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Hintergrund der Erfindung
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Die Kombination genetisch erzeugter
Bakterienzellen und rekombinanter Plasmide ist die Grundlage der
industriellen Biotechnologie. Sie wird beispielsweise zur Herstellung
industriell und medizinisch wichtiger Proteine, wie Enzyme, Cytokine,
Wachstumsfaktoren und Antigene, als auch lebender Bakterienimpfstoffe
verwendet. Seit Beginn der DNA-Immunisierungs- und Gentherapietechnologien
wurde der Verwendung genetisch erzeugter Bakterienzellen und deren
Begleiter, der rekombinanten Plasmide, eine weitere Dimension hinzugefügt. Bei
diesen Technologien ist die Expression von Proteinen in genetisch
erzeugten Bakterienzellen nicht länger das Hauptziel; dies ist
hingegen die Replikation und hochgradige Produktion strukturell
und genetisch stabiler rekombinanter Plasmide mit fremder DNA. Dies
liegt daran, dass die DNA anstelle eines darin kodierten Proteins
das gewünschte
Produkt ist, das man bei DNA-Immunisierungs- oder Gentherapien einsetzt.
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Folglich betrifft die vorliegende
Erfindung die Verwendung genetisch erzeugter Bakterienzellen und deren
Gefährten,
der rekombinanten Plasmide, für
die Klonierung fremder DNA. Insbesondere stellt die Erfindung ein
Verfahren bereit, mit dem fremde, für die Verwendung in der DNA-Immunisierungs-
und Gentherapie geeignete DNA repliziert und in großen Mengen
durch diese Gefährten,
die rekombinanten Plasmide, erzeugt werden kann.
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In einem frühzeitigen Entwicklungsstadium
der rekombinanten DNA-Technologie wurde erkannt, dass eine Hauptherausforderung
dieser aufsteigenden Technologie darin bestand, rekombinante Plasmide
stabil in Bakterienzellen zu halten. Es wurde auch erkannt, dass
dieses Problem größtenteils
auf die schwerwiegende metabolische Last zurückzuführen ist, die genetisch erzeugten
Bakterienzellen auferlegt wird, und zwar als Folge einer hochgradigen
Expression für
sie wertloser Proteine.
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Daher treten bei der Vermehrung genetisch
erzeugte Bakterienzellen, die keinen Anreiz haben, das rekombinante
Plasmid zu behalten, im Laufe der Zeit Plasmid-freie Bakterienzellen
mit zunehmender Häufigkeit
auf. Aufgrund der schwereren metabolischen Last auf Plasmid-haltige
Bakterienzellen haben Plasmid-freie Bakterienzellen höhere Wachstumsgeschwindigkeiten.
Demnach kann die Bakterienkultur innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums
von Plasmid-freien Bakterienzellen dominiert sein, wodurch sich
die Plasmidausbeute verringert.
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Da Plasmid-haltige Bakterienzellen
fast immer einen Wachstumsnachteil im Vergleich zu Plasmid-freien
Bakterienzellen haben, wird jede Plasmid-freie Bakterienzelle, die
während
ausgedehnter Kulturperioden auftritt, schließlich den Fermentations-Bioreaktor übernehmen.
Diesbezüglich
wird angenommen, dass ein 10%-iger Wachstumsvorteil für Plasmid-freie
Bakterienzellen bei einer Verdünnungsrate
von 1 Stunde pro Liter innerhalb von 150 Stunden in Kultur zur Übernahme
des Bioreaktors führt,
selbst wenn die Plasmidverlust-Häufigkeit
nur 1 × 10–7 beträgt. Diese
Berechnungen unterstreichen den Bedarf an einem Plasmidstabilisationssystem,
das den Plasmidverlust mit 100%-iger Wirksamkeit verhindern kann,
da es nicht unüblich
ist, dass Bakterienzellen in industriellen Bioreaktoren kontinuierlich über 300
Stunden kultiviert werden.
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Diese Beobachtungen zeigen, dass
es ohne den Selektionsdruck, der rekombinante Plasmide in vermehrten,
genetisch erzeugten Bakterienzellen hält, zu einer geringeren Häufigkeit
Plasmid-haltiger Bakterienzellen kommt und dass der Plasmidverlust
ferner durch die langsamere Wachstumsgeschwindigkeit von Plasmid-haltigen
Bakterienzellen verstärkt
wird.
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Mehrere Verfahren wurden entwickelt,
mit denen man die Stabilität
rekombinanter Plasmide in Bakterienzellpopulationen verbessern kann.
All diese Verfahren haben ein gemeinsames Grundprinzip: die Ausübung von
Selektionsdruck zur Sicherung des Wachstums und das Manipulieren
nur solcher Bakterienzellen, die das rekombinante Plasmid enthalten.
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In einem dieser Verfahren wird ein
Selektionsdruck auf die Bakterienzellen ausgeübt, indem man das gewünschte Gen
in ein rekombinantes Plasmid kloniert, welches auch ein oder mehrere
Gene mit einer Resistenz gegen bestimmte Antibiotika enthält. Die
Zugabe des oder der bestimmten Antibiotika in die Kultur der wachsenden
Bakterienzellen sichert daher, dass nur diejenigen, die das rekombinante
Plasmid enthalten, überleben.
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Obwohl Antibiotikaresistenz-Gene
sehr nützlich
und wirksam zur Bereitstellung eines Mittels für die Stabilität rekombinanter
Plasmide sind, hat ihre Verwendung schwerwiegende Nachteile. Erstens
ist die Zugabe von Antibiotika zu Kulturmedium während der Fermentation auf
industriellem Maßstab
sehr teuer. Zweitens können
in manchen Fällen,
bei denen der Mechanismus der Antibiotikaresistenz auf der Sekretion
einer Antibiotika hemmenden Verbindung beruht, einige Plasmid-freie
Bakterienzellen über leben,
da benachbarte Plasmid-haltige Bakterienzellen ausreichende Mengen
der Antibiotika-hemmenden Verbindung in das Kulturmedium abgeben,
so dass sowohl die Plasmid-haltigen als auch die Plasmid-freien
Bakterienzellen überleben
können.
Drittens wird die Verwendung rekombinanter Plasmid-DNA mit Antibiotikaresistenz-Genen
bei der DNA-Immunisierungs- und Gentherapie als nachteilig betrachtet,
da solche Gene in das tierische Genom oder in das Genom endogener
Mikroflora inkorporiert werden können.
Viertens können
zurückbleibende
Antibiotika, welche die Plasmid-DNA kontaminieren (als Folge davon,
dass man sie in das Kulturmedium zugibt) die Empfindlichkeit und/oder
systemische allergische Reaktionen in bestimmten Tieren, die mit
solcher Plasmid-DNA behandelt werden, hervorrufen.
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Als Alternative zur Verwendung von
Antibiotikaresistenz-Genen wurden mehrere Verfahren entwickelt, um
die Stabilität
rekombinanter Plasmide zu verbessern und die Anreicherung Plasmid-freier
Bakterienzellen zu verhindern. Der gemeinsame Faden in diesen Verfahren
liegt darin, das Überleben
der genetisch erzeugten Bakterienzellen mit Hilfe eines Plasmid-stämmigen Gens
von einem funktionalen Komplementationssystem abhängig zu
machen.
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Diese bekannten Verfahren können je
nach Typ des von dem verwendeten Gen kodierten Polypeptids in drei
Gruppen geteilt werden. Diese bekannten Verfahren sind jedoch alle
entweder unpraktikabel, um die Rate mit der Plasmid-freie Bakterienzellen
unter industriellen Bedingungen auftreten zu vermindern, und/oder ungeeignet
zur Produktion rekombinanter Plasmide für die Verwendung in Eukaryoten,
wie für
die DNA-Immunisierungs- und Gentherapie. Die einzelnen Verfahrensgruppen
sind nacheinander beschrieben.
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Die erste Gruppe umfasst Verfahren,
bei denen ein chromosomaler Defekt zu einem Fehler bei der Herstellung
eines essentiellen Nährstoffs
führt und
das Plasmid-stämmige
Gen für
ein Enzym kodiert, das für die
Biosynthese dieses Nährstoffs
(z.B. einer Aminosäure),
der normalerweise in üblicherweise
verwendetem Bakterienwachstumsmedium enthalten ist, essentiell ist
(Dwivedi, C. P. et al. Biotechnology and Bioengineering (1982) 24:
1465–1668;
Imanaka, T. et al. J. Gen. Microbiol. (1980) 118: 253-261). Diese Verfahren,
wie im Stand der Technik beschrieben, erfordern, dass man die Plasmid-haltigen
Bakterienzellen auf speziellem und teurem synthetischen Medium aufzieht,
dem die fragliche Aminosäure
fehlt. Dies ist unter Bedingungen industrieller Bioreaktoren ungeeignet.
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Die zweite Gruppe umfasst Verfahren,
bei denen ein chromosomaler Defekt zur fehlerhaften Produktion eines
benötigten
Endprodukts führt
und das Plasmid-stämmige
Gen für
ein Enzym kodiert, dass dieses Endprodukt synthetisiert, wobei das
Endprodukt jedoch nicht in üblicherweise
verwendetem Bakterienwachstumsmedium enthalten ist (Diderichsen,
B. Bacillus Molecular Genetics and Biotechnology Applications (1986) Seiten
35–46;
Ferrari, E. et al. BioTechnology (1985) 3: 1003–1007; Galan, J. E. et al.
Gene (1990) 94: 29 ; Nakayama, K. et al. BioTechnology (1988) 6:
696; Curtiss, R. et al. Res Microbiol (1990) 141: 797).
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Bis heute hat sich dieses Verfahren
auf die Synthese von Aminosäuren
konzentriert, welche in die Bakterienzellwand eingebaut werden.
Dieser Ansatz kann bei der DNA-Immunisierungs-
und Gentherapie aus folgenden Gründen
nicht verwendet werden.
