DE69929638T2 - Plasmide, deren Konstruktion und Anwendung zur Herstellung von Interleukin-4 und dessen Muteine - Google Patents

Description

• Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion und Verwendung von Expressionsplasmiden zur Herstellung von rekombinantem Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-4-Muteinen.
• Hintergrund der Erfindung
• Reifes menschliches Interleukin-4 (IL-4) ist aus 129 Aminosäuren mit 50%iger Homologie zu Maus-IL-4 zusammengesetzt. IL-4 ist das einzige Zytokin, von dem bekannt ist, dass es die Differenzierung von T-Helferzellen auf einen T_H2-Phänotyp ausrichtet(Mosmann und Sad, Immunol. Today 17, 138–146, 1996). IL-4 signalisiert auf Lymphozyten und weiteren Zellen durch einen heterodimeren Komplex aus 2 Zytokin-Rezeptoren, dem IL-4Rα und der allgemeinen γ-Kette (γc). Antagonistische IL-4-Mutanten sind beschrieben worden (Kruse et al., EMBO J. 11, 3237–3244, 1992). 3 Aminosäuren nahe am C-Terminus (R121, Y124 und S125) sind zur Bindung an die γc-Kette wichtig. Die Einführung von Asp (D) in diese Positionen blockiert die Rezeptor-Dimerisierung und Transmembran-Signalisierung.
• Das Interleukin-4-Doppelmutein (IL-4-DM) ist eine IL-4-Variante mit 2 Aminosäureänderungen in Position 121 und 124, bezeichnet als IL-4 R121D Y124D. IL-4-DM vermag sowohl IL-4- als auch IL-13-Aktivitäten zu blockieren. Im Gegensatz zu allen Einzelstelle-Mutanten ist keine restliche agonistische Aktivität für dieses Mutein jemals herausgefunden und festgestellt worden. Es wird davon ausgegangen, dass sich diese agonistischen Eigenschaften von IL-4-DM zur Behandlung von Krankheiten eignen, bei denen eine T_H2-Entwicklung und/oder eine IgE-Produktion involviert sind (Ryan, J. Allergy Clin. Immunol. 99, 1–5, 1997).
• Wie in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben, können prokaryotische Organismen zur Erzeugung von rekombinantem IL-4 und von IL-4-Muteinen verwendet werden. Leider weisen die beschriebenen Systeme eine Anzahl von Nachteilen (niedriger Exprimierungsspiegel, niedrige Stabilität des Expressionsvektors) auf, welche eine Produktion von IL-4 und von IL-4-Muteinen in großem Maßstab unmöglich oder wirtschaftlich nicht durchführbar machen.
• L.R. PTITSYN und I.B. ALTMAN: BULLETIN OF EXPERIMENTAL BIOLOGY AND MEDICINE, Band 119, Nr. 1, Januar 1995, Seiten 77–79, ist betitelt mit "Recombinant Escherichia coli strains provide high-level expression of human Interleukin-3 und Interleukin-4". Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von dieser zitierten Literatur dadurch, dass ein E. coli-T5-Promotor im beanspruchten Operon betroffen ist. US 4,689,409 bezieht sich auf eine Steigerung der mikrobiellen Exprimierung von Polypeptiden, und S.C. MAKRIDES: MICROBIOLOGICAL REVIEWS, Band 60, Nr. 3, 1. September 1996, Seiten 512–538, betrifft "Strategies for achieving highlevel expression of genes in Escherichia coli".
