JPH08505283A

JPH08505283A - ウシヒートショックプロモータおよびその使用

Info

Publication number: JPH08505283A
Application number: JP6511541A
Authority: JP
Inventors: ヤチェックコワルスキー、; スコットギルバート、; ティモスィージェイ．ザブ、
Original assignee: バイオスターインコーポレイテッド
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1993-11-03
Publication date: 1996-06-11
Also published as: EP0672156B1; CA2148492A1; DE69331551D1; ES2172517T3; CA2148492C; DK0672156T3; US5521084A; WO1994011521A1; DE69331551T2; US5733745A; ATE213021T1; US5981224A; EP0672156A1; PT672156E

Abstract

(57)【要約】熱誘導性ウシｈｓｐ７０Ａプロモータと関連ｃｉｓ−作用要素とを用いる新規な発現系につき開示する。この系は、実質的に感染性ウィルスおよび細胞蛋白汚染物を含まない高純粋の真正蛋白質の連続産生を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】ウシヒートショックプロモータおよびその使用技術分野本発明は一般に組換遺伝子発現系に関する。より詳細には本発明は、誘導性ウシヒートショックプロモータを用いる遺伝子生産物の新規な発現および分泌方法に関するものである。本発明は、医薬上重要なポリペプチドを産生させるのに特に有用である。発明の背景蛋白質は、各種の原核性および真核性組換発現系にて便利に産生される。しかしながら、これらの系はしばしば自然の産生を模倣せず、したがって得られる蛋白質は真正の第３構成を欠如すると共に翻訳後の改変が一般に存在する。さらに、発現レベルは特にウィルスベクターの哺乳動物系にてしばしば不充分である。たとえば溶解系にて、発現はウィルスの溶解作用によって著しく制限されうる。高発現レベルが達成される場合、発現蛋白質の細胞毒性により細胞成長および増殖に伴う問題が生じうる。非溶解系はしばしば低収率、クローン不安定性および最終生産物の細胞毒性という欠点を有する。これら幾つかの問題を解決する努力にて、誘導性発現系が用いられている。しかしながら、この種の系で現在用いられる大抵の誘導性プロモータは、比較的狭い範囲の宿主細胞に制限されるか或いは部分的にしか誘発性でなく、或いはたとえば腫瘍ウィルスのような本来危険である生物から誘導される。したがって、蛋白質の大規模合成を上記の問題を伴うことなく可能にする誘発性発現系が極めて望ましい。この種の１つの候補は、ヒートショック蛋白質（ｈｓｐ）として知られる１群の蛋白質から誘導されたプロモータを用いる系である。これら蛋白質は全ゆるところに存在し、今日まで研究された全ゆる真核性生物に見られ、熱応力および各種の他の外部作用物質により誘導しうる。たとえば高められた成長温度のようなこれら誘導剤に細胞が応答し、その際高レベルのｈｓｐを合成すると共に他の細胞蛋白質の合成割合を減少させる。ｈｓｐは寸法に基づき数種の群に分類される。興味あるものはｈｐｓ７０族であって、これら蛋白質が大きさ約７０ｋＤａであるためこのように命名される。ヒートショックの際の細胞におけるｈｓｐ７０の合成レベルは、その耐熱性に直線関係すると思われる（Ｇ．Ｃ．リー（１９８５）、Int．J．Radiat．Oncol ．Biol．Phys、第１１巻、第１６５〜１７７頁］。２種のヒトｈｓｐ７０蛋白質はｈｓｐ７０Ａ［Ｂ．ウー等（１９８５）、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第５巻、第３３０〜３４１頁；Ｃ．ハントおよびＲ．Ｉ．モリモト（１９８５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第６４５５〜６４５９頁］およびｈｓｐ７０Ｂ［Ｐ．シラー等（１９８８）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第２０３巻、第９７〜１０５頁］と記載されている。ｈｓｐについては次の刊行物が参照される：たとえばモリモト等編、「生物学および医薬におけるストレス蛋白質」（１９９０）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス；Ｌ．Ｅ．ハイタワー（１９９１）、セル、第６６巻、第１９１〜１９７頁；Ｅ．Ａ．クレイグおよびＣ．Ａ．グロス（１９９１）、トレンズ・バイオケミカル・サイエンス、第１６巻、第１３５頁。ｈｓｐ７０プロモータ並びにｈｓｐ７０遺伝子転写物の５′−および３′−未翻訳領域における配列は、誘導および未誘導の両状態にて細胞における蛋白質レベルおよびｍＲＮＡ合成の制御に関係する［Ａ．Ａ．シムコックス等（１９８５）、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第５巻、第３３９７〜３４０２頁；Ｎ．Ｇ．セオドラキスおよびＲ．Ｉ．モリモト（１９８７）、モレキュラ・セルラー・バイオロジー、第７巻、第４３５７〜４３６８頁；Ｈ．Ｊ．ヨスト等（１９９０）、「生物学および医薬におけるストレス蛋白質」、モリモト等編、「生物学および医薬におけるストレス蛋白質」（１９９０）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス社、第３７９〜４０９頁］。ヒートショック要素（ＨＳＥ）として知られる領域は、真核性ヒートショック遺伝子のＲＮＡ開始部位における最初の１００ｂｐ５′に見られる［Ｐ．Ｋ．ソルガー（１９９１）、セル、第６５巻、第３６３頁］。この領域は、ヘッド対ヘッドもしくはテール対テールの配向にて少なくとも２回反復する配列ｎＧＡＡｎを含む（ｎＧＡＡｎｎＴＴＣｎもしくはｎＴＴＣｎｎＧＡＡｎ）。異なる種類からのｈｓｐ７０遺伝子はＨＳＥの個数および配向、並びに上流に見られる他の因子結合部位の種類にて変化する。ＨＳＥは、陽性活動ファクタ、すなわちヒートショックファクタ（ＨＳＦ）を結合することにより、ストレス誘導プロモータ活性化にて機能する。ヒートショックエレメントに対するこのファクタの結合定数は、その各結合部位に対する他の公知の哺乳動物転写ファクタよりも約１００倍高く、このプロモータを最も強力なものにする。ｈｓｐプロモータは、各種の遺伝子を発現すべく使用されている。たとえばＭ．ドレアノ等（１９８６）、ジーン、第４９巻、第１〜８頁は、ヒト成長ホルモン、雛リゾチームおよびヒトインフルエンザヘマグルチニンの熱制御合成を指令すべくヒトｈｐｓ７０Ｂプロモータおよびキイロショウジョウバエｈｓｐ７０プロモータの使用を記載している。ヨーロッパ特許出願公開第３３６，５２３号（ドレアノ等、１９８９年１０月１１日付け公開）は、ヒトｈｓｐ７０プロモータを用いるヒト成長ホルモンのインビボ発現につき記載している。ＰＣＴ出願公開ＷＯ８７／００８６１号（ブロムレー等、１９８７年２月１２日付け公開）は、５′−未翻訳領域を有するヒトおよびキイロショウジョウバエｈｓｐプロモータの使用を記載している。ヨーロッパ特許出願公開第１１８，３９３号（ブロムレー等、１９８４年９月１２日付け公開）およびＰＣＴ出願公開ＷＯ８７／０５９３５号（ブロムレー等、１９８７年１０月８日付け公開）は、キイロショウジョウバエｈｓｐ７０プロモータを用いるイー・コリβ−ガラクトシダーゼおよびヒトインフルエンザヘマグルチニンの発現につき記載している。しかしながら、上記引例はいずれもウシｈｓｐプロモータに関するものでなく或いは耐熱性細胞にて異種蛋白質の発現を始動させるこれらプロモータの使用に関するものでない。さらに、これら引例はいずれも組換発現に関するｈｓｐ７０Ａプロモータの使用について記載していない。発明の要点したがって本発明は、組換蛋白質を産生させる極めて効率的な誘導性発現系を提供する。この系は、有力な病原性物質を含まない真正分子を模倣した蛋白質を経済上有利な多量にて長時間にわたり可逆的に産生することを可能にする。１具体例において本発明は、下流に位置する異種コード化配列の転写を指令しうる分離されたウシｈｓｐ７０プロモータに向けられる。他の具体例において本発明は、分離されたウシｈｓｐ７０５′−未翻訳領域に向けられる。さらに他の具体例において本発明は、選択されたコード化配列の転写を指令するのに有効な組換発現構成体に向けられる。この発現構成体は：（ａ）ウシｈｓｐ７０制御配列と；（ｂ）制御配列に作用結合したコード化配列とからなり、コード化配列は宿主細胞にて転写および翻訳することができ、さらに制御配列の少なくとも１つはコード化配列に対し異種である。特に好適な具体例において、発現構成体におけるウシｈｓｐ７０制御配列は、第２図の上側ストランドにおけるヌクレオチド位置１〜６６６に示した配列に対し実質的に相同かつ機能的に均等なヌクレオチド配列を含む。さらに他の具体例において本発明は、これら構成体で形質転換された宿主細胞およびこれら宿主細胞を用いる組換ポリペプチドの産生方法をも包含する。本発明のこれらおよび他の具体例は以下の開示により当業者には容易に了解され、或いは本発明の実施により判明するであろう。図面の簡単な説明第１図はウシゲノムｈｐｓ７０遺伝子λ−クローンおよび誘導プラスミドのマップを示し、第１ａ図はλＥＭＢＬ３Ａクローンにおけるゲノム挿入体の制限マップを示し、第１ｂ図はｐＢＬＵＥスクリプト（ｐＢＳ）でサブクローン化されたＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を示し、開いたバーで示される領域は第２図に配列決定および図示した領域であり、ｈｓｐ７０遺伝子のＡＴＧ開始コドンの位置が示される。第２図はウシｈｓｐ７０Ａ遺伝子の５′−上流領域およびコード化領域の１部（右側に番号付け）の配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）とヒト同族体（左側に番号付け）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）との比較を示す。ウシ配列は第１ｂ図に開いたバーで示した配列に対応する。ヒトｈｓｐ７０Ａ配列はＣ．ハントおよびＲ．Ｉ．モリモト（１９８５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第６４５５〜６４５９頁により開示された配列の塩基４０〜５７３に対応する。ヒト配列の最初の４０ｂｐは、まだ決定されてないウシ配列に顕著には一致しない。転写ファクタ結合部位、すなわちＴＡＴＡＡ枠および翻訳開始コドンが示される。第３図はウエスタン・ブロットにより分析された一時的トランスフェクトのマジン・ダルビーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞におけるウシヘルペスウィルス１型（「ＢＨＶ−１」）グリコ蛋白の熱制御発現および分泌を示し、第３ａ図は切断ＢＨＶ−１グリコ蛋白ＩＩＩ（「ｇＩＩＩ」）を発現するプラスミドｐ３ＫＨＳＰＧ３ＨＵでの実験を示し、第３ｂ図は切断ＢＨＶ−１グリコ蛋白ＩＶ（「ｇＩＶ」）を発現するプラスミドｐ３ＫＨＳＰＧ４ＨＵでの実験を示す。第４図は安定に形質転換されたＭＤＢＫ細胞の熱誘導性クローン（ＭＧ４−５７）による長時間にわたるＢＨＶ−１ｇＩＶの分泌を示し、第４ａ図は培地のクーマシー・ブルー染色ゲルの図面であり、第４ｂ図は毎日連続的に回収して、積算プロットした培地におけるｇＩＶ蛋白質の定量的ＥＬＩＳＡ測定を示す。発明の詳細な説明本発明の実施には特記しない限り当業界の知識内である分子生物学、微生物学、ウィルス学、組換ＤＮＡ技術および免疫学の慣用技術を用いる。