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Enzyme, die bislang in dieser Situation
eingesetzt wurden (z.B. Aspartatsemialdehyd-Dehydrogenase (asd) oder Alaninracemase
(alr)), katalysieren die Bildung eines kleinen diffundierbaren Wachstumsfaktors (Aspartatsemialdehyd
bzw. D-Alanin), und der Faktor lässt
sich unter den Bedingungen in industriellen Bioreaktoren im Kulturmedium
anreichern. Eine solche Anreicherung fördert den Plasmidverlust, da
die Querversorgungswirkung der Plasmid-haltigen Bakterienzellen
(die den kleinen diffundierbaren Wachstumsfaktor erzeugen) das Wachstum
der Plasmid-freien Bakterienzellen unterstützt. Um solche Querversorgungseffekte
zu verhindern, wurde dieser Gentyp in Plasmiden mit geringer Kopieanzahl
verwendet, d.h. einer Art, die nur mit ein oder zwei Kopien pro
Bakterienzelle auftritt. Klar ist, dass es für die Produktion industrieller
Mengen Plasmid-DNA, bei der man Plasmidtypen wünscht, die zu einer hohen Kopiezahl
führen,
unpraktisch ist, rekombinante Plasmide mit geringerer Kopieanzahl
einzusetzen. Rekombinante Plasmide mit hoher Kopiezahl sind solche
Typen, die in einer Größenordnung
von etwa 50 bis mehreren hundert Plasmidkopien pro Bakterienzelle
vorkommen.
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Das asd-Gen als Plasmid-stämmiges Gen
hat einen weiteren Nachteil. Dieser Nachteil bezieht sich auf jüngste Erkenntnisse
(Park, J. T. Molecular Microbiology (1995) 17: 421– 426),
dass Bakterienzellen (z. B. E. coli) tatsächlich etwa 50% ihrer Peptidoglycanschicht
abbauen. Das Abbauprodukt ist ein Tripeptid, das aus L-Alanin/D-Glutamat/Mesodiaminopimelinsäure besteht,
die von den Bakterienzellen zur Bildung von Peptidoglycan wiederverwendet
wird, und so die Energie eingespart wird, welche die Bakterienzellen
zum Synthetisieren neuer Tripeptidkomponenten von Peptidoglycan
verbraucht hätten.
Ein hoher Anteil dieses Tripeptids wird in das Kulturmedium freigesetzt
und kann von benachbarten Bakterienzellen aufgenommen und in ihre
eigene Peptidoglycanschicht eingebaut werden. Das asd-Gen kodiert
für das
erste Enzym in der Biosynthese der Aminosäuremesodiaminopimelinsäure (dap),
die bereits in diesem Tripeptid enthalten ist. Da Bakterienzellen
jedoch ihr eigenes Peptidoglycan wiederverwerten können und
das Tripeptid mit der ersetzten Aminosäure dap sekretieren können, gibt
es keinen Selektionsdruck auf Plasmid-haltige Bakterienzellen, ihre
Plasmide zu behalten.
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Die dritte Gruppe umfasst Verfahren,
bei denen das Plasmid-stämmige
Gen für
ein Protein kodiert, das funktionelle und strukturelle Gegenstücke in eukaryotischen
Zellen besitzt und/oder fähig
ist, auf eine eukaryotische Zellkomponente zu wirken. Der Einsatz
solcher Gene löst
erhebliche Sicherheitsbedenken aus, da die von diesen Genen kodierten
Proteine in eukaryotischen Zellen wirken könnten und das Gen selbst durch
homologe Rekombination in das eukaryotische Genom integriert werden
könnte.
Beispiele umfassen Gene, die für
Proteine kodieren, welche an der vitalen Funktion der DNA-Replikation
(Einzelstrang-DNA-Bindungsprotein; Proter, R. D. et al. Biotechnology
(1990) 8: 47) oder einer tRNA-verwandten Funktion beteiligt sind
(Valin-tRNA-Synthetase; Nilsson, J. und Skogman, G. Biotechnology
(1986) 4: 901–903).
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Die Verwendung als Marker für das für Alanin-Racemase
(alr) kodierende Gen ist auch ungeeignet für die Herstellung rekombinanter
Plasmid-DNA für
die DNA-Immunisierungs- und Gentherapie, da dieses Enzym in eukaryotischen
Zellen wirken kann. Alanin-Racemase katalysiert die Umwandlung von
L-Alanin zu D-Alanin. Da eukaryotische Zellen L-Alanin als eine
natürliche
Komponente in ihrer biochemischen Aufstellung enthalten, kann die
Verwendung von Alanin-Racemase die biochemischen Reaktionen bei
der L-Alanin-Biosynthese in eukaryotischen Zellen stören und
könnte
zur Bildung einer Aminosäure
(D-Alanin) führen,
die nicht natürlicherweise
in eukaryotischen Zellen vorkommt.
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Vor kurzem wurde ein Treffen der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) einberufen, das dem Thema der
DNA-Immunisierung und Gentherapie gewidmet war (Nucleic Acid Vaccines,
WHO, Genf, wie berichtet in Cichutek, K. Yaccine (1994) 12: 1520;
Robertson, J. S. Vaccine (1994) 12: 1526; Smith, H. Vaccine (1994)
12: 1515). Bei diesem Treffen von Experten auf dem Gebiet der DNA-Immunisierung
und Gentherapie und Experten aus Regulierungsbehörden wurden mehrere Angelegenheiten
zu Kernthemen erklärt,
die angegangen werden müssen,
um den Weg für
diese Technologien für
die Herstellung klinisch verwendbarer Produkte zu ebnen. Dieses
umfassen die strukturelle und genetische Stabilität rekombinanter
Plasmide, die potentielle Integration rekombinanter Plasmid-DNA
in Wirts-Chromosomen sowie die Verwendung von Markergenen (z. B.
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Antibiotika-Resistenz-Genen) zur
Selektion und Vermehrung der gewünschten
Plasmidhaltigen Bakterienzellen.
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Für
das Einführen
fremder DNA in Eukaryonten, wie für die DNA-Immunisierung und
Gentherapie, besteht daher ein Bedarf für ein System, mit dem man genetisch
erzeugte Bakterienzellen für
die Herstellung Plasmid-stämmiger
fremder Gene verwendet werden kann, ohne dass man dabei genetisches
Material verwenden muss, das selbst in das eukaryotische Genom integriert
werden oder das aufgrund seines kodierten Produkts in eukaryotischen
Zellen oder auf eine eukaryotische Zellkomponente wirken kann.
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Zudem wären verbesserte Verfahren für die stabile,
hoch produktive Klonierung in Bakterien allein deshalb hilfreich,
um große
Mengen der gewünschten
DNA herzustellen.
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Loh et al., Gene 66 (1988) 259–268 berichtet
von einer Nukleotidsequenz und der Transkriptionsanalyse einer Funktion
(flm), die an der Erhaltung des F-Plasmids beteiligt ist.
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Die GB-A-2177097 beschreibt unter
anderem Replikons, die bekannte Zellen in Tierzellen oder Eukaryotenzellen
replizieren, wobei die Replikons sowohl das hok-entsprechende als
auch das sok-entsprechende Gen enthalten.
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Steffes et al., J. Bacteriol. 174
(1992) 3242–3249
beschreibt das lysP-Gen.
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Saqib et al., Biochemica et Biophysica
Acta 1219 (1994) 398–404
beschreibt das „LysA"-Gen.
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Offenbarung der Erfindung
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Die Erfindung stellt rekombinante
Systeme zur Herstellung großer
Mengen gewünschter
DNA bereit und insbesondere DNA, die sicher in Eukaryoten integriert
werden kann. Die erfindungsgemäßen Systeme
bieten gegenüber
bekannten Verfahren Vorteile bei der Wirksamkeit und Sicherheit.
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Ein Aspekt der Erfindung betrifft
daher Kultursysteme und die Komponenten davon, ausgelegt für die stabile,
hochergiebige Produktion rekombinanter Plasmide. In diesen Kultursystemen
werden Bakterienzellen verwendet, in denen das Bakterienzell-Chromosom
irreversibel modifiziert wurde, um die Produktion einer für die Bakterienzellen
toxischen Substanz zu bewirken. Die Bakterienzellen werden modifiziert,
so dass sie rekombinante Plasmide enthalten, wobei die rekombinanten
Plasmide genetisches Material umfassen, das zur Produktion einer
zweiten Substanz führt,
welche die Toxizität der
ersten Substanz, die ansonsten unter den Kultursystembedingungen
für die
Zellen toxisch wäre,
neutralisiert. Die Erfindung betrifft auch die Bakterienzellen und
Plasmide, die in diesem Zellkultursystem verwendet werden können, sowie
Verfahren zur Herstellung großer
Mengen der gewünschten
DNA mit Hilfe dieser Materialien. Die in diesem System verwendeten Plasmide
können
ferner eine fremde DNA enthalten, welche operativ an nur in Eukaryoten
wirkende Kontrollsequenzen geknüpft
ist, wobei die fremde DNA in Eukaryotenzellen exprimiert wird, nicht
jedoch in Prokaryotenzellen.
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Ein zweiter Aspekt der Erfindung
betrifft Zellkultursysteme für
die stabile, hochergiebige Produktion rekombinanter Plasmide, bei
denen das Bakterienzellchromosom der Bakterien in diesen Kulturen
irreversibel modifiziert wurde, so dass die Zellen unfähig sind,
einen essentiellen Metaboliten zu produzieren und auch unfähig sind,
den Metaboliten aus dem Kulturmedium aufzunehmen. Das in diesem
System verwendete rekombinante Plasmid ist ein Plasmid, welches
genetisches Material enthält,
das entweder die Fähigkeit
besitzt, den Metaboliten zu synthetisieren oder die Fähigkeit
besitzt, den Metaboliten aus dem Medium aufzunehmen, oder beides.
Dieser Aspekt der Erfindung umfasst auch die Bakterienzellen und
Plasmide, welches Komponenten des Zellkultursystems sind, sowie
Verfahren zur Herstellung großer
Mengen DNA mit Hilfe des Systems. Die Plasmide können auch so modifiziert werden,
dass sie eine fremde DNA enthalten, welche operativ an Kontrollsequenzen
geknüpft
ist, die nur in Eukaryoten wirken, so dass die fremde DNA nur in
Eukaryotenzellen, nicht jedoch in Prokaryotenzellen exprimiert wird.
