DE69822453T2

DE69822453T2 - Regulationssystem für induzierbare expression von gene mit lambda-ähnlichen promotoren

Info

Publication number: DE69822453T2
Application number: DE69822453T
Authority: DE
Inventors: Maurice Nico MERTENS; Rene Erik REMAUT; Charles Walter FIERS
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1998-04-23
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2018-04-24
Also published as: CA2287541C; DK0975775T3; AU7649198A; US6485934B1; ATE262041T1; PT975775E; WO1998048025A3; JP2001526533A; CA2287541A1; WO1998048025A2; EP0975775B1; EP0975775A2; AU729712B2; DE69822453D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges, auf lambdoiden Promotoren basierendes Regulationssystem für die induzierbare Expression von Genen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein regulatorisches Replikon und ein Verfahren für die Herstellung heterologer Proteine.
Um die Herstellung von humanen oder tierischen Proteinen in genügenden Mengen zu ermöglichen, wird das Gen, das für das Protein kodiert, üblicherweise in das Bakterium Escherichia coli kloniert. Dieses Bakterium besitzt eine hohe Syntheserate und ist auf molekularer Ebene gut charakterisiert. Bakterielle Regulationssignale sind für die Expression des klonierten Gens im bakteriellen Wirt ebenfalls von Nöten.
Es wurde herausgefunden, dass die stärksten Regulationssignale für E. coli nicht vom Bakterium selbst herstammen, sondern von Bakteriophagen, welche die Bakterien angreifen. Es existieren so genannte nicht-temperente und temperente Phagen.
Der erste Typ sind Phagen mit unregulierten Promotoren. Gene, die unter der Kontrolle solcher Promotoren stehen, werden kontinuierlich exprimiert. Dies resultiert in einer hohen Proteinherstellung, die für die Wirtsbakterien schädlich oder sogar letal sein kann.
Der andere Typ, die so genannten temperenten Phagen, können ihre DNA in einer nicht-aktiven Form in das Wirtsgenom inserieren und co-replizieren daher passiv mit diesem Wirtsgenom. Durch die Induktion bestimmter Promotoren wird der Wirt zur Herstellung von Phagenprotein oder, im Fall von Expressionsvektoren, die auf Phagenpromotoren basieren, zur Herstellung des heterologen Proteins stimuliert. Solange keine Induktion stattfindet, wird die vom Promotor ausgehende Expression durch Repressormoleküle unterbunden, die kooperativ an den Promotor binden. Die Promotoren der temperenten Phagen gehören zu den stärksten, aber auch zu den am besten exprimierten und kontrollierbaren Promotoren von E. coli, die bekannt sind (Lanzer & Bujard (1988); Knaus & Bujard (1988)).
Die Kombination der innewohnenden Stärke und überlegenen Regulation lässt diese Promotoren anderen regulierbaren oder nicht-regulierbaren E. coli-Promotoren vorziehen, um eine heterologe Expression in einem industriellen Maßstab zu erreichen.
Der am besten bekannte und Prototypphage der Gruppe der temperenten Phagen ist der E. coli-Phage λ. Es gibt viele λ-verwandte oder lambdoide Phagen wie 21, ϕ80, ϕ81, 82, 424, 434, P22, etc. Diese Phagen besitzen üblicherweise eine unterschiedliche Immunität, unter anderem wegen des Gebrauchs unterschiedlicher Promotorsequenzen, Repressormoleküle und Operatorsequenzen.
Viele Expressionsplasmide für die heterologe Proteinherstellung, die in E. coli verwendet werden, basieren auf dem λP_L-Promotor. Der λP_L-Promotor ist sehr stark und kann gut reguliert werden. Der am besten bekannte und am meisten kontrollierbare Regulationsmechanismus verwendet eine thermosensitive Mutante des ursprünglichen Repressormoleküls. In diesem Fall kann die von diesem Promotor ausgehende Induktion der Proteinsynthese durch ein Anheben der Temperatur von 28°C bis 42°C initiiert werden. Das Repressormolekül wird durch diesen Temperaturanstieg deaktiviert. Allerdings kann diese höhere Temperatur für die Herstellung vieler Proteine auch nachteilig sein, weil das Protein, anstatt löslich zu bleiben, dann zum größeren Teil in Form so genannter Einschlusskörper ausfällt, wobei es seine Aktivität verliert.
Tatsächlich stellen Einschlusskörper ein Aggregat falsch gefalteter Polypeptidketten dar. Es handelt sich um ein Phänomen, das sich sowohl im Labormaßstab, als auch im industriellen Maßstab beobachtet werden kann, wenn versucht wird, große Mengen eines spezifischen Proteins in E. coli herzustellen. Einschlusskörper können per se sehr einfach von den anderen zellulären Proteinen in einem Schritt abgetrennt werden. Allerdings muss nach der Isolation der Einschlusskörper das Protein zuerst durch Mittel wie zum Beispiel Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid denaturiert werden und anschließend langsam in die natürliche, räumliche Struktur zurückgefaltet werden. Dieses Zurückfalten des Proteins aus den Einschlusskörpern ist nicht immer erfolgreich und resultiert im Allgemeinen in einem beträchtlichen Verlust von Material und führt auf Grund des Anstiegs der Anzahl der Schritte in der Endprozessierung zu Extrakosten im maßstäblich vergrößerten Verfahren. Das häufige Auftreten von Einschlusskörpern hat dazu geführt, dass es nicht immer möglich ist, das Potential eines wirtschaftlich vorteilhaften Expressionswirts für die heterologe Proteinherstellung vollständig auszunutzen.
Es wurde herausgefunden, dass die Bildung von Einschlusskörpern manchmal durch die Reduzierung der Fermentationstemperatur vermieden werden kann. Der Grund hierfür könnte entweder darin liegen, dass die niedrigere Temperatur einen unterschiedlichen Effekt auf die Faltung des überproduzierten Proteins besitzt, oder dass weniger neu synthetisierte Proteinmoleküle pro Zeit- und Volumeneinheit vorliegen.
