KR101707668B1 - 열 스트레스 반응을 조절할 수 있는 한세눌라 폴리모르파 유래 신규 열 충격 인자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha)로부터 유래한 신규한 열 충격 인자(HpHSF1), 이를 코딩하는 핵산 분자, 이 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이 벡터를 포함하는 숙주 세포, 이 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 알코올 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)은 열 스트레스에 대응하는 유전자들의 발현을 조절함으로써 세포의 열 스트레스 내성을 크게 향상시킨다. 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)를 발현 가능한 상태로 갖는 숙주 세포는 열 스트레스에 대한 내성이 증가되어 에탄올 발효와 같은 발열 공정에 에탄올 생산 균주로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

열 스트레스 반응을 조절할 수 있는 한세눌라 폴리모르파 유래 신규 열 충격 인자 및 이의 용도{A Novel Heat Shock Factor From Hansenula Polymorpha Capable of Controlling Heat Stress Response and Use of the Same}

본 발명은 열 스트레스 반응을 조절하는 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자(Hansenula polymorpha Heat Shock Factor 1; HpHSF1), 이를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 알코올의 생산 방법에 관한 것이다.

세계의 바이오 에탄올 생산량의 70％ 이상이 미생물에 의한 발효에 의해 생산되고 있다. 알코올 생산 균주로는 세균으로서 Zymomonas mobilis가 알려져 있고, 산업적으로 이용되는 효모로서는 Saccharomyces 속, Schizosaccharomyces 속, Pichia 속, Hansenula 속, Torulopsis 속, Candida 속, Rhodotorula 속들이 알려져 있으며, 대부분 Saccharomyces 속의 효모가 주정공업에 사용되고 있다. 여러 효모 중, 출아 효모 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)는 성장률이 높을 뿐만 아니라 에탄올 발효 효율과 내성도 높은 편이라 현재 발효 공학적으로 생산되는 에탄올은 주로 이 균주에 의존하고 있다(Weber C. et al., Appl Microbiol Biotechnol, 87, 1303-1315, 2010). 에탄올은 석유를 대체할 수 있는 에너지 중에서 기능적으로나 경제적인 측면에서 가장 적합한 연료이다. 뿐만 아니라 공해 배출이 적어서 청정 에너지로써 환경 보호 측면에서 적극적으로 검토되고 있다. 종래의 에탄올 발효는 가용성 당분만을 이용하여 생산해 왔으나, 최근 남아돌고 있는 식물성 섬유소나 헤미셀룰로오스(hemicellulose)를 이용한 에탄올 발효가 각광 받고 있다. 그러나 이러한 다당류들을 이용하려면 에너지원으로 사용되기 위해 다당류를 분해하는 효소, 에너지, 시간, 시설, 노동 등이 요구되는 전처리 공정이 행해져야 하는데 이는 전체 에탄올 생산비의 상당 부분을 차지하고 있어 비용을 높이는 요인이 된다. 이런 섬유소 바이오매스를 효과적으로 에탄올로 전환하기 위해, 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스 및 리그닌으로 구성된 바이오매스를 효과적으로 분해하여 발효 가능한 당류를 효율적으로 유리시키는 기술이 발전되고 있으며, 한편으로는 바이오매스를 구성하는 당류인 포도당, 자일로스, 아라비노스 등의 다양한 당류를 발효하여 에탄올을 생산하는 균주 개량 기술이 연구되고 있다. 섬유소 분해 과정은 분해 효소들은 고온을 최적 온도로 요구하며, 또한 다당류 발효 과정도 높은 온도 발생을 야기한다. 이에 유전자 재조합기술에 의하여 다당류 분해 환경과 같은 높은 온도 환경에서도 성장이 가능하며 발효능이 떨어지지 않는 에탄올 생산 효모 균주 개발에 대한 필요성이 크게 부각되고 있다.

메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha)는 48℃ 이상의 온도에서 자이로즈(xylose)와 같은 5-탄당을 이용한 발효가 가능한 균주로서 최근에는 자일로즈가 함유되어 있는 목질계를 이용한 동시 당화 및 발효공정(simultaneous saccharification and fermentation)을 이용한 바이오에탄올 생산 효모 숙주 균주로서 개발될 수 있는 가능성이 크게 주목 받고 있다. 이와 관련하여 열내성을 보다 증가시키거나 자이로즈 활용 에탄올 발효능을 증진시키고자 다양한 대사공학적 연구가 진행되고 있다(Dmytruk et al. Microb Cell Fact 7, 21, 2008; Ishchuk et al. Biotechnol Bioeng. 104, 911-919, 2009). 한세눌라 폴리모르파 대상의 연구로서, 비활성의 ATH1(acid trehalase) 유전자 변이 숙주 및 자이루로키나아제(xylulokinase) 또는 HSP104(heat-shock protein 104) 단백질 과발현 숙주를 활용하여 48℃ 이상의 온도에서 자일오즈를 포함하는 배지로부터 에탄올을 생산하는 방법이 특허문헌에 개시되어 있다(Abbas et al.,US2009/0155872, 2009).

세포가 고온의 열에 노출되었을 때 이에 대응하기 위해 많은 기능성 단백질들을 발현하는데, 이를 열 충격 단백질 (heat shock protein; HSP)이라고 하며, 이들의 발현은 전사 조절 인자인 열 충격 인자(Hsf1p)에 의해 조절된다(Wu C., Annu Rev Cell Dev Biol, 11, 441-469, 1995). 이런 HSP들은 다른 단백질들이 응집(aggregation)되는 것을 방지하고 응집괴(aggregate)를 용해시키며, 단백질의 구조형성을 돕거나, 변형된 단백질의 구조를 바르게 잡고, 손상된 단백질의 보다 큰 응집괴로 격리시키는 역할을 담당한다(Soti C., Br J Pharmacol, 146, 769-780, 2005). Hsf1은 원색 생물에서 진핵 생물에 이르기 까지 모든 종에서 발견되는데 이는 열 스트레스에 대해 오랜 세월에 걸쳐 지속되어온 세포 방어 능력임을 알 수 있다. 포유류 경우 3개의 Hsf 단백질 (Hsf1, Hsf2, Hsf4)가 존재하며 효모의 경우 Hsf1만이 존재 한다. Hsf1은 열 충격과 여러 다른 스트레스에 반응하여 HSP와 같은 유전자들의 발현을 유도하는 과정을 매개 한다. Hsf1은 총 4개의 영역으로 구성되는데, N-말단의 DNA 결합 부위와 루이신 지퍼(leucine zipper), 조절 도메인(regulatory domain)과 트랜스-활성 부위(trans-activation domain)로 구성되어 있다(Morrison AJ, J Neurochem, 75, 363-372, 200l). 스트레스가 없는 조건에서 Hsf1은 HSP90과 같은 샤페론들과 함께 비활성 상태의 거대분자구조 상태를 유지한다. 열 스트레스가 주어지면 HSP90과 같은 샤페론들은 기능을 수행하기 위해 Hsf1에서 떨어져 나가고 해리된 Hsf1은 삼량체화(trimerization)를 형성하게 된다. 삼량체를 형성한 Hsf1은 과인산화(hyperphosphorylation)되어 HSP과 같은 타겟 유전자의 프로모터(promoter) 부분에 존재하는 HSE(heat shock element)에 결합하여 전사인자로서의 기능을 수행한다(Tonkiss J, Int J Hyperthermia, 21, 433-444, 2005). 대부분의 진핵 생물에서 보존된 열 스트레스 전사조절 인자인 Hsf1은 열 스트레스에 반응하는 유전자군의 발현을 활성화시키며, 이 유전자들의 프로모터에는 Hsf1이 인지하는 HSE 서열이 존재한다(von Koskull-Doring et al., Trends Plant Sci, 10, 452-457, 2007). 효모를 포함한 초파리(Drosophila melanogaster)와 예쁜 꼬마 선충(Caenorhabditis elegans)은 각각 하나의 HSF 유전자를 가지고 있으나, 척추 동물은 4개의 HSF 유전자를 가지고 있다. 반면에 고등 식물은 20 종 이상의 HSFs이 존재하며, 크게 세 개의 패밀리로 구성되어 있다. 애기장대식물(Arabidopsis thalilana)은 21개 HSF 유전자, 쌀(Oryza sativa)은 적어도 23개 HSF 유전자, 그리고 토마토(Lycopersicon esculentum)는 18개의 HSF 유전자를 가지고 있다(Nover et al., Cell Stress Chaperones, 6:177-189, 2001;Baniwal et al.,J Biosci, 29:471-487, 2004). 식물의 Hsf들은 다양한 스트레스 반응에 관련하며, 여러 Hsf1는 열 스트레스 반응에 중추적인 역할을 함이 보고되었다. HSF 유전자의 결손이나 저해는 열저항성을 상실시키고, 과발현되면 열저항성 능력이 증진된다. HSF에 의해 조절되는 단백질 샤페론 중에 하나인 HSP101 유전자의 결손이나 열에 의해 유도되는 HSF101의 발현 저해는 획득 열저항성을 손실을 가져오며, HSP101의 과발현은 고온 스트레스 저항성을 향상시킨다는 것이 보고되었다(Hong and Vierling, PNAS, 97:4392-4397, 2000; Queitsch et al., Plant Cell, 12:479-492, 2000). 토마토에서 LeHsfA1의 과발현은 고온 스트레스에 대한 저항성을 향상시키는 반면에 LeHsfA1 발현 저해는 열저항성을 감소시키며, 발현이 억제된 LeHsfA1 균주에서 LeHsfA2 발현은 열 저항성 형질을 회복시킬 수 있어 Hsf1 유전자 과발현이 열내성 증진시킬 수 있는 가능성을 보여 주었다(Mishra et al., Genes Dev 16:1555-1567, 2002). 또한, Hsf는 열 스트레스뿐만 아니라 다양한 스트레스 반응에도 관여한다. AtHsfA2의 과발현은 열 뿐만 아니라 삼투압(osmotic) 스트레스에 대한 저항성도 향상시킨다(Ogawa et al., J Exp Bot 58:3373-3383, 2007), 쌀 유전자 OsHsfA2e와 애기장대식물의 AtHsf3의 과발현은 애기장대식물의 염분 스트레스에 대한 저항성도 증가시켰다(Yokotani et al., Planta 227:957-967, 2008; Yoshida et al., Biochem Biophys Res Commun 368:515-521, 2008). 한편, 최근 보고된 연구에 의하면, 놀랍게도 효모 사카로마이세스 세레비지애에서 식물 유래의 CAP2 cDNA의 발현은 효모의 열충격 인자 1(Hsf1)과 이의 타겟, HSP104 유전자의 발현과 함께 효모의 열저항성을 증가시켰다. 상기 최근 연구 결과들은 열내성 관련 전사조절인자를 활용하여 열 스트레스에 대한 내성을 증진된 균주를 개발할 수 있음을 시사하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 열 스트레스 반응을 조절하는 신규의 열 충격 인자(Heat Shock Factor, HSF)를 발굴하기 위해 고온 내성 효모 균주인 한세눌라 폴리모르파 균주를 대상으로 열 스트레스를 가하였을 때 공통적으로 발현이 증가하는 유전자들을 선별하고, 이들 유전자들의 프로모터 부위의 전사 조절 인자 결합 자리를 분석한 결과, 열충격 인자(HSF)가 결합할 수 있는 HSE(Heat Shock Element)가 존재함을 알아내었다. 이러한 연구결과에 기초하여, 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주로부터 열충격 단백질의 전사 조절 인자인 신규 열 충격 인자(HpHSF1)를 발굴하고, 이의 열 스트레스 반응 조절 기능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자(HpHSF1) 및 이를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 알코올의 생산방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자(Hansenula polymorpha Heat Shock Factor 1; HpHSF1); (ⅱ) 서열목록 제 1 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 열 충격 인자의 활성을 보유하는 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자; 또는 (ⅲ) 상기 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자의 단편으로서 열충격 인자 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자(Hansenula polymorpha Heat Shock Factor 1; HpHSF1); (ⅱ) 서열목록 제 1 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 열 충격 인자의 활성을 보유하는 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자; 또는 (ⅲ) 상기 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자의 단편으로서 열충격 인자 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자(HpHSF1)는 서열목록 제 1 서열에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 서열목록 제 1 서열에 기재된 아미노산 서열은 GenBank Accession Number HQ401564로 등록된 서열이다.