• Die Hauptkriterien für ein wirksames und sicheres Exprimierungssystem sind:
• – hohe Produktausbeute
• – steuerbare stabile Exprimierung/Expression
• – Stabilität des Exprimierungs/Expressionsvektors
• Einige Merkmale eines Exprimierungs/Expressionsplasmids sind für die oben aufgelisteten Kriterien wichtig (Hannig et al., TIBTECH. 16, 54–60, 1998). Diese sind:
• – Promotor
• – ribosomale Bindungsstelle (rbs)
• – Codon-Einsatz des entsprechenden Gens
• – Transkriptionsterminator
• – Resistenzgen
• – Exprimierungs/Expressionsregulierung
• – Replikationsursprung (origin of replication = ori)
• Zusammenfassung der Erfindung
• Es wurden Expressionsplasmide für IL-4 und IL-5-Muteine mit Modifikationen in allen der relevanten Elemente für ein effizientes und sicheres Expressionssystem erzeugt. Die Qualität und Eignung des entsprechenden Expressionssystems wurden hauptsächlich gemäß den folgenden Kriterien eingestuft:
• – Ausbeute des IL-4 und der IL-Muteine
• – Plasmidstabilität
• – Aufrechterhaltung des Induktionsvermögens
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Konstruktion und Verwendung von Expressionsplasmiden zur in großem Maßstab durchführbaren Herstellung von rekombinantem Interleukin-4 (IL-4) und von Interleukin-4-Muteinen zur Verfügung zu stellen. Außerdem sollte das neu entwickelte Wirt/Vektorsystem zur Expression weiterer Proteine (von Zytokinen, Wachstumsfaktoren, löslichen Rezeptoren, Antikörpern usw.) geeignet sein.
• In überraschender Weise ist herausgefunden worden, dass Bakterien, die mit Plasmiden gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert sind, Exprimierungsumsätze, Plasmid- und Exprimierungsstabilitätswerte ergeben, die um ein Vielfaches höher als diejenigen sind, die nach Transformierung der identischen Wirte mit im Stand der Technik bekannten Plasmiden beobachtet wurden. Daher sind die Plasmide der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von rekombinantem Interleukin-4 und von Interleukin-4-Muteinen viel geeigneter als alle bisher bekannten Plasmide.
• Das neu entwickelte Vektorsystem enthält die folgenden Elemente:
• T5-Promotor
• Der E. coli-Phage-T5-Promotor zusammen mit 2 lac-Operator-Sequenzen stammt aus dem pQE30-Plasmid (Qiagen), das zur pDS-Familie von Plasmiden gehört (Bujard et al., Methods Enzymol. 155, 416–433, 1987, und Stüber et al., Immunological Methods, I. Lefkovits und B. Pernis, Herausgeber, Academic Press, Inc., Band IV, 121–152, 1990).
• T7 g10-Ribosom-Bindungsstelle
• Die ribosomale Bindungsstelle (rbs) stammt aus der Region stromaufwärts vom Gen 10 des Phagen T7 (T7 g 10-Führer). Gen 10 von Phage T7 codiert für das Überzugsprotein, welches das Hauptprotein ist, das nach T7-Infektion exprimiert wird. Die T7 g10-rbs wurde aus dem Vektor pET-9a erhalten (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60–89, 1990). Der T7 g10-Führer überspannt eine Region von ca. 100 bp (Olins et al., Gene 227–235, 1988). Im endgültigen Expressionskonstrukt ist die Region stromaufwärts der XbaI-Stelle gelöscht/zerstört. Die T7 g10-Führer-Sequenz überspannt nun 42 bp und beherbergt 1 Basenaustausch von G nach A in Position 3638 des bevorzugten Plasmids.