この種の技術は文献に充分説明されている［たとえばサムブルック、フリッチおよびマニアチス、モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、第２版、１９８９；ＤＮＡクローニング、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．グローバー編、１９８５）；オリゴヌクレオチド合成（Ｍ．Ｊ．ゲイト編、１９８４）；ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション（Ｂ．Ｄ．ヘイムスおよびＳ．Ｊ．ヒギンス編、１９８４）；アニマル・セル・カルチャー（Ｒ．Ｋ．フレッシュネー編、１９８６）；固定化細胞および酵素（ＩＲＬプレス社、１９８６）；Ｂ．パーバル、「分子クローニングへの実際的指針」（１９８４）；シリーズ、メソッズ・イン・エンチモロジー（Ｓ．コロビックおよびＮ．カプラン編、アカデミック・プレス・インコーポレーション社）；ハンドブック・オブ・エキスペリメンタル・イミュノロジー、第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ウェアーおよびＣ．Ｃ．ブラックウェル編、１９８６、ブラックウェル・サイエンチフィック・パブリケーションス）参照］。本明細書で用いる単数型「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明かに他を示さない限り複数型をも包含する。Ａ．定義本発明の説明においては次の用語を用い、下記する意味を有する。「耐熱性細胞もしくは細胞ライン」は、３７℃より高い正常体温を有する生物から得られた細胞または細胞ラインである。培養細胞の耐熱性は、これらが得られる動物種類の正常体温に関係することが示されている［Ｇ．Ｐ．ラーホルスト等（１９７９）、カンサー・リサーチ、第３９巻、第３９６頁］。一般に、この種の細胞は３７℃より高い温度にて長時間にわたり製造し続けて分裂しうると共に、同じ細胞が３７℃で成長する際に見られると実質的に同じ速度の成長速度を維持する。「ウシｈｓｐ７０プロモータ」とは、ＲＮＡポリメラーゼを結合すると共に下流（３′−方向）コード化配列の転写を開始させうるウシｈｓｐ７０遺伝子から得られたＤＮＡ制御領域を意味する。「ウシｈｓｐ７０プロモータ」は、ウシ種類から分離されたｈｓｐ７０プロモータの特性を有するプロモータ、並びにこれに対し実質的に相同かつ機能的に均等であるプロモータの両者を包含する（下記に説明）。ヒトおよびキイロショウジョウバエ（Drosophila）ｈｓｐ７０プロモータはこの規定から特定的に排除される。本発明を規定する目的で、プロモータ配列は転写開始部位により３′−末端にて結合される（しかしながら下記する５′−ＵＴＲにより与えられる部位を必ずしも含まない）。転写開始部位はＴＡＴＡ枠から約３０ｂｐｓ下流にある（３′−方向）。プロモータは上流（５′−方向）に延びて、バックグランドより高い検出レベルにて転写を開始させるのに必要な最小個数の塩基もしくは要素を含む。プロモータ配列内には、各種の転写ファクタおよびＴＡＴＡ枠を結合してＲＮＡポリメラーゼを結合させうる蛋白結合ドメイン（共通配列）が存在する。ウシｈｓｐ７０プロモータはさらに、熱応力の際にヒートショックファクタを結合するための１個もしくはそれ以上のヒートショック要素をも含む。実施例に説明したように分離およびクローン化されたウシｈｓｐ７０Ａプロモータ配列を第２図に示し、これは図面の少なくともヌクレオチド１〜４４１を含むと思われる。「ウシｈｓｐ７０５′−ＵＴＲ」は、ＡＴＧコドンにより３′−末端で結合すると共に上流方向（５′−方向）にｈｓｐ７０転写開始部位まで延びるウシｈｓｐ７０遺伝子からのヌクレオチドの未翻訳領域を意味する。上記で説明したように、この部位はＴＡＴＡ枠から約３０ヌクレオチド下流に位置する。２種のＤＮＡもしくはポリペプチドの配列は、分子の規定長さにわたりヌクレオチドもしくはアミノ酸の少なくとも約８０％（好ましくは少なくとも約９０％、特に好ましくは少なくとも約９５％）が一致する場合、「実質的に相同」である。ここで用いる「実質的に相同」という用語は、特定ＤＮＡもしくはポリペプチド配列に対し同一性を示す配列を意昧する。ウシｈｓｐ７０ＤＮＡのヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列に対し「実質的に相同」なヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列は、対応のヒトもしくはキイロショウジョウバエｈｓｐ７０ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列を包含しないことが了解されよう。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、たとえば特定の系につき規定されるように、厳密な条件下でのサウザン・ハイブリッド化実験にて同定することができる。適するハイブリッド化条件の規定は当業者の知識内である［たとえばサムブルック等、上記；ＤＮＡクローニング、第ＩおよびＩＩ巻、上記；ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション、上記参照］。ウシｈｓｐ７０配列に対し「機能的に均等」な配列は、対応のｈｓｐ７０配列と同様に機能するものである。すなわち、ここに記載したウシｈｓｐ７０プロモータに対し「機能的に均等」なプロモータ配列は、下流コード化配列の転写をバックグランドレベルよりも高く指令しうるものである。ＤＮＡ「コード化配列」または特定蛋白質を「コードするヌクレオチド配列」は、適する制御配列の制御下に置かれた際にポリペプチドにインビボもしくはインビトロで転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。コード化配列の境界は、５ ′−（アミノ）末端における開始コドンおよび３′−（カルボキシ）末端における翻訳停止コドンにより決定される。コード化配列は限定はしないが原核姓配列、真核性ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核性（たとえば哺乳動物）源からのゲノムＤＮＡ配列、ウィルスＲＮＡもしくはＤＮＡ、および合成ヌクレオチド配列を包含する。転写停止配列は一般にコード化配列に対し３′に位置する。ＤＮＡ「制御配列」とは総称してブロモータ配列、ポリアデニル化信号、転写停止配列、上流制御ドメイン、促進剤など未翻訳領域を意味し、これらは５′− ＵＴＲおよび３′−ＵＴＲを包含し、総合して宿主細胞におけるコード化配列の転写および翻訳を可能にする。「作用結合した」という表現は、上記各成分がその通常の機能を果たすよう構成される各要素の配置を意味する。すなわち、コード化配列に作用結合した制御配列は、コード化配列の発現を行うことができる。制御配列は、その発現を指令するよう機能する限り、コード化配列に隣接する必要はない。たとえば介在する未翻訳であるが転写された配列がプロモータ配列とコード化配列との間に存在することもでき、これもプロモータ配列がコード化配列に対し「作用結合した」と考えうる。制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモータ配列を結合すると共にコード化配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこれをコード化配列によりコードされるポリペブチドに翻訳する際、細胞にてコード化配列の「転写を指令する」。「宿主細胞」は、外生ＤＮＡ配列により形質転換された或いは形質転換しうる細胞である。細胞は、外生ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された際に外生ＤＮＡにより「形質転換された」という。外生ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに一体化（共有結合）してもしなくても良い。たとえば原核性動物および酵母において、外生ＤＮＡはたとえばプラスミドのようなエピソーム要素に維持することができる。真核性細胞において、安定に形質転換された細胞は一般に外生ＤＮＡが染色体に一体化されて染色体複製を介し娘細胞により受継がれる細胞、または安定に維持された染色体外のプラスミドを含むものである。この安定性は、外生ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなる細胞ラインもしくはクローンを確立する真核性細胞の能力により示される。ＤＮＡ構成体の「異種」領域は、天然では他の分了に関連して存在しない他のＤＮＡ分子における或いはこれに結合したＤＮＡの同定可能なセグメントである。たとえば、ｈｓｐ以外のウシ蛋白質をコードする配列は、ｈｓｐウシプロモータに結合すれば異種配列と考えられる。同様に、ｈｓｐをコードする配列は、一般には結合しないｈｓｐプロモータに結合すれば異種と考えられる。異種コード化配列の他の例は、コード化配列自身が天然に存在しない構成体である（たとえば天然遺伝とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、異種構造遺伝子とｈｓｐもしくはｈｓｐの１部をコードする遺伝子とからなり、同一もしくは異なるｈｓｐ遺伝子のいずれから誘導されてもｈｓｐプロモータに結合したキメラ配列は、この種のキメラ構成体が一般に自然界には存在しないので異種と考えられる。対立型または天然産の突然変異は、ここで用いるＤＮＡの異種領域を生ぜしめない。「免疫原性ポリペプチド」という用語は、ウィルスもしくは細菌の感染性を中和し（問題とする抗原に依存する）かつ／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞の細胞毒性を媒介して免疫宿主の保護を与える抗体となりうるポリペプチドを意味する。ここで用いる「免疫原性ポリペプチド」は問題とする抗原の全長（または、ほぼ全長）配列を包含し、或いはその免疫原性断片を包含する。「免疫原性断片」という用語は１個もしくはそれ以上のエピトープを含む断片を意味し、したがってウィルスもしくは細菌の感染性を中和する抗体となり或いは抗体− 補体もしくは抗体依存性細胞の細胞毒性を媒介して免疫宿主の保護を与える。この種の断片は一般に少なくとも長さ約５アミノ酸、好ましくは少なくとも長さ約１０〜１５アミノ酸である。蛋白配列のほぼ全長からなり或いは２個もしくはそれ以上のエピトープの断片を含む融合蛋白質からなる断片の長さについては、臨界的な上限が存在しない。たとえば、ここに例示するＢＨＶ−１ｇＩＩＩおよびｇＩＶ免疫原性ポリペプチドは、蛋白の経膜結合ドメインを欠如する断片であって発現産生物の分泌を容易化させる。Ｂ．一般的方法本発明は、ウシｈｓｐ７０プロモータの分離および特性化、並びに異種蛋白質を産生させるための発現系における前記プロモータの使用に基づく。このプロモータは誘導性である。すなわち多量の所望蛋白質を形質転換された細胞を高められた温度およびプロモータの他の公知誘導剤で処理して組換産生することができる。このプロモータを用いて、広範な種類の細胞で所望蛋白質の転写を指令することができる。所望ならば、耐熱性細胞ラインを用いて産生効率を向上させると共に、組換産生の際に宿主細胞の寿命を増大させることができる。ｃｉｓ作用性制御要素をウシｈｓｐ７０プロモータと便利に結合させて、これに関連する構造遺伝子の発現を最適化することができる。これら制御要素は、ヒートショックに際し構造遺伝子の効率的発現を指令する。この系で産生された蛋白質が自然に分泌または処理されれば、形質転換細胞は長時間にわたり生き延びて蛋白産生物を生成し、収率をさらに増大させることができる。この系は真正な構成、翻訳後の真正な改変、比較的純粋な形態、および経済上有利な量にて所望蛋白質の産生を可能にする。本発明のｈｓｐ７０プロモータは適するプローブを用いてウシゲノム保存物から分離して、その後に使用すべくクローン化することができる。同様に配列は、ポリヌクレオチド合成の公知方法を用いて第２図に示した配列に基づき合成的に産生することもできる［たとえばＭ．