본 발명에서 용어 "열 충격 인자(HSF, Heat Shock Factor)"는 진핵세포에서 열 스트레스 해소 반응에 관여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 전사 인자 활성을 가지며, 열 충격 전사인자(Heat Shock Transcription Factor)라고도 한다.

상기 표현 "열 스트레스 해소 반응에 관여하는 유전자"는 열 스트레스에 대응하여 발현이 증가하는 유전자로서 열 내성에 관여하는 유전자를 의미하며, 본 명세서에서 "열 스트레스 타겟 유전자" 라는 용어로도 지칭된다.

상기 열 스트레스 타겟 유전자의 예로는 HSP (Heat Shock Protein)와 같은 단백질 샤페론(Chaperone) 유전자, 지질대사 또는 세포벽 합성에 관련된 유전자를 들 수 있고, 이들 유전자들의 프로모터 부분에는 HSF(Heat Shock Factor)가 인지 결합할 수 있는 HSE (Heat Shock Element)가 존재한다.

본 발명의 한세눌라 폴리모르파 유래 열충격 인자(HpHSF1)는 효모세포에서 열 스트레스 해소 반응에 관여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 전사 인자 활성을 갖는다.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자(HpHSF1)는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)의 열충격 전사인자(ScHSF1)의 결손을 보완(complementation)할 뿐만 아니라, 사카로마이세스 세레비지애의 성장을 더욱 촉진한다.

본 발명의 한세눌라 폴리모르파 유래 열충격 인자(HpHSF1)는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열로 이루어진 것 뿐만 아니라, 서열목록 제 1 서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 동시에 열 충격 인자의 활성을 보유하는 한세눌라 폴리모르파 유래 열 충격 인자도 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상술한 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)는 서열목록 제 1 서열과 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 열충격 인자 활성을 보유하는 열 충격 인자이다. 보다 바람직하게는, 상술한 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)는 서열목록 제 1 서열과 96％ 이상, 보다 더 바람직하게는 97％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 열충격 인자 활성을 보유하는 열 충격 인자이다.

본 발명에서 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열은 한세눌라 폴리모르파의 DL1-L 균주로부터 유래된 열 충격 인자(HpHsf1)의 아미노산 서열이고, 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열은 한세눌라 폴리모르파의 NCYC495 균주로부터 유래된 HpHSF1의 아미노산 서열이며, 서열목록 제 3 서열의 아미노산 서열은 한세눌라 폴리모르파의 CBS4732 균주로부터 유래된 HpHsf1의 아미노산 서열이다. 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 기재된 바와 같이, 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열과, 서열목록 제 3 서열의 아미노산 서열은, 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열과 각각 96.9％와 96.8％의 동일성을 보인다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)는 열 충격 인자 활성을 보유하는 것이라면, 상기 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자의 단편(fragment)도 포함하는 의미이다.

본 발명에서 상기 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자, RNA 분자 및 mRNA 분자를 모두 포함하는 의미이며, 바람직하게는 DNA 분자이다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 상기 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 및 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 원핵세포는 박테리아 세포 및 고세균을 포함하며, 진핵세포는 효모세포, 포유동물세포, 식물세포, 곤충세포, 줄기세포 및 곰팡이를 포함하고, 가장 바람직하게는 효모세포이다.

바람직하게는, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) 상술한 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되며 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함한다.

본 발명의 벡터가 진핵 세포를 숙주 세포로 하는 경우, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) 상술한 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결되며 진핵세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 진핵세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예컨대 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lac UV5 프로 모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터, 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli)이며, 가장 바람직하게는 대장균(E. coli) DH5α이다. 또한, 숙주 세포로서 대장균(E. coli)가 이용되는 경우, 대장균(E. coli) 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. 47-13 2010-11-24 Bacteriol., 158: 1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pL λ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pRS316, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터가 진핵세포에 적용되는 경우, 이용될 수 있는 프로모터는, 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 유래 열 충격 인자(HpHSF1)의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 효모세포에서 유래된 프로모터, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 프로모터, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) GAL1 내지 GAL10 프로모터, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 벡터는 폴리 아네닐화 서열을 포함할 수 있다(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며, 진핵세포인 경우, 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 마이크로인젝션, 유전자총(particle bombardment), YAC에서 이용되는 효모 구형질체/세포 융합, 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질 전환 등을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 벡터로 형질전환되어, 상술한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포이며, 원핵세포인 경우 예를 들어 박테리아 세포 및 고세균을 포함하며, 진핵세포인 경우 효모세포, 포유동물세포, 식물세포, 곤충세포, 줄기세포 및 곰팡이를 포함하고, 보다 바람직하게는 효모세포이다.

본 발명에서 숙주 세포로 사용될 수 있는 효모 균주로는 사카로마이세스 (Saccharomyces)속, 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속, 한세눌라(Hansenula)속, 피키아(Pichia)속, 칸디다(Candida)속, 토루롭시스(Torulopsis)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 파피아(Pfaffia)속, 클루이베로미세스(Kluyveromyces)속, 탈라로미세스(Talaromyces)속, 브레타노미세스(Brettanomyces spp.)속, 파키솔렌(Pachysolen)속, 데바리오미세스(Debaryomyces) 속 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) 또는 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha)이다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포내로 운반하는 방법은 상술한 당업계에서 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 벡터를 이용한 형질전환된 효모세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전달 방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 리튬 아세테이트/DMSO 방법(Hill, J., etal., (1991), DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19, 5791.) 등을 이용하여 실시한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 알코올의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 숙주 세포는 한세눌라 폴리모르파 유래 열 충격 인자(HpHSF1)가 발현 가능한 벡터를 포함하고 있어 향상된 열 스트레스 내성을 가지므로, 발열성 알코올 발효, 특히 에탄올 발효 균주로서 활용이 가능하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명은 한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha)로부터 유래한 신규한 열 충격 인자(HpHSF1)에 관한 것이다.

