CN109337921B

CN109337921B - 一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体及其应用

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Publication number: CN109337921B
Application number: CN201811019561.0A
Authority: CN
Inventors: 李爽; 察亚平; 卓敏; 朱晁谊
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2018-09-03
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2038-09-03
Also published as: CN109337921A

Abstract

本发明公开一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体及其应用，属于生物技术领域。本发明的重组载体可以敲除酿酒酵母基因组中的SED1基因，得到的突变菌株在裂解酶Zymolyase作用下能使细胞快速裂解，释放细胞内物质至胞外。操作对象为酿酒酵母，具有广泛适用性。裂解过程中无需添加额外试剂，成本廉价。裂解时间短，2h可将细胞完全裂解，大大缩短了以往酿酒酵母细胞裂解的时间。操作简便，不需玻璃珠等繁琐步骤和配制复杂裂解液，只需一种简单的缓冲液，大大简化了实验流程。因此，可利用本发明的酿酒酵母裂解方法进行酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和高通量筛选等，具有简易、快捷、廉价的优点，具有较广的应用前景。

Description

一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别提供一种构建酿酒酵母快速裂解工程菌的重组载体和供体DNA，以及通过其获得的酿酒酵母工程菌在酵母细胞内活性物质的提取、基因工程酵母表达系统表达产物的提取以及酵母细胞胞内表达重组蛋白(酶)快速检测的应用。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种广泛研究的单细胞真核微生物，具有复杂的细胞壁结构。酿酒酵母细胞壁厚度约100～300nm，类似“三明治”结构，主要由β-D-葡聚糖(β-D-glucan)、α-D-甘露聚糖(α-D-mannose)和少量的几丁质(chitin)组成。其中葡聚糖是最主要的结构成分，它与原生质体膜相连，起到维持细胞形态和正常渗透压的作用。甘露聚糖与蛋白质共价键相连形成甘露糖蛋白(mannoprotein)，甘露糖蛋白主要分布在细胞壁外层，可以过滤大分子物质。而几丁质只占细胞干重的1～2％，其还原端与β-1,3-葡聚糖支链的还原端以β-1,2键或β-1,4键的形式相连。

目前酿酒酵母破壁的方法有很多，根据作用细胞壁的结构部位不同，可分为破坏葡聚糖结构、破坏甘露糖结构、破坏蛋白质结构和破坏多处结构等。采用的方法包括酸碱破壁、微波破壁、超声波法破壁、单酶法和复合酶法等。虽然这些方法不断的改进，但仍存在操作繁琐、破壁效率低、时间较长和对仪器要求较高等问题。

酿酒酵母在生物研究领域应用越来越广泛，但现有的破壁方法严重限制了外源基因在酿酒酵母中的克隆、表达及活性鉴定，因此，建立简单快捷并可广泛推广的破壁方法、以有效实现酿酒酵母细胞来源的核酸、蛋白、酶、多肽等各种活性物质的提取制备以及基因工程酵母表达产物的活性鉴定和提取、生产尤为重要。

SED1基因存在于酿酒酵母基因组中，其翻译的蛋白Sed1p经过糖基化形成甘露糖蛋白，甘露糖蛋白与葡聚糖通过共价键结合最终锚定在细胞壁外侧(Shimoi H,etal.Sed1p is a major cell wall protein of Saccharomyces cerevisiae in thestationary phase and is involved in lytic enzyme resistance.J Bacteriol,1998,180:3381-7.)。因为甘露糖蛋白分布在细胞壁的外侧，所以部分研究学者将外源蛋白与Sed1p蛋白融合表达，使外源蛋白展示在细胞表面(Kuroda K,et al.Enhancement ofdisplay efficiency in yeast display sys-temby vector engineering and genedisruption.Appl Microbiol Biotechnol，2009,82:713–9.)。Sed1p蛋白可以维持细胞壁和线粒体基因组的稳定性，同时敲除SED1基因不但不会影响细胞的正常生长，反而还会提高酵母细胞对乳酸的耐受性(Phadnis N et al.Role of the putative structuralprotein Sed1p in mitochondrial genome maintenance.J Moliol,2004,342(4):1115-29；Toshihiro S,et al.Disruption of multiple genes whose deletion causeslactic-acid resistance improves lactic-acid resistance and productivity inSaccharomyces cerevisiae.J BIOSCI BIOENG,2013,115(5):467-474)。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种酿酒酵母裂解工程菌的构建方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法构建得到的酿酒酵母裂解工程菌。

