JPH0235091A - 哺乳動物細胞における発現の制御 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
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- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［発明の技術分野］
本発明は、哺乳動物細胞における遺伝子発現に関するも
のである。
のである。
［従来の技術］
細胞における染色体遺伝子の発現制御は、特定ＤＮＡ配
列に結合しかつ特定遺伝子の発現を賦活するか又は抑制
する成る種の蛋白の作用を介して行なうことができる。
列に結合しかつ特定遺伝子の発現を賦活するか又は抑制
する成る種の蛋白の作用を介して行なうことができる。
真核細胞は成る種のＤＮＡ結合性蛋白の作用により環境
刺戟に対し反応すると共に、小エフェクタ分子と相互作
用する。たとえば、グルココルチコイドリプレッサ蛋白
は、グルココルチコイド反応要素（ｒＧＲＥＪ ）と称
する特定の染色体エンハンサ配列と、たとえばデキサメ
タシンのようなグルココルチコイドホルモンとの両者に
結合することができる。適当な細胞外＆ｌＸのデキサメ
タシンの存在下に、ホルモン−グルココルチコイドリプ
レッサ複合体は、ＧＲＥに結合する遺伝子の転写を賦活
することができる。
刺戟に対し反応すると共に、小エフェクタ分子と相互作
用する。たとえば、グルココルチコイドリプレッサ蛋白
は、グルココルチコイド反応要素（ｒＧＲＥＪ ）と称
する特定の染色体エンハンサ配列と、たとえばデキサメ
タシンのようなグルココルチコイドホルモンとの両者に
結合することができる。適当な細胞外＆ｌＸのデキサメ
タシンの存在下に、ホルモン−グルココルチコイドリプ
レッサ複合体は、ＧＲＥに結合する遺伝子の転写を賦活
することができる。
さらに、特異的ＮＡ結合をもたらしつる蛋白の領域が転
写活性化に必須である［Ｊ、カールステツツーデューク
等（１９８７） 、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８４巻、第４４３７
〜４０頁：Ｖ、Ｌ、チャンドラ−等（１９８３） 、セ
ル、第３３巻、第４８９〜９９頁：Ｓ、Ｍ。
写活性化に必須である［Ｊ、カールステツツーデューク
等（１９８７） 、プロシーディング・ナショナル・ア
カデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８４巻、第４４３７
〜４０頁：Ｖ、Ｌ、チャンドラ−等（１９８３） 、セ
ル、第３３巻、第４８９〜９９頁：Ｓ、Ｍ。
ホレンベルク等（１９８５） 、ネイチャー、第３１８
巻、第６３５〜４１頁：Ｓ、Ｍ、ホレンベルク等（１９
８７）、セル、第４９巻、第３９〜４６頁：Ｎ、Ｅ、ハ
イネス等（１９８１）、プロシーディング・ナショナル
・アカデミ−・サイエンス・ｔＪｓＡ、第７８巻、第２
０３８〜４２頁；Ｆ、リー等（１９８１） 、ネイチャ
ー、第２９４巻、第２２８ル３２ サイエンス、第２３６巻、第４２３〜２７頁：Ｓ．ルス
コニ等（１９８７） 、ＥＭＢＯジャーナル、第６巻、
第３９〜４６頁］。
巻、第６３５〜４１頁：Ｓ、Ｍ、ホレンベルク等（１９
８７）、セル、第４９巻、第３９〜４６頁：Ｎ、Ｅ、ハ
イネス等（１９８１）、プロシーディング・ナショナル
・アカデミ−・サイエンス・ｔＪｓＡ、第７８巻、第２
０３８〜４２頁；Ｆ、リー等（１９８１） 、ネイチャ
ー、第２９４巻、第２２８ル３２ サイエンス、第２３６巻、第４２３〜２７頁：Ｓ．ルス
コニ等（１９８７） 、ＥＭＢＯジャーナル、第６巻、
第３９〜４６頁］。
遺伝子移動により真核細胞中に導入される遺伝子の発現
制御を達成すべく数種の誘発性プロモータ系が使用され
ており、たとえば加熱ショックにより誘発しうるプロモ
ータ［Ｃ．ウー（１９８４）、ネイチャー、第３０９巻
、第２２９〜３４頁］、金属イオン誘発性メタロチオネ
インプロモータ［Ｋ．Ｅ。
制御を達成すべく数種の誘発性プロモータ系が使用され
ており、たとえば加熱ショックにより誘発しうるプロモ
ータ［Ｃ．ウー（１９８４）、ネイチャー、第３０９巻
、第２２９〜３４頁］、金属イオン誘発性メタロチオネ
インプロモータ［Ｋ．Ｅ。
マヨ等（１９８２） 、セル、第２９巻、第５９〜２０
頁］、グルココルチコイド誘発性のマウス乳癌ウィルス
末端反復配列［Ｇ．Ｍ．リンゴールド（１９８３）カレ
ント・トピックス・マイクロバイオロジカル・イミュノ
ロジー、第１０６巻、第５９〜２０頁］及びポリ（ＩＣ
）誘発性インターフェロンプロモータ［８．グツドボー
ン等（１９８５） 、セル、第４１巻、第５０９〜２０
頁：Ｊ．ライアルス等（１９８５） 、セル、第４１巻
、第４４７〜４０頁］を包含する。
頁］、グルココルチコイド誘発性のマウス乳癌ウィルス
末端反復配列［Ｇ．Ｍ．リンゴールド（１９８３）カレ
ント・トピックス・マイクロバイオロジカル・イミュノ
ロジー、第１０６巻、第５９〜２０頁］及びポリ（ＩＣ
）誘発性インターフェロンプロモータ［８．グツドボー
ン等（１９８５） 、セル、第４１巻、第５０９〜２０
頁：Ｊ．ライアルス等（１９８５） 、セル、第４１巻
、第４４７〜４０頁］を包含する。
さらに原核細胞も、成る種の環境刺戟に応答するその染
色体遺伝子の発現を制御することができる。たとえば大
腸菌（イー・コリ）は、エネルギー源としての乳糖を利
用しつるような酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）
を合成することができる。この誘発反応は特異性ＤＮＡ
結合蛋白、すなわちｌａｃリプレッサにより媒介される
［Ｊ。
色体遺伝子の発現を制御することができる。たとえば大
腸菌（イー・コリ）は、エネルギー源としての乳糖を利
用しつるような酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）
を合成することができる。この誘発反応は特異性ＤＮＡ
結合蛋白、すなわちｌａｃリプレッサにより媒介される
［Ｊ。
Ｈ．ミラー等（１９８０） 、ザ・オペロン、コールド
・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク−］。この蛋白
は４個の同一３８．６ｋｄサブ単位で構成され［Ｋ、ペ
イロイター（１９８０） 、Ｊ、 Ｈ，ミラー等、上記
、第１２３〜５４頁］、アロラクトース（またはその同
族体）及び一般に細菌染色体中に組込まれる同系１ａｃ
オペレ一タ配列の両者に結合することかできる。オペレ
ータに結合すると、リプレッサはｌａｃオペロンの転写
を防止する。
・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク−］。この蛋白
は４個の同一３８．６ｋｄサブ単位で構成され［Ｋ、ペ
イロイター（１９８０） 、Ｊ、 Ｈ，ミラー等、上記
、第１２３〜５４頁］、アロラクトース（またはその同
族体）及び一般に細菌染色体中に組込まれる同系１ａｃ
オペレ一タ配列の両者に結合することかできる。オペレ
ータに結合すると、リプレッサはｌａｃオペロンの転写
を防止する。
しかしながら、たとえばイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシド（ｒＩＰＴＧＪ）のようなインジューサに結
合すると、リプレッサは３００倍低い親和性をもってオ
ペレータに結合し［Ｍ、Ｄ、バークレー等（１９８０）
、Ｊ、 Ｈ，ミラー等、上記、第１７７〜２２０頁］
、これによりオペロンの転写を賦活する。
ラクトシド（ｒＩＰＴＧＪ）のようなインジューサに結
合すると、リプレッサは３００倍低い親和性をもってオ
ペレータに結合し［Ｍ、Ｄ、バークレー等（１９８０）
、Ｊ、 Ｈ，ミラー等、上記、第１７７〜２２０頁］
、これによりオペロンの転写を賦活する。
Ｒ，ブレンド等（１９８４） 、ネイチャー、第３１２
巻、第６１２〜１５頁は、イー・コリＩｅＸＡリプレッ
サ蛋白を酵母におけるそのオペレータに結合させかつこ
れにより酵母の染色体における遺伝子の転写を阻止する
ことを記載している。
巻、第６１２〜１５頁は、イー・コリＩｅＸＡリプレッ
サ蛋白を酵母におけるそのオペレータに結合させかつこ
れにより酵母の染色体における遺伝子の転写を阻止する
ことを記載している。
Ｍ、Ｃ，Ｔ、ヒユー等（１９８７） 、セル、第４８巻
、第５５５〜５６頁は、宿主細胞染色体に組込まれてな
い遺伝子のマウス細胞における発現をイー・コリａＣリ
プレッサ蛋白により制御することを記載している。ヒユ
ー等は、ｌａｃ工遺伝子を有する真核発現ベクターとｔ
ｋＪ伝子を有するプラスミドとによりマウスＬＴＫ−細
胞を同時トランスフェクトし、ＨＡＴ培地中で成長させ
ることにより安定なトランスフェクト体を選択し、かつ
安定に発現されたｌａｃＩｍＲＮＡ及びリプレッサ蛋白
のためのクローナル分離物をスクリーニングして、官能
性１ａｃリプレツサが発現された細胞ラインを得た。次
いで、ヒユー等はＭＳＶ−ＣＡＴ融合遺伝子とＳＶ４０
初期プロモータ領域とを有するプラスミドによりリプレ
ッサー陽性細胞をトランスフェクトし、ここに１ａＣオ
ペレ一タ配列を挿入した。組込まれないＭＳＶ−ＣＡＴ
融合遺伝子を有するこれらのリプレッサー陽性細胞にお