Wenn eine Proteinsynthese bei einer niedrigeren Temperatur erwünscht ist, ist es nicht mehr möglich, die zur Zeit vorhandene und viel gebrauchte Temperaturinduktion in Verbindung mit den starken und gut regulierten Promotoren zu verwenden, die vom Phagen Lambda und verwandten Promotoren abstammen.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches, gut kontrollierbares Regulationssystem für starke und hoch reprimierbare Promotoren bereitzustellen, die von lambdoiden Phagen abstammen, mit denen eine Induktion bei einer niedrigeren Temperatur möglich wird.
Dies wird durch die Erfindung mit einem Regulationssystem für Expressionsvektoren erreicht, die einen lambdoiden Promotor, ein Gen, das für einen Repressor des lambdoiden Promotors kodiert, und ein Gen umfasst, das für einen Anti-Repressor des Repressors kodiert, wobei das Gen des Anti-Repressors unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht. Dieser Promotor kann von einem Gen abstammen, welches ein anderes ist als das Gen des Anti-Repressors selbst, und ist vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen induzierbar.
Die Regulation der heterologen Proteinexpression kann jetzt durch die Expression des Anti-Repressors kontrolliert werden. Die Abwesenheit oder Anwesenheit des Anti-Repressors bestimmt die Suppression bzw. Aktivierung des Promotors des Proteins, das hergestellt werden soll. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Anti-Repressors ist im Gegenzug dadurch reguliert, ob der Promotor des Anti-Repressors induziert ist oder nicht.
Die Regulation des Gens des Anti-Repressors kann auf unterschiedliche Weise stattfinden. Beispielsweise kann daher von einem Promotor Gebrauch gemacht werden, der durch Laktose, Arabinose oder die Abwesenheit von Aminosäuren regulierbar ist, oder von jedem anderen regulierbaren Promotor.
Die unterschiedlichen Bestandteile des Regulationssystems gemäß der vorliegenden Erfindung können auf einem Chromosom des Wirts positioniert werden, sowie auf einem oder mehreren individuellen Replikons, beispielsweise Plasmiden. In einer besonderen Ausführungsform kann das Gen des Anti-Repressors zusammen mit dem Gen, das für den Repressor des Promotors des Gens für den Anti-Repressor kodiert, auf einem regulatorischen Plasmid liegen. Solch ein regulatorisches Plasmid kann dann mit jedem beliebigen Expressionsvehikel kombiniert werden, welches das heterologe Gen und seinen Promotor und das Repressionssystem enthält. Gegebenenfalls kann sich das Repressionssystem des Promotors des heterologen Gens auch auf dem regulatorischen Vehikel befinden. Alle Bestandteile können auch auf unterschiedlichen Replikons liegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Anti-Repressor das ant des lambdoiden Phagen P22. Ant wird in der immI-Region des Phagen P22 von Salmonella typhimurium kodiert und beteiligt sich an einer nicht-kovalenten Interaktion mit dem C-terminalen Teil des P22c2-Repressors und verhindert dadurch die Dimerisierung des c2-Repressors, die für die Repressoraktivität benötigt wird, und bindet dadurch an den Operator.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Regulationssystems gemäß der vorliegenden Erfindung, steht die Expression dieses Anti-Repressors unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors wie P_N25/O2 Die Repression des P_N25/O2-Promotors findet beispielsweise mittels des lacI-Repressors von E. coli statt. Die Induktion diese Promotors basiert auf einer Derepression und findet vorzugsweise mittels Applikation von IPTG statt.
Das Regulationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung, ist ein flexibles System, wobei gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die Induktion der erwünschten heterologen Proteinsynthese auf zwei Weisen stattfinden kann. Einerseits kann die Herstellung des Anti-Repressors bereits bei niedriger Temperatur durch die Zugabe von IPTG initiiert werden, was zu einer Derepression des lambdoiden Promotors führt. Es ist auch möglich, die selbe bakterielle Kultur zu verwenden, wobei die konventionelle temperaturabhängige Induktion immer noch angewendet werden kann.
Das Regulationssystem kann mit jedem Expressionsvektor angewendet werden, der von Lambda abgeleitet ist. Als regulierbarer Promoter des heterologen Gens wird der λP_L-Promotor besonders empfohlen, aber die Erfindung ist bestimmt nicht darauf beschränkt. Der λP_R-Promotor oder jeder beliebige lambdoide Promotor, der durch einen Repressor mit genügend hoher Homologie in der C-terminalen Region zu dem durch ant zu erkennenden P22c2 reprimiert werden kann, kann ebenfalls verwendet werden.
Das Prinzip der Erfindung, d. h. die Regulation eines Promotors, welcher durch ein Repressionssystem mittels eines Anti-Repressors induzierbar ist, der auf eine regulierte Art und Weise exprimiert wird, kann natürlich auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung in Konfigurationen angewendet werden, welche anders sind, als die hierin spezifisch beschriebenen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein regulatorisches Replikon, das ein Gen umfasst, welches für einen Anti-Repressor kodiert, wobei das Gen des Anti-Repressors unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht. Das Replikon kann weiterhin ein Gen umfassen, welches für einen Repressor des induzierbaren Promotors des Anti-Repressor-Gens kodiert. Ferner kann ein Gen, das für einen Repressor eines lambdoiden Promotors kodiert, ebenfalls im Replikon anwesend sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Replikon gemäß der vorliegenden Erfindung das unter der Kontrolle des P_N25/O2-Promotors stehende Gen, welches für das P22ant-Protein von S typhimurium kodiert, das lacI^q-Gen, das unter der Kontrolle des pLacI^q-Promotor steht und das Gen, welches für den cI857-Repressor kodiert.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines regulatorischen Replikons gemäß der vorliegenden Erfindung ist in den 1 und 3 gezeigt. Beide Figuren zeigen das Plasmid, das hierin als pICA2 bezeichnet ist. 3 zeigt die allgemeine Struktur und 1 die Restriktionskarte. Die Konstruktion dieses Plasmids ist in den Beispielen beschrieben.
In einer alternativen Ausführungsform des Replikons gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Replikon weiterhin die Regulationssignale umfassen, einschließlich des lambdoiden Promotors, welche für die Expression eines heterologen Gens benötigt werden.