本发明的另一目的在于提供通过上述酿酒酵母裂解工程菌的应用。

本发明的再一目的在于提供一种酿酒酵母裂解方法。

本发明提供一种可构建高效、快速地对酿酒酵母细胞壁破壁的方法。

本发明提供一种便捷、灵敏度高、耗时短、成本低的破壁步骤，易于实现酿酒酵母快速裂解。

SED1基因的表达与酿酒酵母的细胞壁结构有关，其表达的蛋白经糖基化之后转运至细胞壁，通过磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol)与细胞周质空间共价结合，同时与周围的葡聚糖形成β-1,6、β-1,3糖苷键使Sed1p糖蛋白锚定在细胞壁上。Sed1p糖蛋白属于甘露糖蛋白，其含量占细胞壁总蛋白的30％，是主要的细胞壁蛋白。敲除SED1基因后细胞壁的结构发生变化，降低细胞壁的坚固性，特别的增强其对裂解酶Zymolyase的灵敏性，而细胞生长并不受影响。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体，该重组载体包括自5′到3′顺次连接Cas9表达框和gSED1表达框；

所述的Cas9表达框核苷酸序列，可为Cas9表达框的任意序列，优选为序列表中SEQID No.1核苷酸序列。

所述的gSED1表达框核苷酸序列，可为gSED1表达框的任意序列，优选为序列表SEQID No.2核苷酸序列。

用于构建所述重组载体的出发载体可为任意一种酿酒酵母载体，优选p426(Addgene公司的商业化质粒p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t)和p414(Addgene公司的商业化质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t)载体。其中，以p426为出发载体，构建的重组载体为p426-Cas9-gSED1。

一种酿酒酵母裂解工程菌的构建方法，包括如下步骤：

将上述重组载体和供体DNA同时转化到酿酒酵母感受态细胞中，实现基因组中SED1基因的敲除，获得酿酒酵母突变株，即酿酒酵母裂解工程菌。

所述的供体DNA核苷酸序列，可为供体DNA的任意序列，优选为序列表SEQ ID No.3核苷酸序列。

所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741，酿酒酵母BJ5464，酿酒酵母CEN.PK2-1Ca。

所述的酿酒酵母突变株为酿酒酵母BY4741Δsed1，酿酒酵母BJ5464Δsed1，酿酒酵母CEN.PK2-1CaΔsed1。

一种酿酒酵母裂解工程菌，通过上述构建方法构建得到。

一种酿酒酵母裂解方法，本发明提供一种酿酒酵母快速裂解释放胞内活性物质如核酸、蛋白、多肽等的方法，及其在重组蛋白(酶)快速筛查方面的应用。包括酿酒酵母重组菌菌落PCR鉴定、质粒提取、蛋白释放以及胞内蛋白(酶)快速筛查等。具体来讲，包括以下步骤：

(1)将外源基因表达载体转化到上述酿酒酵母突变株中，得到重组突变菌株；

(2)培养重组突变菌株，加入裂解酶Zymolyase孵育，酿酒酵母细胞裂解，胞内物质释放到胞外；

(3)对释放到胞外的胞内物质可以进行酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和胞内蛋白(酶)高通量筛选。

所述裂解酶Zymolyase浓度为1～10U/mL，孵育时间为1～6h。

优选的，所述的裂解酶Zymolyase浓度为5～10U/mL。

所述酿酒酵母裂解工程菌或酿酒酵母裂解方法在酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和胞内蛋白(酶)高通量筛选中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)操作对象为酿酒酵母，它是生物领域使用最广泛的单细胞真核生物，具有广泛适用性。