いて、ＣＡＴ発現はＩＰＴＧの不存在下でｌａｃリプレ
ツザにより抑制されかつ培地中のＩＰＴＧでの誘発によ
り抑制解除された。
、第５５５〜５６頁は、宿主細胞染色体に組込まれてな
い遺伝子のマウス細胞における発現をイー・コリａＣリ
プレッサ蛋白により制御することを記載している。ヒユ
ー等は、ｌａｃ工遺伝子を有する真核発現ベクターとｔ
ｋＪ伝子を有するプラスミドとによりマウスＬＴＫ−細
胞を同時トランスフェクトし、ＨＡＴ培地中で成長させ
ることにより安定なトランスフェクト体を選択し、かつ
安定に発現されたｌａｃＩｍＲＮＡ及びリプレッサ蛋白
のためのクローナル分離物をスクリーニングして、官能
性１ａｃリプレツサが発現された細胞ラインを得た。次
いで、ヒユー等はＭＳＶ−ＣＡＴ融合遺伝子とＳＶ４０
初期プロモータ領域とを有するプラスミドによりリプレ
ッサー陽性細胞をトランスフェクトし、ここに１ａＣオ
ペレ一タ配列を挿入した。組込まれないＭＳＶ−ＣＡＴ
融合遺伝子を有するこれらのリプレッサー陽性細胞にお
いて、ＣＡＴ発現はＩＰＴＧの不存在下でｌａｃリプレ
ツザにより抑制されかつ培地中のＩＰＴＧでの誘発によ
り抑制解除された。
［発明の要点コ
一般に本発明は一面において、官能性原核リプレッサを
］−ドするＤＮＡ配列を有しかつ細胞の染色体に組込ま
れた官能性同系オペレータを有する哺乳動物細胞を特徴
とする。
］−ドするＤＮＡ配列を有しかつ細胞の染色体に組込ま
れた官能性同系オペレータを有する哺乳動物細胞を特徴
とする。
オペレータ及びリプレッサは「同系（ｃｏｇｎａｔｅ）
］であり、この用語は本明細書中においてリプレッサが
オペレータに特異的に結合することによりこのオペレー
タに結合した遺伝子の転写を阻止する場合に使用される
。
］であり、この用語は本明細書中においてリプレッサが
オペレータに特異的に結合することによりこのオペレー
タに結合した遺伝子の転写を阻止する場合に使用される
。
リプレッサ及びその同系オペレータは宿主細胞において
「官能性」であり、この用語は本明細書中においてリプ
レッサがオペレータに結合したＤＮＡ配列の転写の開始
を宿主細胞中で防止しうる場合に使用する。
「官能性」であり、この用語は本明細書中においてリプ
レッサがオペレータに結合したＤＮＡ配列の転写の開始
を宿主細胞中で防止しうる場合に使用する。
好適具体例において、細胞はさらに、所望蛋白をコード
するＤＮＡ配列をその転写を促進するプロモータと一緒
にオペレータに結合しかつ染色体中に組込んで有する。
するＤＮＡ配列をその転写を促進するプロモータと一緒
にオペレータに結合しかつ染色体中に組込んで有する。
リプレッサはｌａｃリプレッサからなり、かつオペレー
タは１ａＣオペレータからなっている。ＩａＣオペレー
タはプロモータ内部又は下流かつ所望蛋白をコードする
ＤＮＡ配列の上流に位置する。ｌａｃリプレッサをコー
ドする配列は細胞の染色体に組込まれる。ｌａｃオペレ
ータとｌａｃリプレッサをコードするＤＮＡ配列とはイ
ー・コリから誘導される。プロモータはＳＶ４０から誘
導される。ｌａｃリプレッサ遺伝子は、ｌａｃ■遺伝子
の開始コドンをＧＴＧからＡＴＧまで改変することによ
りイー・コリ１ａｃＩ遺伝子から誘導されたＤＮＡ配列
を含む。ｌａｃオペレータは突然変異イー・コリｌａｃ
オペレータＤＮＡ配列を有する。さらに、ｌａｃオペレ
ータはヌクレオチド配列 ５ −ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＭＴ−３からな
る合成りＮＡ配列を含む。
タは１ａＣオペレータからなっている。ＩａＣオペレー
タはプロモータ内部又は下流かつ所望蛋白をコードする
ＤＮＡ配列の上流に位置する。ｌａｃリプレッサをコー
ドする配列は細胞の染色体に組込まれる。ｌａｃオペレ
ータとｌａｃリプレッサをコードするＤＮＡ配列とはイ
ー・コリから誘導される。プロモータはＳＶ４０から誘
導される。ｌａｃリプレッサ遺伝子は、ｌａｃ■遺伝子
の開始コドンをＧＴＧからＡＴＧまで改変することによ
りイー・コリ１ａｃＩ遺伝子から誘導されたＤＮＡ配列
を含む。ｌａｃオペレータは突然変異イー・コリｌａｃ
オペレータＤＮＡ配列を有する。さらに、ｌａｃオペレ
ータはヌクレオチド配列 ５ −ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＭＴ−３からな
る合成りＮＡ配列を含む。
多面において本発明は哺乳動物細胞における所望蛋白の
合成を制御する方法に関し、この方法は真核プロモータ
に結合した原核リプレッサをコードするＤＮＡ配列と所
望蛋白をコードするＤＮＡ配列にその転写を促進するプ
ロモータと一緒に結合された原核オペレータとにより細
胞をトランスフェクトし、オペレータと結合ＤＮＡ配列
とを細胞の染色体に組込み、オペレータとりプレクサを
コードするＤＮＡ配列とは細胞内にて官能的であるリプ
レッサをコードし、さらにリプレッサを結合して所望蛋
白の合成を与える物質の存在下に細胞を培養し、或いは
りプレクサを結合して所望蛋白の合成を阻止する物質の
不存在下に細胞を培養することを特徴とする。
合成を制御する方法に関し、この方法は真核プロモータ
に結合した原核リプレッサをコードするＤＮＡ配列と所
望蛋白をコードするＤＮＡ配列にその転写を促進するプ
ロモータと一緒に結合された原核オペレータとにより細
胞をトランスフェクトし、オペレータと結合ＤＮＡ配列
とを細胞の染色体に組込み、オペレータとりプレクサを
コードするＤＮＡ配列とは細胞内にて官能的であるリプ
レッサをコードし、さらにリプレッサを結合して所望蛋
白の合成を与える物質の存在下に細胞を培養し、或いは
りプレクサを結合して所望蛋白の合成を阻止する物質の
不存在下に細胞を培養することを特徴とする。
所望蛋白をコードするＤＮＡ配列はオペレータに結合さ
れ、この表現は本明細書中において所望蛋白をコードす
るＤＮＡ配列の転写を促進するプロモータの内部にオペ
レータが位置し、その位置はオペレータがリプレッサに
結合することができかつこのように結合した際に結合Ｄ
ＮＡ配列の転写を阻止するような位置であり、かつオペ
レータがリプレッサにより結合されてない際にプロモー
タ機能を阻害しないような位置である場合使用され、或
いはＤＮＡ配列の転写を促進するプロモータとＤＮＡ配
列自身との間にオペレータが位置する場合に使用される
。
れ、この表現は本明細書中において所望蛋白をコードす
るＤＮＡ配列の転写を促進するプロモータの内部にオペ
レータが位置し、その位置はオペレータがリプレッサに
結合することができかつこのように結合した際に結合Ｄ
ＮＡ配列の転写を阻止するような位置であり、かつオペ
レータがリプレッサにより結合されてない際にプロモー
タ機能を阻害しないような位置である場合使用され、或
いはＤＮＡ配列の転写を促進するプロモータとＤＮＡ配
列自身との間にオペレータが位置する場合に使用される
。
今回、原核リプレッサはその同系オペレータ配列をこれ
が哺乳動物染色体に組込まれた際に識別しかつ結合する
ことを突き止めた。この種の同系オペレータ配列が染色
体中に安定に組込まれた遺伝子に結合する場合、オペレ
ータに対するリプレッサの結合は遺伝子の発現を実質的
に阻止することができる。さらに、リプレッサを結合す
る分子の存在はオペレータ結合した遺伝子の再活性化を
もたらしうる。ｌａｃオペレータに対するｌａｃリプレ
ッサの結合は所望蛋白をコードする結合ＤＮＡ配列の転
写を促進するプロモータからの転写を阻止すると共に、
ｌａｃリプレッサを用いて安定に組込まれた遺伝子の発
現を健全哺乳動物細胞にて厳密に制御することができる
。遺伝子の安定な抑制は、７０ラクトース又はアロラク
トースの同族体（たとえばＩ ＰＴＧ）を細胞の細胞外
環境に存在させて逆転させることができる。
が哺乳動物染色体に組込まれた際に識別しかつ結合する
ことを突き止めた。この種の同系オペレータ配列が染色
体中に安定に組込まれた遺伝子に結合する場合、オペレ
ータに対するリプレッサの結合は遺伝子の発現を実質的
に阻止することができる。さらに、リプレッサを結合す
る分子の存在はオペレータ結合した遺伝子の再活性化を
もたらしうる。ｌａｃオペレータに対するｌａｃリプレ
ッサの結合は所望蛋白をコードする結合ＤＮＡ配列の転
写を促進するプロモータからの転写を阻止すると共に、
ｌａｃリプレッサを用いて安定に組込まれた遺伝子の発
現を健全哺乳動物細胞にて厳密に制御することができる
。遺伝子の安定な抑制は、７０ラクトース又はアロラク
トースの同族体（たとえばＩ ＰＴＧ）を細胞の細胞外
環境に存在させて逆転させることができる。
プロモータからのこれにより促進されるＤＮＡ配列の転
写は、ｌａｃオペレータに対するｌａｃリプレッサの結
合により阻止され、かつ所望蛋白をコードするＤＮＡ配
列は細胞環境における特異性１ａｃリプレツサ結合性物
質（すなわちアロラクトース若しくはその同族体）の存
在により抑制解除することができ、前記アロラクトース
若しくはその同族体は１ａｃ−オペレータに対するリプ
レッサの親和性を低下させる。
写は、ｌａｃオペレータに対するｌａｃリプレッサの結
合により阻止され、かつ所望蛋白をコードするＤＮＡ配
列は細胞環境における特異性１ａｃリプレツサ結合性物
質（すなわちアロラクトース若しくはその同族体）の存