Ｄ．エッジ、ネーチャー（１９８１）、第２９２巻、第７５６頁；ナンベア等、サイエンス（１９８４）、第２２３巻、第１２９９頁；ジェイ・アーネスト、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（１９８４）、第２５９巻、第６３１１頁参照］。本発明の目的で、ウシｈｓｐ７０Ａプロモータを、ウシゲノム保存物をヒトｈｓｐ７０Ａプローブにより下記するようにスクリーニングして分離した。このプロモータは、第２図における位置１〜４４１で示した少なくともヌクレオチドを含むと思われる。ＴＡＴＡＡＡ枠（転写ファクタＩＩＤを結合すると思われる）は第２図の位置４３６〜４４１に位置する。２個のＣＣＡＡＴ枠（ＣＣＡＡＴ枠 −結合転写ファクタ、ＣＴＦの結合部位）はそれぞれ第２図の位置３１４および３９４に位置する。プリン豊富な要素およびＧＣ要素（Ｓｐ１ファクタを結合する）は位置４０８に見られる。ヒートショック要素を含む３個の領域が位置３〜２４、２６５〜２８７および３５０〜３７２に存在すると思われる。ウシｈｓｐ７０プロモータまたはその機能部分を用いて、それに作用結合した際に異種コード化配列の転写を指令することができる。全プロモータ配列は、少なくとも１個のヒートショック要素、並びに転写開始部位およびＲＮＡポリメラーゼ結合部位が存在する限り、存在する必要はない。したがってプロモータを処理して、これら必要な配列のみを含ませることができる。一般に本発明の発現系に使用するには、１個のヒートショック要素を含むほぼ位置３５０〜４４１、より好ましくは２個のヒートショック要素を含む約２６５〜４４１に見られるヌクレオチド、さらに位置１から上流かつ位置４４１から下流に延在するヌクレオチド１〜４４１および領域に対し実質的に相同かつ機能的に均等なヌクレオチドの配列を用いて、所望の異種コード化配列の転写を指令することができる。ウシｈｓｐ７０プロモータを用いて効率的な発現を達成するには、本発明の系にｈｓｐ７０５′−ＵＴＲ領域を含むことが望ましい。この領域はＡＴＧコドンにより３′−末端で結合すると共に、上流（５′−方向）にてｈｓｐ７０転写開始部位まで延在する。上記したように、転写開始部位はＴＡＴＡ枠からほぼ３０ヌクレオチド下流に位置する。すなわち、ウシｈｓｐ７０Ａ５′−ＵＴＲは、第２図に示したＡＴＧコドンの上流に約１９０〜２００ヌクレオチドを含むと思われる。この領域は、対応のヒトｈｓｐ７０５′−ＵＴＲに対し約６５％の配列ホモロジーを示す。用いるｈｓｐ７０５′−ＵＴＲ領域はウシ宿主から誘導する必要がなく、たとえばヒトｈｓｐ７０遺伝子のような他の対応の真核性遺伝子、たとえばキイロショウジョウバエのような昆虫ｈｓｐ７０遺伝子、または他の任意の真核性ｈｓｐ７０遺伝子から誘導することができる。ウシｈｓｐ７０Ａプロモータを使用する場合、対応のｈｓｐ７０Ａ５′−ＵＴＲを使用することが好ましい（この場合も、必ずしもウシ供給源からの必要はない）。しかしながら、ｈｓｐ７０Ｂ遺伝子から誘導された５′−ＵＴＲも、ｈｓｐ７０Ａプロモータを用いる系に使用される。相同５′−ＵＴＲを用いれば、一般に分離されたウシｈｓｐ７０プロモータおよび関連配列の部分として得られ、もはや操作は必要でない。５′−ＵＴＲは公知の５′−ＵＴＲ配列に基づき合成的に産生させて、ｈｓｐ７０プロモータ配列に結合させることができる。同様に、５′−ＵＴＲは、制限酵素および手法を用いて５′−ＵＴＲ配置を有するプラスミドから分離することもでき或いはこれにプロモータ構成体を付加させることもできる。部位特異性ＤＮＡ切断は、適する制限酵素での処理により当業界で一般的に理解された条件およびこれら市販酵素の製造業者により特定された詳細の下で行われる［たとえば、ニュー・イングランド・ビオラブス社、製品カタログ参照］。所望ならば、切断された断片の寸法分離を標準技術によりポリアクリルアミドゲルもしくはアガロースゲルの電気泳動で行うことができる。寸法分離に関する一般的説明はメゾッズ・イン・エンチモロジー（１９５０）、第６５巻、第４９９〜５６０頁に見られる。次いで５′−ＵＴＲおよびプロモータ配列を公知技術により互いに結合させることができる。３′−ＵＴＲから誘導される配列、すなわちｈｓｐ７０構造遺伝子の３′−末端に整列する未翻訳領域を本発明の系と共に用いることもでき、さらにコード化領域から下流に位置せしめてその発現効率を増大させることもできる。３′−ＵＴＲはｍＲＮＡを安定化させると思われる。５′−ＵＴＲと同様に、３′−ＵＴＲは必ずしもウシｈｓｐ遺伝子から誘導する必要はない。寧ろ、３′−ＵＴＲは任意対応のｈｓｐ７０遺伝子から或いは発現すべき遺伝子から得ることもでき、ただし遺伝子は３′−ＵＴＲを含むものとする。本発明における実施例は、それぞれヒトｈｓｐ７０Ａ３′−ＵＴＲおよびキイロショウジョウバエ３′−ＵＴＲをウシｈｓｐ７０Ａプロモータおよび５′−ＵＴＲと組合せて用いることにより異種コード化配列の発現を指令することにつき説明する。３′−ＵＴＲは、当業界で知られた技術により所望の構造遺伝子に結合される。本発明の発現系には、マーカおよびアンプリファイヤも用いることができる。形質転換された細胞ラインを選択するのに有用である各種のマーカが知られており、一般に細胞が適する選択培地で成長する際に発現により形質転換細胞に選択可能な表現型を付与する遺伝子で構成される。哺乳動物細胞ラインに関するこの種のマーカは、たとえばミコフェノール酸とキサンチンとを含有する培地で選択しうる細菌性キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子［ムリガン等（１９８１）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７８巻、第２０７２〜２０７６頁］およびネオマイシン誘導体を含有する培地を用いて選択しうるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン／カナマイシン誘導体の抗菌作用を失活させる蛋白質を特定する）、たとえば哺乳動物細胞に対し一般に毒性であるＧ４１８［コルベーレ・ガラピン等（１９８１）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１５０巻、第１〜１４頁］を包含する。他の真核性発現系のための有用なマーカは当業者に周知されている。さらに発現は、拡大可能な遺伝子、たとえばマウスジヒドロホレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子をコード化配列に隣接させて拡大させることもできる。次いで細胞をｄｈｆｒ欠失細胞にてメトトレキセート耐性につき選択することができる［たとえばウルラウブ等（１９８０）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７７巻、第４２１６〜４２２０頁；ルンゴールド等（１９８１）、ジャーナル・モレキュラ・アンド・アプライド・ジェネティックス、第１巻、第１６５〜１７５頁参照］。上記系を用いて広範な種類の原核性、真核性およびウィルス性蛋白質、たとえばワクチン抗原として使用するのに適するウィルスグリコ蛋白、免疫反応を調節するための免疫調整剤、ホルモン、サイトキンおよび成長因子、並びに他の生物医薬を製造するのに有用な蛋白質などの発現を指令することができる。本発明の系は、限定はしないが、たとえばウシヘルペスウィルスから誘導される抗原（ＢＨＶ−１）、ウシウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸シンシチウムウィルス、ウシロタウィルス、ウシコロナウィルスおよびウシパラインフルエンザウィルスのようなウシウィルス抗原の生産につき特に有用である。これらウィルスからの多数の保護抗原が知られている。たとえばＢＨＶ−１の場合、ウィルスエンベロプグリコ蛋白ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶが分離されており、さらに組換産生されて効果的な保護抗原であることが示されている［たとえばＬ．Ａ．バビウク等（１９８７）、バイロロジー、第１５９巻、第５７〜６６頁および米国特許第５，１５１，２６７号、それぞれこれら抗原の分離およびクローン化に関する説明参照］。同様にＢＶＤＶからのｇｐ５３のモノクローナル抗体分析は、これら抗体がウィルス中和活性を有することを示している［Ｄ．デレクト等（１９９０）、Can．J．Vet．Res．、第５４巻、第３４３〜３４８頁参照］。さらにｇｐ５３のヌクレオチド配列も知られている［Ｍ．コレット等（１９８８）、バイロロジー、第１６５巻、第１９１〜１９９頁］。したがって本発明は、これら重要な抗原を効率的に産生する方法をも提供する。所望蛋白質をコードする遺伝子配列は、公知技術を用いて組換的に分離または得ることができる。或いは、興味ある蛋白質をコードするＤＮＡ配列をクローン化でなく合成的に作成することもできる。ＤＮＡ配列は、特定のアミノ酸配列に適するコドンを用いて設計することができる。一般に、目的とする宿主にて効率的に発現させる好適なコドンを選択する。完全な配列を標準法により作成された重なるオリゴヌクレオチドから組立てると共に、完全なコード化配列まで組立てる［たとえばエッジ等（１９８１）、ネーチャー、第２９２巻、第７５６頁；ナンベア等（１９８４）、サイエンス、第２２３巻、第１２９９頁；ジェイ等（１９８４）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５９巻、第６３１１頁参照］。さらに、興味ある蛋白質の突然変異体または類似体を産生することも望ましい。突然変異体もしくは類似体は、蛋白質をコードする配列の１部の欠失により或いは配列の挿入により或いは配列内の１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換により作成することができる。ヌクレオチド配列を改変するための技術（たとえば部位指向性の突然変異）が当業者に周知されている［たとえばサムブルック等、上記；ＤＮＡクローニング、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、上記；ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション、上記参照］。本発明の目的で、コード化配列をさらに処理して宿主生物からのポリペプチドの分泌を行うことが特に望ましい。これはクローンの安定性を向上させると共に、宿主細胞における蛋白質の毒性蓄積を防止して発現を一層効率的に進行させることができる。この目的に相同信号配列を、一般に信号配列と結合して存在する蛋白質と共に用いることができる。さらに、蛋白質の分泌を可能にする異種リーダー配列を構成体に添加することもできる。好ましくは処理部位は、リーダー断片がこれにより発現された蛋白質から切断されうるよう含ませる。［たとえば切断部位をどのように導入しうるかに関する検討につき米国特許第４，３３６，２４６号参照］。リーダー配列断片は、典型的には疎水性アミノ酸で構成された信号ペプチドをコードする。適するリーダーの選択は、蛋白質を発現させるべく用いる細胞種類に依存する。たとえばヒトα−インタフェロンをコードする遺伝子からの配列［マエダ等、ネーチャー（１９８５）、第３１５巻、第５９２頁］、ヒトガストリン放出性ペプチド［レバック・ベルヘイデン等（１９８８）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第８巻、第３１２９頁］、ヒトＩＬ−２［スミス等（１９８５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第８４０４頁］、マウスＩＬ−３［ミヤジマ等（１９８７）、ジーン、第５８巻、第２７３頁］、およびヒトグルコセレブロシダーゼ［マーチン等（１９８８）、ＤＮＡ、第７巻、第９９頁］をコードする遺伝子からの配列は哺乳動物細胞における異種蛋白の分泌を可能にする。