In einer solchen Ausführungsform gibt es daher keine zwei separaten Vektoren für Expression und Regulation, sondern nur einen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Expressionssystem, welches ein regulatorisches Replikon und einen Expressionsvektor umfasst, der vom Phagen Lambda abgeleitet ist. Beispiele von Expressionsvektoren, die vom Phagen Lambda abgeleitet sind, sind pLT10T oder pLR10T.
Letztendlich betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung eines Genprodukts in einem heterologen Wirt, umfassend die Bereitstellung einer Kultur eines Wirts, welcher die heterologe Sequenz umfasst, die für das Genprodukt kodiert, wobei die Expression der heterologen Sequenz unter der Kontrolle eines Regulationssystems steht, das wenigstens aus einem lambdoiden Promotor, der operativ mit der heterologen Sequenz verbunden ist, aus einem Gen, das für einen Repressor des lambdoiden Promotors kodiert und aus einem Gen, welches für einen Anti-Repressor kodiert, besteht, wobei das Gen des Anti-Repressors operativ mit einem induzierbaren Promotor verbunden ist, und wobei die Methode die Induktion des Promotors des Gens des Anti-Repressors umfasst. Falls der induzierbare Promotor des Gens des Anti-Repressors der P_N25/O2-Promotor ist, kann er durch die Zugabe von IPTG zur Kultur induziert werden.
Unten nachfolgend ist eine Zusammenfassung der Definitionen, die in dieser Anmeldung verwendet werden.
Anti-Repressor: Protein, das einen Repressor neutralisieren kann und daher den reprimierten Promotor aktiviert.
Phage: (Bakteriophage) Ein Virus, dessen Wirt ein Bakterium ist.
Phage λ: (Bakteriophage Lambda) Temperenter Bakteriophage, der Escherichia coli infiziert, gehört zur Familie der Styloviridae.
Phage P22: (Bakteriophage P22) Temperenter Phage, der Salmonella typhimurium infiziert, gehört zur Familie der Podoviridae.
Gen Expression: Expression eines Gens durch Transkription und Translation zu einem Polypeptid oder einem Protein (funktionales Protein).
Temperenter Phage: Phage, der seine genetische Information durch Infektion, sowie mittels der Zellteilung des Wirts nach Insertion in das Genom weitergeben kann.
Immunität: (Phagen-Immunität) Resistenz gegenüber einer Superinfektion mit Phagen, welche die selben oder homologe regulatorische Elemente besitzen.
Einschlusskörper: Diskrete Strukturen, die aus nicht-nativ gefaltetem, coaguliertem Protein bestehen.
LMBP: Laboratory of Molecular Biology Plasmid Collection, anerkannte Körperschaft für die Hinterlegung von Plasmiden, Teil der Belgian Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM).
Plasmid: Extra-genomische Replikationseinheit.
Promotor: DNA-Sequenz, welche die Initiierung der Transkription ermöglicht.
Replikon: Eine Einheit DNA-Replikation.
Repressor: Protein, das die Transkriptioninitiation auf einem oder mehreren bestimmten Promotoren verhindert.
Vektor: Eine biologische Einheit, welche die Vervielfältigung der genetischen Information sicherstellen kann.
In den unten stehenden Beispielen wird die Erfindung auf der Basis des prokaryotischen lacZ-Gens und der eukaryotischen Gene, welche für humanes Interferon-γ (hIFN_γ), murines Interleukin 2 (mIL2) und humanes Interleukin 2 (hIL2) kodieren, als Modellsysteme für Proteinsynthese erläutert. Für den Fachmann wird es offensichtlich sein, dass mit dem hier beschriebenen System auf eine analoge Art und Weise andere Gene in einer regulierten Weise exprimiert werden können, ohne dass zu diesem Zweck irgendeine erfinderische Tätigkeit ausgeführt werden muss.
Beispiele
Zunächst sind im Folgenden die verwendeten Materialien und Methoden erläutert. Danach ist die Erfindung in den Beispielen erläutert. Für die Stützung der meisten Methoden ist ferner ein Hinweis auf Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA, und Miller, J. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, gegeben.
Materialien und Methoden
1. Bakterienstämme, Phasen und Plasmide
Alle Klonierungsexperimente wurden in E. coli MC1061 (hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7697ΔlacX74 galU galK rpsL thi) (Casadaban und Cohen, 1980) ausgeführt, der mit δ lysogenisiert wurde, als δP_L-enthaltende Plasmide vermehrt wurden. Expressionsexperimente wurden in MCI061 ausgeführt, der mit einem regulatorischen Plasmid (zum Beispiel pcI857 oder pICA2) transformiert wurde.
Der Repressor stammte von pcI857 (LMBP537), einem Vektor mit einer hohen Kopienzahl (P15A Replikon), welcher ein autogen reguliertes cI857 Gen trägt, das für eine temperatursensitive cI-Mutante kodiert (Remaut et al., 1983).
S. typhimurium L72 (ATCC 19 585) wurde in Nutrient Broth (Difco 0001) angezogen, das mit 0,5% NaCl supplementiert war. Stocks des Phagen P22 (ATCC 19 585-B1) wurden von Platten konfluenter Lysis gewonnen, die hergestellt wurden, indem auf frisch zubereiteten Nährstoff-Agarplatten ein Überschuss von Plaque-bildenden Einheiten verwendet wurde. Der mazerierte Softagar, wurde durch Zentrifugation geklärt, um die Phagenpartikel zu isolieren. P22-DNA wurde mittels Phenolextraktion aufgereinigter Phagenpartikel präpariert.
pLR10T ist ein von pLT10T abgeleiteter Vektor (Mertens et al., 1995b), in welchem der eigentlichen Translationsinitationsstelle ein kleines, gut translatiertes Cistron vorausgeht, welches aus einer Fusion der N-terminalen Region von T7g10 und dem C-terminalen Anteil des E. coli trpB-Gens resultiert (1).
pDMI,1 (LMBP1594) wurde von Dr. Dietrich Stüber (Hoffmann-La Roche, Basel, Schweiz) erhalten (siehe 2).