在により抑制解除することができ、前記アロラクトース
若しくはその同族体は１ａｃ−オペレータに対するリプ
レッサの親和性を低下させる。
他面において本発明は、染色体中に組込まれた官能性１
ａｃオペ°レータを含有すると共に官能性ｌａｃリプレ
ッサをコードするＤＮＡ配列を含有する哺乳動物細胞を
持った哺乳動物を特徴とする。
ａｃオペ°レータを含有すると共に官能性ｌａｃリプレ
ッサをコードするＤＮＡ配列を含有する哺乳動物細胞を
持った哺乳動物を特徴とする。
他面において本発明は、官能性１ａｃリプレツサをコー
ドするＤＮＡ配列を有する哺乳動物細胞を持った哺乳動
物を特徴とする。
ドするＤＮＡ配列を有する哺乳動物細胞を持った哺乳動
物を特徴とする。
Ｍ、ブラウン等（１９８７） 、セル、第４９巻、第６
０３〜１２頁は、宿主細胞染色体中に組込まれてない遺
伝子のサル細胞及びマウス細胞における発現をイー・コ
リｌａｃリプレッサ蛋白により制御することを記載して
いる。ブラウン等は、ＣＭＶプロモータにより促進され
る１ａｃＩコ一ド配列を有するプラスミドとｌａｃオペ
レータ含有ＳＶ４０初期プロモーターエンハンサに結合
されたＣＡＴ遺伝子を有するプラスミドとによりサル細
胞を同時トランスフェクトして、ｌａｃオペレータ結合
したＣＡＴ遺伝子からの未組込み雛型における発現がｌ
ａｃリプレッサ蛋白により抑制されると共にこの抑制が
Ｉ ＰＴＧの存在下に克服されることを示した。さらに
ブラウン等は、マウスのメタロチオネインーエプロモー
タにより促進されるｌａＣエコード配列を有するプラス
ミドとネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドとに
よりＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞を同時トランスフェクト
して、ｌａｃリプレッサと同一であると思われる蛋白を
安定に産生ずる安定細胞ラインを０４１８補充培地で選
択した。次いで、これらの＋ａｃ４＋細胞を、ｌａｃオ
ペレータ含有ＳＶ４０初期プロモータ／エンハンサ−要
素に結合されたＣＡＴｍ伝子を有するプラスミドにより
トランスフェクトすると共に、これらトランスフエクト
体をＩＰＴＧと共に又はそれなしに培養した。ｌａｃオ
ペレータ結合した雛型からのＣＡＴ発現はＩ ＰＴＧの
不存在下でこれら細胞にて抑制されたのに対し、ＩＰＴ
Ｇの存在下で抑制解除された。
０３〜１２頁は、宿主細胞染色体中に組込まれてない遺
伝子のサル細胞及びマウス細胞における発現をイー・コ
リｌａｃリプレッサ蛋白により制御することを記載して
いる。ブラウン等は、ＣＭＶプロモータにより促進され
る１ａｃＩコ一ド配列を有するプラスミドとｌａｃオペ
レータ含有ＳＶ４０初期プロモーターエンハンサに結合
されたＣＡＴ遺伝子を有するプラスミドとによりサル細
胞を同時トランスフェクトして、ｌａｃオペレータ結合
したＣＡＴ遺伝子からの未組込み雛型における発現がｌ
ａｃリプレッサ蛋白により抑制されると共にこの抑制が
Ｉ ＰＴＧの存在下に克服されることを示した。さらに
ブラウン等は、マウスのメタロチオネインーエプロモー
タにより促進されるｌａＣエコード配列を有するプラス
ミドとネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドとに
よりＮＩＨ−３Ｔ３マウス細胞を同時トランスフェクト
して、ｌａｃリプレッサと同一であると思われる蛋白を
安定に産生ずる安定細胞ラインを０４１８補充培地で選
択した。次いで、これらの＋ａｃ４＋細胞を、ｌａｃオ
ペレータ含有ＳＶ４０初期プロモータ／エンハンサ−要
素に結合されたＣＡＴｍ伝子を有するプラスミドにより
トランスフェクトすると共に、これらトランスフエクト
体をＩＰＴＧと共に又はそれなしに培養した。ｌａｃオ
ペレータ結合した雛型からのＣＡＴ発現はＩ ＰＴＧの
不存在下でこれら細胞にて抑制されたのに対し、ＩＰＴ
Ｇの存在下で抑制解除された。
血道
核酸処理の標準的技術を用いて、本発明によるトランス
フェクトされた哺乳動物細胞を作成することができ、か
つ本発明による方法を実施することができる。例として
示す後記の実施例においては、ｌａｃリプレッサーオペ
レータ制御装置を使用しかつクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（ｒＣＡＴＪ ）の発現を制御
するデリプレッサとしてＩＰＴＧを使用して哺乳動物細
胞ラインを作成した。
フェクトされた哺乳動物細胞を作成することができ、か
つ本発明による方法を実施することができる。例として
示す後記の実施例においては、ｌａｃリプレッサーオペ
レータ制御装置を使用しかつクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（ｒＣＡＴＪ ）の発現を制御
するデリプレッサとしてＩＰＴＧを使用して哺乳動物細
胞ラインを作成した。
ｌａｃリプレッサ（Ｅｌ ａｃＩ＋細胞」）を発現する
ことができかつプロモータが１ａＣオペレータに結合さ
れている所望蛋白をコードする組込みＤＮＡ配列（「所
望ＤＮＡＪ ＞を有する安定な哺乳動物細胞ラインは、
一般に次のように作成することができる。ｌａｃリプレ
ッサを有するプラスミドと結合１ａｃオペレータを有す
る所望ＤＮＡと選択自在なマーカーとにより細胞を同時
トランスフェクトする。トランスフェクト体を前記選択
自在なマーカーによって選択し、かつトランスフェクト
体をｌａｃリプレッサを結合するアロラクトース同族体
の存在下及び不存在下にて所望蛋白の発現につきスクリ
ーニングする。所望蛋白を制御下（すなわち７０ラクト
一ス同族体の存在下であって不存在下でない）で発現す
る細胞ラインを次いで活発成長する培養状態に長時間維
持し、次いでアロラクトース同族体誘発しつる所望蛋白
の発現を行ない続ける細胞ラインは、ｌａｃオペレータ
含有の標的遺伝子を組込んでいるがこの配列の自由コピ
ーを持たないことを分子ハイブリッド化法によって示す
ことができ、自由１ａｃオペレーター標的遺伝子含有プ
ラスミドの不存在と宿主細胞染色体中へのこのＤＮＡ配
列の組込みとの両者を示す。
ことができかつプロモータが１ａＣオペレータに結合さ
れている所望蛋白をコードする組込みＤＮＡ配列（「所
望ＤＮＡＪ ＞を有する安定な哺乳動物細胞ラインは、
一般に次のように作成することができる。ｌａｃリプレ
ッサを有するプラスミドと結合１ａｃオペレータを有す
る所望ＤＮＡと選択自在なマーカーとにより細胞を同時
トランスフェクトする。トランスフェクト体を前記選択
自在なマーカーによって選択し、かつトランスフェクト
体をｌａｃリプレッサを結合するアロラクトース同族体
の存在下及び不存在下にて所望蛋白の発現につきスクリ
ーニングする。所望蛋白を制御下（すなわち７０ラクト
一ス同族体の存在下であって不存在下でない）で発現す
る細胞ラインを次いで活発成長する培養状態に長時間維
持し、次いでアロラクトース同族体誘発しつる所望蛋白
の発現を行ない続ける細胞ラインは、ｌａｃオペレータ
含有の標的遺伝子を組込んでいるがこの配列の自由コピ
ーを持たないことを分子ハイブリッド化法によって示す
ことができ、自由１ａｃオペレーター標的遺伝子含有プ
ラスミドの不存在と宿主細胞染色体中へのこのＤＮＡ配
列の組込みとの両者を示す。
灰里
原核リプレッサと哺乳動物細胞にて官能性であるプロモ
ータ中に挿入されたその同系オペレータとを任意の哺乳
動物細胞ラインに導入し、これを使用することにより転
写がオペレータ結合プロモータにより促進される任意所
望のＤＮＡ配列の発現を厳密に制御することができる。
ータ中に挿入されたその同系オペレータとを任意の哺乳
動物細胞ラインに導入し、これを使用することにより転
写がオペレータ結合プロモータにより促進される任意所
望のＤＮＡ配列の発現を厳密に制御することができる。
本発明によりトランスフェクトされた哺乳動物細胞の培
養物における所望遺伝子の発現は、特異性インデューサ
又は細胞に対し低毒性しか持たないデリプレッサの培地
中の濃度を変化させて厳密に制御することができる。
養物における所望遺伝子の発現は、特異性インデューサ
又は細胞に対し低毒性しか持たないデリプレッサの培地
中の濃度を変化させて厳密に制御することができる。
さらに、生存する哺乳動物における所望遺伝子の発現は
、たとえば哺乳動物の全細胞又は哺乳動物の組織若しく
は器官の細胞の１部に適当なウィルスベクター（たとえ
ば１ａｃリプレツサをコードしかつ所望遺伝子の発現を
促進するプロモータに挿入されたｌａｃオペレータを有
するレトロウィルス）を公知技術によりインフェク１〜
させて制御することができる。官能性１ａｃリプレツサ
とａＣオペレータ結合の所望遺伝子とを含有するプラス
ミドも、胚芽細胞又は胚芽内の接合子又は組織原基中に
たとえば微量注入によって同時に導入することができ、
さらに得られた生物を所望遺伝子のＩ ＰＴＧｉ発性発
現につきスクリーニングすることができる。
、たとえば哺乳動物の全細胞又は哺乳動物の組織若しく
は器官の細胞の１部に適当なウィルスベクター（たとえ
ば１ａｃリプレツサをコードしかつ所望遺伝子の発現を
促進するプロモータに挿入されたｌａｃオペレータを有
するレトロウィルス）を公知技術によりインフェク１〜