(ⅱ) 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)은 열 스트레스에 대응하는 유전자들의 발현을 조절함으로써 세포의 열 스트레스 내성을 크게 향상시킨다.

(ⅲ) 본 발명의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)를 발현 가능한 상태로 갖는 숙주 세포는 열 스트레스에 대한 내성이 증가되어 에탄올 발효와 같은 발열 공정의 에탄올 생산 균주로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha; H. polymorpha) NCYC495(CBS1946/ATCC14754) 균주, A16(CBS4732/ATCC34438) 균주 및 DL1-L(ATCC26012) 균주와, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae: S. cerevisiae) L3262 균주와 W303 균주간의 열내성을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 액체 배양에서 키운 상기 균주를 OD₆₀₀ = 1로 초기 희석한 후, 10배 씩 연속적으로 희석하여 2 ㎕씩 최소고체배지에 각각 점적한 후, 30℃, 45℃ 및 48℃ 배양조건에서 3일간 배양하여 성장 양상을 분석하였다.
도 2는 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 균주와 DL1-L 균주를 각각 지수성장기(OD₆₀₀=0.5)에서 55℃ 열스트레스를 15분간 처리한 샘플의 마이크로어레이(Microarray) 실험을 통해서 전체적인 유전자 발현 양상의 차이를 분석한 그림이다. 패널 (A)는 전체적인 마이크로어레이 실험 디자인을 나타낸 모식도이고, 패널 (B)는 발현 차이를 보인 개별 유전자들에 대해서 두 균주 간에 공통점 및 차이점을 비교한 벤다이어그램 모식도이다. 패널 (C)는 열 스트레스 조건에서 NCYC495 균주와 DL1-L 균주 모두에서 발현 증가를 보인 열 스트레스 조절 유전자들을 나타낸 표이다.
도 3은 열 스트레스 조건에서 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 균주와 DL1(ATCC26012) 균주에서 발현 증가를 보인 조절 유전자들을 RT-PCR로 발현 증가를 다시 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 액체 배양에서 키운 상기 균주를 OD₆₀₀=0.1 로 초기 접종하여 지수 성장기까지 배양한 후, 55℃, 60℃ 조건에서 15, 30, 60분간 반응시킨 샘플에 대하여 전체 RNA를 회수하여 RT-PCR을 통해 발현 패턴을 분석한 결과이다.
도 4는 열 스트레스 조건에서 NCYC495 균주와 DL1-L 균주 모두에서 발현 증가를 보인 열 스트레스 조절 유전자들의 프로모터 부분의 HSE(heat shock element)를 분석한 생물정보학적 정보를 나타낸 그림이다.
도 5a 및 도 5b는 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자 HpHSF1 유전자가 코딩하는 단백질과 사카로마이세스 세레비지애 열충격인자 ScHsf1 단백질의 아미노산 서열의 도메인 분석 결과이다.
도 5c는 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자 HpHsf1 단백질, 사카로마이세스 세레비지애 열충격인자 ScHsf1 단백질을 포함하여, 다른 종에서 확인된 열충격 인자의 아미노산 서열 분석결과이다.
도 5d는 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자 HpHsf1 단백질, 사카로마이세스 세레비지애 열충격인자 ScHsf1 단백질을 포함하여, 다른 종에서 확인된 열충격 인자의 아미노산 상동성 및 유사성의 비교표이다.
도 6a는 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주, NCYC495 균주 및 CBS4732 균주 유래의 HpHSF1의 염기서열과 이들을 비교 분석한 결과이다.
도 6b는 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주, NCYC495 균주 및 CBS4732 균주 유래의 HpHsf1의 단백질 아미노산 서열을 비교 분석한 결과이다.
도 6c는 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주, NCYC495 균주 및 CBS4732 균주 유래의 HpHSF1의 핵산 염기서열과 단백질의 아미노산 서열의 상동성 및 차이를 비교 분석한 결과를 표로 나타낸 것이다.
도 7a는 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)의 정상적인 기능을 확인하기 위해 사카로마이세스 세레비지애 열충격 인자(Schsf1) 결손 균주에 HpHSF1을 도입하여, ScHsf1의 손실된 기능이 회복되는지를 분석하기 위한 실험의 개략도이다.
도 7b는 본 발명의 한세눌라 폴리모르파의 HpHSF1의 발현이 사카로마이세스 세레비지애의 Schsf1 결손을 보완하는 것을 보여주는 효모세포 성장 비교 실험결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 한세눌라 폴리모르파와 사카로마이세스 세레비지애 균주의 열내성 분석

한세눌라 폴리모르파(H. polymorpha)의 가장 대표적인 균주인 NCYC495, A16, 및 DL1-L 균주와 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) L3262와 W303 균주를 대상으로 30℃, 45℃, 48℃ 조건에서 스팟팅 분석을 통해 두 균주간의 열내성 차이를 탐색하였다. 그 결과 사카로마이세스 세레비지애 L3262와 W303 균주는 45℃, 48℃ 조건에서 전혀 성장하지 못하는데 반해, 한세눌라 폴리모르파 NCYC495, A16 및 DL1 균주는 모두 45℃에서 성장하는 것을 보여주었다. 특히 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 균주의 경우 48℃ 조건에서도 성장하였다(도 1 참조).

실시예 2: 한세눌라 폴리모르파 NCYC495와 DL1-L 균주의 열 스트레스 조건에서의 유전체 발현 양상 분석

상기 실시예 1에서 한세눌라 폴리모르파가 사카로마이세스 세레비지애보다 열 내성이 높은 것을 확인하였다. 이어서, 열 스트레스 조건하에서 한세눌라 폴리모르파의 유전체학적 발현 양상을 알아보기 위해 대표적인 기능유전체 연구 방법인 마이크로어레이(Microarray) 실험 방법을 사용하여 NCYC495 및 DL1 균주에서 열 스트레스를 주었을 때 발현이 변화되는 유전체를 분석하였다.

실험 방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다. 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 및 DL1-L 균주를 각각 3 ㎖ YPD 배지에 37℃, 220 rpm으로 16시간 동안 종균 배양하였다. 그리고 100 ㎖ YPD 배지에 OD₆₀₀=0.1이 되도록 균주를 접종하여 배양을 시작하고, 3시간 후 OD₆₀₀=0.5이 되었을 때 55℃, 220 rpm에서 15분간 배양하였다(도 2의 패널 A 참조). 이후 세포를 5％ 페놀(phenol)이 포함된 배지로 전사(transcription)을 블로킹(blocking)한 후 세포를 회수하여 액체질소에서 급속 냉각시킨 후 -70℃에 보관하였다. 이어서, 냉동된 세포를 얼음에서 천천히 녹인 후 DEPC(Diethylpyrocabohydrate) 처리한 증류수로 세척한 후, 다음의 방법으로 RNA를 분리 및 정제하였다. 750 ㎕ TES (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.5％ SDS) 용액을 넣고 같은 양의 산성 페놀-클로로포름을 넣은 후 65℃에서 10 분간 가열하고, 10초간 볼텍싱(vortexing)하는 과정을 번갈아가면서 1시간 동안 반복했다. 1분간 얼음에서 식힌 후 20초 동안 볼텍싱(vortexing)하고 14,000 rpm으로 15분 동안 상온에서 원심 분리했다. 700 ㎕ 상등액을 조심스럽게 새 튜브로 옮기고 같은 양의 산성 페놀-클로로포름을 넣어 잘 섞어주고, 4℃에서 14,000rpm으로 5분 동안 원심 분리했다. 600 ㎕ 상등액을 조심스럽게 새 튜브로 옮긴 후, 같은 양의 클로로포름-이소아밀알콜을 넣어 잘 섞어주고 상기 조건과 동일하게 원심분리하였다. 최종적으로 상등액만을 취해 2.5 배 부피의 100％ 에탄올과 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트(sodium acetate)를 넣어 10 초간 볼텍싱하고, -70℃에서 30분 동안 보관하였다. 원심분리 후, 침전된 RNA를 70％ 에탄올로 세척하고, 공기 중에서 건조시켰다. RNA를 물에 녹인 후 RNA 정량과 1.2％ 아가로즈 젤 전기영동을 통해 RNA의 질, 농도 및 순도를 확인하였다. 추출한 100㎍의 RNA를 미국 퀴아젠(Qiagen)사의 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)을 사용하여, 제조자에 의해 제공된 매뉴얼에 따라 추가 정제하였다. 최종적으로 회수한 RNA는 위와 동일하게 정량 및 젤 전기영동 방법으로 RNA의 질, 농도 및 순도를 확인하였다.