(2)裂解时间短，2h可将细胞完全裂解，大大缩短了以往酿酒酵母细胞裂解的时间。

(3)裂解过程中无需添加额外试剂(如β-巯基乙醇等)和玻璃珠，操作简洁、成本廉价。

(4)操作简便，不需繁琐的步骤和配制复杂的裂解液，只需一种简单的缓冲液即可，大大简化了实验流程。

(5)应用较广，裂解后的细胞可进行酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和胞内蛋白(酶)高通量筛选等，具有较广的应用前景。

(6)本发明的重组载体可以敲除酿酒酵母基因组中的SED1基因，得到的突变菌株在裂解酶Zymolyase作用下能使细胞快速裂解，释放细胞内物质至胞外。因此，可以利用本发明的酿酒酵母裂解方法进行酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和胞内蛋白(酶)高通量筛选等，具有简易、快捷、廉价的优点。

附图说明

图1是重组载体p426-Cas9-gSED1图谱。

图2是酿酒酵母突变菌株和野生菌株对Zymolyase的敏感度；其中，PK2表示CEN.PK2-1Ca。

图3是裂解体系应用于酿酒酵母菌落PCR的结果图。

图4是裂解体系应用于蛋白质鉴定的结果图。

图5是裂解体系应用于酶活检测的结果图。

图6是裂解体系应用于酶活高通量筛选的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特别说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所用的载体YEp352-TEF2p-CYC1t，其构建过程如下：

(1)以酿酒酵母BY4741基因组为模板，分别以P15/P16和P17/P18为引物对，分别扩增得到CYC1终止子片段和TEF2启动子片段。将YEp352载体(Addgene公司的商业化质粒)和CYC1片段用SalI/PstI双酶切，得到的线性片段进行T4连接酶连接，获得载体YEp352-CYC1t。

(2)将上述获得的YEp352-CYC1t载体和TEF2片段用BamHI/XbaI双酶切，得到的线性片段进行T4连接酶连接，获得载体YEp352-TEF2p-CYC1t。

P15：5′-TTTACAGTCGACGGGCCGCATCATGTAATTA-3′；

P16：5′-TTTACACTGCAGGCAAATTAAAGCCTTCGAG-3′；

P17：5′-TTTACAGGATCCATTACCCATAAGGTTGTTTGA-3′；

P18：5′-GAGCGATCTAGAGTTTAGTTAATTATAGTTCGT-3′。

实施例1酿酒酵母重组载体和供体DNA的构建

构建酿酒酵母重组载体p426-Cas9-gSED1和供体DNA，其具体构建方法如下：

1.重组载体p426-gSED1的构建

以p426载体为模板，分别以P1/P2和P3/P4为引物对，分别扩增得到SED1-1和SED1-2片段。利用

II重组克隆试剂盒，将SED1-1和SED1-2两个片段重组，获得携带有SED1引导RNA序列的重组载体p426-gSED1。

P1：5′-TAATAATGGTTTCTTAGTATGA-3′；

P2：5′-CCGATGTCACTTCCTCCTCTGATCATTTATCTTTCACTGC-3′；

P3：5′-AGAGGAGGAAGTGACATCGGGTTTTAGAGCTAGAAATA-3′；

P4：5′-ACTAAGAAACCATTATTATCAT-3′。

2.重组载体p426-Cas9-gSED1的构建

以p414载体为模板，以P5/P6为引物扩增含有启动子TEF1p、基因Cas9和终止子CYC1t的片段。以P7/P8为引物扩增重组载体p426-gSED1，得到载体p426-gSED1的线性化片段。将上述扩增得到的片段，利用

II重组克隆试剂盒，得到重组载体p426-Cas9-gSED1，其图谱如图1所示。

P5：5′-CTAAAGGGAACAAAAGCTGGCATAGCTTCAAAATGTTTCTA-3′；

P6：5′-ATACATTATCTTTTCAAAGAGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCC-3′；

P7：5′-GCTCGAAGGCTTTAATTTGCTCTTTGAAAAGATAATGTATGAT-3′；

P8：5′-AGAAACATTTTGAAGCTATGCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGT-3′。