2. Plasmidkonstruktion (3)
Plasmid-DNA-Aufreinigung wurde ausgeführt wie in Sambrook et al., 1989, beschrieben. Alle Enzyme, die für die Plasmidklonierung verwendet wurden, wurden von New England Biolabs oder Boehringer Mannheim bezogen und gemäß der Empfehlungen der Anbieter verwendet.
Die P22 ant-Region wurde mittels einer PCR mit der Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) ausgeführt, wobei 5'-ATCAGAATTCGCGGTAACAGTCAGGGCTTCGG-3' Vorwärtsprimer und 5'-TTAAGGATCCGAAGCTGGGTCGTTGCGTTGG-3' als Rückwärtsprimer verwendet wurden. Diese amplifiziert eine 1054 bp lange DNA-Region, welche die Koordinaten 498–1531 der POP22IMM Genbank Sequenz umspannt (Sauer et al., 1983). Diese beinhaltet die ant-kodierende Region mit ihrer eigenen Ribosomen-Bindestelle und fügt eine BamHI-Restriktionsstelle an das 3'-Ende an.
Das amplifizierte Fragment wurde mit BamHI geschnitten und in einen mit SmaI und BamHI geöffneten pDS12-Vektor legiert (Stueber et al., 1984). Ein XhoI-BamHI-Fragment aus pDS12ant (mit der P_N25/O2-ant-Kombination) wurde mit dem cI857-Gen auf einem EcoRI-BamHI-Fragment kombiniert, das von pAT153cI857 stammt (Mertens et al., 1995a), (LMBP1065), ein lacI^q-enthaltendes Fragment aus pUC18lacI^q (LMBP3259), das mit AatII und EcoRI geschnitten wurde und ein AatII-SalI-pBR322 (LMBP140)-Vektoranteil. Das resultierende pICA1 ist ein in hoher Kopienzahl vorliegendes Plasmid, welches eine Kombination von lacI^q, cI857 und P_N25/O2 ant enthält, welches gemäß der Erfindung nützlich ist. Aus diesem Plasmid wurde ein EagI-PstI-Fragment mit einem mit PstI und XhoI geschnittenen pUC18Kan (Pharmacia, Schweden) kombiniert und enthält ein npt-Gen (Km^R (Kanamycin-Resistenz)) und mit einem XhoI-EagI-Vektorfragment aus pLG339 (Stoker et al., 1982), um das Plasmid pICA2 gemäß der Erfindung zu erhalten. pICA2 (1) ist ein Plasmid, das in geringer Kopienzahl vorliegt, und das im Hinblick auf den Replikationsursprung (pSC101) und die Antibiotikaselektion mit allen geläufigen Expressionsvektoren kompatibel ist.
3. Geninduktion und Proteinanalyse
Die pCI857, pICA1 oder pICA2 enthaltenden Stämme wurden während der Manipulationen vor der Induktion bei nicht-permissiver Temperatur (28°C) gehalten. Die λP_L-abhängige Temperaturinduktion wurde in MC1061 mit entweder pICA2 gemäß der Erfindung, oder mit dem bekannten pcI857 ausgeführt, indem die Temperatur der Kultur von 28°C auf 42°C angehoben wurde. MC1061 (pICA1) und MC1061 (pICA2) wurden bei Temperaturen von 28°C oder geringer durch das Hinzufügen von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Die Zellen wurden geerntet, in Ultraschallpuffer resuspendiert (SB, 10 mM Tris-Cl pH 7,5; 0,1 M NaCl; 5 mM DTT; 10% Glyzerin) und bei –20°C eingefroren. Aliquots (üblicherweise 200 μl) wurden bei 37°C aufgetaut und auf Eis gekühlt. Die Zellen wurden anschließend durch Ultraschallbehandlung auf Eis aufgebrochen, wobei ein Sonicator von Sonics & Materials (Danbury CT, USA) mit einer Mikrospitze verwendet wurde. Anschließend wurden die Lysate mittels einer Zentrifugation bei 15000 g für 15 Minuten geklärt.
Vor dem Cytokin-Assay wurden die Lysate in SB verdünnt und mit einem Zelluloseacetatfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm filtriert.
β-Galaktosidase wurde bestimmt, indem ONPG als Substrat verwendet wurde (Miller, 1972).
Die mIL2-Titer wurden durch einen Proliferations-Assay bestimmt, wobei die IL2-abhängige zytotoxische T-Zelllinie CTLL-2 verwendet wurde (Guisez et al., 1993).
Die humane Interferon-γ-Aktivität wurde auf humanen FS4-Zellen durch einen Assay auf Reduktion des zytophatischen Effekts bestimmt, wobei der Encephalomyocarditisvirus als Angriffsvirus verwendet wurde (Devos et al., 1982).
Beispiel 1
Konstruktion eines regulatorischen Plasmids für die IPTG-Induktion von λP_L
Das ant-Gen des Phagen P22 von S. typhimurium wurde aus gereinigter P22-DNA amplifiziert und in den pDS12 Expressionsvektor kloniert, wie in Material und Methoden beschrieben ist. Auf diese Weise war das Gen unter der Kontrolle des P_N25/O2-Promotors (Stueber et al., 1984) und mit IPTG induzierbar. Die Induktion des resultierenden Expressionsplasmids pDS12ant resultierte in einer hohen Herstellung des Repressors P22 ant (4B).
Das ant-Gen wurde anschließend mit lacI^q und λcI857 auf eine Weise kombiniert, so dass die unterschiedlichen Promotoren die Expression jedes einzelnen Gens nicht störten. Die resultierende Kombination (pICA1) wurde in ein Replikon mit geringer Kopienzahl transferiert, das ColE1-kompatibel ist und von pSC101 stammt und ebenso einen Kanamycin-Resistenz Selektionsmarker trägt (Stoker et al., 1982). Das resultierende Plasmid pICA2 enthält alle notwendigen Informationen für die Repression von λP_L oder λP_R (mittels cI857) und für die Repression (mittels lacI^q) und die Induktion (vom P_N25/O2-ant Promotor aus) des Anti-Repressors und kann daher als ein geeignetes expressionsregulatorisches Plasmid für die IPTG-induzierte λP_L oder λP_R Expression verwendet werden, wenn es mit einem Expressionsplasmid kombiniert wird, das ein Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des λP_L oder λP_R-Promotors enthält.