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Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung
betrifft ein Kultursystem für
die stabile und hochergiebige Produktion rekombinanter Plasmide
für die
DNA-Immunisierung und Gentherapie , umfassend genetisch erzeugte Bakterienzellen
und rekombinante Plasmide. In diesem System ist das Bakterienzellchromosom
irreversibel verändert
und die Bakterienzellen werden unter solchen Bedingungen vermehrt,
dass die Lebensfähigkeit
der Bakterienzellen von dem rekombinanten Plasmid abhängt. Das
rekombinante Plasmid umfasst genetisches Material, welches die chromosomale
Veränderung
funktional ergänzt,
jedoch besitzt das genetische Material kein funktionales oder strukturelles Äquivalent
in Eukaryotenzellen und erzeugt kein Protein, das fähig ist,
auf eine eukaryote Zellkomponente zu wirken. Das von dem kompensierenden
genetischen Material kodierte Protein oder ein beliebiges Produkt
davon wird auch nicht von den Bakterienzellen sekretiert oder in
so hohen Mengen produziert, dass es für die Bakterienzellen toxisch
ist. Das rekombinante Protein kann auch so angepasst werden, dass
es fremde DNA enthält,
die operativ an Kontrollsequenzen geknüpft ist, welche nur in Eukaryoten
wirken, so dass die Expression der fremden DNA nur in eukaryotischen
Zellen, nicht jedoch in prokaryotischen erfolgt. Die Erfindung betrifft
auch Bakterienzellen und Plasmide mit hoher Kopiezahl, die in diesem Zellkultursystem
verwendet werden können,
sowie Verfahren für
die stabile Herstellung fremder DNA, die mit Hilfe dieses Systems
an Eukaryoten verabreicht werden kann.
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Ein noch weiterer Aspekt dieser Erfindung
betrifft Verfahren zur Bereitstellung einer gewünschten fremden DNA an eukaryote
Zelle oder ein eukaryotes Subjekt, wobei das Verfahren umfasst,
dass man die Zellen mit der durch die erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten DNA zusammenbringt oder diese verabreicht oder dem
Subjekt die Bakterienzellen, die die gewünschte DN enthalten, verabreicht.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
die Konstruktion des rekombinanten Plasmids pCB237.
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2 zeigt
die Konstruktion eines genetisch erzeugten Bakterienstamms (CB101
E. coli) mit einer Deletion in den chromosomalen galE- und galT-Genen.
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3 ist
eine schematische Darstellung zur Klonierung des murF-Gens.
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4 zeigt
die Konstruktion des rekombinanten Plasmids pCB243.
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5 zeigt
die Konstruktion eines genetisch erzeugten Bakterienstamms (CB1031
E. coli) mit einer Deletion in dem chromosomalen murF-Gen.
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6 ist
eine Darstellung der Konstruktion von Plasmiden, die das murF-Gen
enthalten.
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7 zeigt
Plasmidausbeuten für
pMO 106, hergestellt in einem murF-defizienten Stamm bei 42°C.
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8 zeigt
die Stabilität
von pMO 106 in TKL-50-Zellen.
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9 zeigt
die in vitro-Transfektionseffizienz eines Vektors, der murF enthält.
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10 ist
eine graphische Darstellung von ELISA-Titern, die aus Vektoren gewonnen
wurden, welche Antigene mit und ohne dem murF-Gen enthalten.
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11 zeigt
die Nukleotidsequenz des Temperatur-empfindlichen murF-Gens, das
von TKL-46 abstammt.
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Erfindungsgemäße Ausführungsbeispiele
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Die vorliegende Erfindung stellt
Kultursysteme bereit, die die stabile Produktion einer gewünschten DNA
ermöglichen.
In manchen Fällen
wird die gewünschte
DNA eine fremde DNA sein, deren Expression in einer eukaryotischen
Zelle entweder zur Immunisierung oder zur Gentherapie benötigt ist.
Diese „Expression" umfasst die einfache
Transkription sowie die Produktion von Polypeptiden. Die fremde
DNA kann in Eukaryoten zur Antisense- und Gentherapie, bei der therapeutische
Proteine oder Marker hergestellt werden, verwendet werden.
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Soll die fremde DNA einem Eukaryoten
verabreicht werden, kann die amplifizierte replizierte DNA gewonnen
und mittels üblicher
Formulierungstechniken in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung
verabreicht werden. Geeignete Formulierungen zur Verabreichung von
DNA umfassen verschiedene Träger,
beispielsweise Liposomen, Dendrimere, Aquasomen, Cochleate, isotonische
Kochsalzlösung
oder PBS. Die DNA kann auch gewonnen und in einen retroviralen Vektor
ligiert werden. Neben der DNA selbst können Bakterienzellen, die selbst
die replizierte DNA enthalten, einem eukaryoten Subjekt verabreicht
werden. Die Zellen werden so ausgewählt oder manipuliert, dass
sie die geeigneten Merkmale haben, welche erlauben, dass die eingeschlossene
DNA in den Nukleus, beispielsweise eines Makrophagen, gelangt, so
dass die fremde DNA exprimiert werden kann. Die verabreichten Prokaryoten
müssen
daher fähig
sein, das Lysosom zu verlassen, sich zu zersetzen und DNA muss in
den Nukleus gelangen können.
Manche Bakterienwirte, wie Shigella- und Listeria-Stämme besitzen
die innewohnende Eigenschaft, die zu diesen Ergebnissen führt. Neben
der exprimierbaren DNA waren Impfstoffe, die lediglich „nackte
DNA" beinhalten,
auch erfolgreich.
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Im allgemeinen erfolgt die Verabreichung
der DNA, entweder als solche in einer pharmazeutischen Zusammensetzung
oder enthalten in Bakterienzellen, durch Injektion; üblicherweise
intravenös,
intramuskulär,
intradermal oder subkutan. Die Verabreichung kann auch intranasal
oder oral erfolgen oder durch ein Teilchenbeschussverfahren. Es
kann jedoch jedes wirksame systemische Mittel der Verabreichung
verwendet werden.
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Alle erfindungsgemäßen Kultursysteme
beruhen auf einer Komplementierung eines schädigenden Merkmals des Bakterienchromosom
durch die Wirkung von genetischem Material, welches auf einem Plasmid, das
selbst in der Bakterienkultur stabil repliziert wird, enthalten
ist. In einer Ausführungsform
erzeugt das bakterielle Chromosom eine Substanz, die für die Bakterienzellen
toxisch ist, und diese Substanz wird durch eine durch das genetische
Material auf dem Plasmid erzeugte Substanz bekämpft. In einer zweiten Ausführungsform
wird das bakterielle Chromosom so modifiziert, dass die Zelle ihre
Fähigkeit
verliert, einen essentiellen Metaboliten zu produzieren und auch
unfähig
wird, diesen Metaboliten aus dem Kulturmedium aufzunehmen, und das
rekombinante Plasmid stellt eine oder beide dieser Fähigkeiten
wieder her. In jedem dieser Fälle
kann die zu amplifizierende zusätzliche
gewünschte
DNA-Sequenz in dem Plasmid eingefügt sein; ferner kann die gewünschte DNA
operativ an Kontrollsequenzen, die ausschließlich in eukaryoten Zellen
exprimiert werden, geknüpft
sein.
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In einem dritten Ansatz, in diesem
Fall zur Herstellung einer fremden DNA, die operativ an Kontrollsequenzen
geknüpft
ist, welche zur ausschließlichen
Expression in Eukaryoten führen,
verwendet die Erfindung insbesondere genetisch erzeugte Bakterienzellen,
bei denen das native chromosomale Genom irreversibel verändert wurde.
Die Veränderung
kann aus einer Modifikation ein oder mehrerer chromosomaler Gene
bestehen, die alleine oder in Kombination entscheidend für die Lebensfähigkeit
der Zelle unter Bedingungen sind, unter denen sich die Bakterienzellen
vermehren, oder sie kann aus der Insertion ein oder mehrerer fremder Gene
bestehen, die für
die Lebensfähigkeit
der Bakterienzelle unter solchen Bedingungen schädlich sind.
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Die Bakterienzellen werden dann weiter
durch Einfügen
eines rekombinanten Plasmids modifiziert, vorzugsweise eines rekombinanten
Plasmids mit hoher Kopiezahl (ein Typ, der in einer relativ hohen
Kopiezahl, von 50 bis mehreren hundert, pro Plasmid-haltige Bakterienzelle
vorkommt). Das rekombinante Plasmid wird so konstruiert, dass es
genetisches Material enthält,
welches die oben genannte chromosomale Veränderung komplementiert. Die
Einführung
des rekombinanten Plasmids in die Bakterienzellen stellt die Lebensfähigkeit
der Bakterienzellen wieder her und stellt sicher, dass nur Bakterienzellen,
die das rekombinante Plasmid enthalten, überleben können.
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Soll das Plasmid nur zur Herstellung
eines nur in Eukaryoten wirksamen Expressionssystems für eine fremde,
gewünschte
DNA verwendet werden, muss das komplementäre genetische Material ein
oder mehrere Gene betreffen, die kein funktionales oder strukturelles Äquivalent
in den mit der Plasmid-DNA zu behandelnden Eukaryotenzellen haben.
Das komplementäre
genetische Material darf nicht für
ein Polypeptid kodieren (oder eine mRNA erzeugen), das oder die
fähig ist,
auf eine Zellkomponente der mit der Plasmid-DNA zu behandelnden
eukaryoten Zellen zu wirken. Ferner dürfen keine Faktoren oder Materialien,
die auf Basis des komplementären
genetischen Materials produziert werden, von den genetisch erzeugten
Bakterienzellen sekretiert werden oder in Mengen produziert werden,
die für
die genetisch erzeugten Bakterienzellen toxisch sind.
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Das komplementäre Genmaterial sichert daher
die strukturelle und genetische Stabilität der genetisch erzeugten Bakterienzellen,
indem ein selektiver Überlebensdruck
nur auf Plasmid-haltige Bakterienzellen ausgeübt wird. Wie oben erwähnt, ist
das Plasmid vorzugsweise, jedoch nicht zwingend, ein Plasmid mit
hoher Kopiezahl.
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Indem man ein oder mehrere fremde
Gene in das gleiche rekombinante Plasmid kloniert, können die genetisch
erzeugten Bakterienzellen zur Herstellung großer Mengen Plasmid-DNA, die das oder
die fremden Gene enthält,
verwendet werden, die ihrerseits bei der DNA-Immunisierung und Gentherapie,
einschließlich der
Antisensetherapie, eingesetzt wird. Die fremden Gene lassen sich
vorzugsweise nicht in den genetisch erzeugten Bakterienzellen exprimieren,
so dass eine unnötige
metabolische Last oder Zelltoxizität vermieden wird. Dies lässt sich
erreichen, indem man jedes fremde Gen operativ an einen Promotor
knüpft,
der nur in Eukaryoten wirkt.