3.合成可以阻断SED1表达的供体DNA

引物P9(5′-TACTTTGGCCCAATTTTCCAACAGTACATCTGCTTCTTAAACCGATGTCACTTCCTCCT-3′)，P10(5′-TGTGATAGTTACTGAGCCAGAGGAAGTGGAGATGGAAGAGGAGGAAGTGACATCGGTTT-3′)互为模板扩增得到供体DNA。

4.酵母基因组SED1位点编辑验证

将p426-Cas9-gSED1和供体DNA同时转化到S.cerevisiae BY4741(MATa his3Δ1leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0，ATCC 4040002)，BJ5464(MATαura3-52 trp1 leu2Δ1 his3Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL，ATCC 208288)和CEN.PK2-1Ca(MATa trp1-289leu2-3 leu2-112 ura3-52 his3Δ1 MATa trp1-289 leu2-3 leu2-112 ura3-52 his3Δ1，ATCC MYA-1108^TM)的感受态细胞中，在Cas9蛋白协助下，SED1基因转录的gRNA序列进行定位，同时供体DNA重组至编辑位点来阻断SED1基因的正常表达，实现基因组中SED1基因的敲除，获得突变株S.cerevisiae BY4741 Δsed1，BJ5464Δsed1，CEN.PK2-1Ca Δsed1。

随机挑选5个酿酒酵母转化子，以P11(5′-CCCTCTTTTGAACTGTCATA-3′)/P12(5′-GTAGTTGGTGGGAAAGCTGA-3′)为引物进行菌落PCR扩增，并将PCR产物送测。测序结果显示，5个转化子的目的基因SED1位点均发生突变，即成功地敲除了SED1基因。

实施例2酿酒酵母快速裂解方法

1.酿酒酵母的复苏活化

(1)将S.cerevisiae BY4741，BJ5464，CEN.PK2-1Ca的突变菌株和野生菌株分别从-80℃冰箱划线至YPD平板培养基上，在30℃条件下培养48h。

(2)挑取单菌落，分别接种至YPD液体培养基中，在30℃条件下培养至稳定期。

2.酿酒酵母悬浮液的制备：

(1)将培养的菌液3000×g，离心5min。

(2)获得的菌体用缓冲液Tris-HCl(pH 7.5)洗涤2次。

(3)用缓冲液Tris-HCl(pH 7.5)重悬，使其OD₆₀₀至0.6～0.7，得到酿酒酵母悬浮液。

3.与裂解酶Zymolyase孵育

分别取200μL酿酒酵母悬浮液加入到96孔板中，加入不同浓度(1U/mL、5U/mL、10U/mL)Zymolyase，在30℃，250rpm振荡培养6h，每1h测得OD₆₀₀，设置3个平行组，计算细胞残余率OD₆₀₀(％)。

其中，T表示不同时间点1h，2h，3h...

0表示0h。

4.实验结果(图2)表明，除了1U/mL Zymolyase对细胞的作用无明显效应外，在5U/mL和10U/mL Zymolyase浓度下，OD₆₀₀(％)随着时间的增加逐渐的下降，说明Zymolyase对菌株的效应浓度为5U/mL和10U/mL。同时BY4741Δsed1，BJ5464Δsed1和CEN.PK2-1Ca Δsed1突变菌株比其野生菌株裂解得都要快，其在5U/mL Zymolyase孵育6h后裂解效率分别提高了12.23％，12.46％和16.64％，同样在10U/mL Zymolyas条件下其效率分别有19.24％，9.47％和11.58％的提高，说明突变菌株对Zymolyase更敏感，更易于细胞的快速裂解。另外，用10U/mL Zymolyase处理突变菌株6h后，BJ5464Δsed1和CEN.PK2-1Ca Δsed1 OD₆₀₀(％)分别降到了29.19％和37.04％，细胞几乎完全被裂解。

综上所述，与野生菌株相比，突变菌株对Zymolyase更敏感，更易被裂解，且5U/mLZymolyase裂解酶便可达到裂解细胞的目的，节约了成本。另外操作过程简单，不需额外有机试剂的添加和烦琐的物理处理步骤，是一种理想的细胞快速裂解方法。