Beispiel 2
Enge (tight) Regulation und Expression bei niedrigen Temperaturen mit dem P22 ant-basierten Expressionssystem
Um die Eigenschaften des neuen Expressionssystems zu quantifizieren, wurde ein Expressionsvektor verwendet, der als Modellgen ein λP_L-angetriebenes lacZ-Gen für die Proteinsysthese beinhaltet. Dieser Vektor ist in der Lage, mittels der Translations-gekoppelten Translationsinitiation hohe Mengen von funktionaler β-Galaktosidase zu induzieren (Mertens et al., 1995a; Mertens et al., 1997).
Die nicht-induzierte Menge von β-Galaktosidase, die durch eine mögliche kontinuierliche Anwesenheit von niedrigen Konzentrationen nicht-induziertem Anti-Repressorprotein beinflusst werden könnten, waren vergleichsweise gering, als die pICA2 oder pcI857-Plasmide (ohne Anti-Repressor) verwendet wurden. Dies bedeutet daher, dass geringe, nicht-induzierte Mengen von Anti-Repressorproteinen wahrscheinlich nicht anwesend sind, da, wenn dies in der Tat der Fall wäre, eine höhere Expression von lacZ zu erwarten gewesen wäre.
Untersuchungen über die Induktionskinetik des lacZ-Gens wurden in MC1061[pICA2] bei 18°C, 24°C, 28°C, 37°C oder 42°C nach Zugabe von 1 mM IPTG ausgeführt (4A). Temperaturen über 28°C denaturieren gleichfalls den temperatursensitiven cI857 λ-Repressor und geben einen Hinweis auf die Höhe der mit diesem Vektor durch Thermoinduktion erreichbaren Expression. Aus der 4A kann geschlossen werden, dass maximale β-Galaktosidasemengen durch die Zugabe von IPGT bei niedrigeren Temperaturen erreicht werden können. Wie erwartet, war die Induktionskinetik bei Temperaturen von unter 28°C langsamer, weil unter diesen sub-optimalen Wachstumsbedingungen eine geringere Wachstumsrate und ein geringerer Stoffwechsel erreicht werden.
4B vergleicht die Menge des induzierten Proteins in MC1061[pICA2][pLRI0βgal] und MC1061[pDMI,1][pDS12ant], und zeigt, dass die hohe Expressionsmenge von P22 ant, die mit der Verwendung des Expressionsvektors pDS12ant mit hoher Kopienzahl erreicht wurde, nach der Übertragung der P_N25/O2-ant Kombination auf ein Plasmid mit geringer Kopienzahl (6–10 Kopien/Zelle) verschwindet, während die Fähigkeit, den lambdoiden Promotor durch Induktion von ant zu induzieren, erhalten bleibt.
Die Verminderung der Synthese des Repressor-Antagonisten auf weniger als 1% der Gesamtproteinsynthese ist vorteilhaft, weil das Hauptanliegen darin liegt, eine große Menge eines bestimmten Proteins zu erhalten – von dem Gen, welches hinter den starken lambdoiden Promotor inseriert wurde – und die ultimative Ausbeute dieses Zielproteins kann nachteilig beeinflusst werden, wenn der Repressor-Antagonist in großen Mengen hergestellt werden muss.
Beispiel 3
Die Induktion bei niedriger Temperatur kann die Herstellung von löslichen, heterologen Proteinen verbessern
Die zu einer hohen Expressionsmenge führende Induktion, besonders bei erhöhten Temperaturen, bei denen der Stoffwechsel von E. coli hoch ist, resultiert häufig, wie oben bereits angedeutet, in der Herstellung von Einschlusskörpern, während zur selben Zeit das weitere Zellwachstum oft inhibiert ist. Aus Gründen, die bislang noch nicht vollständig geklärt sind, ist die Induktion bei niedrigen Temperaturen vorteilhafter, wenn die Herstellung von korrekt gefaltetem, löslichem Protein, erforderlich ist (Lin et al., 1990; Shirano & Shibata, 1990; Schein und Noteborn, 1988; Bishia et al., 1987; Mizukami et al., 1986).
Dieses Beispiel untersucht daher, ob verschiedene Verfahren der Induktion (Anhebung der Temperatur oder IPTG), in unterschiedlichen Mengen des löslichen Proteins, resultieren.
Zu diesem Zweck wurden Expressionsvektoren verwendet, die von pLT10T (Mertens et al., 1995) abstammen, und eines der folgenden Gene beinhalten: das prokaryotische T7g10 oder Thioredoxin, zwei Proteine, die leicht in E. coli exprimiert werden können; humanes Interferon-γ (hIFNγ) und murines Interleukin-2 (mIL2).
5 vergleicht die Herstellungsmengen, die entweder nach Thermoinduktion oder nach einer IPTG-Induktion bei niedriger Temperatur erreicht wurden. Von den prokaryotischen Beispielen, T7g10 und Thioredoxin, kann leicht abgeleitet werden, dass in der selben Zeitspanne die selbe Menge an heterologem Protein induziert werden kann. Die Stämme, die mittels IPTG induziert wurden, wuchsen weiter und synthetisierten schließlich eine größere Menge des Wirtsproteins (5B, Spur B). Dies resultierte in einer geringeren Ausbeute im Vergleich mit dem Gesamtproteingehalt (% des Gesamtproteins), ergab aber praktisch die selbe absolute Ausbeute (mg Protein pro Liter Kultur). In der Figur werden äquivalente Mengen von bakteriellen Kulturen miteinander verglichen.
6 zeigt die Aktivitäten von mIL2 und hIFNγ, die nach der Induktion durch Temperaturerhöhung oder mittels IPTG-Induktion erhalten wurden.
In diesen Experimenten mit den eukaryotischen Proteinen humanes Interferon-γ und murines Interleukin-2, zwei Proteine, die leicht in E. coli aggregieren, wird nach der IPTG-Induktion bei geringerer Temperatur weniger heterologes Protein gebildet (5A). Allerdings resultiert die hohe Expression bei 42°C ausschließlich in der Bildung von Einschlusskörpern, während nach der IPTG-Induktion bei 28°C eine beachtliche Menge an löslichem Protein hergestellt wird (6A und 6B). Die auf dem Gel sichtbare lösliche Proteinfraktion entspricht der erhaltenen Menge an Aktivität nach einer biologischen Titration.