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In Abhängigkeit von dem oder den fremden
Genen, die in das rekombinante Plasmid kloniert werden, kann die
Plasmid-DNA bei der DNA-Immunisierung und/oder der Gentherapie verwendet
werden. Die Plasmid-DNA kann zur in vivo-Behandlung verwendet werden,
um ein oder mehrere gewünschte
fremde Gene in einen eukaryoten Wirt zu übertragen. Das fremde Gen kann
beispielsweise ein Säugetiergen
sein, das für
ein Polypeptid kodiert, welches für die Gesundheit oder das Überleben
eines behandelten Säugetiers
benötigt wird.
Das fremde Gen kann auch ein virales Gen sein, welches für ein Polypeptid
kodiert, gegen das man in einem behandelten Tier eine Immunität erzeugen
will. Alternativ kann das in dem rekombinanten Plasmid enthaltende
Expressionssystem eine Antisense-mRNA für die therapeutische Behandlung
erzeugen. Andere Beispiele werden für den Fachmann auf dem Gebiet
offensichtlich sein.
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Die Erfindung wird nun weiter mit
Bezug auf die verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Die
Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsformen beschränkt und
der Fachmann wird leicht alternative Ausführungsformen innerhalb des
Umfangs der Beschreibung der erfindungsgemäßen Merkmale erkennen.
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Eine Ausführungsform bezieht sich auf
ein Aminosäure-addierendes
Enzym, das zur Herstellung der Bakterienzellwand benötigt wird.
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Peptidoglycane sind einzigartig in
Bakterienzellen vorkommende Zellwandstrukturen. Demnach eignen sich
einige der Gene, die für
Enzyme kodieren, welche für
die Biosynthese oder Anordnung der Peptidoglycanschicht verantwortlich
sind, ausgezeichnet als Kandidaten für Markergene in rekombinanten
Plasmiden für
die DNA-Immunisierung und Gentherapie.
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Die Peptidoglycanschicht besteht
aus mehreren aneinander grenzenden Ketten. Jede Kette besteht aus
sich abwechselnden Einheiten aus N-Acetylmuraminsäure- (NAM)
und N-Acetylglucosamin-(NAG)-Resten.
Bestimmte NAM-Reste auf jeder Kette sind an ein Tetrapeptid geknüpft, dessen
Zusammensetzung leicht in Abhängigkeit
davon variiert, ob das Bakterium Gram-positiv oder Gram-negativ
ist. Die benachbarten Peptidoglycanketten sind miteinander über eine
Peptidbindung verbunden, welche die dritte Aminosäure, Diaminopimelin
(dap), eines Tetrapeptids mit der vierten Aminosäure, D-Alanin, des Tetrapeptids
am NAM-Rest der benachbarten Kette verbindet. Die Aminosäure D- Alanin ist eine einzigartige
Komponente des Peptidoglycans aller Bakterien. Diese Aminosäure wird
durch die Wirkung des als Alanin-Racemase (alr) bezeichneten Enzyms
aus L-Alanin synthetisiert. Die Bildung dieser letzteren Peptidbindung
ist wesentlich für
die Überlebensfähigkeit
der Bakterienzelle, da die Bakterienzellen ohne diese Bindung in üblicherweise
verwendetem bakteriellem Wachstumsmedium lysieren.
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Die Tetrapeptidbildung erfordert
die Wirkung zweier verschiedener Gengruppen, nämlich diejenigen, die für Enzyme
kodieren, welche für
die Biosynthese der einzelnen Aminosäuren der Tetrapeptide benötigt werden
(z. B. Enzyme, die für
die Biosynthese von L-Alanin, D-Glutaminsäure, dap und D-Alanin benötigt werden}
und diejenigen, die für
die sequentielle Addition und Ligierung dieser Aminosäuren aneinander
benötigt werden,
so dass das Tetrapeptid entsteht. Die letzteren Enzyme sind die
sogenannten Aminosäure-Additions-Enzyme.
Allgemein ist die Tetrapeptidsequenz in N→ C-Richtung L-Alanin/D-Glutaminsäure/Diaminopomelinsäure (dap)/D-Alanin.
Die Reihe der Aminosäure-addierenden
Enzyme umfasst das L-Ala-addierende Enzym, welches die Aminosäure L-Alanin
an die Polysaccharidkette addiert; das Enzym, das die Aminosäure D-Glutaminsäure an das
Polysaccharid-gebundene L-Alanin addiert (murD), das Enzym, welches
die Aminosäure
dap an das L-Alanin/D-Glutaminsäure-Dipeptid
addiert (murF) und das Enzym, welches D-Alanin an das L-Alanin/D-Glutaminsäure/dap-Tripeptid
addiert (murF).
-
Folglich lässt sich gemäß einer
erfindungsgemäßen Ausführungsform
ein System zur Herstellung einer für die Verwendung bei der DNA-Immunisierung
und Gentherapie geeigneten Plasmid-DNA durch genetisch erzeugte
Bakterienzellen konstruieren, so dass ein chromosomales Gen, welches
für eines
der Aminosäure-addierenden
Enzyme (z. B. das murF-Gen) kodiert, seine Funktionalität verliert.
Die Lebensfähigkeit
der genetisch erzeugten Bakterienzellen wird durch die Aufnahme
eines rekombinanten Plasmids, auf dem ein funktionales murF-Gen
kloniert ist, wieder hergestellt.
-
Temperatur-empfindliche Bakterienzellen
mit einer Mutation in dem Gen, welches für eines der Aminosäure-addierenden
Enzyme kodiert (z. B. murF), sind bekannt. Diese Zellen wachsen
nicht bei nicht-zulässigen
Temperaturen, obwohl sie die einzelnen Aminosäurekomponenten des Tetrapeptids
synthetisieren können.
Die Unfähigkeit
dieser Mutanten bei nicht-zulässigen
Temperaturen zu wachsen ist darauf zurückzuführen, dass sie bei dieser Temperatur
kein vollständiges
und funktionales Tetrapeptid zusammenfügen können. Weitere bakterielle Wirtszellen,
die sich für
die erfindungsgemäßen Zellkulturen
eignen, umfassen daher solche vorhandenen Stämme, die bei nichtzulässigen Temperaturen
kultiviert werden.
-
Die Verwendung des murF-Gens in dem
gewonnenen System mit den genetisch erzeugten Bakterienzellen, einschließlich komplementärer rekombinanter
Plasmide, hat mehrere Vorteile. Erstens ist das murF-Enzym ein intrazelluläres und
nicht-diffundierbares Protein und erzeugt kein toxisches oder sekretiertes
Produkt. Dadurch wird verhindert, dass sich die Anzahl der Plasmid-haltigen
Bakterienzellen aufgrund der zuvor beschriebenen Querversorgungs-Wirkung
verringert. Zweitens ist das murF-Gen in Bakterienzellen einzigartig und
hat kein funktionales oder strukturelles Gegenstück in Eukaryotenzellen, wie
nachstehend insbesondere für
humane Zellen gezeigt. Drittens hat das murF-Gen kein Substrat in
eukaryoten Zellen. Es scheint daher kein Risiko einer Aktivität des murF-Enzyms
zu bestehen, selbst wenn das murF-Gen in eukaryoten Zellen exprimiert
wird, welche mit der Plasmid-DNA behandelt wurden. Diese Vorteile
führen
zu einer wirksamen Stabilisierung und Produktion des rekombinanten
Plasmids unter industriellen Fermentationsbedingungen. Ferner ist
das auf murF basierende System sicher für den Einsatz bei der DNA-Immunisierung
und Gentherapie.
-
Jedes der vier oben beschriebenen
Aminosäure-addierenden
Enzyme kann als Grundlage für
das erfindungsgemäß geeignete
Komplementierungssystem verwendet werden. Das Bakteriengenom kann
daher geändert
werden, indem man das für
das L-Alaninaddierende Enzym kodierende Gen deletiert und das für dieses
Enzym kodierende Gen auf einem Plasmid bereitstellt; oder indem
man das Chromosom so modifiziert, dass es nicht mehr fähig ist,
murD, murE oder murF zu synthetisieren, und man die Fähigkeit
das entsprechende Enzym herzustellen, auf dem Plasmid bereitstellt.
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Obwohl man jedes dieser Aminosäure-addierenden
Enzyme auswählen
kann, besteht eine Hierarchie bezüglich einer bevorzugten Auswahl
von murF- > murE- > murD > L-Ala-addierendem Enzym.
Diese Betrachtung bezieht sich auf die Wirksamkeit des Zellwandabbaus
bei der Teilung der Bakterien. Der Abbau erfolgt unvermeidlich vom
C-Terminus des Tetrapeptids aus und kann unvollständig sein.
Daher benötigen
die Tochterzellen die murF-Komponente allgemein dringender als murE,
die jedoch wiederum dringender benötigt wird als murD oder das
L-Alanin-addierende Enzym.
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Eine zweite Ausführungsform beruht darauf, dass
man die Funktion eines chromosomales Gen ausschaltet, welches für ein Enzym
kodiert, das für
die Synthese einer natürlicherweise
in üblichem
Bakteriummedium für
industrielle Anlagen vorliegenden Aminosäure verantwortlich ist. Allgemein
ist eine solche chromosomale Genveränderung weder ein praktisches
Verfahren zur Verbesserung der Stabilität rekombinanter Plasmide noch
zur Produktion großer
Mengen Plasmid-DNA. Werden jedoch, wie nachstehend als Beispiel beschrieben,
zusätzliche
Sicherheitsvorkehrungen eingebaut, kann dieser Ansatz zur stabilen
Produktion von Plasmid-DNA auf industriellem Maßstab verwendet werden.
-
Beispielsweise wird ein chromosomales
Gen (als lysA bezeichnet), welches für ein Enzym kodiert, das für die Synthese
der Aminosäure
Lysin wesentlich ist, nicht-funktional
gemacht. Ein zweites chromosomales Gen (als lysP bezeichnet), welches
für ein
Permease-Protein kodiert, das für
die Aufnahme dieser Aminosäure aus
der Umgebung oder dem Wachstumsmedium verantwortlich ist, wird ebenfalls
nichtfunktional gemacht. Solche genetisch erzeugten Bakterienzellen
können
nicht länger
alleine ülerleben.