させて制御することができる。官能性１ａｃリプレツサ
とａＣオペレータ結合の所望遺伝子とを含有するプラス
ミドも、胚芽細胞又は胚芽内の接合子又は組織原基中に
たとえば微量注入によって同時に導入することができ、
さらに得られた生物を所望遺伝子のＩ ＰＴＧｉ発性発
現につきスクリーニングすることができる。
或いは、これら遺伝子のそれぞれを有する所定の哺乳動
物における別のトランスジェニック種類を接合させ、か
つ１ａｃＩと所望のｌａｃオペレータ結合遺伝子との両
者を有する子孫を同定すると共にこれを同系交配して、
表現型がｌａｃ工”かつｌａｃオペレータ結合遺伝子十
であるような安定な種類を形成することができる。
物における別のトランスジェニック種類を接合させ、か
つ１ａｃＩと所望のｌａｃオペレータ結合遺伝子との両
者を有する子孫を同定すると共にこれを同系交配して、
表現型がｌａｃ工”かつｌａｃオペレータ結合遺伝子十
であるような安定な種類を形成することができる。
たとえば、豚における豚成長ホルモン又は牛における中
成長ホルモンはトランスジェニック動物に選択量のＩＰ
ＴＧを動物成長の際の選択時点で給飼し或いは注入する
ことにより調整されて、骨つぼい構造の不健全な成長を
活性化することなく肉の生産を増大させることができる
。同様に、たとえばｌａｃ工及びｌａｃオペレータ含有
ヒトインシュリン遺伝子をそれぞれ適当なブロモ〜りに
より促進して同居細胞中に導入、これを患者に組込むこ
とにより、タイプ■型のヒト糖尿病におけるインシュリ
ン分泌を制御するこができる。次いで、Ｉ ＰＴＧ又は
適する同族体を投与しないか或いは投与することにより
、インシュリン発現を賦活させ或いは抑制することがで
きる。
成長ホルモンはトランスジェニック動物に選択量のＩＰ
ＴＧを動物成長の際の選択時点で給飼し或いは注入する
ことにより調整されて、骨つぼい構造の不健全な成長を
活性化することなく肉の生産を増大させることができる
。同様に、たとえばｌａｃ工及びｌａｃオペレータ含有
ヒトインシュリン遺伝子をそれぞれ適当なブロモ〜りに
より促進して同居細胞中に導入、これを患者に組込むこ
とにより、タイプ■型のヒト糖尿病におけるインシュリ
ン分泌を制御するこができる。次いで、Ｉ ＰＴＧ又は
適する同族体を投与しないか或いは投与することにより
、インシュリン発現を賦活させ或いは抑制することがで
きる。
［実施例］
以下、例示の目的で実施例に劣り、ＩＰＴＧ誘発性ＣＡ
Ｔ十表現型を有する安定な０４１８耐性サル細胞ライン
の作成につき説明する。
Ｔ十表現型を有する安定な０４１８耐性サル細胞ライン
の作成につき説明する。
プラスミド及びその作成
第１図を参照して、制限切断の標準法により作成された
プラスミドｐＣＭＶｌａｃＩの制限マツプが示され、こ
のプラスミドは細胞がｌａｃＩ十表現型を示すよう哺乳
動物細胞をトランスフェクトすべく使用することができ
る。プラスミドｐＣＭＶ Ｉ ａｃ １［ブラウン等（
１９８７） 、ｔ／Ｌ、、第４９巻、第８０３〜６１２
真に記載］は、サルのサイトメガロウィルス（コルバー
ン）ＩＥ９４プロモータ要素の制御下に改変開始コドン
（ＡＴＧ）を有するクローン化１ａｃ４コード配列を含
む。実験的に証明された制限エンドヌクレアーゼ部位が
示されている。ｓｓｐ工、Ｓａｌ工、Ｍｌｕ工、Ａｐａ
Ｉ及びＥＣ０ＲＶのための部位は独特である。ｌａｃＩ
ｍ伝子の中央部分におけるＭａｅＩ１１部位は、独特の
ＢＳｔＥｎ部位の内部に含まれる。
プラスミドｐＣＭＶｌａｃＩの制限マツプが示され、こ
のプラスミドは細胞がｌａｃＩ十表現型を示すよう哺乳
動物細胞をトランスフェクトすべく使用することができ
る。プラスミドｐＣＭＶ Ｉ ａｃ １［ブラウン等（
１９８７） 、ｔ／Ｌ、、第４９巻、第８０３〜６１２
真に記載］は、サルのサイトメガロウィルス（コルバー
ン）ＩＥ９４プロモータ要素の制御下に改変開始コドン
（ＡＴＧ）を有するクローン化１ａｃ４コード配列を含
む。実験的に証明された制限エンドヌクレアーゼ部位が
示されている。ｓｓｐ工、Ｓａｌ工、Ｍｌｕ工、Ａｐａ
Ｉ及びＥＣ０ＲＶのための部位は独特である。ｌａｃＩ
ｍ伝子の中央部分におけるＭａｅＩ１１部位は、独特の
ＢＳｔＥｎ部位の内部に含まれる。
１ａｃｅ：コード単位内に示された部位は、ファラボ−
（１９７８） 、ネイチャー、第２７４巻、第７６５〜
７６９頁に記載された公知のｌａｃ工配列配列全に一致
する。完全ｌａｃエコード単位は、２個のＥＣｏＲＩ部
位と整列する。ＸｂａＩの部位は存在しない。
（１９７８） 、ネイチャー、第２７４巻、第７６５〜
７６９頁に記載された公知のｌａｃ工配列配列全に一致
する。完全ｌａｃエコード単位は、２個のＥＣｏＲＩ部
位と整列する。ＸｂａＩの部位は存在しない。
次に第２図を参照して、プラスミド
ｐｓｖ ｌ ａｃＯｃＡＨの制限マツプが示され、この
プラスミドは細胞がＣＡＴ十表現系を示すよう哺乳動物
細胞を１〜ランスフエクトすべく使用することができる
。プラスミドρＳＶ ｌ ａｃＯｃＡＴ［ブラウン等（
１９８７） 、セル、第４９巻、第６０３〜６１２頁に
記載］はＳＶ４０プロモータ／エンハンサ−配列（ｒＰ
Ｊ）と突然変異体である対称ａＣオペレータ配列とクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｒＣＡ
ＴＪ ）コード配列とを有する。
プラスミドは細胞がＣＡＴ十表現系を示すよう哺乳動物
細胞を１〜ランスフエクトすべく使用することができる
。プラスミドρＳＶ ｌ ａｃＯｃＡＴ［ブラウン等（
１９８７） 、セル、第４９巻、第６０３〜６１２頁に
記載］はＳＶ４０プロモータ／エンハンサ−配列（ｒＰ
Ｊ）と突然変異体である対称ａＣオペレータ配列とクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｒＣＡ
ＴＪ ）コード配列とを有する。
切断及び結合は全て、たとえばマニアチス等（１９８２
） 、モレキュラ・クローニング・ラボラトリ−・マニ
ュアル、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨー
クに記載された標準法にしたがって行なった。制限エン
ドヌクレアーゼはベーリンガー・マンハイム社及びニュ
ー・イングランド・ビオラブ社から購入した。プラスミ
ドｐＣＭＶｌａｃＩは、ブラウン等（１９８７） 、セ
ル、第４９巻、第６０３〜６１２頁に概説されているよ
うに作成した。サルＣＭＶ （コルバーン）ＩＥ９４プ
ロモータ及びエンハンサ−領域のヌクレオチド配列は、
ジーング等（１９８７） 、ジャーナル・パイロロジー
、第６１巻、第１５５９〜１５７０頁に記載されている
。
） 、モレキュラ・クローニング・ラボラトリ−・マニ
ュアル、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨー
クに記載された標準法にしたがって行なった。制限エン
ドヌクレアーゼはベーリンガー・マンハイム社及びニュ
ー・イングランド・ビオラブ社から購入した。プラスミ
ドｐＣＭＶｌａｃＩは、ブラウン等（１９８７） 、セ
ル、第４９巻、第６０３〜６１２頁に概説されているよ
うに作成した。サルＣＭＶ （コルバーン）ＩＥ９４プ
ロモータ及びエンハンサ−領域のヌクレオチド配列は、
ジーング等（１９８７） 、ジャーナル・パイロロジー
、第６１巻、第１５５９〜１５７０頁に記載されている
。
プラスミドｐｓｖ ｌ ａｃＯｃＡＴは、一般に次のよ
うに作成した。２２個の塩基を含有しかつ構すＥ − 旧 ！ を有するオリゴヌクレオチドを合成した。この−本積Ｄ
ＮＡは天然ｌａｃオペレータ配列の１８ヌクレオチド同
族体（下線部分）［シモンス等（１９−８４＞、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ｔ
ＪｓＡ、第８１巻、第１６２４〜１６２８頁及びサドラ
ー等（１９８３） 、プロシーディング・ナショナル・
アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８０巻、第６７８
５〜６７８９頁に記載］を含有し、かつ自家融合して次
の二本鎖構造を形成した：５’−ＴＣＧＭＴＴＧＴＧＡ
ＧＣＧＣＴＣＡＣＭＴ −３３’−ＴＭＣＡＣＴ
ＣＧＣＧＡＧＴＧＴＴＭＧＣＴ−５この工程で、完全２
２ｂＤパリンドロ一ムオベロレータ配列（＊印によって
上記に下線をして示した） ［シモン等、上記に記載コ
が形成された。
うに作成した。２２個の塩基を含有しかつ構すＥ − 旧 ！ を有するオリゴヌクレオチドを合成した。この−本積Ｄ
ＮＡは天然ｌａｃオペレータ配列の１８ヌクレオチド同
族体（下線部分）［シモンス等（１９−８４＞、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ｔ
ＪｓＡ、第８１巻、第１６２４〜１６２８頁及びサドラ
ー等（１９８３） 、プロシーディング・ナショナル・
アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第８０巻、第６７８
５〜６７８９頁に記載］を含有し、かつ自家融合して次
の二本鎖構造を形成した：５’−ＴＣＧＭＴＴＧＴＧＡ
ＧＣＧＣＴＣＡＣＭＴ −３３’−ＴＭＣＡＣＴ
ＣＧＣＧＡＧＴＧＴＴＭＧＣＴ−５この工程で、完全２