• Codon-Einsatz der natürlichen IL-4-Sequenz
• Als wirkungsvolle Maßnahme zur synonymen Codon-Einsatzvorgabe kann der Codon-Adaptionsindex (CAI) zur Voraussage des Expressionsspiegels eines gegebenen Gens von Nutzen sein (Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15, 1281–1295, 1987, und Apeler et al., Eur. J. Biochem. 247, 890–895, 1997). Der CAI wird als geometrischer Mittelwert relativer synonymer Codon-Einsatz- (relative synonymous codon usage = RSCU)-Werte, die jedem in einem Gen verwendeten Codon entsprechen, dividiert durch den maximal möglichen CAI für ein Gen derselben Aminosäure-Substanz, berechnet. RSCU-Werte für jedes Codon werden aus sehr hoch exprimierten Genen eines besonderen Organismus, z.B. von E. coli, berechnet und stellen die beobachtete Häufigkeit eines Codon dar, dividiert durch die Häufigkeit, die unter der Annahme eines gleichwertigen Einsatzes der synonymen Codone für eine Aminosäure erwartet wird. Hoch exprimierende Gene, z.B. Gene, die ribosomale Proteine eincodieren, weisen im Allgemeinen hohe CAI-Werte ≥ 0,46 auf. Gering exprimierte Gene wie lacI und trR in E. coli weisen niedrige CAI-Werte ≤ 0,3 auf.
• Der berechnete E. coli-CAI-Wert für die natürliche IL-4-Sequenz beträgt 0,733. Dies bedeutet, dass das natürliche Gen gut geeignet für eine Exprimierung in E. coli auf hohem Niveauspiegel sein sollte. Dennoch weist ein synthetisches Gen mit optimalem E. coli-Codon-Einsatz (CAI-Wert = 1) das Potenzial auf, den Exprimierungsspiegel noch weiter zu steigern. Deshalb wurden synthetische IL-4- und IL-4-Mutein-Gene entworfen und kloniert.
• Transkriptionsterminator
• Das T7-DNA-Fragment, enthaltend den Transkriptionsterminator Tϕ, stammt aus dem Vektor pET-9a (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60–89, 1990). Transkriptionsterminatoren bestimmen die Punkte, wo der mRNA-RNA-Polymerase-DNA-Komplex dissoziiert, um dadurch die Transkription zu beenden. Das Vorliegen eines Transkriptionsterminators am Ende eines hoch exprimierten Gens weist mehrere Vorteile auf: er minimiert die Aktivität der RNA-Polymerase, die ansonsten in unnötige Transkription verwickelt sein könnte, er beschränkt die mRNA-Länge auf ein Minimum, wodurch der Energieverbrauch in Grenzen gehalten wird, und, da eine starke Transkription den Replikationsursprung stören kann, steigert ein Transkriptionsterminator die Plasmidstabilität durch Beibehaltung der Anzahl der Kopien (Balbas und Bolivar, Methods Enzymol. 185, 14–37, 1990).
• Resistenzgen
• Das kan-Resistenzgen stammt aus dem Vektor pET-9a (Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60–89, 1990). Ursprünglich ist jenes das kan-Gen von Tn903 aus dem Vektor pUC4KISS (Barany, Gene 37, 111–123, 1985). Im bevorzugten Plasmid weisen das kan-Gen und das IL-4- und IL-4-Mutein-Gen umgekehrte Orientationen auf, so dass es keine Steigerung des kan-Genprodukts nach Induktion wegen Ablese-Durchtranskription aus dem T5-Promotor geben sollte. Kanamycin wurde als selektiver Marker gewählt, weil es das bevorzugte Antibiotikum für GMP-Zwecke ist. Außerdem sind kan-Gen-basierte Vektoren stabiler als Ampicillin-resistente (bla)-Plasmide. Ampicillin-Selektion neigt dazu, in Kulturen verloren zu gehen, da die Arznei durch das ausgeschiedene β-Lactamase-Enzym abgebaut wird. Die Art bakterieller Resistenz gegen Kanamycin beruht auf einer Aminoglycosid-Phosphotransferase, die das Antibiotikum inaktiviert.