Sie können überleben, wenn
sie mit einem rekombinanten Plasmid transformiert werden, das ein
funktionales Gen für
oder ein Äquivalent
zu lysA oder lysP trägt.
Daher bietet eine genetisch erzeugte Bakterienzelle, bei der die
Lysinaufnahme (aufgrund eines nicht-funktionalen chromosomalen lysP-Gens)
und die Lysinbiosynthese (aufgrund eines nicht-funktionalen chromosomalen
lysA-Gens) gestört
ist, und die mit einem rekombinanten Plasmid transformiert wird,
das ein funktionales lysA-Gen oder ein Äquivalent davon trägt, ein
wirksames System zur stabilen und hochgradigen Produktion von Plasmid-DNA
für die
DNA-Immunisierung und Gentherapie.
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Das Plasmid-stämmige Komplementationsgen ist
in diesem Beispiel das lysA-Gen, da bekannt ist, dass das lysA-Gen
kein strukturelles oder funktionales Gegenstück in eukaryotischen Zellen
besitzt. Ferner hat das lysA-Enyzm, das von dem lysA-Gen kodiert
wird, in eukaryoten Zellen kein Substrat und als solches kann dieses
Enzym in eukaryoten Zellen nicht funktionieren, selbst wenn es darin
exprimiert wird. Da Lysin eine essentielle Aminosäure für alle lebenden
Mikroorganismen, einschließlich
sowohl Gram-positiver als auch Gram-negativer Bakterien, ist, stellt
dieses System ein praktisches und vielseitiges System für die stabile
und hochgradige Produktion von Plasmid-DNA in allen Bakterienzellen
bereit.
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In einer dritten Ausführungsform
wird ein Selektionsdruck beibehalten, indem man einen Postsegregations-Tötungsmechanismus
verwendet. Die natürlich
vorkommenden E. coli-Plasmide
R1 und F enthalten Genloki, die für diesen Ansatz geeignet sind.
Bei dem R1-Plasmid
ist dieser Lokus parB (Gerdes, K. et al. PNAS (1986) 83: 3116–3120; Rasmussen,
P. B. et al. Mol. Gen. Genetics (1987) 209: 122–128). Im Fall des F-Plasmids
ist dieser Lokus Flm (Loh, S. M. et al., Gene (1988) 66: 259–268). Diese
Loki vermitteln eine wirksame Stabilisierung des rekombinanten Plasmids
mittels eines Postseggregations-Tötungsmechanismus.
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Sowohl der parB- als auch der flm-Lokus
bestehen aus zwei kleinen Genen, die im Fall von parB als das hok-Gen
(Wirt-tötend)
und sok-Gen (Supressor der Wirt-Tötung) und im Fall des F-Plasmids
als das flmA-Gen (Wirt-tötend)
und das flmB-Gen (Supressor der Wirt-Tötung) bezeichnet werden. Das
hok- und das flmA-Gen sind daher in Struktur und Funktion analog,
ebenso wie das hok- (Anmerkung des Übersetzers: sok-) und das flmB-Gen.
-
Die hok- und flmA-Genprodukte sind
kleine hydrophile Proteine (52 Aminosäuren), die potente Wirt-tötende Faktoren
sind. Die Expression des hok-Gens wird durch ein kleines (etwa 100
Basenpaar großes) RNA-Molekül reguliert,
welches von dem sok-Gen transkribiert wird und als Antisense-RNA
komplementär
zu der mRNA des hok-Gens wirkt. In ähnlicher Weise wird die Expression
des flmA-Gens durch ein etwa 100-Basenpaar-RNA-Molekül reguliert,
welches von dem flmB-Gen transkribiert wird und als Antisense-RNA
komplementär
zu der mRNA des flmA-Gens wirkt. Die hok- und flmA-mRNAs sind hochstabil,
wohingegen die sok- und flmB-RNAs schnell abgebaut werden. In beiden
Fällen
ist es die unterschiedliche Stabilität der zwei RNA-Arten, die zu
dem Mechanismus der Tötung
der Bakterienzelle führt.
Verliert eine Bakterienzelle, die ein Plasmid mit dem parB-Lokus
enthält,
ein solches Plasmid, führt
das längere
Vorliegen der hok-mRNA zur Synthese des hok-Proteins, wodurch ein
schnelles und selektives Töten
der neu gebildeten Plasmid-freien Bakterienzellen sichergestellt
wird. Verliert eine Bakterienzelle, die ein Plasmid mit dem Flm-Lokus
enthält,
das Plasmid, kommt es durch das längere Vorliegen der flmA-mRNA
in ähnlicher
Weise zur Synthese des flmA-Proteins,
wodurch ein schnelles und selektives Töten der neu gebildeten Plasmid-freien
Bakterienzellen sichergestellt wird.
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Die kombinierte Wirkung der hok-
und sok-Gene oder der flmA- und flmB-Gene kann vorteilhaft zur Konstruktion
eines Systems für
die Produktion von Plasmid-DNA für
die DNA-Immunisierung und Gentherapie verwenden kann. Die Nützlichkeit
dieser Systeme könnte
dadurch beeinträchtigt
werden, dass eukaryotische Zellen, wie solche der Säugerwirte,
denen man während
der DNA-Immunisierung oder Gentherapie Plasmid-DNA mit der hok/sok- oder flmA/flmB-Kombination
injiziert, getötet
werden. Daher wird nur das sok-Gen (100 bp) oder das flmB-Gen (100
bp) in das rekombinante Plasmid eingebracht, wohingegen das hok-Gen
oder das flmA-Gen in das Bakterienzellchromosom integriert wird.
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Für
das auf der hok/sok- oder flmA/flmB-Kombination beruhende Plasmidproduktionssystem
wird genetisch ein Bakterienstamm erzeugt, indem man das für das hok-
oder flmA-Protein kodierte Gen in einer nicht-essentiellen Region
des Bakterienchromosoms einfügt
(z. B. in dem lacZ-Gen). Genetisch erzeugte Bakterienzellen werden
dann mit einem rekombinanten Plasmid transformiert, in dem der einzige
Marker das entsprechende sok- oder flmB-Gen ist. Solange das rekombinante
Plasmid in den Bakterienzellen verbleibt, reguliert das sok- oder
flmB-Gen des rekombinanten Plasmids die Expression des hok- oder
flmA-Gens und die Bakterienzelle gedeiht. Sobald das rekombinante
Plasmid mit dem sok- oder flmB-Gen verloren geht, stirbt die Bakterienzelle,
da der Tötungsfaktor
von dem chromosomalen hok- oder flmA-Gen erzeugt wird.
-
Dieses System bietet folgende spezifische
Vorteile für
die Herstellung von Plasmid-DNA. Erstens ist das System in seiner
Verwendung nicht auf einen bestimmten Bakterienstamm beschränkt. Zweitens,
da nur 100 by DNA, die für
das sok- oder das flmB-Gen kodiert, in dem rekombinanten Plasmid
verwendet wird, kann ein viel kleineres und kompakteres Plasmid
konstruiert werden. Dies selbst führt zu einer höheren Plasmidausbeute
und bietet die Möglichkeit,
mehr als ein fremdes Gen in ein rekombinantes Plasmid zu klonieren.
-
Der Fachmann wird weitere erfindungsgemäße Kombinationen
genetisch erzeugter Bakterienstämme und
rekombinanter Plasmide (die als Vektoren für fremde DNA dienen können) auffinden,
bei denen das rekombinante Plasmid DNA enthält, die kamplementär zu der
veränderten
(d.h. addierten oder durch Modifikation, Deletion oder Inaktivierung
nicht-funktional gemachten) chromosomalen DNA ist, und welche man
demnach als Marker für
das Vorliegen oder die Abwesenheit des rekombinanten Plasmids und
zur Ausübung
von Selektionsdruck verwendet werden kann, um das rekombinante Plasmid
in der genetisch erzeugten Bakterienzelle zu halten.
-
Die vorliegende Erfindung wird ausführlich in
nachfolgenden Beispielen beschrieben. Diese Beispiele sind zur Verdeutlichung
eingefügt
und nicht so zu verstehen, dass sie die vorliegende Erfindung beschränken.
-
Beispiel 1
-
Konstruktion des chromosomal
veränderten
Wirts CB102
-
Die Peptidoglycanschicht ist unter
gewöhnlichen
Bedingungen absolut notwendig für
die Lebensfähigkeit
der Bakterienzelle, da sie die zerbrechliche zytoplasmatische Membran
vor einem osmotischen Schock schützt.
Unter bestimmten Bedingungen können
Bakterienzellen, die einen Defekt in der Peptidoglycansynthese haben,
dennoch in bestimmten Mediumtypen überleben, wie solchen, die
mit Natriumchlorid oder Sucrose angereichert sind. Der Grund für die Fähigkeit
dieser Bakterienzellen in diesen Medien typen zu überleben, wird auf die Wirkung
dieser Zusatzverbindungen, wie osmotischer Stabilisatoren, zurückgeführt oder
auf deren Fähigkeit,
die Produktion von Colansäure
(„colanic
acid") zu induzieren,
welche als Osmosestabilisator wirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden Bakterienzellen daher genetisch so erzeugt, dass sie vollständig von
der Gegenwart einer intakten Peptidoglycanschicht abhängig sind,
unabhängig
vom Mediumtyp, in dem die Bakterienzellen aufgezogen werden. Die
Fähigkeit
dieser Bakterienzellen, Colansäure
zu synthetisieren, wurde in dieser Ausführungsform ausgeschaltet, zusätzlich dazu,
dass eine Mutation oder eine Deletion eingeführt wurde, die zu einer defekten
Peptidoglycananordnung führte.