２ｂＤパリンドロ一ムオベロレータ配列（＊印によって
上記に下線をして示した） ［シモン等、上記に記載コ
が形成された。
このＤＮＡはＸｈｏＩ適合性付着末端を有しかつこれを
フロム等（１９ｇ２） 、ジャーナル・モレキュラ・ア
プライド・ジエネティック、第１巻、第４５７〜４８１
頁に記載したようにｐｘ−ａの独特なＸｈＯ工部位にク
ローン化した。得られたプラスミド（ｐＳＶｌ ａｃｏ
）をＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し、かつ１，１ｋｂのプロモ
ータ／オペレータ含有断片をゴーマン等（１９８２）
、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第２巻、第１
０４４〜１０５１頁に記載されたように１）ＳＶＯＣＡ
Ｔの独特なＨｉ ｎｄ１１１部位に結合させて、ブラウ
ン等（１９８７） 、セル、第４９巻、第６０３〜６１
２真に記載されたようにｐｓｖ Ｉ ａｃＯｃＡＴを発
生させた。
フロム等（１９ｇ２） 、ジャーナル・モレキュラ・ア
プライド・ジエネティック、第１巻、第４５７〜４８１
頁に記載したようにｐｘ−ａの独特なＸｈＯ工部位にク
ローン化した。得られたプラスミド（ｐＳＶｌ ａｃｏ
）をＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し、かつ１，１ｋｂのプロモ
ータ／オペレータ含有断片をゴーマン等（１９８２）
、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第２巻、第１
０４４〜１０５１頁に記載されたように１）ＳＶＯＣＡ
Ｔの独特なＨｉ ｎｄ１１１部位に結合させて、ブラウ
ン等（１９８７） 、セル、第４９巻、第６０３〜６１
２真に記載されたようにｐｓｖ Ｉ ａｃＯｃＡＴを発
生させた。
単純庖疹ウィルス（ｒ）−１ｓＶＪ）から誘導されたチ
ミジンキナーゼプロモータＮｔｋＪ）をネオマイシン耐
性遺伝子（ＩＮＥＯｊ ）に結合させ、次いでこのキメ
ラ配列をｐＢＲ３２２でクローン化することにより、容
易に入手しうる材料を用いてプラスミドｐＨ３ＶＮＥｏ
を作成することができる。
ミジンキナーゼプロモータＮｔｋＪ）をネオマイシン耐
性遺伝子（ＩＮＥＯｊ ）に結合させ、次いでこのキメ
ラ配列をｐＢＲ３２２でクローン化することにより、容
易に入手しうる材料を用いてプラスミドｐＨ３ＶＮＥｏ
を作成することができる。
安定なトランスフェクトされた哺乳動物細胞ライＣＶ−
１Ｐ及びそのＧ４１８耐性誘導型細胞ライン（ｒｃｉＯ
ｃＡＴＪ ）を、１０％新生牛血清（ｒＮｃｓＪ 、フ
ロー・ラボラドリース社、ミズーリ州、ロックビル在）
が補充されたイーグル最小必須培地（ｒＤＭＥＪ 、ギ
ブコ社）のデュルベッコ改変培地にてプラスチック表面
（ベクトンージキンワン社）上で成長させた。この培地
に抗生物質Ｇ４１８（ギブコ社）を指示されたように添
加した。細胞を１０％ＣＯ２を含有する湿潤雰囲気にて
３７℃で培養した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド（ｒＩＰＴＧＪ、ベセスダ・リサーチ・ラボラド
リース社）を、１ｘＰＢｓ（０，０１Ｍ燐酸ナトリウム
［ＤＨ７，’ｌｌ］、０．１４Ｍ Ｎａ（１）におけ
る１Ｍ保存溶液として作成し、その１部を上記培養物に
必要に応じて添加した。
１Ｐ及びそのＧ４１８耐性誘導型細胞ライン（ｒｃｉＯ
ｃＡＴＪ ）を、１０％新生牛血清（ｒＮｃｓＪ 、フ
ロー・ラボラドリース社、ミズーリ州、ロックビル在）
が補充されたイーグル最小必須培地（ｒＤＭＥＪ 、ギ
ブコ社）のデュルベッコ改変培地にてプラスチック表面
（ベクトンージキンワン社）上で成長させた。この培地
に抗生物質Ｇ４１８（ギブコ社）を指示されたように添
加した。細胞を１０％ＣＯ２を含有する湿潤雰囲気にて
３７℃で培養した。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド（ｒＩＰＴＧＪ、ベセスダ・リサーチ・ラボラド
リース社）を、１ｘＰＢｓ（０，０１Ｍ燐酸ナトリウム
［ＤＨ７，’ｌｌ］、０．１４Ｍ Ｎａ（１）におけ
る１Ｍ保存溶液として作成し、その１部を上記培養物に
必要に応じて添加した。
スーパーコイルされたプロモータＤＮＡを、−般にグラ
ハム等（１９７３） 、パイロロジー、第５２巻、第４
５６〜４６７頁に記載されたような燐酸カルシウム共沈
技術によりＣＶ−ＩＰ細胞中に導入し、次いで４時間後
に一般にパーカー等（１９７９） 、ジャーナル・パイ
ロロジー、第３１巻、第３６０〜３６９頁及びウィグラ
ー等（１９７９） 、プロシーディング・ナショナル・
アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７６巻、第１３７
３〜１３７６真に記載されたようにグリセリンショック
を与えた。詳細には、４２縄の１）ＣＭＶ Ｉ ａｃ
Ｉと３μ９のｐｓｖ ｌ ａｃＯｃＡＴと３μ９のｐＨ
３ＶＮＥｏとを含有する１、５ｄのＤＮＡ／ＣａＣ１２
２溶液を１．５ｍｌの２回濃縮されたｌ−Ｉ Ｅ Ｐ
Ｅ Ｓ緩衝塩水（ｒ２ｘＨＢＳＪ 、ｐＩ−１７，０５
）に滴加した。この溶液を空気でのバブリングによって
混合し、かつ１５〜２０分間にわたり沈澱させた。次い
で、１ｍｌの沈澱物をＧＶ−１Ｐ細胞の３個の８０％融
合６０ｍｍプレートのそれぞれに添加した。４時間後、
細胞から培地を排液し、次いで１ＸＨＢＳ （１）Ｈ７
，０５）における１５％グリセリンに３７℃で３分間露
出した。トランスフェクトしてから３日後に、細胞をト
リプシン処理しかつ１０％ＮＣ３及びＧ４１８ （４０
０Ｉ１９／ｄ）が補充されたＤＭＥを含有するｔｏｏｍ
ｍプレートに移し［サウザン等（１９８２） 、上記に
記載］、個々のＧ４１８耐性コロニーをクローン化用シ
リンダ内でトリプシン処理しかつこれをプラスチックマ
イクロタイター穴部に移した。クローンラインを成長さ
せかつ１０％ＮＣ８とＧ４１８ （１００／ｉ／ｍｉ＞
とを含有するＤＭＥに維持した。
ハム等（１９７３） 、パイロロジー、第５２巻、第４
５６〜４６７頁に記載されたような燐酸カルシウム共沈
技術によりＣＶ−ＩＰ細胞中に導入し、次いで４時間後
に一般にパーカー等（１９７９） 、ジャーナル・パイ
ロロジー、第３１巻、第３６０〜３６９頁及びウィグラ
ー等（１９７９） 、プロシーディング・ナショナル・
アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７６巻、第１３７
３〜１３７６真に記載されたようにグリセリンショック
を与えた。詳細には、４２縄の１）ＣＭＶ Ｉ ａｃ
Ｉと３μ９のｐｓｖ ｌ ａｃＯｃＡＴと３μ９のｐＨ
３ＶＮＥｏとを含有する１、５ｄのＤＮＡ／ＣａＣ１２
２溶液を１．５ｍｌの２回濃縮されたｌ−Ｉ Ｅ Ｐ
Ｅ Ｓ緩衝塩水（ｒ２ｘＨＢＳＪ 、ｐＩ−１７，０５
）に滴加した。この溶液を空気でのバブリングによって
混合し、かつ１５〜２０分間にわたり沈澱させた。次い
で、１ｍｌの沈澱物をＧＶ−１Ｐ細胞の３個の８０％融
合６０ｍｍプレートのそれぞれに添加した。４時間後、
細胞から培地を排液し、次いで１ＸＨＢＳ （１）Ｈ７
，０５）における１５％グリセリンに３７℃で３分間露
出した。トランスフェクトしてから３日後に、細胞をト
リプシン処理しかつ１０％ＮＣ３及びＧ４１８ （４０
０Ｉ１９／ｄ）が補充されたＤＭＥを含有するｔｏｏｍ
ｍプレートに移し［サウザン等（１９８２） 、上記に
記載］、個々のＧ４１８耐性コロニーをクローン化用シ
リンダ内でトリプシン処理しかつこれをプラスチックマ
イクロタイター穴部に移した。クローンラインを成長さ
せかつ１０％ＮＣ８とＧ４１８ （１００／ｉ／ｍｉ＞
とを含有するＤＭＥに維持した。
ａＣオペレータを有するハイブリッド
ＳＶ４０プロモータの制御下に、組込まれたクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｒｃＡＴＪ）
遺伝子を含有する安定な＋ａｃ工＋細胞ラインを次のよ
うに作成した。サル腎臓細胞（ＣＶ−ＩＰ＞を、ｌａｃ
リプレッサを有するプラスミド（ｐｃＭＶｌａｃＩ、第
１図）とオペレータ含有ＳＶ４０プロモータ要素に結合
したＣＡＴコード配列を有するプラスミド（ＤＳＶ Ｉ
ａｃＯｃＡＴ、第２図）とネオマイシン（ＮＥＯ＞耐
性遺伝子を有するプラスミド（ＤＨ３ＶＮＥＯ） とで
１６： １．０：１．２−Ｅ／Ｌ、比ＬＴ同時トラン
スフェクトした。０４１８が補充された培地中でクロー
ンを選択し、かつ安定な０４１８耐性細胞ラインまで成
長した全部で４３種のクローンを分析した。各ラインか
らの活発成長する細胞の同一反復培養物を、１５ｍＭの
Ｉ ＰＴＧを含有（＋）又は欠如（−）コする培地と平
行して３〜４日間培養した。培養期間の終了後、細胞は
融合に達し、次いでこれらを抽出物の作成のため集めた
。各細胞ラインからの抽出物対（＋、−）を蛋白含有量
及びＣＡＴ活性につき平行して分析した。３種のＩ Ｐ
ＴＧ処理されたライン（Ｃ上ΩＣＡＴライン、Ａ４、Ａ
８及びＡ１１）から得られた抽出物はそれぞれＣＡＴ活
性を示した。Ｉ ＰＴＧの不存在下で、未処理の培養物
対におけるＣＡＴ活性のレベルは初期ＣＶ−１ＰＭ胞の