• Exprimierungs/Expressionsregulierung
• Gesteuerte Gen-Expression ist absolut notwendig zum Erstellen eines stabilen Plasmid-Systems, besonders wenn das Protein von Interesse gegen die Wirtszelle zerstörerisch ist. Das bevorzugte Plasmid verwendet ein lacbasiertes induzierbares System aus einem lac-Repressorgen (lacI) und 2 synthetische lac-Operator-Sequenzen, die stromabwärts vom E. coli-Phage-T5-Promotor kondensiert sind. Der lacI^q-Promotor und das lacI-Strukturgen wurden aus dem Vektor pTrc99A isoliert (Amann et al., Gene 69, 301–315, 1988). I^q ist eine Promotormutation, die zu einer Überproduktion des lacI-Repressors führt. Der Wild-Typ-lac-Repressor ist ein tetrameres Molekül, das 4 identische Untereinheiten von jeweils 360 Aminosäuren umfasst. Das lac-Repressor-Tetramer ist ein Dimer aus 2 funktionellen Dimeren. Die 4 Untereinheiten werden durch ein 4-Helix-Bündel zusammengehalten, das aus den Resten 340 bis 360 gebildet ist. Wegen der Isolierung des lacI-Gens aus dem Vektor pTrc99A durch einen NarI-Schnitt werden die Reste jenseits der Aminosäure 331 zerstört bzw. gelöscht, und es werden 10 Aminosäuren, die im Normalfall im lacI-Gen nicht eincodiert sind, hinzugefügt. Es ist bekannt, dass Mutationen oder Löschungen/Zerstörungen, die im C-endständigen Teil von lacI, jenseits der Aminosäure 329, auftreten, funktionelle Dimere ergeben, die phänotypisch ähnlich dem Wild-Typ-Repressor erscheinen (Pace et al., TIBS 22, 334–339, 1997).
• Replikationsursprung (origin of replication = ori)
• Der Replikationsursprung (ori) des bevorzugten Plasmids stammt aus dem Vektor pET-9a, dessen ori ursprünglich wiederum aus pBR322 hervorgeht. Das bevorzugte Plasmid trägt daher das pMB1 (ColE1)-Replikon. Plasmide mit diesem Replikon sind Mehrfachkopie-Plasmide, die in einer "entspannten" Weise replizieren bzw. vervielfältigen. Ein Minimum von 15 bis 20 Plasmid-Kopien wird in jeder bakteriellen Zelle unter normalen Wachstumsbedingungen aufrecht erhalten. Die tatsächliche Anzahl für das bevorzugte Plasmid liegt innerhalb dieses Bereichs. Replikation des ColE1-Typ-ori wird durch ein 555-Nucleotid-RNA-Transkript, RNA II, ausgelöst, das ein beständiges Hybrid mit seiner Templat-DNA nahe dem ori bildet. Das RNA II-DNA-Hybrid wird dann durch RNase H am ori gespalten, um eine freie 3'-OH zu ergeben, die als Primer für DNA-Polymerase I dient. Dieses Primen der DNA-Synthese ist negativ reguliert durch RNA I, einem 108-Nucleotid-RNA-Molekül, das komplementär zum 5'-Ende der RNA II ist. Wechselwirkung der Antisense-RNA I mit RNA II verursacht eine Konformationsänderung in RNA II, wodurch die Bindung der RNA II an die Templat-DNA inhibiert und als Folge davon die Auslösung einer Plasmid-DNA-Synthese verhindert werden. Die Bindung zwischen den RNA I und II wird durch ein kleines Protein von 63 Aminosäuren (das Rop-Protein, Repressor of primer) gesteigert, welches durch ein Gen eincodiert wird, das 400 Nucleotide stromabwärts vom Replikationsursprung angeordnet ist und vorliegt (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Löschung des Rop-Gens führt zu einer Steigerung der Kopiezahl und aufgrund eines Gen-Dosierungseffekts zu erhöhten Expressionsspiegeln des Plasmid-eincodierten heterologen Gens. Diese Beobachtung wurde auch für die getesteten IL-4-Expressionsvektoren gemacht. Es stellte sich aber heraus, dass Rop-Plasmide instabil sind und sehr rasch während der Fermentation unter nicht-selektiven Bedingungen verloren gehen. Daher enthält das Replikon des bevorzugten Plasmids das Rop-Gen, um eine hohe Plasmidstabilität zu gewährleisten. Dem bevorzugten Plasmid fehlt das Mob-Gen, das zur Mobilisierung benötigt wird, und es ist daher nicht dazu befähigt, seinen eigenen Konjugaltransfer von einem Bakterium zum anderen zu lenken.