-
Colansäure ist ein Polymer aus Glucose,
Galactose, Fructose und Glucuronsäure. Da Galactose ein Bestandteil
der Colansäure
ist, besteht eine Möglichkeit,
mit der man den Bakterien die Fähigkeit
entziehen kann, Colansäure
herzustellen, darin, dass man die Fähigkeit der Bakterienzellen
hemmt, Galactose zu synthetisieren und zu verwenden. In diesem Beispiel
wird dies durch Einführen
irreversibler Deletionen in die chromosomalen galE- und galT-Gene
erreicht, die an der Verwendung von Galactose beteiligt sind. Bei
dem erhaltenen Bakterienstamm wird dann eine Deletion in dem chromosomalen
murF-Gen durchgeführt, so
dass ein Stamm entsteht, dessen Lebensfähigkeit von der Komplementierung
mit einem rekombinanten Plasmid mit einem funktionalen murF-Gen
abhängt,
und zwar wie folgt:
-
Zunächst wurde der JM105-E. coli-Stamm,
der eine Deletion in den galE- und galT-Genen enthielt, konstruiert. Um die
galE- und galT-Gene zu klonieren, wurden zwei Oligonukleotidprimer
(stromaufwärts
und stromabwärts)
auf Grundlage der bekannten Nukleotidsequenzen der galE- und galT-Gene
synthetisiert. Um das Klonieren zu erleichtern, wurde eine XbaI-Stelle
am Ende jeder dieser Primer erzeugt. Der stromaufwärts liegende
Primer (als gal-3 bezeichnet) entsprach dem 5'-Ende des galE-Gens und hatte folgende Nukleotidsequenz:
5' gctctagaggctaaattcttgtgtaaacga3'.
-
Der stromabwärts liegende Primer (als gal-4
bezeichnet) entsprach dem 3'-Ende
des galT-Gens und hatte
folgende Nukleotidsequenz:
5'gctctagatctgccagcatttcataaccaa3'.
-
Die Primer gal-3 und gal-4 (jeweils
100 pmol) wurden mit 2 μl
einer Übernacht-Kultur
der JM105-Bakterienzellen zusammengebracht. Zu diesem Gemisch gab
man 4 μl
einer 5 mM Desoxynukleosid-(dNTP) Lösung, 1 μl 100 mM MgSO4,
5 μl 10 × Vent-Reaktionspuffer und
1 μl Vent-DNA-Polymerase
(gekauft von NEB Biolab) hinzu. Das Reaktionsgemisch wurde über 30 Zyklen
amplifiziert, wobei folgendes Zyklisierungsprofil verwendet wurde:
Schmelzen: 94°C
für 1 Minute,
Annealing: 55°C
für 1 Minute
und Verlängerung:
72°C für 2 Minuten.
Nach der Amplifikation wurde das Reaktionsgemisch durch Elektrophorese
auf 1%-iger Agarose untersucht. Eine einzelne Bande der erwarteten
Größe (etwa
2 Kilobasenpaare; entsprechend den gesamten galE- und galT-Genen) war nach der
Ethidiumbromidfärbung
der in dem Polymerasekettenreaktions-(PCR) Gemisch vorliegenden DNA erkennbar.
Die obige DNA-Bande wurde ausgeschnitten und mit Hilfe eines GeneClean-(Marke)
Kits (von BioCan) von der Agarose gereinigt. Wie in 1 gezeigt, wurde das gereinigte DNA-Fragment
mit T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia) behandelt und in die HincII-Stelle
des pTZ18-Plasmids ligiert. Das pTZ18-Plasmid mit den galE- und
galT-Genen wurde als pCB233 bezeichnet.
-
Eine interne Deletion in den galE-
und galT-Genen wurde, wie weiter in 1 gezeigt,
konstruiert. Ein pTZ18-Plasmid wurde mit dem HindIII-Enzym geschnitten,
mit dem Klenow-Enzym behandelt und selbst-ligiert, so dass das Plasmid
pCB234 entstand, in dem keine HindIII-Stelle mehr vorlag. Das Plasmid
pCB233 wurde mit EcoRI- und PstI-Enzymen
geschnitten, um ein DNA-Fragment zu gewinnen, welches die gesamten galE-und galT-Gene umfasste.
Dieses letztere Fragment wurde in pCB234 ligiert, welches auch mit
EcoRI- und PstI-Enzymen geschnitten war. Das Ligationsereignis führte zur
Isolierung eines Plasmids, das als pCB235 bezeichnet wurde. Das
Plasmid pCB235 wurde mit HindIII- und NcoI-Enzymen geschnitten,
um einen internen Teil der Nukleotidsequenz in den galE- und galT-Sequenzen
zu deletieren, mit Klenow-Enzym behandelt und dann selbst-ligiert,
so dass das Plasmid pCB236 entstand. Das Plasmid pCB236 wurde mit
EcoRI- und PstI-Enzymen geschnitten, so dass die gekürzten galE-
und galT-Gene entstanden.
Das DNA-Fragment mit den gekürzten
galE- und galT-Genen wurde mit T4-DNA-Polymerase-Enzym behandelt.
Gleichzeitig wurde das Suizid-Vektorplasmid, das als pCVD442 bezeichnet
wird (J. B. Kaper; Universität
von Pennsylvania), mit dem XbaI-Enzym geschnitten und dann mit dem
Klenow-Enzym behandelt. Das DNA-Fragment, welches die gekürzten galE-
und galT-Gene enthielt, wurde dann in das obige pCVD442 ligiert
und dann in E. coli SY327 transformiert, so dass das Plasmid pCB237
entstand. Das Plasmid pCB237 wurde dann in E. coli SM10 transformiert
und die letzteren Bakterienzellen, welche pCB237 enthielten, wurden
für den
weiteren Gebrauch wie nachstehend beschrieben ausgewählt.
-
Die galE- und galT-Deletionen wurden
wie in 2 gezeigt in
JM105 E. coli eingefügt.
SM10-Bakterienzellen, die das Plasmid pCB237 trugen, wurden verwendet,
um die irreversibel nicht-funktionalen (d.h. mit internen Deletionen
versehenen) galE- und galT-Gene
in den E. coli-Stamm JM105 zu transferieren, und zwar durch das
von Donnenberg, M. und Kaper, J. Infection and Immunity (1990) 59:
4310–4317
beschriebe Konjugationsprotokoll. Das Einfügen der irreversibel nicht-funktionalen
galE- und galT-Gene in das Chromosom der JM105-Bakterienzellen und
das Ersetzen der full-length-Wildtyp-galE-und galT-Gene der letzteren Bakterienzellen
durch die irreversibel nicht-funktionalen galE- und galT-Gene wurde
mittels PCR-Analyse der chromosomalen JM105-DNA bestätigt. Der
JM105-E. coli-Bakterienstamm, der eine interne Deletion in den galE- und
galT-Genen besaß,
wurde als CB101 bezeichnet.
-
Um eine Deletion in dem murF-Lokus
zu erzeugen, wurde zunächst
das chromosomale murF-Gen aus JM105 E. coli mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion
(PCR) isoliert. Zwei Oligonukleotidprimer wurden beruhend auf der
bekannten Sequenz des murF-Gens synthetisiert. Diese Primer wurden
als murF1 und murF2 bezeichnet und ihre Nukleotidsequenzen waren
wie folgt:
Stromaufwärts
liegender Primer (murF1 ):
5'cgagcactgcgagagatgattagcgtaacccttagccaactt3' und
Stromabwärts liegender
Primer (mur F2):
5'cagcgcgtgcagcaggctgacagtggcgcga3'.
-
Das murF-Gen scheint unter der Kontrolle
des murE-Promotors transkribiert zu werden, folglich wurden die
obigen PCR-Primer so gestaltet, dass sie eine In-Rahmen-Fusion der
kodierenden murF-Sequenz an den murE-Promotor erlauben. Hierzu wurde
das murE-Gen, einschließlich seines
Promotorelements, mit Hilfe der als murE1 und murE2 bezeichneten
PCR-Primer aus JM105-E. coli isoliert. Die Nukleotidsequenzen dieser Primer
waren wie folgt:
Stromaufwärts
liegender Primer (murE1):
5'gccggatccgcgccggtctttggtgcca3' und
Stromabwärts liegender
Primer (murE2):
5'aagggatccgctaatcatgcaatcacc3'.
-
Wie in 3 gezeigt,
wurde das murE-Gen nach der PCR-Amplifikation in das Plasmid pBR322
kloniert, so dass ein Plasmid entstand, welches als pCB238 bezeichnet
wurde. Das murF-Gen wurde mit Hilfe der Primer murF1 und murF2 aus
JM105-Bakterienzellen amplifiziert. Das Plasmid pCB238 wurde mit
dem NruI-Enzym verdaut, um die kodierende Sequenz des murE-Gens
zu entfernen, wobei die murE-Promotorsequenz zurückblieb. Das amplifizierte
murF-Gen wurde dann in das Plasmid pCB238 ligiert, welches mit dem NruI-Enzym
verdaut worden war, und das erhaltene Plasmid wurde als pCB239 bezeichnet.
-
Das Plasmid pCB239 wurde mit geeigneten
Enzymen verdaut, um ein DNA-Fragment auszuschneiden, welches den
murE-Promotor, fusioniert an das murF-Gen, umfasste und das Fragment
wurde dann in das Plasmid pACYC184 kloniert, um das Plasmid pCB240
herzustellen.
-
Um einen E. coli-Stamm mit einer
irreversiblen Veränderung
(d.h. Deletion) in seinem murF-Gen zu konstruieren, wurde ein Plasmid,
in dem ein deletiertes murF-Gen zusammen mit DNA-Sequenzen, die
von stromaufwärts-
und stromabwärts-liegenden
flankierenden Sequenzen stammten, kloniert wurde, konstruiert. Hierzu
wurde ein Oligonukleotidprimer auf Basis der bekannten Sequenzen
des murE-Gens (stromaufwärts des
murF-Gens) entworfen und ein zweiter Oligonukleotidprimer wurde
auf Basis der bekannten Sequenz des OrfY-Gens (stromabwärts des
murF-Gens) entworfen. Der stromaufwärts liegende Primer wurde als
murE1 bezeichnet und hatte folgende Nukleotidsequenz:
5'gccggatccgcgccggtctttggtgcca3'.
-
Der stromabwärts liegende Primer wurde als
OrfY-1 bezeichnet und hatte folgende Nukleotidsequenz:
5'taacgccagcgaacctacatc3'.