活性と同レベルであった（下記参照）。第４のライン（
ＣＩＯＣＡＴラインＡ２２）は、Ｉ ＰＴＧの不存在下
又は存在下にＣＡＴ活性の実質的発現を示した。残余の
３９ラインは、ＩＰＴＧの存在下若しくは不存在下にＣ
ＡＴ活性のバックグランドをボした。
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｒｃＡＴＪ）
遺伝子を含有する安定な＋ａｃ工＋細胞ラインを次のよ
うに作成した。サル腎臓細胞（ＣＶ−ＩＰ＞を、ｌａｃ
リプレッサを有するプラスミド（ｐｃＭＶｌａｃＩ、第
１図）とオペレータ含有ＳＶ４０プロモータ要素に結合
したＣＡＴコード配列を有するプラスミド（ＤＳＶ Ｉ
ａｃＯｃＡＴ、第２図）とネオマイシン（ＮＥＯ＞耐
性遺伝子を有するプラスミド（ＤＨ３ＶＮＥＯ） とで
１６： １．０：１．２−Ｅ／Ｌ、比ＬＴ同時トラン
スフェクトした。０４１８が補充された培地中でクロー
ンを選択し、かつ安定な０４１８耐性細胞ラインまで成
長した全部で４３種のクローンを分析した。各ラインか
らの活発成長する細胞の同一反復培養物を、１５ｍＭの
Ｉ ＰＴＧを含有（＋）又は欠如（−）コする培地と平
行して３〜４日間培養した。培養期間の終了後、細胞は
融合に達し、次いでこれらを抽出物の作成のため集めた
。各細胞ラインからの抽出物対（＋、−）を蛋白含有量
及びＣＡＴ活性につき平行して分析した。３種のＩ Ｐ
ＴＧ処理されたライン（Ｃ上ΩＣＡＴライン、Ａ４、Ａ
８及びＡ１１）から得られた抽出物はそれぞれＣＡＴ活
性を示した。Ｉ ＰＴＧの不存在下で、未処理の培養物
対におけるＣＡＴ活性のレベルは初期ＣＶ−１ＰＭ胞の
活性と同レベルであった（下記参照）。第４のライン（
ＣＩＯＣＡＴラインＡ２２）は、Ｉ ＰＴＧの不存在下
又は存在下にＣＡＴ活性の実質的発現を示した。残余の
３９ラインは、ＩＰＴＧの存在下若しくは不存在下にＣ
ＡＴ活性のバックグランドをボした。
誘発性ＣＡＴ十表現系を示す３種のクローン０４１８−
耐性ライン及び初期ＣＶ−ＩＰ細胞から得られた各抽出
物につき行なった定量ウェスタン・プロット分析は、こ
れらの形質転換細胞ラインが完全なｌａｃリプレッサを
合成することを示し１こ。
耐性ライン及び初期ＣＶ−ＩＰ細胞から得られた各抽出
物につき行なった定量ウェスタン・プロット分析は、こ
れらの形質転換細胞ラインが完全なｌａｃリプレッサを
合成することを示し１こ。
これらの結果は、ＩＦ’ＴＧがこれら哺乳動物細胞のＣ
ＡＴ表瑛表金系御しうろことを示し、ＣＡＴコード単位
が細胞内に安定に存在することを強力に示唆する。ＣＡ
Ｔコード単位が高分子量ＤＮＡ中に組込まれたことを確
認するため、Ｉ ＰＴＧ誘発性ラインの１種を６月間に
わたる培養にかけた後に試験した。特に、Ｃｌ０ＣＡＴ
ＡＢからの細胞ＤＮＡの制限切断生成物をアガロースゲ
ル電気泳動により分析した。ゲルのプロットを、ＣＡＴ
コード配列ＳＶ４０初期スプライス及びポリアデニル化
信号とを有する１、６ｋｂプローブと共に培養した。ｌ
−１ｉｎｄｌＩはＤＳＶ ｌ ａｃＯｃＡＴプラスミド
ＤＮＡ （５，６ｋｂ）を２つの部位で切断して、４．
５ｋｂのＣＡＴ含有断片を生成した。Ａ８ ＤＮＡの
１−１ｉｎｄＩＩＩ切断に際し、７，５ｋｂにおける主
たる単一バンドが数個のずっと強度の低い急速移動する
バンドと共に検出された。ＸｂａＩ及びＸｈｏＩを包含
するｐｓｖ Ｉ ａｃＯｃＡＴを切断しないことが知ら
れた酵素によるＡ８ ＤＮＡの切断のみが、高分子量
のハイブリッド化断片（≧９．４ｋｂ）の出現をもたら
した。Ｈｉｎｄｌ［及びＸｂａによる二重切断は７．５
〜６．Ｏｋｂの主たるｌ−１ｉｎｄ［Ｉバンドの寸法を
減小させて７．５ｋｂバンドのみを残し、これは残った
７、５ｋｂ ｌ−１ｉｎｄＩＩＩバンドであると思わ
れる。
ＡＴ表瑛表金系御しうろことを示し、ＣＡＴコード単位
が細胞内に安定に存在することを強力に示唆する。ＣＡ
Ｔコード単位が高分子量ＤＮＡ中に組込まれたことを確
認するため、Ｉ ＰＴＧ誘発性ラインの１種を６月間に
わたる培養にかけた後に試験した。特に、Ｃｌ０ＣＡＴ
ＡＢからの細胞ＤＮＡの制限切断生成物をアガロースゲ
ル電気泳動により分析した。ゲルのプロットを、ＣＡＴ
コード配列ＳＶ４０初期スプライス及びポリアデニル化
信号とを有する１、６ｋｂプローブと共に培養した。ｌ
−１ｉｎｄｌＩはＤＳＶ ｌ ａｃＯｃＡＴプラスミド
ＤＮＡ （５，６ｋｂ）を２つの部位で切断して、４．
５ｋｂのＣＡＴ含有断片を生成した。Ａ８ ＤＮＡの
１−１ｉｎｄＩＩＩ切断に際し、７，５ｋｂにおける主
たる単一バンドが数個のずっと強度の低い急速移動する
バンドと共に検出された。ＸｂａＩ及びＸｈｏＩを包含
するｐｓｖ Ｉ ａｃＯｃＡＴを切断しないことが知ら
れた酵素によるＡ８ ＤＮＡの切断のみが、高分子量
のハイブリッド化断片（≧９．４ｋｂ）の出現をもたら
した。Ｈｉｎｄｌ［及びＸｂａによる二重切断は７．５
〜６．Ｏｋｂの主たるｌ−１ｉｎｄ［Ｉバンドの寸法を
減小させて７．５ｋｂバンドのみを残し、これは残った
７、５ｋｂ ｌ−１ｉｎｄＩＩＩバンドであると思わ
れる。
Ｈｉ ｎｄＩｎとＥＣ０ＲＩとＸｂａＩとＸｈｏＩとに
よるＣＶ−１Ｐ ＤＮＡの制限切断は、ハイブリッド
化バンドを与えなかった。これらの結果は、第４図に示
した配置における高分子ｍＤＮＡ中へのｐＳＶ ｌ ａ
ｃＯｃＡＴの１単位の組込みと良く一致する。これらの
細胞はこの分析前の６月間にわたり培養物中にて活発に
成長したので、これらの結果はＣＡＴコード単位が宿主
細胞の染色体に組込まれることを示す。未切断Ａ８
ＤＮＡに２３ｋｂ未渦のバンドが存在し、ないことは、
この細胞ラインに測定しうる量の遊離プラスミドＤＮＡ
が存在しないことを反映する。
よるＣＶ−１Ｐ ＤＮＡの制限切断は、ハイブリッド
化バンドを与えなかった。これらの結果は、第４図に示
した配置における高分子ｍＤＮＡ中へのｐＳＶ ｌ ａ
ｃＯｃＡＴの１単位の組込みと良く一致する。これらの
細胞はこの分析前の６月間にわたり培養物中にて活発に
成長したので、これらの結果はＣＡＴコード単位が宿主
細胞の染色体に組込まれることを示す。未切断Ａ８
ＤＮＡに２３ｋｂ未渦のバンドが存在し、ないことは、
この細胞ラインに測定しうる量の遊離プラスミドＤＮＡ
が存在しないことを反映する。
Ｉ ＰＴＧによるＣＡＴ発現の誘発
誘発性Ｃｌ０ＣＡＴラインの培養物に対するＩ ＰＴＧ
の添加及び除去の後のＣＡＴ活性の出現及び消失の速度
を測定して哺乳動物細胞における誘発の速度を評価すべ
く、２つの試験を行なった。
の添加及び除去の後のＣＡＴ活性の出現及び消失の速度
を測定して哺乳動物細胞における誘発の速度を評価すべ
く、２つの試験を行なった。
第１に、プレートにＣＶ−１Ｐ及びＣ上ΩＣＡＴＡ４、
八８及びＡ１１の保存培養物からの細胞を適切なプレー
トにて融合に達する前に４８．７２若しくは９６時間に
わたり成長させる濃度にて平行的に接種した。Ｉ ＰＴ
Ｇ （１５ｍ）ｌ）を、所定の時間間隔にわたり、これ
らの活発に成長する細胞を浸漬した培地に存在させた。
八８及びＡ１１の保存培養物からの細胞を適切なプレー
トにて融合に達する前に４８．７２若しくは９６時間に
わたり成長させる濃度にて平行的に接種した。Ｉ ＰＴ
Ｇ （１５ｍ）ｌ）を、所定の時間間隔にわたり、これ
らの活発に成長する細胞を浸漬した培地に存在させた。
各ラインからの成長細胞を含有する比較プレートを、Ｉ
ＰＴＧを含まない培地で培養した。それぞれ所定時間
の後、抽出物を全ての細胞ラインから作成しかつ一般に
Ｍ、Ｍ。
ＰＴＧを含まない培地で培養した。それぞれ所定時間
の後、抽出物を全ての細胞ラインから作成しかつ一般に
Ｍ、Ｍ。
ブラッドフォード（１９７６） 、アナリチカル、バイ
オケミストリー、第７２巻、第２４８〜５４頁に記載さ
れたように蛋白含有量につき平行分析した。次いで、そ
れぞれ４４５μ９の蛋白を含有する細胞抽出物の１部を
等しい最終容積（１５０μに）に調節しかつＣＡＴ活性
につき平行分析した。誘発性Ｃｌ０ＣＡＴラインにおい
て、ＣＡＴ活性は１５ｍＭＩ ＰＴＧの存在下に３〜４
日間にわたり直線的に増大したのに対し、ＣＶ−１Ｐ細
胞及び比較Ｃ土０ＣＡＴ細胞からのＩ ＰＴＧに露出し
てない抽出物におけるＣＡＴ活性はバックグランドレベ
ルのままで必った。最大ＣＡＴ活性は成る場合には４日
間で達し、又特に伯の場合には培養を開始してから１５
ｍＭのＩ ＰＴＧの存在下で１２日間までこれら細胞を
経過させた際、全＜ＣＡＴ活性の増加は生じなかった。
オケミストリー、第７２巻、第２４８〜５４頁に記載さ
れたように蛋白含有量につき平行分析した。次いで、そ
れぞれ４４５μ９の蛋白を含有する細胞抽出物の１部を
等しい最終容積（１５０μに）に調節しかつＣＡＴ活性
につき平行分析した。誘発性Ｃｌ０ＣＡＴラインにおい
て、ＣＡＴ活性は１５ｍＭＩ ＰＴＧの存在下に３〜４
日間にわたり直線的に増大したのに対し、ＣＶ−１Ｐ細
胞及び比較Ｃ土０ＣＡＴ細胞からのＩ ＰＴＧに露出し
てない抽出物におけるＣＡＴ活性はバックグランドレベ
ルのままで必った。最大ＣＡＴ活性は成る場合には４日
間で達し、又特に伯の場合には培養を開始してから１５
ｍＭのＩ ＰＴＧの存在下で１２日間までこれら細胞を
経過させた際、全＜ＣＡＴ活性の増加は生じなかった。
１ａｃＩ＋イー・コリにおいて、誘発剤イソプロピル−