• Im bevorzugten Plasmid wurden alle Elemente, die zur Plasmidreplikation und -resistenz sowie zur regel- und steuerbaren Expression nicht notwendig sind, gelöscht bzw. zerstört.
• Beispielsweise kann ein natürliches Interleukin-4- oder Interleukin-4-Mutein-Gen anstatt eines synthetischen Gens mit optimalem E. coli-Codon-Einsatz verwendet werden. Der bevorzugte Transkriptionsterminator ist Tϕ, aber weitere Terminatoren wie rrnB T2 oder aspA können ebenfalls verwendet werden.
• Die im Laufe der Erstellung des Expressionssystems angewandten Verfahren werden nun angegeben.
• Materialien und Verfahren
• Enzyme
• Restriktionsendonucleasen, alkalische Kälberdarm-Phosphatase, T4-Polynucleotid-Kinase und T4-DNA-Ligase wurden von Boehringer Mannheim und GIBCO-BRL gekauft und gemäß den Empfehlungen des Lieferanten verwendet.
• Rekombinante DNA-Verfahren
• Standard-Klonierverfahren sind in Sambrook et al. beschrieben (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Transformationen wurden gemäß M. Scott durchgeführt (Seed und Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365–3369, 1987). Als Wirte für Transformationen wurden die E. coli-Stämme DH5α (GIBCO BRL) und W3110 (ATCC 27325) vorrangig verwendet. Der Genotyp von W3110 ist K12, F^–, [N(rmD – rrnE)]λ^–.
• Isolierung der Plasmid-DNA in großem Maßstab wurde mit Qiagen-Tips (Qiagen) durchgeführt. Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen erfolgte mit Jetsorb (Genomed) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten.
• Oligonucleotide zur Stelle-gelenkten Mutagenese, für PCR-Reaktionen und zur Sequenzierung wurden von MWG Biotech, Pharmacia Biotech oder von GIBCO BRL erhalten.
• Die Mutagenese-Versuche wurden mit dem Verfahren von Deng und Nickoloff (Deng und Nickoloff, Anal. Biochem. 200, 81–88, 1992) mit dem "Unique Site Elimination Mutagenesis"-System von Pharmacia Biotech durchgeführt. Der Primer zur Rekreation der T7 g10-rbs weist die folgende Sequenz auf:
  5'TCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACATCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAA3' (Seq. 1)
• Alle Konstrukte und DNA-Sequenzen wurden mit Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierung mit AmpliTaq-DNA-Polymerase, FS an einem ABI 373A-Sequenziergerät (Applied Biosystems) durchgeführt.
• Die Erfindung wird nun noch detaillierter durch die folgenden Beispiele, Figuren und Sequenz-Informationen erläutert:
• 1 bis 4: Konstruktion des bevorzugten Expressionsplasmids (Abkürzungen: IL-4-TM = IL-4-Triplemutein; IL-4-DM = IL-4-Doppel-Mutein)
• 5: Plasmidstabilität der IL-4-Mutein-Expressionsvektoren pRO21.1.0 und pRO2.1.O. Der Vektor pRO2.1.O bleibt vollkommen stabil über 78 Generatoren ohne antibiotische Selektion. Dagegen geht der Expressionsvektor pRO21.1.O, der auf dem im Handel verfügbaren Plasmid pET-30a (Novagen) basiert, sehr rasch verloren. Lediglich 16 % der Kolonien enthalten das Plasmid nach 78 Generatoren ohne Kanamycin-Selektion.