さらに、これら配列を用いて昆虫宿主細胞における分泌を与えることもでき、またたとえばバキュロウィルスｇｐ６７遺伝子のようなＤＮＡコード遺伝子を用いて昆虫もしくはバキュロウィルス蛋白を分泌させることもできる。細菌にて発現させるには、適する信号配列をコードするＤＮＡを分泌された細菌蛋白質に関する遺伝子、たとえばイー・コリ外膜蛋白遺伝子（ｏｍｐＡ）［ガーライエブ等（１９８４）、ＥＭＢＯジャーナル、第３巻、第２４３７頁］およびイー・コリアルカリホスファターゼ信号配列（ｐｈｏＡ）［オカ等（１９８５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第７２１２頁］から得ることができる［米国特許第４，３３６，３３６号をも参照］。各種のバチルス菌株からのα−アミラーゼ遺伝子の信号配列を用いて、異種蛋白質を枯草菌から分泌させることができる［パルバ等（１９８２）、ブロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７９巻、第５５８２頁；ＥＰＯ特許公開第２４４，０４２号］。最後に、酵母における分泌は酵母インベルターゼ遺伝子［ＥＰＯ特許公報第０１２，８７３号］およびα−ファクタ遺伝子［米国特許第４，５４６，０８３号、第４，５８８，６８４号および第４，８７０，００８号］により指令することができる。或る種の蛋白質、特にウィルスグリコ蛋白については、存在するであろう経膜結合ドメインの全部もしくは１部を欠失させることにより経膜結合を排除し或いは実質的に減少させると共に分泌を増大させることにより、分泌を行うことができる。この種の手法はたとえばＭ．モッツ等（１９８７）、ジーン、第５８巻、第１４９〜１５４頁；およびスペテー等（１９９０）、ジャーナル・バイロロジー、第６４巻、第２９２２〜２９３１頁に記載されている。或いは、細胞からの発現生産物の滲出に役立つことが知られた分子を、所望の蛋白質と共に発現させることもできる［たとえばハッチンソン等（１９９２）、ジャーナル・バイロロジー、第６６巻、第２２４０〜２２５０頁参照］。所望蛋白質につきコード化配列が作成され或いは分離された後、発現ベクターを特定のコード化配列がウシｈｓｐ７０プロモータおよび５′−ＵＴＲ（存在すれば）から下流にてベクターに存在するよう作成する。したがって本発明の好適な構成体は一般に、順次に転写開始部位を含むウシｈｓｐ７０プロモータ配列とｈｓｐ７０５′−ＵＴＲと翻訳開始をコードするコンセンサス配列と蛋白質が分泌されるよう処理した所望の蛋白質をコード化する遺伝子配列と３ ′−ＵＴＲとを含む。さらに、介入するヌクレオチド配列をも、所望のコード化配列の転写および翻訳が阻害されない限り存在させることができる。制御配列に対するコード化配列の位置および配向は、コード化配列が制御配列の指令下で転写されるようにする（すなわち制御配列におけるＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼはコード化配列を転写する）。興味ある特定蛋白質をコードする配列の改変が、この目的を達成するのに望ましい。たとえば或る場合は、配列を改変して適する配向を有する制御配列に付着させるようにし、すなわち適切な読枠を維持する必要がある。制御配列を、ベクターに挿入する前にコード化配列に結合させることができる。或いはコード化配列を、既に制御配列と適する制限部位とを有する発現ベクターに直接クローン化させることもできる。次いで発現ベクターを用いて適する宿主細胞を形質転換させる。多数の哺乳動物細胞ラインが当業界で知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手しうる不死細胞ライン、たとえば限定はしないが支那ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヘラ細胞、乳児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞性癌細胞（たとえばＨｅp Ｇ２）、マジン・ダルビーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞などを包含する。同様に、たとえばイー・コリ、バチルス・スブチリスおよびストレプトコッカスｓｐｐなどの細菌宿主も本発明の発現構成体につき使用することができる。本発明に有用な酵母宿主は特にサッカロミセス．セレビシー（Saccharomyces cerevisiae）、キャンジダ・アルビカンス（Candida albicans ）、キャンジダ・マルトーサ（Candida maltosa）、ハンセヌラ・ポリモルフア（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fr agilis）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ピチア・ギレリモンジー（Pichia guillerimondii）、ピチア・パストリス（Pichia pastor is）、シゾサッカロミセス．ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）およびヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）を包含する。バキュロウィルス発現ベクターと共に使用する昆虫細胞は特にエデス・エジプチ（Λedes aegypti）、オウトグラファ・カリホルニカ（Autographa californica）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）、ドロソフィラ・メラノガスタ（Drosophila melanogaster）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）およびトリコプルシア・ニー（Trichoplusia ni）を包含する。蛋白質を使用すべき種類と相同である細胞ラインを用いて、構造真正性を確保すると共に異種阻害性汚染物を含まない産生物を保証することが望ましい。さらに耐熱性細胞ラインを用いて、熱を誘導剤として使用する際に所望蛋白質を産生させることが特に好ましい。この種の細胞は長時間の高められた温度に耐えて、ヒートショックプロモータの誘導を可能にすると共に、細胞を死滅させることなく長時間にわたり所望蛋白質を同時に産生させる。多数の耐熱性細胞ラインが当業界で知られており、一般に３７℃より高い正常体温を有する生物から得られる。すなわち、たとえばＭＤＢＫ細胞のようなウシ種類（３９ ℃の正常体温を有する）から誘導される細胞が本発明で使用され、同様にブタ（３９℃の正常体温を有する）、ムンチャック（３８．５℃の体温を有する）などの動物から得られる細胞ラインも使用される。用いる形質転換法は、形質転換すべき宿主に依存する。たとえばＤＥＡＥ−デキストランに基づく手法、燐酸カルシウム沈澱［Ｆ．Ｌ．グラハムおよびＡ．Ｊ．ファンデルエブ（１９７３）、バイロロジー、第５２巻、第４５６〜４６７頁］、プロトプラスト融合、リポソーム媒介移動、ポリブレン媒介トランスフェクションおよび核内へのＤＮＡの直接的ミクロ注入を用いて哺乳動物細胞を便利に形質転換させることができる。一般に細菌細胞は、塩化カルシウムを単独で或いは他の二価陽イオンおよびＤＭＳＯとの組合せで用いて形質変換される［サムブルック、フリッチおよびマニアチス、モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュアル、第２版（１９８９）］。さらにＤＮＡをエレクトロポレーションにより細菌細胞に導入することもできる。外生ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、典型的にはスフェロプラストの形質転換またはアルカリ陽イオンで処理された完全酵母細胞の形質転換を包含する。次いで形質転換された宿主細胞を適する培地にてその発現を与える条件下で増殖させて蛋白質を産生させる。この種の条件は公知であり、或いは当業者に容易に明かとなる。血清フリー培地（２４時間毎に交換する）における増殖は蛋白質の収率を著しく増大させることが判明した。所望蛋白質の産生は、形質転換細胞をｈｓｐプロモータを誘導することが知られた薬剤で処理して誘導される。この種の作用剤はたとえば熱、金属イオン（たとえばＣｄ、ＺｎおよびＣｕ）、アゼチジン、フォルスコリン、プロスタグランジンＰＧＡ２、アデノウィルスＥ１Ａ蛋白、アミノ酸類似体、或る種のイオノフォア、エタノール、過酸化水素およびミトコンドリア作用の抑制剤を包含する。特に好適な誘導方法は熱の使用である。すなわち増殖の際に細胞の周囲温度を一般に後期定常期にて３７℃より高い温度まで上昇させることにより、ｈｓｐブロモータを誘導させる。一般に、細胞は３８〜４５℃の温度、より好ましくは３９〜４４℃、特に好ましくは４０〜４３℃の温度に１〜１２時間、より好ましくは４〜６時間、特に好ましくは６時間にわたり維持される。さらに、温度は周期的に、すなわち毎日１〜１０時間、より好ましくは毎日３〜６時間にわたり１〜２１日間もしくはそれ以上の期間につき上昇させることができる。他の適する温度および時間は、ｈｓｐ７０プロモータの効率を確保すべく当業者により容易に決定して所望生産物の産生レベルを最大化させることができる。次いで蛋白質を宿主細胞から分離して精製する。発現系が蛋白質を増殖培地中に分泌する場合は、蛋白質を直接用い或いは培地から精製することもできる。蛋白質が分泌されない場合は、これを細胞溶解物から分離する。適する回収法の選択は当業者の知識内である。さらに構成体を遺伝子療法または核酸免疫化に用いて、所望の遺伝子生産物をインビボで産生するよう指令することもでき、その際発現構成体を患者に対しそのインビボ翻訳のため直接に投与することができる［たとえばＥＰＡ公開第３３６，５２３号（ドレアノ等、１９８９年１０月１１日付け公開）参照］。或いは、検体の細胞もしくは組織に発現構成体を生体外からトランスフェクトさせると共に形質転換材料を宿主中に再導入して、遺伝子移動を行うこともできる。構成体を宿主生物にたとえば注入によって直接導入することができる［国際特許公開ＷＯ／９０／１１０９２号；およびウォルフ等（１９９０）、サイエンス、第２４７巻、第１４６５〜１４６８頁）参照］。リポソーム媒介遺伝子移動は公知方法を用いて行うこともできる［たとえばハジンスキー等（１９９１）、Am．J．R espir．Cell．Mol．Biol.、第４巻、第２０６〜２０９頁；ブリガム等（１９８９）、アメリカン・ジャーナル・メジカル・サイエンス、第２９８巻、第２７８〜２８１頁；カノニコ等（１９９１）、クリニカル・リサーチ、第３９巻、第２１９Ａ頁；およびナベル等（１９９０）、サイエンス、第２４９巻、第１２８５〜１２８８頁参照］。たとえば特定細胞種類で発現された表面抗原に指向する抗体のような標的剤をリポソーム表面に共有結合させて、核酸を特定組織および細胞に局部投与のため供給することができる。発現構成体を宿主生物に導入した後、動物を熱処理して所望蛋白質の産生をたとえば通気培養器荷より刺激することができ、たとえばＥＰＡ特許公開第３３６，５２３号（ドレアノ等、１９８９年１０月１１日付け公開）に記載されている。或いは動物を発熱誘発剤または他のストレス作用剤に露呈してｈｓｐプロモータを誘導させることもできる。Ｃ．実験本発明を実施する特定具体例につき、実施例を以下に示す。これら実施例は例示の目的であって、本発明の範囲を決して限定することを意図しない。使用する数字（たとえば量、温度など）に関し正確を期するよう努力したが、或る程度の実験誤差および偏差も認めるべきことは勿論である。材料および方法酵素は市販の供給源から購入し、製造業者の指示に従って使用した。放射性ヌクレオチドおよびニトロセルロースフィルタも市販の供給源から購入した。特記しない限りＤＮＡ断片のクローン化に際し、全てのＤＮＡ操作は標準法に従って行った［サムブルック等、上記参照］。