实施例3酿酒酵母快速裂解方法在菌落PCR中的应用

1.酿酒酵母菌落PCR

(1)挑取按照实施例6获得的S.cerevisiae BY4741重组野生菌株和重组突变菌株的单菌落，在SD(Ura)板上划patch，30℃培养。

(2)patch板上挑取少许菌体至20μL Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液里，震荡使其均匀。

(3)分别加入1U Zymolyase，30℃，孵育30min，60℃，失活5min。

(4)14,000rpm，离心2min，取0.5μL上清为模板进行PCR，引物为P13/P14。

(5)琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2.实验结果表明，重组突变菌株和重组野生菌株都扩增出了目的条带，但重组突变菌株扩增的条带比重组野生菌株的要亮(见图3)，说明突变菌株裂解的更充分，释放更多的目的基因到上清。该方法比传统的反复冻融进行菌落更省时，只需要35min便可达到裂解细胞的目的，而反复冻融的方法往往需要2h以上。并且该方法操作简便，不需要额外的实验材料如液氮等，所以也大大节约了成本。因此利用该体系进行酵母菌落PCR是一种较理想的方法。

实施例4酿酒酵母快速裂解方法在质粒提取中的应用

1.菌株的培养

(1)从-80℃复苏活化按照实施例6获得的S.cerevisiae BY4741重组突变菌株和重组野生菌株，30℃培养。

(2)挑取单菌落接入到SD(Ura)液体培养基中，30℃培养36h。

2.细胞的裂解

(1)将菌液3000×g，5min离心收集菌体，每管收集菌体5OD。

(2)将重组突变菌株用0.5mL Tris-HCl(pH 7.5)裂解缓冲液重悬至2mL离心管中，然后加入25U Zymolyase裂解酶，在30℃，250rpm条件下裂解细胞0.5h。

(3)重组野生菌株按照Omega和Sangon酵母质粒提取试剂盒的方法将细胞裂解。

3.纯化处理

(1)重组突变菌株裂解后加入1μL 21μg/μLRNase A缓冲液，去除RNA。余下纯化步骤参考Sangon试剂盒说明书进行。

(2)重组野生菌株按照Omega和Sangon酵母质粒提取试剂盒的方法进行纯化质粒。

4.对提取到的质粒进行鉴定

将提取到的质粒(1μL)分别转化到20μL E.coli DH5α感受态细胞中，统计转化子个数。

5.通过对各质粒提取方法的比较(表1)可以看出，本发明建立的酵母质粒提取方法与Sangon试剂盒相比，大大缩短了操作所需时间(从3.5～4h缩短至约1h)；而跟Omega试剂盒相比，操作过程中无需添加β-巯基乙醇和玻璃珠，大大简化了操作步骤，操作时间缩短了约0.5h。此外本发明涉及的质粒提取方法，通过转化实验也验证质粒质量均优于商业化Sangon和Omega试剂盒所得质粒。

表1与市面常用酵母质粒提取试剂盒操作步骤及质粒提取质量比较

实施例5酿酒酵母快速裂解方法在蛋白质鉴定中的应用

1.菌株的培养

(2)挑取单菌落接入到SD(Ura)液体培养基中，30℃，200rpm培养36h。

2.细胞的裂解

(1)3000×g，5min离心收集菌体，每管收集菌体10OD。

(2)用10mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液洗涤两次，最终用1mL缓冲液进行重悬。

(3)加入50U Zymolyase，30℃，250rpm细胞裂解3h，对照组加入Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液。

(4)为了优化裂解的时间，采用同样的裂解方法裂解细胞，并每小时进行取样。

3.蛋白质的鉴定

3000×g，5min离心取上清，SDS-PAGE鉴定。

4.实验结果表明，与对照实验结果相比突变菌株和野生菌株均在70kD左右出现目的条带，但目的条带比理论计算值要大，原因在于目的蛋白在真核细胞表达时被修饰例如糖基化，使实际检测的条带稍大。从图4a可以看出目的蛋白Gus成功地在酵母细胞中表达。并且突变菌株的目的条带比野生的要亮一些，表明突变菌株裂解得更充分，将更多的目的蛋白释放到胞外。图4b表明通过优化细胞裂解时间，突变菌株只在1h内便可检测到目的条带，而野生菌株则需要2h的时间，说明突变菌株更易被裂解酶裂解，释放胞内目的蛋白至胞外。