Beispiel 4
Verwendung des ant-basierten Induktionssystems von unterschiedlichen Replikons
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, findet die Synthese des Repressors, des Anti-Repressors und des Repressors des Promotors, der das Gen des Anti-Repressors kontrolliert, von einem Plasmid mit geringer Kopienzahl aus, statt. Dieses Beispiel erläutert die Verwendung des ant-Systems von anderen Replikons.
Von Fall zu Fall wurden die regulatorischen Gene (der durch den auto-regulatorischen Promotor P_M kontrollierter Repressor cI857, der durch den P_N25/O2-kontrollierte Anti-Repressor ant und der durch den konstitutiven P_lacI ^q-Promotor kontrollierte Gen lacI) von einem Plasmid hoher Kopienzahl und einem ColE1/pMB1-Replikationsursprung aus induziert (7A). Das Gen für die Expression (humanes Interleukin 2, hIL2) wurde auf einem Plasmid mit hoher Kopienzahl und einem breiten Wirtsspektrum mit dem λP_L-Promotor und einer prokaryotischen Ribosomen-Bindestelle (die aus dem ner-Gen des Phagen Mu stammt) verbunden. Dieses Plasmid beinhaltet auch eine extra Kopie des λP_L Repressor-Gens cI857. Das pPLGNIhIL2-Plasmid beinhaltet ebenfalls die benötigten Funktionen, die für die Replikation in anderen Bakterien nötig sind (7B).
Die Induktion wurde nach der Zugabe von 0, 0,1 oder 1 mM des Induktors IPTG untersucht, der eine Induktion von ant vom P_N25/O2-Promotor aus ermöglicht, was wiederum zu einer Inhibierung des λP_L-Repressors cI857 führt und daher den λP_L aktiviert, was in einer Überexpression von, in diesem Fall, hIL2 resultiert (7C). Diese Induktionen wurden bei 28°C ausgeführt und mit der klassischen Temperaturdeaktivierung von cI857 verglichen, indem die Bakterien weiter bei 42°C kultiviert wurden.
In diesem Beispiel sind die relative Produktion von hIL2 bei der Verwendung des ant-Systems, und bei der Temperatur-Induktion, ungefähr gleich. Die Temperatur-Induktion bei 42°C wies allerdings einen größeren wachstumsinhibierenden Effekt auf (das Gel zeigt äquivalente Proben von Kulturmedium).
Beispiel 5
Ein ant-basiertes Expressionssystem für die lambdoiden Pomotoren P22P_L und P22P_R
Die Induktion eines Repressor-Antagonisten, um einen Promotor zu induzieren, kann prinzipiell auf andere Promotoren als den λP_L angewendet werden. In diesem Beispiel wird ein Vektorsystem beschrieben, das vom P22 ant-Gen Gebrauch macht, um den homologen P22c2-Repressor zu deaktivieren und daher zu einer Induktion von P22P_L oder P22P_R führt.
Zu diesem Zweck wurde zunächst das Plasmid pICA3 konstruiert, das von pICA2 abstammt, aber das statt des λcI857-Repressor-Gens das P22c2-Repressor-Gen beinhaltet. Der λP_L-Promotor in pLT1OT3 wurde ferner durch, sowohl den P22P_L (pLT22T3), als auch den P22P_R (pRT22T3), ersetzt. Sowohl pICA3, als auch pLT22T3 und pRT22T3, sind in 8 gezeigt.
Beispiel 6
Ein ant-basiertes regulatorisches System für λP_L und λP_R, das mit L-Arabinose induzierbar ist
Im regulatorischen Plasmid pICA2 wird die ant-Induktion durch den IPTG-induzierbaren P_T5N25/O2 kontrolliert. Die Kontrolle der ant-Genexpression kann prinzipiell von jedem beliebigen induzierbaren Promotor stammen. Vorzugsweise ist der Promotor der Wahl auch bei niedrigeren Temperaturen induzierbar (28°C oder niedriger). Vorzugsweise wird der Promotor der Wahl auch gut reguliert. Wenn dies nicht der Fall wäre, kann die Expressionsstärke der nicht-induzierten Kultur ausreichen, um eine kontinuierliche Expression zu initiieren. Eine unkontrollierte Expression resultiert wahrscheinlich in einem letztendlichen Verlust des funktionellen Expressionsstamms.
In diesem Beispiel wurde ein regulatorisches Plasmid konstruiert, das die Promotorregion des E. coli Arabinose Operons (P_araBAO) und das Gen, welches den araC-Repressor dieses Promotors kodiert, enthält. Das ant-Gen wird auf diese Weise durch einen Promotor kontrolliert, der durch die Zugabe von L-Arabinose induzierbar ist.
Der ParaBAD-Promotor und das araC-Repressor-Gen, das den Repressor für diesen Promotor kodiert, wurden aus einem Wildtyp E. coli-K12-Bakterienstamm amplifiziert, wobei die PCR-Primer NM73 (ATATATCCAAGGTTAT-GCAATCGCCATCGTTTCACTCC) und NM72 (ATATCGGCCGTTATGACAACTTGACGGCTACATC) verwendet wurden. Die PCR-Amplifikation wurde mit der Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) ausgeführt, und das resultierende Fragment wurde zwischen die XmaIII und StyI Restriktionsstellen kloniert, die in pICA2 vorhanden sind. Das resultierende Plasmid pICA5 wurde mit einer Restriktionskartierung und einer PCR-Analyse charakterisiert, und das PCR-amplifizierte Insert wurde sequenziert. 9 zeigt das Plasmid pICA5.