β−〇−チオガラクトシド（Ｉ ＰＴＧ）は、数分間以
内にβ−ガラクトシダーゼの発現を賦活することができ
た。したがって、これら細胞における誘発速度は、イー
・コリにおける誘発速度とは顕著に相違する。
β−〇−チオガラクトシド（Ｉ ＰＴＧ）は、数分間以
内にβ−ガラクトシダーゼの発現を賦活することができ
た。したがって、これら細胞における誘発速度は、イー
・コリにおける誘発速度とは顕著に相違する。
Ｃ上０ＣＡＴ細胞抽出物で測定した４４５μ９の蛋白当
りのアセチル化りロラムフエコールの平均基礎％（±Ｓ
、Ｅ、Ｍ、） は、初期（７）ＣＶ−ＩＰ細胞抽出物で
検出されたよりも僅かに高かった。他の試験において、
これら数値間に有意の差は存在しなかった。バックグラ
ンドレベルとしてのＣｖ−１２細胞におけるＣＡＴ活性
の平均レベルを考慮して、平均の特異性ＣＡＴ活性は１
５ｍＭ ＩＰＴＧと共に４日間培養することによりＣ
上ΩＣＡＴ細胞にて最小で３２倍増大した。３種の別々
に誘導したクローンラインは全て、同一条件下に分析し
た場合、同様な性質を示した。
りのアセチル化りロラムフエコールの平均基礎％（±Ｓ
、Ｅ、Ｍ、） は、初期（７）ＣＶ−ＩＰ細胞抽出物で
検出されたよりも僅かに高かった。他の試験において、
これら数値間に有意の差は存在しなかった。バックグラ
ンドレベルとしてのＣｖ−１２細胞におけるＣＡＴ活性
の平均レベルを考慮して、平均の特異性ＣＡＴ活性は１
５ｍＭ ＩＰＴＧと共に４日間培養することによりＣ
上ΩＣＡＴ細胞にて最小で３２倍増大した。３種の別々
に誘導したクローンラインは全て、同一条件下に分析し
た場合、同様な性質を示した。
第２の試験は、■ＰＴＧ除去後の再抑制の速度か同様な
過程を辿ることを示した。ＣＶ−１Ｐ並びにＣｒ０ＣＡ
ＴラインＡ４、Ａ８及びＡ１１がらの活発成長する細胞
の複数プレートを、１５ｍＭのＩＰＴＧを含有する培地
で９６時間培養した。この期間の後、各ラインからの細
胞の半分を抽出しかつ残部をＩＰＴＧの不存在下でさら
に２４．４８若しくは７２時間にわたり活発成長する密
度でサブ培養した。陰性比較としてＩ ＰＴＧの不存在
下で培養したこれら全てのラインからの活発成長細胞の
複数プレー１〜を用いた。細胞を所定時間間隔で採取し
、かつ全抽出物を平行して蛋白含有量につき分析した。
過程を辿ることを示した。ＣＶ−１Ｐ並びにＣｒ０ＣＡ
ＴラインＡ４、Ａ８及びＡ１１がらの活発成長する細胞
の複数プレートを、１５ｍＭのＩＰＴＧを含有する培地
で９６時間培養した。この期間の後、各ラインからの細
胞の半分を抽出しかつ残部をＩＰＴＧの不存在下でさら
に２４．４８若しくは７２時間にわたり活発成長する密
度でサブ培養した。陰性比較としてＩ ＰＴＧの不存在
下で培養したこれら全てのラインからの活発成長細胞の
複数プレー１〜を用いた。細胞を所定時間間隔で採取し
、かつ全抽出物を平行して蛋白含有量につき分析した。
同一量の蛋白（４４５μ１ｇ）を含有する各細胞抽出物
の１部を等しい最終容積に調節し、かつＣＡＴ活性につ
き平行分析した。ＩＰＴＧを除去してから３日間にわた
り、３種全てのＩＰＴＩ理されたＣｌ０ＣＡＴクローン
ラインにおける定常状態のＣＡＴ活性は、９６時間の時
点におけるその数値からバックグランドレベルまで低下
した。
の１部を等しい最終容積に調節し、かつＣＡＴ活性につ
き平行分析した。ＩＰＴＧを除去してから３日間にわた
り、３種全てのＩＰＴＩ理されたＣｌ０ＣＡＴクローン
ラインにおける定常状態のＣＡＴ活性は、９６時間の時
点におけるその数値からバックグランドレベルまで低下
した。
これに対し、ＣＶ−１Ｐ細胞、並びにＩ ＰＴＧに露出
しなかったＣ土ΩＣＡＴ細胞の複数プレートからのＣＡ
Ｔ活性は、バックグランドレベルに留まった。したがっ
て、ＣＡＴ遺伝子発現の誘発及び再抑制の速度は、これ
らのサル細胞において同様な遅い時間経過を辿ると思わ
れる。さらに、誘発剤を除去した後、ＣＡＴＪ伝子の明
らかに完全な再抑制が検出された。
しなかったＣ土ΩＣＡＴ細胞の複数プレートからのＣＡ
Ｔ活性は、バックグランドレベルに留まった。したがっ
て、ＣＡＴ遺伝子発現の誘発及び再抑制の速度は、これ
らのサル細胞において同様な遅い時間経過を辿ると思わ
れる。さらに、誘発剤を除去した後、ＣＡＴＪ伝子の明
らかに完全な再抑制が検出された。
Ｉ ＰＴＧ濃度に対するＣＡＴ活性に関する誘発の機能
的依存性を次のように示した。
的依存性を次のように示した。
Ｃｌ０ＣＡＴ細胞の複数プレートを、種々の濃度のＩＰ
ＴＧを含有する培地で４日間活発に成長させた。このよ
うな３種の別々の実験において、ＩＰＴＧの濃度は低投
与量（１〜５００μＭ）、中投与ｆｆｌ （０，５〜１
５ｍＭ＞及び高投与量（５〜５０ｎ＋Ｈ）にわたって変
化させた。細胞を４日後に集めかつ抽出物を上記実験に
おけると同様に蛋白含有量及びＣＡＴ活性につき分析し
、ただしＣＡ下分析は９０分間にわたって行なった。低
Ｉ ＰＴＧ濃度において、ＣＡＴ活性はラインＡ１１に
おいて２５μＭから始まるＩＰＴＧ濃度における対数の
関数として増大した。他の２種のラインも同様な反応を
示した。ＣＡＴ活性はこれら３種の全てのラインにおい
て、中投与量範囲にわたり試験した際、Ｉ ＰＴＧ濃度
の直線的関数として増大した。高投与量のＩ ＰＴＧに
おいて、ラインＡ１１におけるＣＡＴ活性も同様に全Ｉ
ＰＴＧ範囲にわたり連続的に増加した。他の２種のラ
インはこのように試験しなかった。５０ｍＭより大きい
Ｉ ＰＴＧ濃度にて毒性が観察され、これは成長速度及
び（又は）ブレーティング効率の低下によって反映され
た。蛋白４４５μｇ当りのアセチル化クロラムフェニコ
ールの％として測定した特異的ＣＡＴ活性は、２反復の
分析に６いてＡ１細胞を５０ｍＭのＩ ＰＴＧと共に４
日間にわたり培養した後に６０倍増加した。
ＴＧを含有する培地で４日間活発に成長させた。このよ
うな３種の別々の実験において、ＩＰＴＧの濃度は低投
与量（１〜５００μＭ）、中投与ｆｆｌ （０，５〜１
５ｍＭ＞及び高投与量（５〜５０ｎ＋Ｈ）にわたって変
化させた。細胞を４日後に集めかつ抽出物を上記実験に
おけると同様に蛋白含有量及びＣＡＴ活性につき分析し
、ただしＣＡ下分析は９０分間にわたって行なった。低
Ｉ ＰＴＧ濃度において、ＣＡＴ活性はラインＡ１１に
おいて２５μＭから始まるＩＰＴＧ濃度における対数の
関数として増大した。他の２種のラインも同様な反応を
示した。ＣＡＴ活性はこれら３種の全てのラインにおい
て、中投与量範囲にわたり試験した際、Ｉ ＰＴＧ濃度
の直線的関数として増大した。高投与量のＩ ＰＴＧに
おいて、ラインＡ１１におけるＣＡＴ活性も同様に全Ｉ
ＰＴＧ範囲にわたり連続的に増加した。他の２種のラ
インはこのように試験しなかった。５０ｍＭより大きい
Ｉ ＰＴＧ濃度にて毒性が観察され、これは成長速度及
び（又は）ブレーティング効率の低下によって反映され
た。蛋白４４５μｇ当りのアセチル化クロラムフェニコ
ールの％として測定した特異的ＣＡＴ活性は、２反復の
分析に６いてＡ１細胞を５０ｍＭのＩ ＰＴＧと共に４
日間にわたり培養した後に６０倍増加した。
以下は成長停止した細胞がＩ ＰＴＧにより誘起されう
ろことを示している。融合細胞（Ａ４及びＡ１１）のプ
レートを１５ｍＭのＩ ＰＴＧの存在下又は不存在下に
４日間培養した。融合細胞の平行プレートを成長させか
つ１日目及び４日目に細胞数につき計数した。４日間の
培養期間の後、細胞抽出物を前記と同様に作成しかつ蛋
白含有量及びＣＡＴ活性につき分析した。ＣＡＴ活性の
顕著なＩ ＰＴＧ媒介誘発が、これらの接触阻止された
成長停止細胞において初期ＣＶ−ＩＰ細胞と比較して生
じた。細胞が成長停止したことを証明するため、Ｉ Ｐ
ＴＧの存在下におけるラインＡ１１の細胞数の結果は１
日目に平均してプレート１枚当り６．６ｘ１０６（固の
細胞を示しかつ４日目にプレート１枚当り６．８ｘ１０
６個の細胞を示した。Ｉ ＰＴＧの不存在下では、１日
目及び４日目の両者において平均でプレー１〜１枚当り
４．８Ｘ１０６個の細胞であった。したがって、Ｉ Ｐ
ＴＧによるＣＡＴ活性の誘発は活発な細胞分裂を必要と
しない。
ろことを示している。融合細胞（Ａ４及びＡ１１）のプ
レートを１５ｍＭのＩ ＰＴＧの存在下又は不存在下に
４日間培養した。融合細胞の平行プレートを成長させか
つ１日目及び４日目に細胞数につき計数した。４日間の
培養期間の後、細胞抽出物を前記と同様に作成しかつ蛋
白含有量及びＣＡＴ活性につき分析した。ＣＡＴ活性の
顕著なＩ ＰＴＧ媒介誘発が、これらの接触阻止された
成長停止細胞において初期ＣＶ−ＩＰ細胞と比較して生
じた。細胞が成長停止したことを証明するため、Ｉ Ｐ
ＴＧの存在下におけるラインＡ１１の細胞数の結果は１
日目に平均してプレート１枚当り６．６ｘ１０６（固の
細胞を示しかつ４日目にプレート１枚当り６．８ｘ１０
６個の細胞を示した。Ｉ ＰＴＧの不存在下では、１日
目及び４日目の両者において平均でプレー１〜１枚当り
４．８Ｘ１０６個の細胞であった。したがって、Ｉ Ｐ
ＴＧによるＣＡＴ活性の誘発は活発な細胞分裂を必要と
しない。
他の実施例
本発明の範囲において他の実施例も可能で必る。
たとえばイー・コリｌａｃリプレッサ／オペレータ系か
ら得られた他の官能性リプレッサ及び官能性オペレータ
