sequenz in Bezug auf den Promotor entgegengesetzt zu ihrer normalen Leserichtung orientiert ist, wobei die kodierende Sequenz die Transkription einer Minusstrang-RNA verursacht, die gegenüber einem endogenen RNA-Targetstrang ausreichend komplementär ist; oder

- Einführen einer DNA-Sequenz, die die Transkription einer Minusstrang-RNA mit ausreichender Komplementarität zu einem pathogenen RNA-Targetstrang aufweist, in eine Pflanze;

- wobei die ausreichende Komplementarität derart ist, daß die Minusstrang-RNA in effektiver Weise an den RNA-Targetstrang bindet, um die Aktivität des RNA-Targetstrangs in vivo zu inhibieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der RNA-Targetstrang eine Boten-RNA ist und die inhibierte Aktivität die Expression eines endogenen Proteins ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der RNA-Targetstrang mindestens ein Teil einer pathogenen RNA ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der RNA-Targetstrang die RNA vom Tabakmosaikvirus ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Schritt des Einführens der DNA-Sequenz in die Pflanze die folgenden Schritte umfaßt:

- Herstellung eines Expressionsvektorplasmids einschließlich eines normalerweise in Pflanzenzellen arbeitenden Promotors und einer DNA-Sequenz, die für mindestens einen Teil der 3' vom Promotor lokalisierten Target-DNA kodiert, in einem Bakterium, wobei die DNA-Sequenz in Bezug auf den Promotor entgegengesetzt zu ihrer normalen Leserichtung orientiert ist,

- Transformation von Pflanzenzellen in Kultur mit dem Expressionsvektor von dem Expressionsvektorplasmid, so daß die transformierten Pflanzenzellen den RNA-Minusstrang transkribieren, und

- Regeneration der transformierten Pflanzenzellen zu vollständigen Pflanzen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Transformationsschritt die folgenden Schritte einschließt:

- Konjugation des Expressionsvektorwirtes mit A. tumefaciens,

- Auswahl von A. tumefaciens-Transkonjuganten, und

- Infektion von Pflanzenzellen mit dem ausgewählten A. tumefaciens.

7. In Pflanzen arbeitende chimäre Genkonstruktion, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt

- eine normalerweise in Pflanzenzellen arbeitende Promotorsequenz, und

- eine DNA-Kodierungssequenz, die 3' vom Promotor lokalisiert ist und für mindestens einen Teil eines normalerweise in Pflanzenzellen aktiven RNA-Targetstrangs kodiert, wobei die DNA-Kodierungssequenz in Bezug auf den Promotor entgegengesetzt zu ihrer normalen Transkriptionsrichtung orientiert ist, so daß das chimäre Gen die Transkription eines RNA-Minusstrangs verursacht, welcher komplementär zu mindestens einem Teil des RNA- Targetstrangs ist, so daß die Aktivität des RNA-Targetstrangs in vivo inhibiert wird.

8. Chimäres Gen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner eine normalerweise in Pflanzen arbeitende, 3' von der DNA-Kodierungssequenz lokalisierte Polyadenylierungssequenz umfaßt.

9. Morphologisch normale Pflanze, die in ihrem Genom eine chimäre Genkonstruktion gemäß Anspruch 7 oder 8 umfaßt.

10. Samen einer morphologisch normalen Pflanze, wobei der Samen in seinem Genom eine chimäre Genkonstruktion gemäß Anspruch 7 oder 8 umfaßt.