마이크로어레이 실험을 위한 cDNA의 제조, 하이브리다이제이션 (hybridization) 및 형광표지 등에 사용된 모든 시약과 실험은 진켐(GeneChem)사의 아미노일릴 포스트 DNA 라벨링 키트(Aminoallyl post DNA Labeling kit)와 제공된 매뉴얼에 따라 수행 하였다. 간략히 기술하면, cDNA 합성을 위해서 총 40 - 50 ㎍의 RNA를 사용하였고, 키트에서 제공된 RT 프라이머를 넣고 80℃에서 10분간 반응시켰다. 얼음에서 냉각시킨 후 RNA 분해효소 저해제인 수퍼레이즈-인 (Superase-In^TM)과 RT 버퍼, dNTP 혼합물과 역전사 효소 혼합물을 첨가하여 42 ℃에서 2시간 반응시키고, 3.5 ㎕ 0.5 M NaOH/50 mM EDTA 용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. DNA/RNA 하이브리드를 변성시키기 위해 65℃에서 20분 반응시키고, 1 M Tris-HCl 버퍼(pH 7.5)로 반응을 중화시켰다. 이어서, 이렇게 얻어진 cDNA 반응물을 퀴아젠(Qiagen)사의 PCR 정제 키트를 사용하여 정제 및 농축한 후, NHS-ester Cy dyes를 라벨링하였다. 열 스트레스를 가하지 않은 샘플은 Cy3로 라벨링하고, 열 스트레스를 가한 샘플은 Cy5로 라벨링한 후 한세눌라 폴리모르파 전체 지노믹 마이크로어레이 슬라이드(Park et al., Appl Environ Microbiol 73:5990-6000, 2007)에 떨어뜨려 45℃, 18시간 동안 암반응을 행하였다. 슬라이드를 차례대로 2x SSC/0.1％ SDS, 2x SSC, 0.2x SSC 및 증류수로 씻어 주고, 완전히 건조시켜 최종 마이크로어레이 슬라이드를 얻었다. 상기 마이크로어레이 슬라이드를 스캔어레이5000(ScanArray5000)으로 스캐닝하여 어레이 이미지를 얻었다. 이어서, 상기 이미지를 액손(Axon)사의 진픽스(GenePix 4.0) 프로그램을 이용하여, 스팟 발견(spot finding), 정량(quantification), 바탕 측정(background estimation)의 세 단계로 이루어진 이미지 프로세싱 과정을 거쳐서 실험 오차를 반영하여 실험 결과를 표준화하였고, 발현 차이를 분석하였다.

열 스트레스에 의한 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 균주 및 DL1-L 균주의 전사체 발현의 비교분석을 통해, 열에 의해 조절되는 상당 부분의 유전자들이 두 균주에서 공통적으로 발현이 증가하는 양상을 보였다(도 2의 패널 B 참조). NCYC495 균주의 경우 75％의 유전자가 DL1-L에서 증가한 유전자와 공통적으로 증가되고 있음을 확인하였다. 공통적으로 증가된 유전자군은 HSP(Heat shock protein)과 같은 단백질 샤페론(chaperone), 지질 대사, 및 세포벽 합성에 관련된 유전자들이었으며, 이들 유전자군의 발현 증가가 두드러지게 나타났다(도 2의 패널 C 참조). 감소되는 유전자군은 DL1 균주에 비해 NCYC495 균주에서는 거의 나타나지 않았다(도 2의 패널 B 및 C 참조). 이러한 결과는 열내성 분석 실험에서 보여준 것처럼, DL1-L 균주보다 NCYC495 균주가 더 강한 열내성을 갖게 하는 주요한 요인이 될 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 3: RT-PCR을 통한 한세눌라 폴리모르파 NCYC495와 DL1균주의 열 스트레스 조건에서의 증가된 유전자의 검증

상기 어레이 결과에 의해 두 균주 간에 공통적으로 증가되는 유전자를 선별하여 열내성 관련 유전자 군을 정리하였다. 어레이 결과의 검증하기 위해 일부 유전자를 선별하여 RT-PCR을 통한 발현 패턴 확인하였다.

상기에서 기술한 방법으로 정제한 RNA를 주형으로 역전사 반응을 통해 cDNA를 합성하였고, 다시 이를 주형으로 한 쌍의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 그리고 중합효소연쇄 반응의 생산물은 아가로즈 젤 전기영동을 하여 비교 분석하였다.

DL1-L 균주의 경우, 55℃ 열 스트레스 조건에서 HSP26, HSP104, STI1,　SIS1와 같은 유전자들이 15분에서 급격히 발현이 증가되었다가, 15분 이후에는 발현이 감소되었다. 그러나 60℃ 조건에서는 살펴본 모든 유전자의 발현의 변화가 없었다. 이와 달리 NCYC495 균주의 경우, 55℃에서 테스트한 모든 HSP26, HSP78, HSP104, ITR1, STI1, 및 SIS1 유전자의 증가를 보였을 뿐만 아니라, 60℃ 에서도 STI1을 제외한 모든 유전자의 증가를 확인할 수 있었다. 상기의 유전자들은 열 스트레스에 반응에 대처하는 샤페론 및 방어 유전자에 관련한 것들로, 고온에서 NCYC495 균주는 무리 없이 여러 종류의 방어 유전자의 발현이 증가되어 오랫동안 지속되고 있는 결과를 보여주었다(도 3 참조). 이는 스팟팅을 통한 열내성 분석실험에서 보여준 것처럼, NCYC495 균주가 DL1-L 균주에 비해 상대적으로 열 스트레스에 대한 내성이 강화될 수 있음을 암시한다.

실시예 4: 한세눌라 폴리모르파 NCYC495와 DL1-L 균주의 열 스트레스 조건에서의 증가된 유전자의 프로모터(promoter) 분석

상기 에레이 분석에서 선별된 한세눌라 폴리모르파 균주에서 열내성을 가지게 하는 33개의 타겟 유전자의 프로모터 부분을 생물 정보 분석(http://www. yeastract.com/)을 수행한 결과 22개의 유전자의 프로모터부분에서 HSE(heat shock element)를 가지고 있음을 확인하였다(도 4 참조). 이는 본 발명에서 선정된 한세눌라 폴리모르파의 열 스트레스에 대한 타겟 유전자들이 대부분 HSF1에 의해 조절되는 유전자들임을 간접적으로 설명해 준다. 따라서, 한세눌라 폴리모르파의 열 스트레스 조절 핵심 전사인자인 HpHSF1 유전자 및 이의 발현조절을 통해 열내성을 가진 효모 균주 개발이 가능하다.

실시예 5: HpHSF1 유전자 발굴 및 특성 분석

최근 본 발명자들이 염기서열 분석한 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주에 대한 유전자 염기서열 데이터베이스(Sohn et al., unpublished data)로부터 사카로마이세스 세레비지애의 열 충격 단백질의 조절 전사인자인 ScHSF1 유전자와 26％의 동일성(identity)을 보이는 ORF(open reading frame), PA2119.g103을 찾았다. 이 ORF를 프라이머 세트 1 (5′-TTAACTAGTATGGGCGCTTTCCGACCA-3′: 서열목록 제7서열 /5′-CTGAATTCTTAAACTTGTTTAATCCTCTTCTTGTC-3′: 서열목록 제8서열)를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 증폭한 후, 염기서열을 판독하였고, 이 염기서열을 NCBI GenBank 데이터베이스에 기탁번호 HQ401564호로 등록하였으며, 상기 유전자가 담겨 있는 벡터 p414A-HpHSF1를 제작하여 후 대장균(E. coli) DH5α 균주에 형질전환으로 도입하였다.

확보된 한세눌라 폴리모르파의 PA2119.g103의 아미노산 서열의 도메인을 분석한 결과(도 5a 및 도 5b 참조), 사카로마이세스 세레비지애의 ScHsf1 단백질에서 발견되는 일시적인 열 충격 조절에 관여하는 AR1 (N-terminal trans-activation domain), 지속된 열 스트레스에 관여하는 AR2 (C-terminal trans-activation domains), CE2 (Negative regulatory domain conserved element 2) 도메인을 조절하는 CTM (C-terminal modulator domain), 그리고 삼량체(trimer)형성하여 표적 유전자 프로모터에 결합하는데 관계되어있는 DBD (winged helix turn helix DNA binding domain)와 올리고머(oligomer)와 같은 도메인들(Raitt et al., Mol Biol Cell, 11:2335-47, 2000; Imazu and Sakurai, Eukaryot Cell, 4:1050-6, 2005; Hashikawa and Sakurai, Mol Cell Biol, 24:3648-59, 2004)이 PA2119.g103에도 잘 보존되어 있다는 것을 확인하였다. 따라서, PA2119.g103를 한세눌라 폴리모르파 열 충격 조절 인자 1, HpHSF1 유전자라고 명명하였다.