-
Die Primer murE1 und OrfY-1 wurden
in der PCR-Reaktion verwendet, um das murF-Gen mit flankierenden Sequenzen, die
von dem murE- und dem OrfY-Gen stammten, zu amplifizieren. Wie in 4 gezeigt, wurde das amplifizierte
DNA-Fragment in das Plasmid pBR322 kloniert, um das Plasmid pCB241
zu erzeugen. Das Plasmid pCB241 wurde mit geeigneten Enzymen verdaut,
um den Großteil
des murF-Gens zu entfernen, so dass nur ein kleiner Teil der murF-Gensequenz,
flankiert durch eine von dem murE-Gen abstammenden Sequenz auf einer
Seite und einer Sequenz, die von dem OrfY-Gen abstammte, auf der
anderen Seite, zurückblieb.
Nach dem Verdau wurde das Plasmid selbst-ligiert, so dass das Plasmid
pCB242 entstand. Das DNA-Fragment, welches die Sequenzen umfasste,
die von dem murE-Teil der murF- und OrfY-Genen abstammten, wurde
aus dem Plasmid pCB242 zurückgewonnen,
indem das letztere mit geeigneten Enzymen verdaut wurde. Das DNA-Fragment,
das die letzteren Sequenzen trug, wurde dann in den Suizidvektor pCVD442
ligiert und dann in SY327-E. coli-Zellen transformiert. Die letzteren
Bakterienzellen wurden zur Herstellung des Plasmids pCVD442 verwendet,
welches die flankierenden Sequenzen enthielt, und dieses letztere Plasmid
wurde als pCB243 bezeichnet. Das Plasmid pCB243 wurde dann in E.
coli-SM10-Zellen transformiert, so dass eine Bakterienzellpopulation
entstand, die zur Übertragung
der murF-Deletion in den E. coli-Stamm CB101 geeignet war.
-
Wie in 5 gezeigt,
wurden SM10-Bakterienzellen, die das Plasmid pCB243 trugen, verwendet,
um das irreversibel nicht-funktionale (d. h. mit interner Deletion
versehene) murF-Gen in den E. coli-Stamm CB101 zu transferieren,
der mit dem Plasmid pCB240 transformiert war, und zwar durch das
oben beschriebene Konjugationsprotokoll (Donnenberg und Kaper 1990).
Die Inkorporation des irreversibel veränderten murF-Gens in das Chromosom
der CB101-Bakterienzellen und der Ersatz des full-length-Wildtyp-murF-Gens
der letzteren Bakterienzellen mit dem irreversibel veränderten
murF-Gen wurde durch
PCR-Analyse der chromosomalen CB101-DNA bestätigt. Der CB101-Bakterienstamm mit
einer internen Deletion in dem murF-Gen wurde als CB102 bezeichnet.
-
Der Bakterienstamm CB102 kann dann
mit dem Plasmid pCB239 transformiert werden, um das Plasmid pCB240
zu verdrängen.
Der Bakterienstamm CB102, der das Plasmid pCB239 trug, wurde als
CB103 bezeichnet.
-
Beispiel 2
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Konstruktion eines alternativen
murF-defizienten Bakterienwirts, TK-48
-
Bestimmte Temperatur-empfindliche
Bakterienzellmutanten, die eine Mutation in dem murF-Gen enthalten,
wie die TKL-46, können
bei 30°C
aufgezogen werden, wachsen jedoch nicht bei der nicht-zulässigen Temperatur
von 42°C.
Die Unfähigkeit
dieser Mutanten, bei nicht-zulässigen
Temperaturen zu wachsen, ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass
sie aufgrund der Mutation in dem murF-Gen kein vollständiges und
funktionales Zellwand-Tetrapeptid aufbauen können. Diese Mutanten können als
bakterielle Wirte in den erfindungsgemäßen Zellkultursystemen verwendet
werden.
-
Ein System zur Herstellung rekombinanter
Plasmide, das sich für
die Verwendung bei der DNA-Immunisierung und der Gentherapie eignet,
kann daher konstruiert werden, indem man in diese Temperatur-empfindlichen
Bakterienzellen (z. B. des E. coli-Stamms TKL- 46 oder seiner Derivate) ein rekombinantes
Plasmid einführt,
das ein bei 42°C
funktionales murF-Gen enthält.
Durch das Aufziehen der Bakterienzellen bei 42°C überleben dann nur diejenigen
Zellen, die das rekombinante Plasmid tragen.
-
In diesem Beispiel wurde ein weiter
bevorzugtes Derivat von TKL-46, das sich als Wirt eignet, hergestellt.
Der E. coli-Stamm TKL-46 (Lugtenberg et al., J. Bacteriology (1972)
110: 35–40)
stammte von dem Coli Genetic Stock Center (CGSC). TKL-46-Bakterienzellen
wurden zunächst
bei 30°C
in LB-Nährmedium
aufgezogen, welches das Antibiotikum Nalidixinsäure enthielt, um einen Nalidixinsäure-resistenten
Stamm, der als TKL-47 bezeichnet wurde, zu selektieren. TKL-47-Zellen
wurden recA-negativ gemacht, indem man sie mit dem (Nalidixinsäure-sensitiven,
recA-negativen) Bakterienstamm JC10240 konjugierte, so dass die
Fähigkeit der
Zellen für
eine homologe Rekombination verloren ging. Ihre Chromosomen nehmen
daher kein genetisches Material von der eingeführten Plasmid-DNA auf. recA-negative
Zellen, die von TKL-47-Zellen stammten, wurden als TKL-48 bezeichent.
-
TKL-48-Bakterienzellen wurden bei
30°C aufgezogen
und dann zur Herstellung kompetenter Bakterienzellen verwendet.
Kompetente TKL-48-Bakterienzellen wurden mit dem Plasmid pCB239
transformiert, welches ein funktionales murF-Gen trug, um einen
Bakterienstamm herzustellen, der als TKL-49 bezeichnet wurde. TKL-49-Bakterienzellen wurden
dann zum Erhalt des rekombinanten Plasmids und der Plasmid-DNA-Produktion bei
42°C aufgezogen.
-
Als Alternative zu CH102- oder TKL-48-Bakterienzellen
als Wirte wurden zusätzliche
verbesserte Formen konstruiert, indem man das murF-Gen in den Chromosomen
der Zellen modifizierte, die native wünschenswerte Eigenschaften
hatten. Einigen E. coli-Stämmen fehlt
beispielsweise ein Enzym, wie Endonukleasen, die Plasmid-DNA abbauen.
Gelingt es einem die Chromosomen dieser Wirte zu verändern, um
beispielsweise die Temperatur-empfindliche Form von murF bereitzustellen,
bieten diese Wirte vorteilhafte Alternativen zu TKL-48.
-
Das Temperatur-empfindliche murF-Gen
aus TKL-46 wurde durch Amplifizieren der geeigneten Sequenz mittels
PCR und der murF3- und murF4-Primer gewonnen:
murF3 (stromaufwärts liegender
Primer):
5'gccggatcccgatcgcgtcacggtggcgcg3'
murF4 (stromabwärts liegender
Primer):
5'gaagatctcagcgcgtgcagcaggctgacagtggcgcga3'
-
Die amplifizierte Nukleotidsequenz
wurde in die BamHI-Stelle von pUC19 kloniert, und die Nukleotidsequenz
wurde mit Hilfe des Dideoxynukleotidverfahrens bestimmt. Die vollständige Nukleotidsequenz
des amplifizierten Gens ist in 11 gezeigt
und unterscheidet sich von dem Wildtyp-Gen in den Positionen 862 und
990, wie in 11 gezeigt.
Der Austausch von G gegen A in Position 862 führt zu Threonin anstelle von Alanin;
die Addition des GAC-Kodons in Position 990 führt zur Addition eines Asparaginsäurerests
an die Peptidsequenz.
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Der Wirtsstamm mit gewünschten
Eigenschaften wird dann verändert,
indem man das Wildtyp-murF-Gen gegen die Temperatur-empfindliche
Form ersetzt, üblicherweise
durch homologe Rekombination, um den verbesserten Bakterienwirt
zu erhalten.
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Daher können entweder CB102 oder TKL-48
oder weitere gewünschte
Bakterien, die so modifiziert wurden, dass sie das Temperatur-empfindliche
murF-Gen enthalten, und welches irreversible chromosomale Mutation
in dem murF-Gen haben, die das Gen oder das davon kodierte murF-Protein
unter den verwendeten Kulturbedingungen nichtfunktional machen,
dort als geeignete Wirte verwenden, wo das eingeführte Plasmid ein
unter den verwendeten Kulturbedingungen funktionales murF-Gen enthält. Die
Produktionsmengen kann man mit der Produktion fremder DNA, die in
dem Plasmid pBR322 enthalten ist, vergleichen, wobei ein Markergen
für Ampicillin
kodiert.
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Beispiel 3
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Konstruktion
weiterer murF-Gen-haltiger Plasmide
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Mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen
murE1- und murE2-Primer wurde das chromosomale murE-Gen mittels
PCR aus der genomischen E. coli JM105-DNA amplifiziert und in die
BamHI-Stelle von pUC18 kloniert. Das erhaltene Plasmid pMO101 wurde
mit NruI geschnitten, wodurch der Großteil des murE-Gens, bis auf
den murE-Promotor und etwa 330 by vom murE3'-Ende, entfernt wurden. Das wie in Beispiel
1 beschrieben amplifizierte murF-Gen wurde in die NruI-Stelle von
pMO101 ligien und das Ligationsgemisch wurde in E. coli JM109 transformiert.
Zwei Plasmide, die als pMO102 und pMO106 bezeichnet wurden und die
kodierende murF-Sequenz in entgegen liegenden Richtungen enthielten,
wurden identifiziert. pMO106 enthielt das murF-Gen in der richtigen
Orientierung, operativ an den murE-Promotor geknüpft, und exprimierte das murF-Protein;
pMO102 enthielt die falsche Orientierung von murF und exprimierte
das Gen daher nicht. Eine Zusammenfassung der Konstruktion von pMO102
und pMO106 ist in 6 gezeigt.
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Weitere Plasmide, die das murF-Gen
enthielten, wurden wie folgt konstruiert: pHW203 wurde als System
zum Testen der in vitro-Transfektionswirksamkeit in eukaryoten Zellen
konstruiert. pCMVB, erhältlich
von Clonetech, welches das β-Galactosidasegen
unter der Kontrolle eines in Säugetierzellen
wirksamen Promotors enthielt, wurde mit EcoRI geschnitten, mit Klenow
behandelt und mit dem BamHI, Klenow-gefüllten Fragment von pMO106 ligiert,
welches das murF-Gen enthielt. Das resultierende Plasmid wurde mit
BstHI geschnitten, um das Ampicillin-Resistenzgen zu entfernen,
und religiert. Das religierte Produkt wurde in TKL-48 transformiert
und eine isolierte Kolonie, weiche das Plasmid pHW203 enthielt,
wobei die Kolonie TKL-52 genannt wurde, wurde zur Herstellung des
Plasmids im Großmaßstab verwendet.