制限酵素、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノー断片および他の生物学的試薬は産業供給業者から購入し、その製造業者の指示に従って使用した。二本鎖ＤＮＡ断片はアガロースゲルで分離した。細胞およびＤＮＡトランフェクションマジン・ダルビーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞（ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．ＣＣＬ２２）を、１０％胎児ウシ血清が補充された最小必須培地（ＭＥＭ）にて増殖させた。一時的ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介のＤＮＡトランフェクションはクリーグラーにより記載されたように行った［Ｍ．クリーグラー（１９９０）、ジーン・トランスファー・アンド・エックスプレッション（ストックトン・プレス社）］。安定なトランスフェクションは、５μｇのＤＮＡと４０μｇのリポフェクチン［Ｐ．Ｌ．フェルグナー等（１９８７）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８４巻、第７４１３〜７４１７頁］を４×１０⁶細胞につき用いて行った。ネオマイシン耐性のクローン（約２０／μｇＤＮＡ）を６６６μｇ／ｍＬＧ４１８の存在下での増殖により選択し［Ｆ．フェーラー等（１９９２）、ジャーナル・バイロロジー、第６６巻、第８３１〜８３９頁］、次いで４００μｇ／ｍＬに維持した。分泌ｇＩＶのモノクローナル抗体分析間接的ＥＬＩＳＡを用いて、従来記載されているようにｇＩＶの収率を決定した［ファン・ドルンネン−リテル−Ｓ．ファン・デン・ハーク等、上記］。ＭＤＢＫ細胞により分泌される切断ｇＩＶの抗原性を、トランスフェクトされたＭＤＢＫ細胞および組換ワクチンウィルス感染ＢＳＣ−１細胞からの当量のｇＩＶを含有する培地を一連希釈しかつプレートに吸着させて用いる間接的ＥＬＩＳＡ分析で評価した。ワクチン産生およびＢＨＶ−１産生の全長ｇＩＶの反応性を予め比較して同一であることが判明した［ファン・ドルンネン−リデル−Ｓ．ファン・デン・ハーク等、ワクチン（出版中）］。個々のまたは混合したｇＩＶ−特異性のモノクローナル抗体に続き西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを従来記載されているように検出につき用いた［ドルンネン−リテル− Ｓ．ファン・デン・ハーク等（１９８４）上記；Ｇ．ヒュー等、上記］。実施例１ウシｈｓｐ７０プロモータのクローン化および同定 λ ＥＭＢＬ３Ａ［Ａ．Ｍ．フリシャウフ等（１９８３）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１７０巻、第８２７頁］における全部で３×１０⁶プラークのウシゲノム保存物を、ヒトｈｓｐ７０ｃＤＮＡクローン（ｐＨ２．３）［Ｂ．ウー等（１９８５）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第５巻、第３３０〜３４１頁］から作成されたプローブにより極めて厳密にスクリーニングした。５種の陽性クローンを選択して拡大させた。これらクローンの３種は、λ相が通過に際し喪失したので不安定であった。残り２種のクローンは同一であり、したがってクローン的に近縁であると思われる。これらの一種をさらに分析するため選択した。このクローンにおけるゲノム挿入物の制限マップを第１ａ図に示す。ヒトｈｓｐ７０ｃＤＮＡクローンの断片を用いるサウザンブロット分析を使用して、ヒトｈｓｐ７０ｍＲＮＡの５′−末端に対しホモロジーを有するウシゲノムクローンの断片を同定した。このＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片を、一層詳細に制限酵素分析して配列決定すべくｐＢＳＫＳＩＩ＋にサブクローン化した［ストラタジーン；Ｍ．Ａ．アルティング・ミースおよびＪ．Ｍ．ショート（１９８９）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１７巻、第９４９４頁］。ｐＢＳＫＳＩＩ＋におけるＤＮＡ挿入物をＴ７配列決定用キット（ファルマシア社）および³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（アメルシャム社）を用いる変性二本鎖雛型として配列決定した。反応生成物を標準法により分析した。データを解析すると共に配列分析ソフトウェア［ＩＢＩ、インテリジェネティックス・インコーポレーション社］によりジェネバンク・ファイルと比較した。ＤＮＡ配列は全て、雛型を各方向に少なくとも１回読取って決定した。第１ｂ図における位置２０００と３３００との間に示された全１３１５ｂｐＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片をこの手法により配列決定した。最後の７５０ｂｐの配列を第２図に示し、これをヒトｈｓｐ７０Ａ遺伝子の対応領域と比較した。位置６６７〜７５０からの配列は部分開放読枠を構成する。配列の翻訳は、２８個のコード化されたアミノ酸のうち２５個がヒトｈｓｐ７０Ａ蛋白質の最初の２８個のアミノ酸と同一であることを示した［Ｃ．ハントおよびＲ．Ｉ．モリモト（１９８５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第６４５５〜６４５９頁］。ＴＡＴＡＡＡ枠（転写ファクターＩＩＤ結合部位と予想される）は位置４３６に位置する。ヒトおよびウシプロモータは−７９および＋２０位置にわたり約７０％のホモロジーを有すると思われる。ウシｍＲＮＡの５′−ＵＴＲは長さ約２００個のヌクレオチドであるのに対しヒトｈｓｐ７０ｍＲＮＡについては２１５個のヌクレオチドであって、この領域のヒトＲＮＡに対し６０％のホモロジーを有する。プロモータの一般的構成はヒトｈｓｐＡ７０プロモータに類似する［Ｇ．Ｔ．ウィリアムスおよびＲ．Ｉ．モリモト（１９９０）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１０巻、第３１２５頁；アブラバヤ等（１９９１）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第１１巻、第５８６〜５９２頁］。位置３１５とＴＡＴＡＡＡ要素との間のヒートショック要素（ヒートショックファクター結合部位、ＨＳＥ）ＣＣＡＡＴ枠［ＣＣＡＡＴ枠結合転写ファクター（ＣＴＦ）結合部位］、プリンリッチ要素およびＧＣ要素（Ｓｐ１ファクター結合部位）の相対位置はヒトプロモータにおけるこれら領域の位置と同一であって、この領域にわたり８６％の配列同一性を有する。共通ヒートショック要素は、現在ヘッド対ヘッドもしくはヘッド対テールの配向にて配列ＮＧＡＡＮの３個もしくはそれ以上の完全もしくは不完全反復として規定される［Ｊ．Ｔ．リス等（１９９０）、「生物学および医薬におけるストレス蛋白質」、Ｒ．Ｉ．モリモト等編、（コールド・スプリング・ハーバー・プレス社）］。ウシｈｓｐ７０上流領域は、これら基準に合致する３個の部位を有する。その２個は位置２６５〜２８７および位置３５０〜３７２に存在し、ここではウシおよびヒト配列がほぼ同一である。これら２種の後者におけるＮＧＡＡＮ反復は、インビボの足指紋実験にて保護されることが示された［Ｋ．アブラバヤ等、上記］。ＮＧＡＡＮ要素の第２クラスタは、対応のヒト配列が存在しない領域にて位置３〜２４でウシ配列に見られる。この領域における５個のＮＧＡＡＮ型反復のうち３個は、互いに共通ヒートショック要素（位置１２〜２４）に対し正確な間隔を有する。これらの結果は、ヒトｈｓｐ７０Ａ遺伝子のウシ同族体におけるプロモータ領域が分離されかつ配列決定されたことを示す。この遺伝子はヒトｈｓｐ７０Ａ遺伝子に類似する。ウシｈｓｐ蛋白質の最初の２８個のアミノ酸はヒトｈｓｐ７０蛋白質に対し９０％の同一性を示す。プロモータ領域は、識別可能な転写ファクター結合部位の保持とその相対的な間隔とを示す（第２図）。実施例２ＢＨＶ−１ｇＩＩＩおよびｇＩＶの発現プラスミド作成ウシｈｓｐ７０Ａ５′−ＵＴＲおよびヒトｈｓｐ７０Ａ３′−ＵＴＲを有する構造物における異種蛋白の発現を指令するウシｈｓｐ７０Ａヒートショックプロモータの能力を、２個のＢＨＶ−１グリコ蛋白の分泌型をコードする配列を用いて次のように試験した。ｈｓｐ７０開放読枠の翻訳開始コドンを配列決定により位置決めした後、プライマをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のため合成した。このＰＣＲは、第１ｂ図に示したＳａｌＩ部位で出発すると共にＮｃｏＩ部位で停止する５３０ｂｐプロモータ断片を産生し、ｈｓｐ７０Ａ遺伝子のＡＴＧ開始コドンを有する。より長い上流領域を有するプラスミドを、前記断片を上流ｈｓｐ７０断片に対しＳａｌＩ部位を介し再結合させて作成した。分泌型の蛋白質をコードするＢＨＶ−１ｇＩＩＩ遺伝子を、全部で３個の読枠およびＳｐｅＩ部位に停止コドンを有するリンカーが経膜アンカーの直ぐ上流のＳｐｌＩ部位に挿入されたアミノ酸４６５で蛋白質を停止するプラスミドから得た［Ｄ．フィッツパトリック等（１９８９）、バイロロジー、第１７３巻、第４６〜５７頁］。ＳｐｅＩおよびＣｌａＩ末端を有するヒトｈｓｐ７０Ａ３′−ＵＴＲ断片を、ＰＣＲによりプラスミド（ｐＨ２．３）から得た［Ｂ．ウー等（１９８５）、モレキュラ・セルラ・バイオロジー、第５巻、第３３０〜３４１頁］。これを切断ｇＩＩＩコード化配列の背後に入れてプラスミドｐ３ＫＨＳＰＧ３ＨＵを得た。このプラスミドは３ｋｂのウシｈｓｐ７０上流配列を有し、これはウシｈｓｐ７０５′−ＵＴＲを含むと共に、ウシｈｓｐ７０蛋白質と正確に同じ位置にＢＨＶ−１蛋白開始コドンを有する。分泌型のＢＨＶ−１ｇＩＶをコードするＤＮＡ断片を、５′−末端を開始コドンにてＮｃｏＩ部位に改変すると共に３−枠停止コドンリンカーを経膜アンカーの直ぐ上流のＳａｃＩＩ部位に挿入してアミノ酸３２０にて蛋白質を停止させることにより得た［Ｔ．Ｋ．チコー等（１９９０）、ジャーナル・バイロロジー、第６４巻、第５１３２〜５１４２頁］。この断片を用いてｇＩＩＩ配列をｐ３ＫＨＳＰＧ３ＨＵに置換し、ｐ３ＫＨＳＰＧ４ＨＵを得た。安定にトランスフェクトされた細胞ラインを発生させるためのプラスミドを、ｐＳＶ２ＮＥＯ［Ｐ．Ｊ．サウザンおよびＰ．ベルグ（１９８２）、モレキュラ・アンド・アプライド・ジェネティックス、第１巻、第３２７〜３４１頁］からアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を発現させるためのカセットをヒトｈｓｐ７０３′−ＵＴＲの直ぐ背後にて上記構造物に挿入することにより作成し、それぞれ切断ｇＩＩＩおよびｇＩＶのコード化配列を含むプラスミドｐＧ３ＨＵＮＥＯおよびｐＧ４ＨＵＮＥＯ（ＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９０７５および６９０７６）を得た。これら全ての構造物のためのＤＮＡ骨格はプラスミドｐＰＯＬ２６によって与えられた［Ｈ．Ｊ．ジョージ等（１９８７）、バイオテクノロジー、第５巻、第６００〜６０３頁］。実施例３プラスミドｐ３ＫＨＳＰＧ３ＨＵおよびｐ３ＫＨＳＰＧ４ＨＵを用いるＢＨＶ−１ｇＩＩＩおよびｇＩＶの発現ウシｈｓｐ７０Ａプロモータおよび５′−ＵＴＲ、並びにヒトｈｓｐ７０Ａ３′−ＵＴＲにより始動されるそれぞれｇＩＩＩおよびｇＩＶ遺伝子を有するプラスミドｐ３ＫＨＳＰＧ３ＨＵおよびｐ３ＫＨＳＰＧ４ＨＵからＢＨＶ−１グリコ蛋白を発現および分泌させるための一時的分析を次のように行った。ＭＤＢＫ細胞を、材料および方法の項で説明したようなＤＥＡＥ−デキストラン法により上記発現構成体で形質転換させた。一時的にトランスフェクトされた細胞培養物を２回洗浄して血清を除去すると共に、血清フリーＭＥＭもしくはオプチＭＥＭＩ（ギブコ社）の最少容積（５ｍＬ／７５ｃｍ²）にて３７℃または４３℃でインキュベートした。インキュベート時間の終了後、培地を集めて２０００×ｇで５分間遠心分離することにより細胞および残骸を除去した。