Beispiel 7
Vergleich des λP_L-ant Induktionssystems mit anderen IPTG-induzierbaren Expressionssystemen
Obwohl der λP_L-Promotor zu den stärksten Promotoren gehört, die von der E. coli-Transkriptionsmaschinerie erkannt werden, ermöglicht der T7-Promotor, der durch eine extrem aktive T7 RNA-Polymerase (T7RNAP) erkannt wird, die Bildung einer weitaus größeren Menge von mRNA (Studier und Moffatt, 1986). Ein gut kontrolliertes IPTG-basiertes Induktionssystem für die T7RNAP, das ebenfalls auf einem von pSC101 abgeleiteten Plasmidsystem niedriger Kopienzahl beruht, wurde bereits vorhergehend beschrieben (Mertens et al., 1995b). Die Expressionsplasmide pLT10mIL2T und pLT10hIFNγT, die beide die λP_L und P_T7-Promotoren beinhalten (Mertens et al., 1995a), wurden verwendet, um die Expression zu vergleichen, die entweder vom P_T7 oder dem λP_L-Induktionssystem nach Zugabe von IPTG erhalten wurden (10A).
Auffallender Weise hörten die Zellen, die das T7-basierte Induktionssystem beinhalteten, beinahe sofort nach der Induktion auf zu wachsen, während diese Zellen, die mit dem λP_L-ant-System induziert wurden, weiter proliferierten. Dies resultierte in einer beinahe 10-fachen höheren Biomasse nach 4 h der Induktion bei 28°C. Beachtenswerter Weise befanden sich nach der Induktion des P_T7T7RNAP-Systems das gesamte mIL2 und fast das gesamte hIFNγ in der unlöslichen Phase, während bei Verwendung des λP_L-ant-Systems ungefähr 50% des heterologen Proteins in der löslichen Phase gefunden werden konnte.
Die Kombination der kodierenden Sequenz von hIFNγ mit dem starken RBST7g10 führte zu einer vorteilhaften Translationsinitiationsregion (Mertens et al., 1995a). Bei Kombinationen mit einem starken Promotor auf einem Plasmid hoher Kopienzahl, wurde eine reichliche Expression nach der Induktion erreicht. Um den Unterschied der Promotorstärke zwischen verschiedenen IPTG-induzierbaren Promotoren wie P_trc (Amann et al., 1988), P_T5N25/O2 (Stueber et al., 1984) und P_T7 (Mertens et al., 1995b; Studier et al., 1990) und dem λP_L-ant-System zu betonen, wurde die RBS-Gen-Terminator-Kombination, die mit den vorhergehend genannten Promotoren kombiniert ist, auf ein RK2-Replikon transferiert (Blatny et al., 1997). Dies resultierte in Expressionsplasmiden mit einer viel geringeren Kopienzahl, als die der üblicherweise verwendeten ColE1-abgeleiteten Vektoren. Anschließend wurde dann die Induktion von hIFNγ bei der Verwendung dieser Vektoren verglichen. Die Verwendung des stärkeren P_T7 resultierte in einer höheren Herstellungsmenge, aber das gesamte hergestellte hIFNγ war unlöslich. Die Verwendung des P_trc- und P_T5N25/O2-Promotoren resultierte nicht in einer visuell nachweisbaren Menge von induziertem Protein ausgehend von diesem Vektor niedriger Kopienzahl nach der Färbung einer SDS-PAGE mit Coomassie Brilliant Blue. Wenn allerdings das λP_L-ant-System verwendet wurde, wurde eine deutlich nachweisbare Menge von hIFNγ synthetisiert, während das Protein vollständig löslich blieb (10B).
10 zeigt, dass bei der Verwendung des λP_L-ant-Systems die Induktion bei 28°C zu einer effizienteren Herstellung von funktionalem Protein führt als andere IPTG-induzierbare Expressionssysteme. 10A stellt die SDS-PAGE-Analyse von löslichen (S) und pelletierten (P) Proteinen nach Induktion von pLT10mIL2T oder pLT10hIFNγT in entweder MC1061[pT7POL26] (Induktion des T7 Promotors) oder in MC1061[pICA2] (Induktion des λP_L-Promotors) dar. Induktion wurde erreicht durch Kultivierung für 5 h bei 28°C in der Gegenwart von IPTG. Mit der Verwendung des λP_L-ant-Induktionssystems wurde deutlich mehr lösliches mIL2 erzielt. Im Gegensatz zum T7-System erlaubt es das letztere System den Kulturen auch, ihr Wachstum fortzusetzen, was daher in einer höheren Akkumulation von Biomasse resultierte.
10B stellt einen Vergleich der Expression des RBS_T7g10-hIFNγ-T7Tϕ-Moduls dar, das mit einigen verschiedenen IPTG-induzierbaren Promotoren auf einem RK2-abgeleiteten Plasmid geringer Kopienzahl kombiniert wurde, (S=lösliche, P=pelletierte Fraktion). Pfeilspitzen markieren die Position des induzierten Proteins. Die Proteinmarker (M) sind 94, 67, 43, 30, 21 und 14 kDa.
Literaturverzeichnis

Amann et al. (1988). Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in E. coli. Gene 69, 301–315.
Bishia, W. R., Rappuoli, R., and Murphy, J. R. (1987). High-level expression of a proteolytically sensitive diphtheria toxin fragment in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169, 5140–5151.
Blatny et al. (1997) Improved broad-host-range RK2 vectors useful for high and low regulated gene expression levels in gram-negative bacteria. Plasmid 38, 35–51. Casa
daban, M. J. and Cohen, S. N. (1980). Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 138, 179–207.
Devos, R., Cheroutre, H., Taya, Y., and Fiers, W. (1982). Isolation and characterisation of IFN-gamma MRNA derived from mitogen-induced human spienocytes. J. Interferon Res. 2, 409–420.
Guisez, Y., Demolder, J., Mertens, N., Raeymaekers, A., Plaetinck, G., Robbens, J., Vandekerckhove, J., Remaut, E., and Fiers, W. (1993). Highlevel expression, purification, and renaturation of recombinant murine interleukin-2 from Escherichia coli. Protein Expr. Purif 4, 240–246.
Knaus, R. and Bujard, H. (1988). PL of coliphage lambda: an alternative solution for an efficient promoter. EMBO J. 7, 2919–2923.
Lanzer, M. and Bujard, H. (1988). Promoters largely determine the efficiency of repressor action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 8973–8977.