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Das Plasmid pCB253 wurde konstruiert,
um zu untersuchen, ob das murF-Gen eine Wirkung auf die DNA-Immunisierung
in eukaryoten Wirten besaß.
Das Wirtsplasmid, pSLRSVGIV.md1, erhalten von R. Braun, enthielt
das Gen, das für
das Glycoprotein IV (GIV) aus dem Rinder-Herpes-Virus kodierte und
zwar unter der Kontrolle des Rous-Sarcoma-Virus-Promotors; daher enthielt
dieses Plasmid ein Expressionssystem zur Herstellung eines Immunogens
in Vertrebraten. Das BamHI-DNA-Fragment aus pMO106, welches das
murF-Gen unter der Kontrolle des murE-Promotors enthielt, wurde
in die Msc-Stelle von pSLRSVGIV.md1 ligiert und das Ligationsgemisch
wurde in JM109-Zellen transformiert (die von New England Biolabs
stammten). Das aus erfolgreichen Transformanten isolierte Plasmid
wurde mit BstHI verdaut, um das Ampicillin-Resistenz-Gen zu entfernen,
religiert und dann in TKL-48 transformiert, um das Produktplasmid
pCB253 zu erhalten. Die pCB253-Kolonie, die als TKL-51 bezeichnet
wurde, wurde zur Herstellung dieses Plasmids im Großmaßstab verwendet.
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In den vorstehenden Abschnitten wurde
TKL-48 mit pMO102, pMO106, pCB253 oder pHW203 transformiert, indem
man kompetente Zellen mit Plasmid-DNA mischte und 30 Minuten auf
Eis inkubierte. Die Zellen wurden dann 90 Sekunden bei 42°C durch Hitzeschock
behandelt und dann in 1 ml LB-Nährlösung 2 Stunden bei
30°C inkubiert.
Die Zellen wurden dann auf LB/0,1 %-Thymin-Platten ausplattiert
und über
Nacht bei 42°C inkubiert.
Die erhaltenen transformierten Zelllinien wurden wie folgt benannt:
pMO102-TKL-49A;
pMO106-TKL-50;
pCB253-TKL-51;
pHW203-TKL-52.
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Natürlich erzeugten die TKL-49A-Zellen
das murF-Genprodukt nur bei 30°C
und sie wurden als Kontrolle verwendet, um die Plasmidausbeute in
Gegenwart von Ampicillin als selektierbarer Marker bei 30°C zu ermitteln.
Die Plasmidausbeute der restlichen Zell-Linien konnte bei 42°C ohne Zugabe von Ampicillin
ermittelt werden.
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Beispiel 4
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Plasmidausbeute
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TKL-50-, -51- und -52-Zellen wurden
verwendet, um die Plasmidausbeute zu ermitteln, wenn Zellen bei
42°C ohne
die Zugabe von Ampicillin aufgezogen wurden, TKL-49A-Zellen wurden als
Kontrollen verwendet. Einzelne Kolonien der LB/Thymin-Platten wurden
gepicked und 2 ml TB/Thymin-Nährlösung wurde
damit beimpft und 6 Stunden bei 42° inkubiert (30°C in Gegenwart
von Ampicillin für
TKL-49A). Mit den Zellen wurden dann 10 ml TB/Thymin-Nährlösung beimpft,
man ließ die
Zellen 4 oder mehr Stunden wachsen und beimpfte damit dann 250 ml
TB/Thymin-Nährlösung und
ließ die
Zellen weitere 12 Stunden wachsen. Die Plasmide wurden mit Hilfe
von Quiagen-(Marke)
Säulen
nach den Herstellerangaben extrahiert und die Plasmidausbeute wurde
durch Berechnen der O. D. bei 260 und 280 bestimmt. Die Reinheit
der Plasmide wurde durch die Analyse von Plasmid-Aliquots auf Agarosegelen
bestimmt.
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Die Plasmidausbeute wurde auch in
einer Sauerstoff-angereicherten 10-Liter-„Fed-Batch"-Fermentation in einem 14-Liter-NBS-Microferm-
(Marke) Apparat bestimmt, und zwar in TB-Nährlösung, angereichert mit 0,01%
Thymin bei einer Rührgeschwindigkeit
von 200 Upm, einem Luftfluss von 0,6 VVM (6 l/min, 5 psig) und einem
pH-Wert, der bei 7,2 gehalten wurde. Die Plasmidausbeute wurde durch
die anschließende
Extraktion der Plasmid-DNA aus Aliquots des Kulturmediums mit Hilfe
des Quiagen- (Marke) Säulenverfahrens
bestimmt.
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Die Ausbeute aus Zellen, die in Schüttelflaschen
(3 Präparationen)
oder einem 10-Liter-Gärbottich (zwei
Läufe)
aufgezogen wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt.
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7 zeigt
die absolute und spezifische Plasmidausbeute, bestimmt für das Plasmid
pMO106, hergestellt in dem TKL-50-Stamm.
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Beispiel 5
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Plasmidstabilität
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Die Stabilität des Plasmids pMO106 in dem
TKL-50-Stamm wurde über
170 Wachstumsgenerationen unter verschiedenen Selektionsdrücken für die Erhaltung
des Plasmids wie folgt bestimmt. Zellen wurden in TB/0,1% Thymin-Nährlösung entweder
bei 30°C
oder bei 42°C
aufgezogen. Nach unterschiedlichen Generationen wurden Proben bei
der relevanten Temperatur entnommen, verdünnt und auf TB/Thyminplatten
ausplattiert und bei 30°C
inkubiert. Die Kolonien wurden dann auf TB/Thymin/Ampicillin-Platten
repliziert und bei 30°C oder
42°C inkubiert.
Der Prozentsatz Plasmid-haltiger Zellen wurde durch Vergleichen
der Anzahl Kolonien, die in Gegenwart und Abwesenheit von Ampicillin
bei 30°C
oder 42°C
wuchsen, ermittelt. Das Vorliegen von Plasmiden wurde ferner durch
ein alkalisches Lyseverfahren zur Plasmidpräparation auf kleinem Maßstab bestätigt.
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Das Plasmid pMO106 ging langsam aus
Zellen verloren, die bei 30°C
wuchsen, wurde jedoch in 100% der Zellen, die bei 42°C wuchsen, über 170
Wachstumsgenerationen erhalten, wie in 8 gezeigt. Die Integrität des Plasmids
pMO106 wurde durch Restriktionsanalyse bestätigt.
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TKL-49A-Ze11en wurden auch getestet,
indem man sie in Gegenwart von Ampicillin bei 30°C wachsen ließ; das Plasmid
pMO102 blieb über
120 Generationen in 100% der Zellen erhalten.
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Beispiel 6
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Wirksamkeit
der in vitro-Transfektion
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Die oben beschriebenen Plasmide pCMVB
und pHW203 wurden in diesem Assay verwendet. Jeweils 2 μg jedes Plasmids
wurden getrennt mit verschiedenen Mengen Lipofectamin (Gibco/BRL)
gemischt und gemäß den Herstellerangaben
in Maus-Fibroblasten-L-929-Zellen
transfiziert. Die Transfektionseffizienz wurde in einem kolorimetrischen
X-gal-Assay bestimmt, indem man die Anzahl Zellen zählte, die β-Galactosidase exprimierten,
und zwar im Vergleich zur Gesamtzahl Zellen pro Well.
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Es wurden, wie in 9 gezeigt , ähnliche Transfektionseffizienzen
für beide
Plasmide gefunden.
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Beispiel 7
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Wirkung des
murF-Gens auf die Immunisierung
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Mäuse,
jeweils in Gruppen von 10, wurden zweimal (im Abstand von zwei Wochen)
intramuskulär
mit jeweils 100 μg
eines der Plasmide pCB253, pSLRSVG1V.md1 (oben beschrieben) oder
einem Null-Vektor immunisiert. Ein und drei Wochen nach der zweiten
Injektion ließ man
die Mäuse
ausbluten und untersuchte ihre Seren auf das Vorliegen von Antikörpern, die
im ELISA-Assay immunologisch spezifisch mit dem GN-Glycoprotein
reagierten. Wie in 10 gezeigt,
wurden in beiden Fällen ähnliche
Antikörpertiter
gefunden.
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Beispiel 8
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Fehlen einer
murF-Homologie mit humanen Sequenzen
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Die Suche in Nukleotid- und Aminosäuresequenz-Datenbanken
zeigte, dass Sequenzen, die mit dem murF-Gen/Protein assoziiert
sind, keine Homologie zu einer bekannten humanen Gen/Protein-Sequenz
besitzen. Um das Fehlen einer Homologie zu bestätigen, wurde humane genomische
DNA, gekauft von der Promega Corporation, mit EcoRI und BamHI verdaut
und mit BamHI geschnittenem pMO106 versetzt. Die genomische DNA
wurde auf 0,7%-igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt und
zwar zusammen mit dem BamHI-Fragment, welches das murF-Gen aus pMO106,
das für
die Sequenz an sich kodierende murF-Gen und ein mit EcoRI linearisiertes
Plasmid pMO106 enthielt. Nach dem Transfer auf Nylonmembranen mittels Kapillartransfer
wurden die DNAs durch Vernetzung mit ultraviolettem Licht gemäß den Herstellerangaben
fixiert. Die Membranen wurden 8 Stunden bei 50°C in 6 × SSC, 0,5% Natriumdodecylsulfat
vorhybridisiert und dann 12 Stunden mit einer 32PdCTP-markierten
full-length-murF-DNA-Sonde
hybridisiert. Die Blots wurden zweimal 30 Minuten bei 22°C in 2 × SSC, 0,5%
SDS gewaschen und anschließend
zweimal 30 Minuten bei 50°C
in 1 × SSC,
0,5% SDS. Nach dem Trocknen und Aussetzen gegenüber Röntgenfilmen, 16 Stunden bis 2
Wochen, wurde kein Hybridisierungssignal mit humaner genomischer
DNA nachgewiesen.