또한, HpHsf1 단백질과 다른 진핵생물 종에 존재하는 유사 Hsf1 단백질 간의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과, DBD와 올리고머(oligomer) 도메인 부분들이 국지적으로 높은 유사성을 보였으며(도 5c 참조), 전체적으로 각 종간의 상동성 및 유사도를 분석한 결과, 한세눌라 폴리모르파의 HpHSF1은 전통효모 사카로마이세스 세레비시애 ScHSF1과는 약 25％ 정도의 낮은 상동성을 보였다(도 5d 참조).

실시예 6: 한세눌라 폴리모르파 DL-1, NCYC495, CBS4732 세 균주의 HpHSF1 유전자 비교 분석

한세눌라 폴리모르파의 대표적인 균주로는 DL1-L, NCYC495 및 CBS4732 세 종류의 균주가 존재한다. 한세눌라 폴리모르파 HSF1의 균주간 분자적 특성을 비교하기 위해 NCYC495 및 CBS4732의 지노믹 DNA를 주형으로 하여 프라이머 세트 2 (5′-TTATCTAGAATGGGCGCTTTCCGACCA-3′:서열목록 제9서열 / 5′-CTGAATTCTTAAAGTTGTTTGATCCTTTTCTTGTC-3′: 서열목록 제10서열)를 사용하여 PCR 증폭하여 염기서열을 판독하였다. 각 균주들 간의 HpHSF1 유전자의 염기서열와 아미노산 서열을 비교 분석한 결과, DL-1 균주 유래의 HpHSF1 유전자는 NCYC495 및 CBS4732 유래의 HpHSF1 유전자와 각각 95.9％ / 95.9％의 염기서열 상동성과, 96.9％ / 96.8％의 아미노산 서열의 상동성을 보였다(도 6a 및 도 6b 참조). 반면, NCYC495 및 CBS4732 유래의 HpHSF1 유전자들은 서로 99.5％ 동일한 아미노산 서열을 보였다(도 6c 참조).

실시예 7: 사카로마이세스 세레비지애에서의 한세눌라 폴리모르파 HpHSF1 유전자 발현 및 기능 확인

한세눌라 폴리모르파 HSF1 유전자가 사카로마이세스 세레비지애 ScHSF1과 동일한 기능을 수행하는지 확인하기 위해, 먼저 발현벡터를 제작하였다. 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주의 지노믹 DNA를 주형으로 프라이머 세트 3 (5′-CTGAATTCTTAAACTTGTTTAATCCTCTTCTTGTC-3': 서열목록 제11서열/5'-CAGGAACATCGTATGGGTAAACTTGTTTAATCCTCTTCTTGTC-3': 서열목록 제12서열)을 사용하여 1차 PCR 한 후에 이 증폭 산물을 주형으로 프라이머 세트 4 (5'-CTGAATTCTTAAACTTGTTTAATCCTCTTCTTGTC-3': 서열목록 제13서열/ 5'-CTGAATTCTTAGCCCGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTA-3': 서열목록 제14서열)를 사용하여 HpHSF1 유전자에 HA - 태깅(hemagglutinin epitope-tagging)한 증폭산물을 얻어 내었다. 증폭된 PCR 절편을 SpeI과 EcoRI 제한효소로 처리하여 얻은 단편을 ADH1 유전자의 프로모터를 가지고 있는 벡터 pRS414-ADH와, TEF2 유전자의 프로모터를 가지고 있는 벡터 pRS414-TEF(Mumberg et al., Gene, 156:119-22, 1995)에 삽입하였다. 그 결과 최종적으로 사카로마이세스 용 HpHSF1 발현 벡터 p414A-HpHSF1HA와, p414T-HpHSF1HA를 각각 제작하였다(도 7a 참조). 한세눌라 폴리모르파 HSF1 (HpHSF1)의 기능을 검증하기 위해, 사카로마이세스 세레비지애 hsf1 결손 균주에 한세눌라 폴리모르파 HpHSF1을 도입하여 기능이 회복되는 지를 확인하였다. 사카로마이세스 세레비지애 HSF1(ScHSF1)가 결손되면 세포자체의 생존이 불가능하다. 사카로마이세스 세레비지애 W303 야생형 균주에 Schsf1 결손 유전자형과, ScHSF1 유전자를 발현가능한 형태로 동시에 가지고 있는 선택적 결손 균주인, PS145 균주(MATa ade2-1 trp1 can1-100 his3-11,15 leu2-3112 ura3 hsf1::LEU2 YCpGAL1-yHSF)(Sorger and Pelham, Cell, 54: 855-864, 1988)를 실험에 사용하였다. 상기 균주는 ScHSF1 유전자의 발현이 GAL1 프로모터에 의해 조절받기 때문에 탄소원으로 갈락토즈(galactose)를 사용하는 배양 조건에서는 성장이 가능하나, 포도당(glucose)을 사용하는 조건에서는 생존하지 못하는 특성을 가지고 있다. 상기 제작한 HpHSF1 발현 벡터 p414A-HpHSF1HA 및 p414T-HpHSF1HA를 각각 상기 PS145 균주에 도입하여 형질전환 균주를 얻었고, 이어서 5-FOA(5-Fluoroorotic acid)를 포함하는 선택배지에서 ScHSF1 선택 조절발현 벡터, YCpGAL1-yHSF를 제거하여 최종적으로 Schsf1 유전자 결손과 동시에 HpHSF1 유전자 발현벡터만을 갖는 사카로마이세스 세레비지애 균주를 제작하였다(도 7a 참조).