培地を透析すると共に凍結乾燥させた。これら試料を変成させると共に、７．５％ミニプロテインゲル（ビオラド社）における電気泳動により解像させ、蛋白質をウエスタンブロットにより検出した。一次抗体は、ＢＨＶ−１ｇＩＩＩもしくはｇＩＶ蛋白質のいずれかに対しモノクローナル抗体プールの１：２０００希釈とした［ファン・ドルンネン・リテル−Ｓ．ファンデン・ハーク等（１９８４）、バイロロジー、第１３５巻、第４６６〜４７９頁；Ｇ．ヒュース等（１９８８）、アーカイブス・オブ・バイロロジー、第１０３巻、第４７〜６０頁］。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧとした。ＭＤＢＫ細胞にてＢＨＶ−１グリコ蛋白を発現および分泌させるための一時的分析の結果を第３図に示す。第３ａ図はプラスミドｐ３ＫＨＳＰＧ３ＨＵからの切断ｇＩＩＩの発現を示す。レーン１〜５は時間間隔の開始時点で洗浄細胞に添加された細胞培養培地の分析を示す（下記する）。レーン６〜９は細胞抽出物の１０％の分析を示す。レーン１および６は未トランスフェクト細胞を示し；レーン２および７は３７℃、３時間を示し；レーン３および８は４３℃、３時間を示し；レーン４は４３℃、３時間（その後に細胞を洗浄して３７℃、２時間で処理した）を示し；レーン５および９は４３℃、６時間を示す。４個の顕著なマーカバンド（番号なしのレーン）は、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼで検出された１１６、９７、６６および４５ｋＤａのビオチニル化分子量マーカに対応する。基礎レベル合成は検出可能であった（レーン２）が、４３℃まで移動すれば著量のｇＩＩＩを培地で産生した（レーン３）。４３℃にて３時間でなく６時間の後（レーン５）、培地には一層多量のｇＩＩＩ蛋白質が存在し、これは分泌の過程が４３℃にて３時間以上持続したことを示す。分泌は、レーン６〜９で検査した細胞抽出物がｇＩＩＩの細胞内蓄積の証拠を示さなかったので効率的であると思われた。ｐ３ＫＨＳＰＧ４ＨＵからの切断ｇＩＶの発現を第３ｂ図に示す。レーン１は、ワクチニアウィルス発現系で合成および分泌された精製切断ｇＩＶ蛋白質を示す。レーン２〜５はｐ３ＫＨＳＰＧ４ＨＵでトランスフェクトされたＭＤＢＫ細胞を示す。細胞培養培地を２４時間後に分析した。細胞を洗浄すると共に３７ ℃（レーン２および４）または４３℃（レーン３および５）にてブレフェルジンＡなし（レーン２および３）または２．５μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（レーン４および５）を有する培地で２時間インキュベートした。細胞を３７℃もしくは４３℃でインキュベートする前に薬物で１時間にわたり予備インキュベートした。³⁵Ｓ−メチオニンが酸沈澱性物質に混入する速度は、８μｇ／ｍＬ程度のブレフェルジンＡの濃度により影響を受けなかった。４個の顕著なマーカバンド（番号なしのレーン）は、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼで検出された１１６、９７、６６および４５ｋＤａのビオチニル化分子量マーカに対応する。ここでも、合成の基礎レベルは検出可能であった（レーン２）。４３℃、３時間への移行は、培地における蛋白質量の激増を生ぜしめた（レーン３）。レーン４および５は、培地におけるｇＩＶの存在が実際に分泌の結果であって細胞の脱着および溶解の結果でないことを示す。何故なら、ブレフェルジンＡ、すなわち小胞体とゴルジ装置との間の移動の特異的抑制剤がこの過程を阻止するからである（レーン４および５）。レーン２〜５におけるｇＩＶの直ぐ上に出現するバンドは残留ウシ血清アルブミンであって、細胞を洗浄することにより除去されない。実施例４プラスミドｐＧ３ＨＵＮＥＯおよびｐＧ４ＨＵＮＥＯで安定にトランスフェクトされたＭＤＢＫ細胞からのＢＨＶ−１ｇＩＩＩおよびｇＩＶの持続制御された発現および分泌実施例２からのプラスミドｐＧ３ＨＵＮＥＯおよびｐＧ４ＨＵＮＥＯ（それぞれＡＴＣＣ受託Ｎｏ．６９０７５および６９０７６）からのｇＩＩＩおよびｇＩＶの発現および分泌を次のように試験した。これらプラスミドは、それぞれウシｈｓｐ７０Ａプロモータおよび５′− ＵＴＲ、ヒトｈｓｐ７０３′−ＵＴＲ、並びにアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードするカセットにより始動される切断ｇＩＩＩおよびｇＩＶのコード化配列を含む。ＭＤＢＫ細胞を上記したようにトランスフェクトすると共に処理して、Ｇ４１８に対し耐性の安定な細胞ラインを発生させた。各構造物により同数の薬物耐性クローンを得た。３７℃または４３℃のいずれかで上記したようにインキュベートした後、安定にトランスフェクトされたクローンからの培地をゲル分析のため４倍濃縮し（第４ａ図）、或いは未希釈のままにした（第４ｂ図、第１表）。ドット免疫ブロット分析を培地で行った。試験した１６０種のネオマイシン耐性クローンのうち、１００種がグリコ蛋白合成および分泌につき熱誘導性であると判明した。残余は両温度にて陰性であった。各クローンはグリコ蛋白の成生量および基礎レベルと誘導蛋白レベルとの間の比が変化した。ｇＩＩＩ−およびｇＩＶ −成生クローンにつき発現表現型の分布には差が観察されなかった。７種のｇＩＶ−成生クローンの誘導特性を８０回の細胞倍化により追跡し、顕著な変化がなかった。１種のｇＩＶクローン（ＭＧ４−５７と称する）を長時間にわたりグリコ蛋白の合成および分泌につき試験した。クローンＭＧ４−５７は、１５０ｃｍ²フラスコにおける４％血清含有培地にて増殖融合し（４×１０⁷細胞）、フラスコを１０ｍＬの血清フリー培地で４３℃にて８日間にわたり（８サイクルを示す）毎日６時間インキュベートした。この培地をｇＩＶの収率につき試験し、これを第４図に示す。培養物は４３℃にて６時間につき７５μｇ／１５０ｃｍ²の量（４×１０⁷細胞）にてｇＩＶを産生し、ｇＩＶを合成および分泌する能力は８サイクル後にも減少しなかった。ｇＩＩＩ分泌性クローンでの平行実験にて定量的に類似する結果が観察された。その後の実験は、３７℃への温度の低下がＭＧ４−５７細胞ラインによるｇＩＶの合成の即時停止をもたらさないことを示した。その結果、４３℃にて６時間のヒートショックを２４時間毎に１回行うことにより最良の収率が得られ、これら細胞を血清フリーの培地に保つと共に、この培地を２４時間に１回変化させた（ヒートショックの直前）。この培地はｇＩＶを１０〜１５μｇ／ｍＬのレベルで含有し、実験を２１時間にわたりさらに続けた。したがって全収率は２１日間×１３ｍＬ× １０〜１５μｇ／ｍｌ＝フラスコ１５０ｃｍ²当り３〜４ｍｇまたは４×１０⁷細胞であった。これらの結果および実施例３の結果は、ウシｈｓｐ７０Ａ遺伝子が組換ＢＨＶ −１グリコ蛋白の熱制御発現にて機能的であり、したがってウシヒートショック同族体もしくは偽遺伝子でない。さらに、これらの結果は、構造物が一時的トランスフェクションにおいて温度の上昇および低下の両者に応答することをも示す。安定にトランスフェクトされたこれら構造物で作成される細胞ラインは、熱制御可能な発現を有する高比率のクローンを示す。実施例５発現プラスミドｐＧ４ＨＵＮＥＯにより産生されたｇＩＶの抗原真正性実施例４に記載した安定にトランスフェクトされたＭＤＢＫ細胞により分泌される切断ｇＩＶを、全長ｇＩＶの連続および不連続エピトープの両者に向けられる一連のモノクローナル抗体と反応させた［ファン・ドルンネン−リデル−Ｓ．ファン・デン・ハーク等（１９８４）、上記；Ｇ．ヒュース等（１９８８）、上記］。その結果を第１表に示す。反応性は、ワクチニアウィルス発現系で産生された切断および全長ｇＩＶの反応性とは顕著に相違しなかった。後者の２種の蛋白質を真正の全長ＢＨＶ−１ｇＩＶと比較し、ウシにて現場試験し、ＢＨＶ−１感染に対し極めて保護性であると判明した［ファン・ドルンネン・リテル−Ｓ．ファン・デン・ハーク等、ワクチン（出版中）］。ＢＨＶ−１ｇＩＶは、天然型のこの蛋白を発現する安定的にトランスフェクトされた細胞ラインを分離するのが極めて困難であるという観察に基づき細胞毒性を有することを幾つかの報告が示唆している［Ｆ．フェーラー等（１９９２）、ジャーナル・バイロロジー、第６６巻、第８３１〜８３９頁］。ｈｓｐ７０Ａプロモータは３７℃にて基礎的活性を示すが（第３図参照）、生成物の細胞毒性は分泌された切断型の蛋白質を用いて解消された。安定クローンの個数およびｇＩＩＩとｇＩＶとを発現する構造物間の誘導性発現特性には差が観察されなかった。特定の理論に拘束されるものでないが、ｇＩＶの細胞毒性は膜におけるその位置に依存するか或いは切断型にて喪失する構成の維持に依存することが推測される。しかしながら、ここに示したように、蛋白質と数種のモノクローナル抗体との反応性は実質的に変化せず、これは効果的なワクチン免疫源であることを示唆する。要するに、この発現系はワクチンの生産につき重要な実際的利点を有する。４ ×１０⁷定常期細胞の１本の１５０ｃｍ²フラスコは、温度変化および培地回収を含む最小の操作にて約３〜４ｍｇの抗原（約２５０回分）を生産することができる。この生産は８回の温度移行サイクルの後にも直線的であり、この手法の拡張および最適化が収率を向上させると思われる。さらに、この結果はトランスフェクトされた細胞を定常期に長時間にわたり維持しうると共に組換蛋白質の産生能力を保持することを示す。比較として、最も生産性の高い哺乳動物に基づく入手可能な発現系の１種であるコンセンサス強力後期ウィルスプロモータに基づくワクチニア／ＢＳＣ−１系は、前記量の２倍しか分泌ｇＩＶを生産しなかった［ファン・ドルンネン・リテル− Ｓ．ファン・デン・ハーク（出版中）、上記］。実施例６キイロショウジョウバエ３′−ＵＴＲを用いる代案ＢＨＶ−１発現プラスミドの作成上記と同様に発現プラスミドを作成したが、ただし切断ＢＨＶ−１ｇＩＩＩ遺伝子を用いると共にヒト３′−ＵＴＲの代りにｐ１７３０Ｒ［Ｒ．フェルミー等（１９８５）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第４９４９〜４９５３頁］から得られたキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogastor）ｈｓｐ７０３′−ＵＴＲを用いた。ウシｈｓｐ７Ａ０プロモータと５′−ＵＴＲと切断ｇＩＩＩ遺伝子とキイロショウジョウバエ３′−ＵＴＲとで構成される得られたプラスミドｐＧＩＩＩＡＤＵを、実施例３に記載したようにＭＤＢＫ細胞にトランスフェクトさせた。培養物をトランスフェクトしてから２４時間後にヒートショックにかけ、培地と細胞抽出物とを実施例３に記載したようにウエスタンブロットにより分析した。全ての検出可能なｇＩＩＩが培地に存在し、これは蛋白質が実際に発現および分泌されたことを示す。３７℃におけるｇＩＩＩの低い基礎合成レベルも見られた。４３℃への細胞の移行は、恐らくウシｈｓｐ７０Ａプロモータおよび関連５ ′−ＵＴＲにより始動される効率的な転写および翻訳の誘導に基づき、合成および分泌の高い誘導をもたらした。分泌は４３℃にて少なくとも３〜６時間にわたり効率的に進行した。この実験は、ウシｈｓｐ７０Ａプロモータおよび５′−ＵＴＲがキイロショウジョウバエ３′−ＵＴＲと一緒にトランスフェクト細胞におけるＢＨＶ−１グリコ蛋白の制御発現を効果的に指令することを示す。実施例７大腸菌β−ガラクトシダーゼの熱制御合成原核性蛋白質を発現するウシｈｓｐ７０Ａプロモータの能力を、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＬａｃＺ遺伝子を用いて試験した。上記した第１ｂ図に示すｈｓｐ７０Ａ遺伝子のＡＴＧ開始コドンをＬａｃＺ配列を有するプラスミドｐＰＯＬ２６［Ｈ．Ｊ．ジョージ等（１９８７）、バイオテクノロジー、第５巻、第６００〜６０３頁］に組込むＳａ１Ｉ−ＮｃｏＩ断片をクローン化してプラスミドを作成した。このコード化配列の直後に翻訳停止コドンおよびＳＶ４０小型ｔイントロンとポリアデニル化信号とが続く。