上述实验结果表明，本发明的细胞快速裂解方法可以应用于目的蛋白的鉴定，且此方法简便易行，成本较低，时间较短，无需复杂的裂解缓冲液和昂贵的仪器，具有广泛的应用价值。

实施例6酿酒酵母快速裂解方法在酶活检测中的应用

1.构建目的基因表达载体

以E.coli DH5α基因组DNA为模板，以P13(5′-TAATTAACTAAACTCTAGAAATGTTACGTCCTGTAGAAACCC-3′)，P14(5′-ACATGATGCGGCCCGTCGACTCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3′)为引物扩增β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)片段。

将载体YEp352-TEF2p-CYC1t用XbaI/SalI双酶切，纯化得到该载体的线性化片段。利用

II重组克隆试剂盒，将载体的线性化片段与GUS基因片段进行重组，得到目的基因表达载体YEp352-TEF2p-GUS-CYC1t。

将上述构建的表达载体转化到S.cerevisiae BY4741，BJ5464，CEN.PK2-1Ca突变菌株和野生菌株的感受态细胞中，得到重组突变菌株和重组野生菌株。

2.菌株的培养

挑取单菌落接入到SD(Ura)液体培养基中，30℃，200rpm培养至稳定期。

3.细胞的裂解

按照实施案例2方法进行细胞的快速裂解。

4.Gus酶活的检测

(1)将90μL PBS(pH 7.0)缓冲液加入到96孔板中，然后加入底物1g/L p-nitrophenyl-β,D-galactopyranoside(pNPG)80μL。

(2)取10μL裂解液加入上述鉴定体系中，37℃，反应10min。

(3)加入20μL 1M NaOH终止反应。

(4)用酶标仪测定OD₄₀₅值。

(5)测定不同浓度(0、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500μM)产物对硝基苯酚(pNP)的OD₄₀₅值，绘制标准曲线。

(6)根据标准曲线计算Gus酶活，即在pH7.0，37℃条件下，每小时内底物释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量为1个活力单位，记作U。

5.实验结果(图5)表明，1U/mL Zymolyase对细胞几乎无作用，释放到胞外的酶较低，其结果与OD₆₀₀(％)变化相一致。在5U/mL和10U/mL Zymolyase孵育下，S.cerevisiaeBY4741，BJ5464，CEN.PK2-1Ca大量细胞被裂解，6h后其酶活达到了最高值(约30U/mL)，说明细胞得到了充分地裂解。在5U/mL Zymolyase作用4h后S.cerevisiae BY4741 Δsed1的酶活达到了最大值，是野生菌株的2倍以上，而其野生菌株6h时的酶活比突变菌株还要低，说明突变菌株更易裂解，更易释放目的蛋白酶到胞外。虽然S.cerevisiae BJ5464，CEN.PK2-1Ca的突变菌株与野生菌株酶活差异不显著，但是整体来看突变菌株的酶活比野生菌株的要高，而且5h时也可以达到最高酶活。另外，在10U/mL Zymolyase条件下，突变菌株的酶活也是比野生菌株的要高，而且在较短的时间内可以得到较高的酶活，4h时的酶活已达到较高值，说明增加裂解酶的浓度可以在较短的时间内释放更多的酶活，缩短了实验周期。

由上述实验结果来看，在5U/mL Zymolyase条件下突变菌株可得到充分地裂解，释放胞内目的蛋白酶至胞外，更易检测酶活。因此本发明的酵母快速裂解方法可以很好地运用于胞内目的蛋白酶的检测，且步骤简便，无需有机试剂的添加，保证了目的蛋白酶的活性，是一种较好的酵母胞内蛋白酶的测定方法。

实施例7酿酒酵母快速裂解方法在高通量筛选中的应用

1.菌株的培养

(1)将实施例6获得的目的基因表达载体YEp352-TEF2p-GUS-CYC1t转化到S.cerevisiae BY4741突变菌株和野生菌株的感受态细胞中，30℃培养。