も使用することができる。たとえばイー・コリｌａｃオ
ペレータの他の突然変異体又は合成同族体も使用するこ
とができる。たとえば上記［Ａ、シモン、上記１の実施
例に用いたような合成パリンドａ−ムオペレータが好適
である。
ら得られた他の官能性リプレッサ及び官能性オペレータ
も使用することができる。たとえばイー・コリｌａｃオ
ペレータの他の突然変異体又は合成同族体も使用するこ
とができる。たとえば上記［Ａ、シモン、上記１の実施
例に用いたような合成パリンドａ−ムオペレータが好適
である。
何故なら、これは高親和性をもって特異的にａＣリプレ
ッサに結合するが、このように結合した場合たとえばＩ
ＰＴＧのようなアロラクトース同族体により解離する
よう誘発さぜうるからである。
ッサに結合するが、このように結合した場合たとえばＩ
ＰＴＧのようなアロラクトース同族体により解離する
よう誘発さぜうるからである。
Ｉ ＰＴＧ以外のアロラクトースの同族体も、ｌａｃリ
プレッサを結合することによりオペレータに対するリプ
レッサの結合親和性を低下させるだめの誘発剤として使
用することができ、オペレータに結合した遺伝子の転写
を活性化することができる［Ｍ、Ｄ、バーケー等、上記
］。Ｉ ＰＴＧに結合したｌａｃリプレッサはｌａｃオ
ペレータに対し３００倍低い親和性を有しかっｌａｃリ
プレッサが好適な高親和性１ａｃオペレータに結合した
場合にはＩＰ王Ｇがオペレータからのりプレフサの解離
を誘発するためＩ ＰＴＧが好適である。
プレッサを結合することによりオペレータに対するリプ
レッサの結合親和性を低下させるだめの誘発剤として使
用することができ、オペレータに結合した遺伝子の転写
を活性化することができる［Ｍ、Ｄ、バーケー等、上記
］。Ｉ ＰＴＧに結合したｌａｃリプレッサはｌａｃオ
ペレータに対し３００倍低い親和性を有しかっｌａｃリ
プレッサが好適な高親和性１ａｃオペレータに結合した
場合にはＩＰ王Ｇがオペレータからのりプレフサの解離
を誘発するためＩ ＰＴＧが好適である。
イー・コリ１ａｃオペロン以外のオペロン系から得られ
た原核リプレッサ及びその同系オペレータも使用するこ
とができる。たとえばイー・コリのガラクトースオペロ
ンから得られたｇａｌリプレッサ及びその同系ｇａｌオ
ペレータを本発明で使用して、ｇａｌオペロンに結合し
がっ哺乳動物細胞の染色体に組込まれた遺伝子の発現を
制御することもできる。ガラクトース又はｇａｌリプレ
ッサ結合性同族体も誘発剤として使用することができろ
。さらに、たとえばイー・コリのトリプトファンオペロ
ンから得られたｔｒｐアポリプレッサ及びその間系ｔｒ
ｐオペレータを本発明で使用して、ｔｒｐオペレータに
結合されかつ哺乳動物細胞の染色体に組込まれた遺伝子
の発現を制御することもできる。ｔｒｐオペレータ結合
した遺伝子の転写は、アボリプレッザを結合してｔｒｐ
リプレッサによるオペレータ結合を阻止するトリプトフ
ァンの存在により阻止することができる。
た原核リプレッサ及びその同系オペレータも使用するこ
とができる。たとえばイー・コリのガラクトースオペロ
ンから得られたｇａｌリプレッサ及びその同系ｇａｌオ
ペレータを本発明で使用して、ｇａｌオペロンに結合し
がっ哺乳動物細胞の染色体に組込まれた遺伝子の発現を
制御することもできる。ガラクトース又はｇａｌリプレ
ッサ結合性同族体も誘発剤として使用することができろ
。さらに、たとえばイー・コリのトリプトファンオペロ
ンから得られたｔｒｐアポリプレッサ及びその間系ｔｒ
ｐオペレータを本発明で使用して、ｔｒｐオペレータに
結合されかつ哺乳動物細胞の染色体に組込まれた遺伝子
の発現を制御することもできる。ｔｒｐオペレータ結合
した遺伝子の転写は、アボリプレッザを結合してｔｒｐ
リプレッサによるオペレータ結合を阻止するトリプトフ
ァンの存在により阻止することができる。
第１図は真核プロモータ要素の制御下に必る改変開始コ
ドンと共にクローン化ｌａｃエコード配列を有するプラ
スミドの制限マツプであり、第２図はプロモータ／エン
ハンザ配列とｌａｃオペレータ配列と所望蛋白をコード
するＤＮＡ配列とを有するプラスミドの制限マツプであ
り、第３図は宿主染色体ＤＮＡへの１）−３ＶｌａｃＱ
ＣＡＴ ＤＮＡの組込みに関する推定配置を示す制限
マツプである。 手続補正書（斌） 補正の対象 平成元年６月１日
ドンと共にクローン化ｌａｃエコード配列を有するプラ
スミドの制限マツプであり、第２図はプロモータ／エン
ハンザ配列とｌａｃオペレータ配列と所望蛋白をコード
するＤＮＡ配列とを有するプラスミドの制限マツプであ
り、第３図は宿主染色体ＤＮＡへの１）−３ＶｌａｃＱ
ＣＡＴ ＤＮＡの組込みに関する推定配置を示す制限
マツプである。 手続補正書（斌） 補正の対象 平成元年６月１日
Claims (10)
- （１）原核リプレッサをコードするＤＮＡ配列に結合し
た真核プロモータにより哺乳動物細胞をトランスフエク
トし、 所望蛋白をコードするＤＮＡ配列に結合した原核オペレ
ータと前記結合ＤＮＡ配列の転写を促進するプロモータ
とにより前記哺乳動物細胞をトランスフエクトし、前記
オペレータと前記結合ＤＮＡ配列とを前記細胞の染色体
に組込むと共に、前記オペレータと前記結合ＤＮＡ配列
と前記プロモータと前記リプレッサとを前記細胞中で作
用させ、かつ 前記リプレッサを結合する物質と前記細胞を接触させる ことを特徴とする哺乳動物細胞における所望蛋白の発現
方法。 - （２）リプレッサ及びオペレータが両者とも￥ｌａｃ￥
又は両者とも￥ｇａｌ￥であるか又は前記リプレッサが
￥ｔｒｐ￥アポリプレッサでありかつ前記オペレータが
￥ｔｒｐ￥オペレータである請求項１記載の方法。 - （３）￥ｌａｃ￥リプレッサを結合する物質がアロラク
トース若しくはその同族体である請求項２記載の方法。 - （４）同族体がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ドである請求項３記載の方法。 - （５）￥ｇａｌ￥リプレッサを結合する物質がガラクト
ース若しくはその同族体である請求項２記載の方法。 - （６）￥ｔｒｐ￥アポリプレッサを結合する物質がトリ
プトファン若しくはその同族体である請求項２記載の方
法。 - （７）官能性の原核リプレッサと官能性の同系オペレー
タとをコードするＤＮＡ配列を含み、前記オペレータが
細胞の染色体中に組込まれてなる哺乳動物細胞。 - （８）所望蛋白をコードするＤＮＡ配列と結合ＤＮＡ配
列の転写を促進するプロモータとをオペレータに結合し
てさらに含む請求項７記載の細胞。 - （９）請求項７又は８記載の細胞を含む非ヒト哺乳動物
。 - （１０）所望蛋白をコードするＤＮＡ配列に結合して原
核オペレータをコードする官能性 ＤＮＡ配列を染色体中に組込むと共に前記結合ＤＮＡ配
列の転写を促進するプロモータをも組込んだ細胞を哺乳
動物に与え、さらに 前記細胞は原核リプレッサをコードする官能性のＤＮＡ
配列を真核プロモータに結合して有し、かつ 前記細胞を前記リプレッサに結合する物質の存在下又は
不存在下に成長させる ことを特徴とする非ヒト哺乳動物における所望蛋白の産
生を制御する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16705588A | 1988-03-11 | 1988-03-11 | |
| US167055 | 1988-03-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0235091A true JPH0235091A (ja) | 1990-02-05 |
Family
ID=22605747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1056542A Pending JPH0235091A (ja) | 1988-03-11 | 1989-03-10 | 哺乳動物細胞における発現の制御 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0332416A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0235091A (ja) |
| AU (1) | AU3102289A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0866190A (ja) * | 1990-05-02 | 1996-03-12 | Merck & Co Inc | 哺乳動物の誘導性プロモーターカスケード系 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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- 1989-03-10 JP JP1056542A patent/JPH0235091A/ja active Pending
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| EP0332416A2 (en) | 1989-09-13 |
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