この構成体をＤＥＡＥ−デキストラン媒介ＤＮＡトランスフェクションにより上記したようにＭＤＢＫ細胞に導入した。β−ガラクトシダーゼ産生を、固定細胞に対するＸ−ｇａｌの付加および細胞抽出物におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析により組織化学的に監視した。実験は、ウシｈｓｐ７０プロモータが同じ目的でＳＶ４０早期プロモータを用いてプラスミドにより産生される量よりも２０倍多い量のβ−ガラクトシダーゼの産生を指令したことを示した。実施例８ｈｓｐ７０プロモータを用いるＢＶＤＶｇｐ５３の発現ＢＶＤＶは陽性ストランドＲＮＡウィルスである。したがって、ｇｐ５３遺伝子を感染細胞から作成されたＲＮＡの逆転写によりクローン化させ、次いでポリメラーゼ連鎖反応を行ってＤＮＡを拡大させた。ＰＣＲプライマは、ＮＡＤＬストレイン配列におけるアミノ酸６６６の前の開始コドン、並びにアミノ酸１０３６の後の停止コドンおよびＳａ１Ｉ部位を組込むＮｃｏＩ部位を与えるよう設計した。このＤＮＡをＢＨＶ−１ｇＩＶコード化配列でなくｐＧ４ＨＵＮＥＯに挿入した。得られたプラスミド（ｐＧＰ５３ＨＵＮＥＯと称する）をウシＭＤＢＫ細胞にトランスフェクトさせ、上記したように切断ｇｐ５３（ｔｇｐ５３）を得た。安定にトランスフェクトされたＭＤＢＫ細胞におけるｔｇｐ５３の産生をインキュベーション温度を４３℃まで６時間かけて上昇させることにより誘導させ、その後に細胞を３７℃にて２〜４日間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、細胞培養培地を集め、１５００×ｇで５分間にわたり遠心分離して細胞および残骸を除去した。分泌されたｔｇｐ５３を、アフィゲル１０（登録商標）（ビオラド社）に結合したｇｐ５３に対するモノクローナル抗体のカラムを用いる免疫親和性クロマトグラフィーにより上澄液から精製した［Ｊ．Ｖ．ファン・デン・ハークおよびファン・ドルンネンーリテル−Ｓ．ファン・デン・ハーク（１９９２）、アーカイブス・オブ・バイロロジー、第１２６巻、第１９５〜２１３頁］。ｔｇｐ５３の濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。２匹のウサギを１０μｇの親和性精製ｔｇｐ５３で２回免疫処理した。２匹の動物は、広範な種類のＢＶＤＶストレインに対しウィルス中和性抗体を発生した（第２表に示す）。実施例９ｈｓｐ７０プロモータを用いるフォリスタチンの発現生物学上活性なブタフォリスタチンを、ウシヒートショックプロモータを用いて次のように産生させた。トランスフアプラスミドｐＧＥＭ−ＦＳを、発情サイクルの黄体期における雌ブタより得られた２ｇの卵巣組織からＲＮＡを分離して作成した。ＰＣＲプライマーはフォルスタチンｃＤＮＡ配列を拡大するよう設計し、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応の生成物をｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）にクローン化させた［プロメガ社、ネピアン、オンタリオ］。大腸菌株ＪＭ１０９［ストラタジーン社、ラ・ヨラ、ＣＡ］の形質転換によりｐＧＥＭ−ＦＳを得た。クローン化されたプラスミドの確認は、制限エンドヌクレアーゼ地図化および一本鎖ＤＮＡ配列決定により行った。フォリスタチン遺伝子を有するｐＧＥＭ−ＦＳをＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで切断すると共にヒートショック発現プラスミドｐＧ４ＨＵＮＥＯ（実施例２）に結合させ、ＢＨＶ−１ｇＩＶコード化配列を置換してｐＦＳＨＵＮＥＯにした。ＭＤＢＫ細胞を、上記ＤＥＡＥ−デキストラン法によりｐＦＳＨＵＮＥＯで形質転換させた。ネオマイシン耐性クローンを、６６６μｇ／ｍＬのＧ４１８（ネオマイシン類似体）の存在下での増殖により選択した。安定な細胞ラインを２回の単一細胞クローン化の後に選択した。形質転換されたＭＤＢＫ細胞を４３℃における６時間のヒートショックにかけ、次いで３７℃にて１８時間培養した。上澄液を回収し、使用するまで凍結貯蔵した。免疫学的活性分析のため、２５０μＬのヒートショックされたｐＦＳＨＵＮＥＯ形質転換細胞からの培地を４０倍濃縮し、次いで１０％レムリゲルにおけるＳＤＳＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロットを作成した。これらブロットをウサギ抗ブタフォルスタチン［リング博士、ウィッチアー・インスチチュート、ラ・ヨラ、ＣＡから入手］で試,験し、抗体結合をペルオキシダーゼ結合の二次抗体および４−クロルナフトール比色試薬を用いて可視化させた。これらブロットは、組換フォリスタチンがブタフォリスタチンに対するウサギ抗血清と反応することを確認した。インビトロ前側下垂体細胞培養系を用い生物学的活性を測定した。要するに、前側下垂体組織を、腟洗浄により決定される発情前期の雌スプラグ・ドーリー・ラットから剔出した。下垂体組織を１〜２ｍｍ片に切断し、１８５００単位のコラゲナーゼ（タイプ１１、シグマ社）と５００単位のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ１、シグマ社）と０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社）とを含有するカルシウムおよびマグネシウムのないハンクス（ＣＭＦＨ）溶液に懸濁させ、絶えず撹拌しながら３７℃にて１．５時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後、組織を無菌のシリコン処理したパッスールピペットにより約２０回吸入して分散させた。さらに３０分間にわたりインキュベートした後、組織懸濁物を２００×ｇにて８分間にわたり遠心分離した。上澄液をデカントし、組織をさらに１×パンクレアチン（パンクレアチン４×ＮＦ、ギブコ社）と５００単位のＤＮアーゼ１と０．１％のＢＳＡとを含有するＣＭＦＨにて２０分間インキュベートした。残余の組織を再懸濁させ、上記したように遠心分離した。上澄液をデカントし、０．１％のＢＳＡと５００単位のＤＮアーゼ１と１ｍＬのアポプロチニン（シグマ社）とを含有する１ｍＬのＭＥＭを細胞ぺレットに添加した。このペレットを直ちに再懸濁させ、室温にて２分間インキュベートした後、１０ｍＬのＭＥＭと０．１％のＢＳＡを添加した。この溶液を上記のように遠心分離し、２回洗浄し、次いで生存細胞を計数した。６×１０⁵個の細胞を、６０μＬのマトリゲル（コラボラチブ・バイオメジカル・プロダクツ社、ベッドフォード、ＭＡ）の１：４希釈物を含有する１０％ＦＢＳが補充されたＭＥＭに塗沫して１晩インキュベートした。培地を、ＦＢＳを含有しないＭＥＭで置換した。６時間の後、１０ｎＭのＧｎＲＨ（シグマ社、セントルイス、ＭＯ）を各穴に添加した。１〜１／２時間の後、３００μＬのヒート・ショックされたｐＦＳＨＵＮＥＯトランスフェクトＭＤＢＫ細胞からの上澄液を各穴に添加した。細胞培養物を１晩インキュベートし、その後に上澄液を取り出し、ＦＳＨ活性につき分析するまで凍結貯蔵した。ＦＳＨ放射線免疫分析キットはナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルスから入手した。この分析の結果は、組換ＦＳが生物学上活性であり、下垂体細胞によるＦＳＨ分泌を抑制することを示した。以上、新規なウシｈｓｐ７０プロモータおよび効率的発現系におけるプロモータの使用につき説明した。本発明の好適実施例につき詳細に説明したが、本発明の思想および範囲を逸脱することなく多くの改変をなしうることが了解されよう。本発明を実施するのに有用なストレインの寄託以下のストレインの生物学上純粋な培養物の寄託は国際寄託機関アメリカン・タイブ・カルチャー・コレクション、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランドに対しブタペスト条約にしたがって行った。示した受託番号が生存試験の成功により与えられ、必要な経費を支払った。これら培養物およびそれに関する情報の入手はブタペスト条約の規則１１およびこの規則に示された条件にかなう機関、自然人および法人に与えられる。示した寄託物は、寄託日から少なくとも３０年間にわたり或いは寄託の最終的要請後の５年間にわたり維持される。培養物が生存しなくなった場合または不注意に損壊された場合、或いはプラスミド含有株がそのプラスミドを喪失した場合は、同じ分類学的説明を有する生存培養物で補充される。これら寄託物は当業者に対する便利さのためであって、寄託が要求されたことを承認するものでない。これらプラスミドの核酸配列、並びにこれによりコードされたポリペプチドのアミノ配列は、その説明と矛盾する場合は制限される。寄託物の作成、使用または販売には許諾が必要とされ、この種の許諾はここでは承認しない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１月１９日【補正内容】補正請求の範囲１．下流に位置する異種コード化配列の転写を指令しうる分離されたウシｈｓｐ７０Ａプロモータにおいて、プロモータが第２図の上側ストランドのヌクレオチド位置３５０〜４４１に示した配列に対し実質的に相同なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする分離されたウシｈｓｐ７０Ａプロモータ。２．前記プロモータが、第２図の上側ストランドのヌクレオチド位置２６５〜４４１に示した配列に対し実質的に相同なヌクレオチド配列を含む請求の範囲第１項に記載のプロモータ。３．前記プロモータが、第２図の上側ストランドのヌクレオチド位置１〜４４１に示した配列に対し実質的に相同なヌクレオチド配列を含む請求の範囲第２項に記載のプロモータ。４．第２図の上側ストランドのヌクレオチド位置４７６〜６６６に示した配列に対し実質的に相同なヌクレオチド配列を含む分離されたウシｈｓｐ７０Ａ５ ′−未翻訳領域。５．選択されたコード化配列の転写を指令するのに有効な組換発現構成体において：（ａ）選択されたポリペプチドのためのコード化配列と；（ｂ）前記コード化配列に作用結合した制御配列とからなり、前記コード化配列は宿主細胞で転写および翻訳されて前記選択ポリペプチドを産生し、さらに前記制御配列の少なくとも１つは前記コード化配列に対し異種であり、前記制御配列は（ｉ）前記コード化配列の上流に位置する請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載のウシｈｓｐ７０Ａプロモータと、（ｉｉ）前記プロモータの下流に位置するｈｓｐ７０５′−未翻訳領域（ここで５′−未翻訳領域はその３′末端にて翻訳開始コドンにより結合されると共に、その５′末端にてｈｓｐ７０Ａ転写開始部位により結合される）と、（ｉｉｉ）前記コード化配列の下流に位置する３′−未翻訳領域とからなることを特徴とする組換発現構成体。６．前記ｈｓｐ７０５′−未翻訳領域が、第２図の上側ストランドのヌクレオチド位置４７６〜６６６に示した配列に対し実質的に相同なヌクレオチド配列を含むウシｈｓｐ７０Ａ５′−未翻訳領域からなる請求の範囲第５項に記載の組換発現構成体。７．前記３′−未翻訳領域がｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第５項または第６項に記載の組換発現構成体。８．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がヒトｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第７項に記載の組換発現構成体。９．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がキイロショウジョウバエｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第７項に記載の組換発現構成体。１０．