• 6: Aufrechterhaltung der Induktion und des Expressionsvermögens des bevorzugten IL-4- und IL-4-Mutein-Expressionsvektors.
• Beispiele
• Beispiel 1
• Plasmid-Stabilitätstest
• Die Plasmid-Stabilitätstests wurden immer mit einer in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Kultur begonnen. Der OD₆₀₀-Wert der aufgetauten Kultur wurde bestimmt, die Kultur wurde bis 10^–4 in PBS-Puffer verdünnt und auf LB-Agar-Platten ohne Antibiotikum plattiert.
• 1 mL der aufgetauten Kultur wurde in 100 mL Pepton-Medium (30 g Soja-Pepton, 20 g Hefeextrakt, 5 g KH₂PO₄, 20 g Glycerin, 1 g MgSO₄ × 7 H₂O/L, pH = 7,0) inokuliert und bei 37°C mit 280 U/min 24 h lang inkubiert.
• Der OD₆₀₀-Wert der gezüchteten Kultur wurde bestimmt, die Kultur wurde bis auf 10^–6 in PBS-Puffer verdünnt und auf LB-Agar-Platten ohne Antibiotikum plattiert, um gut abgetrennte Kolonien zu ergeben.
• 100 μL aus der gezüchteten Kultur wurden in 100 mL Pepton-Medium inokuliert und bei 37°C mit 280 U/min 24 h lang inkubiert. Diese Vorgehensweise wurde 8 Mal wiederholt.
• 100 gut abgetrennte Kolonien aus den LB-Platten wurden auf LB-Platten mit Kanamycin (25 μg/mL) und auf LB-Platten ohne Kanamycin netzartig ausgebreitet und bei 37°C über Nacht inkubiert. Der Prozentsatz resistenter Kolonien wurde jeden Tag bestimmt.
• Die Anzahl der Generatoren pro Tag wurde gemäß der folgenden Formel: log[OD_600END/OD_600BEG]log2 berechnet.
• Für die Expressionsstudien wurde 1 mL gezüchtete Kultur 100-fach in LB-Medium verdünnt und wie beschrieben (siehe Beispiel 2) gehandhabt.
• Beispiel 2
• Expression
• Zur Expression von Interleukin-4 und Interleukin-4-Muteinen in kleinem Maßstab wurden Zellen in LB-Medium (10 g Bacto-Tryton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl pro L, pH = 7,5) gezüchtet, bis der OD₆₀₀-Wert einen Wert von 0,8 bis 1,0 erreichte. Die Expression wurde durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 0,5 mM induziert, und die Inkubation wurde 5 h lang fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet.
• Zur SDS-PAGE-Analyse wurden Zell-Pellets in SDS-PAGE-Beladungspuffer auf eine Konzentration von 1 OD₆₀₀-Einheit/100 μL resuspendiert.
• SEQUENZLISTE

  
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Claims (4)

1. Vektor zur Herstellung von IL-4 und IL-4-Muteinen in einem Stamm von Escherichia coli, umfassend in 5'- bis 3'-Ordnung die folgenden operativ verbundenen Elemente: einen regelbaren Promotor, bestehend aus dem E. coli-Phage-T5-Promotor und 2 lac-Operator-Sequenzen, eine Ribosom-Bindungsstelle aus dem E. coli-Phage-T7 g10, ein Translationsstartcodon, ein Strukturgen für IL-4 oder ein IL-4-Mutein und stromabwärts dieses Strukturgens 1 Transkriptionsterminator.
2. DNA-Konstrukt, das die in SEQ ID NO: 2 dargestellte DNA-Sequenz umfasst.
3. Escherichia coli, transformiert mit dem Vektor gemäß Anspruch 1 oder mit dem DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 2.
4. Verwendung des Vektors gemäß Anspruch 1 oder des DNA-Konstrukts gemäß Anspruch 2 in einem Verfahren zur Herstellung von IL-4 und IL-4-Muteinen.