Lin, K., Kurland, I., Xu, L. Z., Lange, A. J., Pilkis, J., eI Maghrabi, M. R., and Pilkis, S. J. (1990). Expression of mammalian liver glycolyticlgiuconeogenic enzymes in Escherichia coli: recovery of active enzyme is strain and temperature dependent. Protein Expr. Purif 1, 169–176.
Mertens, N., Remaut, E., and Fiers, W. (1995a). A tight transcriptional control ensures stable high-level expression from T7 promoter-based expression plasmids. Bio/Technology 13, 175–179.
Mertens, N., Remaut, E., and Fiers, W. (1995b). Versatile, multi-featured vectors for high-level expression of heterologous genes in E. coli: overproduction of human and murine cytokines. Gene 164, 9–15.
Miller, J. (1972). Experiments in Molecular Genetics (NY: Cold Spring Harbor Laboratory).
Mizukami, T., Komatsu, Y., Hosoi, N., Ito, S., and Oka, T. (1986). Production of active human interferon-☐ in E. coli, 1. Preferential production by lower culture temperature. Biotechnol. Letters 8, 605–610.
Remaut, E., Tsao, H., and Fiers, W. (1983b). Improved plasmid vectors with a thermoinducible expression and temperature-regulated runaway replication. Gene 22, 103–113.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, 7. (1989). Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.
Sauer, R. T., Krovatin, W., DeAnda, J., Youderian, P., and Susskind, M. M. (1983). Primary structure of the imml immunity region of bacteriophage P22.
Sauer, R. T., Krovatin, W., DeAnda, J., Youderian, P., and Susskind, M. M. (1983). Primary structure of the imml immunity region of bacteriophage P22. J. Mol. Biol. 168, 699–713.
Schein, C. H. and Noteborn, M. H. M. (1988). Formation of soluble recombinant proteins in E. coli is favored by lower growth temperature. Bio/Technology 6, 291–294.
Shirano, Y. and Shibata, D. (1990). Low temperature cultivation of Escherichia coli carrying a rice lipoxygenase L-2 CDNA produces a soluble and active enzyme at a high level. Febs. Lett. 271, 128–130.
Stoker, N. G., Fairweather, N. F., and Spratt, B. G. (1982). Versatile low copy-number vectors for cloning in E. coli. Gene 18, 335–341.
Stueber, D., lbrahimi, I., Cutler, D., Dobberstein, B., and Bujard, H. (1984). A novel in vitro transcription-translation system: accurate and efficient synthesis of single proteins from cloned DNA sequences. EMBO J. 3, 3143–3148.
Studier and Moffatt (1986) Use of bacteriophage T7RNA polymerase to direct selective high level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, 113–130.
Studier et al. (1990) Use of T7RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60–89.

Claims

Regulationssystem für eine induzierbare Expression von Genen, wobei das Regulationssystem einen lambdoiden Promotor, ein für einen Repressor für den lambdoiden Promotor kodierendes Gen und ein für einen Anti-Repressor des Repressors kodierendes Gen umfaßt, wobei der Anti-Repressor unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors ist.
Das Regulationssystem nach Anspruch 1, wobei das Anti-Repressor-Gen unter der Kontrolle eines Promotors ist, der von einem anderen Gen als dem Anti-Repressor-Gen stammt.
Das Regulationssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Anti-Repressor das ant-Protein des lambdoiden Phagen P22 von Salmonella typhimurium ist und von dessen immI-Region kodiert wird.
Das Regulationssystem nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Expression des Anti-Repressors unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors P_N25/O2 ist.
Das Regulationssystem nach Anspruch 4, wobei die Repression des Promotors des Anti-Repressor-Gens mittels des lacI-Repressors von E. coli erfolgt.
Das Regulationssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das System aus einer Vielzahl von Replikons besteht.
Regulatorisches Replikon, umfassend ein für einen Anti-Repressor kodierendes Gen, das unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors ist, wobei der Anti-Repressor das ant-Protein des lambdoiden Phagen P22 von Salmonella typhimurium ist.
Das Replikon nach Anspruch 7, wobei der induzierbare Promotor von einem anderen Gen als dem Anti-Repressor-Gen stammt.
Das Replikon nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Replikon außerdem ein für einen Repressor des induzierbaren Promotors des Anti-Repressor-Gens kodierendes Gen umfaßt.
Das Replikon nach den Ansprüchen 7 bis 9, wobei das Replikon außerdem ein für einen Repressor für einen lambdoiden Promotor kodierendes Gen umfaßt.
Das Replikon nach Anspruch 10, wobei das Replikon das für das P22 ant-Protein von S. typhimurium unter der Kontrolle des Promotors P_N25/O2, das lacI^q-Gen unter der Kontrolle des Promotors placI^q und das für den Repressor cI857 kodierende Gen umfaßt.
Das Replikon nach Anspruch 11, wobei das Replikon das in l dargestellte Plasmid pICA2 ist.
Das Replikon nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei das Replikon außerdem die für die Expression eines heterologen Gens erforderlichen regulatorischen Signale einschließlich des lambdoiden Promotors umfaßt.
Expressionssystem, umfassend ein regulatorisches Replikon nach einem der Ansprüche 7 bis 13 und einen Expressionsvektor auf Basis eines lambdoiden Promotors.
Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts in einem heterologen Wirt durch Bereitstellung einer Kultur eines Wirts, der eine heterologe Sequenz, die für das Genprodukt kodiert, umfaßt, wobei die Expression der heterologen Sequenz unter der Kontrolle eines Regulationssystems ist, und das System zumindest aus einem lambdoiden Promotor, funktionierend verbunden mit der heterologen Sequenz, aus einem Gen, das für einen Repressor für den lambdoiden Promotor kodiert, und aus einem Gen, das für einen Anti-Repressor kodiert, besteht, wobei das Anti-Repressor-Gen funktionierend verbunden ist mit einem induzierbaren Promotor, und wobei die Induktion der Expression dadurch erzielt werden kann, daß der Promotor des Anti-Repressor-Gens induziert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der induzierbare Promotor des Anti-Repressor-Gens der Promotor P_N25/O2 ist und durch die Zugabe von IPTG zur Kultur induziert wird.