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がウシｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第７項に記載の組換発現構成体。１１．前記コード化配列が免疫原性ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ− １）ｇＩＩＩポリペプチドをコードする請求の範囲第５〜１０項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。１２．前記コード化配列が免疫原性ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ− １）ｇＩＶポリペプチドをコードする請求の範囲第５〜１０項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。１３．前記コード化配列が免疫原性ウシウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）ｇｐ５３ポリペプチドをコードする請求の範囲第５〜１０項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。１４．選択されたコード化配列の転写を指令するのに有効な組換発現構成体において：（ａ）第２図の上側ストランドのヌクレオチド位置１〜６６６に示した配列に対し実質的に相同なヌクレオチド配列を含むウシｈｓｐ７０Ａ制御配列と；（ｂ）前記制御配列に作用結合したコード化配列とからなり、前記コード化配列は宿主細胞にて転写および翻訳することができ、さらに前記制御配列の少なくとも１つは前記コード化配列に対し異種であることを特徴とする組換発現構成体。１５．前記コード化配列の下流に位置するｈｓｐ７０３′−未翻訳領域をさらに含む請求の範囲第１４項に記載の組換発現構成体。１６．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がヒトｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第１４項に記載の組換発現構成体。１７．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がキイロショウジョウバエｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第１４項に記載の組換発現構成体。１８．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がウシｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第１４項に記載の組換発現構成体。１９．前記コード化配列が免疫原性ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ− １）ｇＩＩＩポリペプチドをコードする請求の範囲第１４〜１８項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。２０．前記コード化配列が免疫原性ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ− １）ｇＩＶポリペプチドをコードする請求の範囲第１４〜１８項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。２１．前記コード化配列が免疫原性ウシウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）ｇｐ５３ポリペプチドをコードする請求の範囲第１４〜１８項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。２２．請求の範囲第５〜２１項のいずれか一項に記載の組換発現構成体で安定に形質転換された宿主細胞。２３．前記細胞が耐熱性細胞である請求の範囲第２２項に記載の宿主細胞。２４．前記耐熱性細胞がマジン・ダルビーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞である請求の範囲第２３項に記載の宿主細胞。２５．（ａ）請求の範囲第２２〜２４項のいずれか一項に記載の宿主細胞の集団を供給し；（ｂ）前記細胞の集団を前記コード化配列が発現される条件下で熱処理して前記組換ポリペプチドを産生させることを特徴とする組換ポリペプチドの産生方法。２６．前記組換ポリペプチドを前記宿主細胞から分泌させる請求の範囲第２５項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ギルバート、スコットカナダ国ティー１ジェイ３ズィー４アルバータ州レスブリッジボックス 640 スィー／オーアドリ（番地なし) (72)発明者ザブ、ティモスィージェイ. アメリカ合衆国 11733 ニューヨーク州セトーケットストロングズネックブリュースターレイン 31

Claims

【特許請求の範囲】１．下流に位置する異種コード化配列の転写を指令しうる分離されたウシｈｓｐ７０プロモータ。２．前記プロモータがウシｈｓｐ７０Ａプロモータである請求の範囲第１項に記載のプロモータ。３．前記プロモータが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド位置３５０〜４４１で示される配列に対し実質的に相同かつ機能的に均等なヌクレオチド配列を含む請求の範囲第２項に記載のプロモータ。４．前記プロモータが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド位置２６５〜４４１で示される配列に対し実質的に相同かつ機能的に均等なヌクレオチド配列を含む請求の範囲第２項に記載のプロモータ。５．前記プロモータが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド位置１〜４４１で示される配列に対し実質的に相同かつ機能的に均等なヌクレオチド配列を含む請求の範囲第２項に記載のプロモータ。６．分離されたウシｈｓｐ７０５′−未翻訳領域。７．前記領域がウシｈｓｐ７０Ａ５′−未翻訳領域である請求の範囲第６項に記載の５′−未翻訳領域。８．選択されたコード化配列の転写を指令するのに有効な組換発現構成体において：（ａ）請求の範囲第１〜７項のいずれか一項に記載のウシｈｓｐ７０制御配列と；（ｂ）前記制御配列に作用結合したコード化配列とを含み、前記コード化配列は宿主細胞にて転写および翻訳することができ、さらに前記制御配列の少なくとも１つは前記コード化配列に対し異種であることを特徴とする組換発現構成体。９．前記ウシｈｓｐ７０制御配列がウシｈｓｐ７０Ａプロモータとｈｓｐ７０５′−未翻訳領域とを含む請求の範囲第８項に記載の組換発現構成体。１０．ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域をさらに含む請求の範囲第８項または第９項に記載の組換発現構成体。１１．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がヒトｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第１０項に記載の組換発現構成体。１２．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がキイロショウジョウバエｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第１０項に記載の組換発現構成体。１３．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がウシｈｓｐ７０３′−未翻訳領域を含む請求の範囲第１０項に記載の組換発現構成体。１４．前記コード化配列が免疫原性ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ− １）ｇＩＩＩポリペプチドをコードする請求の範囲第８〜１３項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。１５．前記コード化配列が免疫原性ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ− １）ｇＩＶポリペプチドをコードする請求の範囲第８〜１３項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。１６．前記コード化配列が免疫原性ウシウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）ｇｐ５３ポリペプチドをコードする請求の範囲第８〜１３項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。１７．選択されたコード化配列の転写を指令するのに有効な組換発現構成体において：（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド位置１〜６６６で示される配列に対し実質的に相同かつ機能的に均等なヌクレオチド配列を含むウシｈｓｐ７０Ａ制御配列と；（ｂ）前記制御配列に作用結合したコード化配列とからなり、前記コード化配列は宿主細胞にて転写および翻訳することができ、前記制御配列の少なくとも１つは前記コード化配列に対し異種であることを特徴とする組換発現構成体。１８．前記コード化配列から下流に位置するｈｓｐ７０３′−未翻訳領域をさらに含む請求の範囲第１７項に記載の組換発現構成体。１９．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がヒトｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第１８項に記載の組換発現構成体。２０．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がキイロショウジョウバエｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第１８項に記載の組換発現構成体。２１．前記ｈｓｐ７０３′−未翻訳領域がウシｈｓｐ７０３′−未翻訳領域からなる請求の範囲第１８項に記載の組換発現構成体。２２．前記コード化配列が免疫原性ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ− １）ｇＩＩＩポリペプチドをコードする請求の範囲第１７〜２１項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。２３．前記コード化配列が免疫原性ウシヘルペスウィルス１型（ＢＨＶ− １）ｇＩＶポリペプチドをコードする請求の範囲第１７〜２１項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。２４．前記コード化配列が免疫原性ウシウィルス性下痢ウィルス（ＢＶＤＶ）ｇｐ５３ポリペプチドをコードする請求の範囲第１７〜２１項のいずれか一項に記載の組換発現構成体。２５．請求の範囲第８〜２４項のいずれか一項に記載の組換発現構成体で安定に形質転換された宿主細胞。２６．前記細胞が耐熱性細胞である請求の範囲第２５項に記載の宿主細胞。２７．前記耐熱性細胞がマジン・ダルビーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞である請求の範囲第２６項に記載の宿主細胞。２８．（ａ）請求の範囲第２５〜２７項のいずれか一項に記載の宿主細胞の集団を供給し；（ｂ）前記細胞の集団を前記コード化配列が発現される条件下で熱処理して前記組換ポリペプチドを産生させることを特徴とする組換ポリペプチドの産生方法。２９．前記組換ポリペプチドを前記宿主細胞から分泌させる請求の範囲第２８項に記載の方法。