탄소원으로서 포도당 또는 갈락토즈를 공급한 선택배지에서 이들 균주를 OD 1에서 10분의 1씩 연속적으로 3번까지 희석한 것을 각각 5 ㎕ 씩 스팟팅하여 배양하였다. 사카로마이세스 세레비지애 hsf1 결손 균주는 포도당 배지에서는 자라지 못하고 갈락토즈 배지에서만 성장한 것에 비해, HpHSF1 유전자가 도입된 균주는 두 배지 모두에서 성장이 가능하였으며, ScHSF1 유전자가 도입된 균주 보다 성장이 더 증가됨을 나타내었다(도 7b 참조). 이와 같은 결과는 한세눌라 폴리모르파 HSF1( HpHSF1)가 사카로마이세스 세레비지애 hsf1 결손을 보완하여 줄 뿐만 아니라, 열 스트레스 조절 관련 기능을 수행을 통해, ScHSF1 유전자가 도입된 균주 보다 더욱 증가된 성장을 유도할 수 있음을 증명한 결과이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chung-Ang University Industry Academic Cooperation Foundation Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A Novel Heat Shock Factor From Hansenula Polymorpha Capable of Controlling Heat Stress Response and Use of the Same <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 648 <212> PRT <213> Hansenula polymorpha <400> 1 Met Gly Ala Phe Arg Pro Ser Val Asn Pro Gly Glu Val Val Asp Gln 1 5 10 15 Leu His Gly Ser Pro Gln Ile Glu Glu Ile Thr Asp Lys Ser Gly Gly 20 25 30 Asn Gln Phe Asp Thr Asn Ile Pro Asn Leu Thr Asp Asn Glu Leu Leu 35 40 45 Asp Pro Ile Ser Thr Ala Thr Gly Thr Thr Pro Thr Asn Asn Thr Ser 50 55 60 Asn Gly Leu Tyr Pro Phe Pro Ile Ser Asp Val Pro Ser Leu Gly Asp 65 70 75 80 Glu Ser Asn Thr Gly Asp His Ile Pro His Thr Pro Val Val Thr Ser 85 90 95 Pro Gln Pro Ser Ile Ser Ile Lys Ser Asp Ala Arg His Ile Asn Pro 100 105 110 Tyr Ala Asn Gly Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Met Ile Ser Arg Tyr Asn 115 120 125 Pro Pro Ala Ser Leu Pro Tyr Tyr Asp Ser Pro Gln Leu Pro Ser Gly 130 135 140 Thr Thr Asn Ser Asn Val Lys Ser Leu Gln Phe Lys Lys Pro Lys Pro 145 150 155 160 Lys Lys Leu Gln Asn Gln Met Ser Gly Pro Pro Lys Arg Pro Ala Phe 165 170 175 Val Met Lys Leu Trp Asn Met Val Asn Asp Pro Ser Asn Ser Lys Tyr 180 185 190 Ile Ser Trp Leu Pro Asp Gly Lys Ala Phe Gln Val Ser Asp Arg Glu 195 200 205 Ser Phe Met Arg His Val Leu Pro Lys Tyr Phe Lys His Asn Asn Phe 210 215 220 Ala Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Met Tyr Gly Trp His Lys Ile Gln 225 230 235 240 Asp Val Asn Ser Gly Ser Leu Val Gln Gly Glu Glu Val Trp Gln Phe 245 250 255 Glu Asn Pro Asn Phe Ile Lys Gly Lys Glu Asn Leu Leu Asp Asn Ile 260 265 270 Val Arg Asn Arg Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asp Asp Ile Asp Ile Asn 275 280 285 Thr Leu Leu Met Glu Leu Glu Ser Met Lys Gln Lys Gln Arg Met Ile 290 295 300 Ala Asp Asp Leu Ser Arg Leu Val Gln Asp Asn Glu Leu Leu Trp Lys 305 310 315 320 Glu Asn Tyr Met Ala Arg Glu Arg His Lys Ala Gln Ser Glu Thr Leu 325 330 335 Asp Lys Ile Leu Arg Phe Leu Val Thr Leu Tyr Gly Gly Ser Ser Lys 340 345 350 Phe Leu Glu Ser Ala Gly Gly Ala Pro Ser Glu Phe Leu Glu Met Ala 355 360 365 Ser Lys Arg Asp Ala Gln Glu Gln Gln His His Pro His Gly Pro Asp 370 375 380 Phe Asp Ile Gln Gln Gln Met His Gln Gln Pro Ser Ser Tyr Tyr Gln 385 390 395 400 Pro Gln Asn Gly Asn Ser Arg Leu Met Leu Thr His Arg Ala His Asn 405 410 415 Asn Gly Ser Lys Ser Thr Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Gln Ser Ile 420 425 430 His Asn Gly Ser Asp Ala Ser Asp Ser Pro Ile Gln Glu Ile Arg Arg 435 440 445 Gly Pro Glu Asn Gln Asn Ser Glu Gln Leu Asp Gly Tyr Lys Pro Tyr 450 455 460 Pro Leu Gln Gly Thr Pro Gln Phe Gln His Pro Leu Pro Asn Phe Gln 465 470 475 480 Ser Pro Val Ser Met Ala Asn Ser Pro Arg Ser Tyr Phe Pro Glu Ile 485 490 495 Ser Pro Gln Val Pro Gln Ser Ser Val Pro Ala Thr Pro Ser Ala Leu 500 505 510 Ser Ser Ala Thr Pro Leu Gln Gln Asp Thr Asp Ser His Met Pro Pro 515 520 525 Glu Tyr Leu Met Gly Asn Ile Asn Gln Gln Leu Asn Lys Gln Gln Ser 530 535 540 Ser Ile Arg Gln Ile Asn Asp Trp Ile Ser Arg Leu Ala Ser Ser Lys 545 550 555 560 Leu Pro Asp Glu Ile Asn Ala Asn Gln Gln Pro Leu Met Asp Asp Phe 565 570 575 Arg Met Asp Asp Phe Leu Leu Pro Gln Thr Pro Asn Gly Gly Val Asp 580 585 590 Pro Ser Leu Asn Thr Asp Asp Asn Phe Gly Glu Ile Tyr Asn Pro Ser 595 600 605 Gln Gln Glu Ser Asn Glu Ser Tyr Thr Asp Ser Ala Ser Ser Arg Ala 610 615 620 Ser Thr Phe Ser Ser Lys Lys Arg Arg Asp Ser Ser Pro Ser Ser Glu 625 630 635 640 Asp Lys Lys Arg Ile Lys Gln Val 645 <210> 2 <211> 649 <212> PRT <213> Hansenula polymorpha <400> 2 Met Gly Ala Phe Arg Pro Ser Val Asn Pro Gly Glu Val Val Asp Gln 1 5 10 15 Leu His Gly Ser Pro Gln Ile Glu Glu Ile Thr Asp Lys Ser Gly Gly 20 25 30 Asn Gln Ile Asp Ser Asn Ile Pro Asn Leu Thr Asp Asn Glu Leu Leu 35 40 45 Asp Pro Ile Ser Thr Thr Thr Gly Thr Thr Pro Thr Asn Asn Thr Ser 50 55 60 Asn Gly Leu Tyr Pro Phe Pro Thr Ser Asp Val Pro Ser Leu Gly Asp 65 70 75 80 Asp Ser Asn Thr Gly Asp His Ile Ala His Thr Pro Val Val Thr Ser 85 90 95 Pro Gln Ser Ser Ile Ser Ile Lys Ser Asp Ala Arg His Ile Asn Pro 100 105 110 Tyr Ala Asn Gly Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Tyr Met Ile Ser Arg Phe 115 120 125 Asn Pro Pro Ala Ser Leu Pro Tyr Tyr Asp Ser Pro Gln Leu Ser Ser 130 135 140 Gly Thr Thr Asn Ser Asn Val Lys Ser Leu Gln Phe Lys Lys Pro Lys 145 150 155 160 Pro Lys Lys Leu Gln Asn Gln Met Ser Gly Pro Pro Lys Arg Pro Ala 165 170 175 Phe Val Met Lys Leu Trp Asn Met Val Asn Asp Pro Ser Asn Ser Lys 180 185 190 Tyr Ile Ser Trp Leu Pro Asp Gly Lys Ala Phe Gln Val Ser Asp Arg 195 200 205 Glu Ser Phe Met Arg His Val Leu Pro Lys Tyr Phe Lys His Asn Asn 210 215 220 Phe Ala Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Met Tyr Gly Trp His Lys Ile 225 230 235 240 Gln Asp Val Asn Ser Gly Ser Leu Val Gln Gly Glu Glu Val Trp Gln 245 250 255 Phe Glu Asn Pro Asn Phe Ile Arg Gly Lys Glu Asn Leu Leu Asp Asn 260 265 270 Ile Val Arg Asn Arg Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asp Asp Ile Asp Ile 275 280 285 Asn Thr Leu Leu Met Glu Leu Glu Ser Met Lys Gln Lys Gln Arg Met 290 295 300 Ile Ala Asp Asp Leu Ser Arg Leu Val Gln Asp Asn Glu Leu Leu Trp 305 310 315 320 Lys Glu Asn Tyr Met Ala Arg Glu Arg His Lys Ala Gln Ser Glu Thr 325 330 335 Leu Asp Lys Ile Leu Arg Phe Leu Val Thr Leu Tyr Gly Gly Ser Ser 340 345 350 Lys Phe Leu Glu Ser Ala Gly Gly Ala Pro Ser Glu Phe Leu Glu Met 355 360 365 Ala Ser Lys Arg Asp Ala Gln Glu Gln Gln His His Pro His Gly Ser 370 375 380 Asp Phe Asp Ile Gln Gln Gln Met His Gln Gln Pro Asn Ser Tyr Tyr 385 390 395 400 Gln Pro Gln Asn Gly Asn Ser Arg Leu Met Leu Thr His Arg Ala His 405 410 415 Asn Asn Gly Ser Lys Ser Thr Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Gln Ser 420 425 430 Ile Asn Asn Gly Ser Asp Ala Ser Asp Leu Pro Ile Gln Glu Ile Arg 435 440 445 Arg Gly Pro Glu Asn Gln Asn Ser Glu Gln Leu Asp Gly Tyr Lys Pro 450 455 460 Tyr Pro Leu Gln Gly Thr Pro Gln Phe Gln His Pro Leu Pro Asn Phe 465 470 475 480 Gln Ser Pro Ala Ser Met Ala Asn Ser Pro Arg Ser Tyr Phe Pro Glu 485 490 495 Ile Ser Pro Gln Val Pro Gln Ser Ser Val Pro Ala Thr Pro Ser Ala 500 505 510 Leu Ser Ser Ala Ala Pro Leu Gln Gln Asp Thr Asp Thr His Met Pro 515 520 525 Pro Glu Tyr Leu Met Gly Asn Ile Asn Gln Gln Leu Asn Lys Gln Gln 530 535 540 Ser Ser Ile Arg Gln Ile Asn Asp Trp Ile Ser Arg Leu Ala Ser Ser 545 550 555 560 Lys Leu Pro Asp Glu Ile Asn Ala Asn Gln Gln Pro Leu Met Asp Asp 565 570 575 Phe Arg Met Asp Asp Phe Leu Leu Pro Gln Thr Pro Asn Gly Gly Val 580 585 590 Asp Pro Ser Leu Asn Thr Asp Asp Asn Phe Gly Glu Ile Tyr Asn Pro 595 600 605 Ser Gln Gln Glu Ser Asn Glu Ser Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Ser Arg 610 615 620 Ala Ser Thr Phe Ser Ser Lys Lys Arg Arg Asp Ser Ser Pro Ser Ser 625 630 635 640 Glu Asp Lys Lys Arg Ile Lys Gln Leu 645 <210> 3 <211> 649 <212> PRT <213> Hansenula polymorpha <400> 3 Met Gly Ala Phe Arg Pro Ser Val Asn Pro Gly Glu Val Val Asp Gln 1 5 10 15 Leu Gln Gly Ser Pro Gln Ile Glu Glu Ile Thr Asp Lys Ser Gly Gly 20 25 30 Asn Gln Ile Asp Ser Asn Ile Pro Asn Leu Thr Asp Asn Glu Leu Leu 35 40 45 Asp Pro Ile Ser Thr Thr Thr Gly Thr Thr Pro Thr Asn Asn Thr Ser 50 55 60 Asn Gly Leu Tyr Pro Phe Pro Thr Ser Asp Val Pro Ser Leu Gly Asp 65 70 75 80 Asp Ser Asn Thr Gly Asp His Ile Ala His Thr Pro Val Val Thr Ser 85 90 95 Pro Gln Ser Ser Ile Ser Ile Lys Ser Asp Ala Arg His Ile Asn Pro 100 105 110 Tyr Ala Asn Gly Ile Ile Gly Asn Asn Tyr Tyr Met Ile Ser Arg Phe 115 120 125 Asn Pro Pro Ala Ser Leu Pro Tyr Tyr Asp Ser Pro Gln Leu Ser Ser 130 135 140 Gly Thr Thr Asn Ser Asn Val Lys Ser Leu Gln Phe Lys Lys Pro Lys 145 150 155 160 Pro Lys Lys Leu Gln Asn Gln Met Ser Gly Pro Pro Lys Arg Pro Ala 165 170 175 Phe Val Met Lys Leu Trp Asn Met Val Asn Asp Pro Ser Asn Ser Lys 180 185 190 Tyr Ile Ser Trp Leu Pro Asp Gly Lys Ala Phe Gln Val Ser Asp Arg 195 200 205 Glu Ser Phe Met Arg His Val Leu Pro Lys Tyr Phe Lys His Asn Asn 210 215 220 Phe Ala Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Met Tyr Gly Trp His Lys Ile 225 230 235 240 Gln Asp Val Asn Ser Gly Ser Leu Val Gln Gly Glu Glu Val Trp Gln 245 250 255 Phe Glu Asn Pro Asn Phe Ile Arg Gly Lys Glu Asn Leu Leu Asp Asn 260 265 270 Ile Val Arg Asn Arg Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asp Asp Ile Asp Ile 275 280 285 Asn Thr Leu Leu Met Glu Leu Glu Ser Met Lys Gln Lys Gln Arg Met 290 295 300 Ile Ala Asp Asp Leu Ser Arg Leu Val Gln Asp Asn Glu Leu Leu Trp 305 310 315 320 Lys Glu Asn Tyr Met Ala Arg Glu Arg His Lys Ala Gln Ser Glu Thr 325 330 335 Leu Asp Lys Ile Leu Arg Phe Leu Val Thr Leu Tyr Gly Gly Ser Ser 340 345 350 Lys Phe Leu Glu Ser Ala Gly Gly Ala Pro Ser Glu Phe Leu Glu Met 355 360 365 Ala Ser Lys Arg Asp Ala Gln Glu Gln Gln His His Pro His Gly Ser 370 375 380 Asp Phe Asp Ile Gln Gln Gln Met His Gln Gln Pro Ser Ser Tyr Tyr 385 390 395 400 Gln Pro Gln Asn Gly Asn Ser Arg Leu Met Leu Thr His Arg Ala His 405 410 415 Asn Asn Gly Ser Lys Ser Thr Ser Arg Asp Thr Ser Ser Ser Gln Ser 420 425 430 Ile Asn Asn Gly Ser Asp Ala Ser Asp Leu Pro Ile Gln Glu Ile Arg 435 440 445 Arg Gly Pro Glu Asn Gln Asn Ser Glu Gln Leu Asp Gly Tyr Lys Pro 450 455 460 Tyr Pro Leu Gln Gly Thr Pro Gln Phe Gln His Pro Leu Pro Asn Phe 465 470 475 480 Gln Ser Pro Ala Ser Met Ala Asn Ser Pro Arg Ser Tyr Phe Pro Glu 485 490 495 Ile Ser Pro Gln Val Pro Gln Ser Ser Val Pro Ala Thr Pro Ser Ala 500 505 510 Leu Ser Ser Ala Ala Pro Leu Gln Gln Asp Thr Asp Thr His Met Pro 515 520 525 Pro Glu Tyr Leu Met Gly Asn Ile Asn Gln Gln Leu Asn Lys Gln Gln 530 535 540 Ser Ser Ile Arg Gln Ile Asn Asp Trp Ile Ser Arg Leu Ala Ser Ser 545 550 555 560 Lys Leu Pro Asp Glu Ile Asn Ala Asn Gln Gln Pro Leu Met Asp Asp 565 570 575 Phe Arg Met Asp Asp Phe Leu Leu Pro Gln Thr Pro Asn Gly Gly Val 580 585 590 Asp Pro Ser Leu Asn Thr Asp Asp Asn Phe Gly Glu Ile Tyr Asn Pro 595 600 605 Ser Gln Gln Glu Ser Asn Glu Ser Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Ser Arg 610 615 620 Ala Ser Thr Phe Ser Ser Lys Lys Arg Arg Asp Ser Ser Pro Ser Ser 625 630 635 640 Glu Asp Lys Lys Arg Ile Lys Gln Leu 645 <210> 4 <211> 1947 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 4 atgggcgctt tccgaccaag cgtgaacccc ggcgaggttg ttgatcaatt gcacggctcg 60 ccacagattg aagaaatcac agataagtct ggaggcaacc agtttgatac caacatccca 120 aacctcacgg acaatgaact tttagatcca atttccaccg ctacaggcac gactcccaca 180 aacaacacgt ccaatggttt ataccctttt cctatatcag atgtgccctc tttgggcgat 240 gagtccaaca ccggagacca tattccgcat acacctgtcg tcacgtcacc gcaaccgtcc 300 atttccatca aatcagatgc acggcatatt aacccgtatg caaacggtat caacggaaat 360 aactacatga tttcgaggta caacccccct gcgtcattgc cgtactatga tagtccccaa 420 ttaccgtctg gaacgaccaa ttcgaacgtg aaatctttgc aattcaagaa acccaaacct 480 aagaagcttc agaaccagat gtcgggacct ccaaaacggc ccgcttttgt catgaagtta 540 tggaacatgg tcaatgatcc ttccaactct aaatacatct cgtggctacc tgacggaaag 600 gccttccagg tgagcgacag agaaagcttt atgagacatg tgttgcccaa gtacttcaaa 660 cacaataact ttgcttcctt tgtgagacag ctgaacatgt atggctggca caaaattcag 720 gacgtcaact cagggtccct tgttcagggt gaagaagttt ggcaattcga gaatccaaac 780 ttcatcaagg gcaaggagaa cctattggat aacatcgtta gaaatcggtc ttccaaagag 840 gaagacgacg acatcgacat taacaccttg ctgatggagc tggagtcgat gaagcagaaa 900 cagaggatga ttgctgacga cctgagtaga ctcgttcagg acaacgagct actatggaaa 960 gagaattaca tggctagaga aagacacaag gctcaatcgg agactcttga caagatcttg 1020 cgattccttg tcaccttgta tggtgggtca tccaagtttc tggaaagtgc aggaggagct 1080 cccagcgagt ttctcgagat ggcctcaaaa agagacgcac aggaacagca acaccatccg 1140 catggaccag atttcgatat ccagcagcag atgcaccagc agcctagctc gtactaccag 1200 cctcaaaatg gaaacagcag gttgatgctg actcacagag cacacaataa tgggtccaag 1260 tcgacctcga gagatacatc cagcagccag agcattcaca acggttctga tgccagcgac 1320 tcgccgatcc aggagattcg tagaggaccc gagaaccaga acagcgaaca gctcgacggc 1380 tataagccgt atccactcca aggaacgccg caattccaac atccgttacc gaacttccag 1440 tcgcctgttt caatggccaa ttcgcctcgt tcttacttcc ccgagatcag cccgcaagtg 1500 ccgcaatcct ccgttcccgc cacgccatcc gcgctgtcct ctgcaactcc tttgcaacaa 1560 gacacagatt ctcacatgcc tcctgaatat ctcatgggaa acatcaacca gcagctgaac 1620 aagcagcaga gctcgatccg gcagataaac gactggatct cgcggctggc cagttcaaaa 1680 cttcctgacg agatcaacgc taatcaacag ccacttatgg atgattttag aatggacgat 1740 tttttacttc cgcagacccc gaacggcggt gtcgatccgt ctttgaacac tgacgacaac 1800 tttggtgaga tctacaaccc ttctcagcaa gagtccaacg aatcctacac agactccgcg 1860 tcttcgcggg ccagcacgtt ttcaagcaaa aagagaagag acagttcgcc gtcttcagag 1920 gacaagaaga ggattaaaca agtttaa 1947 <210> 5 <211> 1950 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 5 atgggcgctt tccgaccaag cgtgaacccc ggcgaggttg ttgatcaatt gcacggctcg 60 ccacagatcg aagaaatcac agacaagtct ggaggcaacc agattgattc caacatccca 120 aacctcacgg acaatgaact tttggatcca atttccacca ccacgggcac gactcccaca 180 aacaacacgt cgaatggttt ataccctttt cctacatcag atgtgccctc tttgggcgat 240 gattccaaca ccggagacca tattgcgcat acacctgtcg tcacgtcacc gcaatcgtcc 300 atttccatca aatcagatgc acggcatatt aacccgtatg caaacggtat caacggaaat 360 aactactaca tgatttcaag gttcaacccc cctgcgtcat tgccgtatta tgatagtccc 420 caactatcgt ctggaacgac caattcgaac gtgaaatctt tgcaattcaa gaaacccaaa 480 ccgaagaagc ttcaaaacca gatgtccgga cctccaaaac ggcccgcttt tgtcatgaag 540 ttatggaaca tggtcaatga tccttccaac tccaaataca tctcgtggct acctgacgga 600 aaggccttcc aggtgagcga cagagagagc ttcatgagac atgtgttgcc caagtacttc 660 aaacacaata actttgcttc ctttgtgaga cagctgaaca tgtatggctg gcacaaaatt 720 caggatgtca actcagggtc ccttgttcaa ggtgaagaag tttggcaatt tgagaatcca 780 aatttcatca ggggcaagga gaatctgttg gataacattg tcagaaaccg gtcttccaaa 840 gaggaggacg acgacatcga catcaatacc ttgctgatgg agttggagtc gatgaaacag 900 aaacagagga tgattgctga cgacctgagt agactcgttc aggacaacga gctactatgg 960 aaagagaatt acatggctag agaaagacac aaggctcaat cggaaactct tgacaagatc 1020 ttgcgatttc ttgtcacctt gtatggtggg tcgtccaagt ttctggaaag tgcaggagga 1080 gctcccagcg agtttctcga gatggcctcg aaaagagacg cacaggaaca gcaacaccat 1140 ccgcatggat cagatttcga tattcaacag cagatgcacc agcagcctaa ctcgtactac 1200 cagcctcaaa atgggaacag caggttgatg ctgactcaca gagcacataa caatgggtcc 1260 aagtcgacct cgagagatac atctagcagc cagagcatta acaacggttc tgacgccagc 1320 gacttaccga tccaggagat ccgcagagga cccgagaacc agaacagcga acagctcgac 1380 ggctataagc cgtatccact ccaaggaacg ccgcaatttc aacatccgtt accgaacttc 1440 cagtcgcctg cttcaatggc caattcacca cgttcttact tccccgagat cagtccgcaa 1500 gtgccgcaat cttcggtccc cgccacgccg tccgcactgt cctctgcagc tcctttgcaa 1560 caagacacag atactcacat gcctcctgaa tatctcatgg gaaacatcaa ccagcagctg 1620 aacaagcagc agagctcgat ccggcagata aacgactgga tctcgcggct ggccagttca 1680 aaacttcctg acgagatcaa cgctaatcaa cagccactta tggatgattt tagaatggac 1740 gattttttac ttccgcagac cccgaacggc ggtgtcgatc cgtctttgaa cactgacgac 1800 aattttggtg agatctacaa cccttctcag caagagtcca acgaatccta cacagactcc 1860 tcgtcctcgc gggccagcac gttttccagc aaaaagagaa gagacagttc gccgtcctca 1920 gaggacaaga aaaggatcaa acaactttaa 1950 <210> 6 <211> 1950 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 6 atgggcgctt tccgaccaag cgtgaacccc ggcgaggttg ttgatcaatt gcaaggctcg 60 ccacagatcg aagaaatcac agacaagtct ggaggcaacc agattgattc caacatccca 120 aacctcacgg acaatgaact tttagatcca atttccacca ccacgggcac gactcccaca 180 aacaacacgt cgaatggttt ataccctttt cctacatcag atgtgccctc tttgggcgat 240 gattccaaca ccggagacca tattgcgcat acacctgtcg tcacgtcacc gcaatcgtcc 300 atttccatca aatcagatgc acggcatatt aacccgtatg caaacggtat catcggaaat 360 aactactaca tgatttcaag gttcaacccc cctgcgtcat tgccgtatta tgatagtccc 420 caactatcgt ctggaacgac caattcgaac gtgaaatctt tgcaattcaa gaaacccaaa 480 ccgaagaagc ttcaaaacca gatgtccgga cctccaaaac ggcccgcttt tgtcatgaag 540 ttatggaaca tggtcaatga tccttccaac tccaaataca tctcgtggct acctgacgga 600 aaggccttcc aggtgagcga cagagagagc ttcatgagac atgtgttgcc caagtacttc 660 aaacacaata actttgcttc ctttgtgaga cagctgaaca tgtatggctg gcacaaaatt 720 caggatgtca actcagggtc ccttgttcaa ggtgaagaag tttggcaatt tgagaatcca 780 aatttcatca ggggcaagga gaatctgttg gataacatcg tcagaaaccg gtcttccaaa 840 gaggaggacg acgatatcga catcaacacc ttgctgatgg agttggagtc gatgaaacag 900 aaacagagga tgattgctga cgacctgagt agactcgttc aggacaacga gctactatgg 960 aaagagaatt acatggctag agaaagacac aaggctcaat cggaaactct tgacaagatc 1020 ttgcgatttc ttgtcacctt gtatggtggg tcgtccaagt ttctggaaag tgcaggagga 1080 gctcccagcg agtttctcga gatggcctcg aaaagagacg cacaggaaca gcaacaccat 1140 ccgcatggat cagatttcga tattcaacag cagatgcacc agcagcctag ctcgtactac 1200 cagcctcaaa atgggaacag caggttgatg ctgactcaca gagcacataa caatgggtcc 1260 aagtcgacct cgagagatac atctagcagc cagagcatta acaacggttc tgacgccagc 1320 gacttaccga tccaggagat ccgcagagga cccgagaacc agaacagcga acagctcgac 1380 ggctataagc cgtatccact ccaaggaacg ccgcaatttc aacatccgtt accgaacttc 1440 cagtcgcctg cttcaatggc caattcacca cgttcttact tccccgagat cagtccgcaa 1500 gtgccgcaat cttcggtccc cgccacgccg tccgcactgt cctctgcagc tcctttgcaa 1560 caagacacag atactcacat gcctcctgaa tatctcatgg gaaacatcaa ccagcagctg 1620 aacaagcagc agagctcgat ccggcagata aacgactgga tctcgcggct ggccagttca 1680 aaacttcctg acgagatcaa cgctaatcaa cagccactta tggatgattt tagaatggac 1740 gattttttac ttccgcagac cccgaacggc ggtgtcgatc cgtctttgaa cactgacgac 1800 aattttggtg agatctacaa cccttctcag caagagtcca acgaatccta cacagactcc 1860 tcgtcctcgc gggccagcac gttttccagc aaaaagagaa gagacagttc gccgtcctca 1920 gaggacaaga aaaggatcaa acaactttaa 1950 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 ttaactagta tgggcgcttt ccgacca 27 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 ctgaattctt aaacttgttt aatcctcttc ttgtc 35 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 ttatctagaa tgggcgcttt ccgacca 27 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 ctgaattctt aaagttgttt gatccttttc ttgtc 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 ctgaattctt aaacttgttt aatcctcttc ttgtc 35 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 caggaacatc gtatgggtaa acttgtttaa tcctcttctt gtc 43 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 ctgaattctt aaacttgttt aatcctcttc ttgtc 35 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 ctgaattctt agcccgcata gtcaggaaca tcgtatgggt a 41

Claims (8)

1. 다음의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(Hansenula polymorpha Heat Shock Factor 1; HpHSF1) 또는 이의 단편 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산 분자: (i) 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 한세눌라 폴리모르파 열충격 인자(HpHSF1); (ⅱ) 서열목록 제 1 서열과 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 열 충격 인자의 활성을 보유하는 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1); 또는 (ⅲ) 상기 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자의 단편으로서 열 충격 인자 활성을 보유하는 폴리펩타이드.
   
2. 삭제
3. 제 1 항의 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(HpHSF1)를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
   
4. 제 3 항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
   
5. 제 4 항의 숙주세포는 효모인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
   
6. (i) 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자(Hansenula polymorpha Heat Shock Factor 1; HpHSF1); (ⅱ) 서열목록 제 1 서열과 95％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고 열충격 인자의 활성을 보유하는 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자; 또는 (ⅲ) 상기 한세눌라 폴리모르파 열 충격 인자의 단편으로서 열 충격 인자 활성을 보유하는 폴리펩타이드.
   
7. 삭제
8. 삭제

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