(2)用牙签挑取单菌落均匀地转接到SD(DUra)固体培养基上，继续30℃培养24h。

(3)将长出来的单菌落影印到硝酸纤维素膜上，有菌落的一面朝上，在SD(DUra)固体培养基上继续培养12h。

2.酶活的高通量筛选

(1)用含有20U/mL Zymolyase Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液浸湿滤纸，将硝酸纤维素膜放置到浸湿后的滤纸上，有菌落的一面朝上，30℃裂解2h。

(2)用含有底物pNPG的缓冲液将滤纸浸湿，将硝酸纤维素膜放置到浸湿后的滤纸上，有菌落的一面朝上，37℃培养30min。

(3)培养后将硝酸纤维素膜转移至用0.1M NaOH浸湿后的滤纸上，30℃培养约1h至黄色出现。

(4)拍照，记录结果。

3.由图6可以看出，与对照组S.cerevisiae BY4741野生菌相比，突变菌株用上述方法进行酶活检测后，其菌落周围均出现了黄色圈，显色率得到了100％，说明胞内的Gus目的蛋白酶得到了充分地释放，与底物反应后生成了黄色的产物。而野生菌的菌落周围几乎看不到黄色圈，表明突变菌株可以应用于胞内酶的高通量筛选。

由上述结果可以看出，本发明的酶活筛选过程只需要硝酸纤维素膜和滤纸，不需要大型昂贵的筛选仪器如流式细胞仪等，大大较低了成本，同时简化了操作步骤。另外本发明的酶活高通量筛选方法只需要3.5h，且阳性率达到了100％，表明此筛选方法时间短，效率高。因此本发明的筛选方法是一种较理想的酶活高通量筛选方法。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas9表达框核苷酸序列

<400> 1

catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg gactccgcgc 60

atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct ctttcttcct 120

ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt 180

ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaaa 240

tttttttttt gatttttttc tctttcgatg acctcccatt gatatttaag ttaataaacg 300

gtcttcaatt tctcaagttt cagtttcatt tttcttgttc tattacaact ttttttactt 360

cttgctcatt agaaagaaag catagcaatc taatctaagt tttctagaac tagtggatcc 420

cccgggaaaa atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg 480

ttgggccgtc attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa 540

taccgatcgc cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga 600

gacggccgaa gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa 660

tcggatctgc tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt 720

cttccatagg ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc 780

aatctttggc aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca 840

tctgaggaag aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc 900

gctggcgcat atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga 960

caacagcgat gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga 1020

agagaacccg atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc 1080

caaatcccgg cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct 1140

gtttggtaat cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga 1200

cctggccgaa gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa 1260

tctgctggcc cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc 1320

agacgccatt ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct 1380

gagcgctagt atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc 1440

ccttgtcaga cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa 1500

tggctacgcc ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa 1560

gcccatcttg gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga 1620

tctgttgcgc aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg 1680

cgaactgcac gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag 1740

ggaaaagatt gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg 1800

gggaaattcc agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa 1860

cttcgaggaa gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa 1920

ctttgataaa aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta 1980

cttcacagtt tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc 2040

agcattcctg tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg 2100

gaaagttacc gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc 2160

tgttgaaatc agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct 2220

cctgaaaatc attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga 2280

ggacattgtc ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa 2340

aacttacgct catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac 2400

aggatggggg cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa 2460

gacaatcctg gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat 2520

ccatgatgac tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg 2580

ggacagtctt cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat 2640

actgcagacc gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga 2700

gaatatcgtt atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag 2760

tagggaaagg atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa 2820

ggaacaccca gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca 2880

gaacggcagg gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga 2940

cgtggatcat atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt 3000

gacaagatcc gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa 3060

gaaaatgaaa aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt 3120

cgataatctg actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat 3180

caaaaggcag cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc 3240

acgcatgaac accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac 3300

tctgaagtct aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga 3360

gatcaacaat taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact 3420

tatcaaaaaa tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga 3480

tgttaggaaa atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt 3540

cttttacagc aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat 3600

tcggaagcga ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg 3660

tagggatttc gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa 3720

gaccgaagta cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga 3780

caagctgatc gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc 3840

tacagtcgct tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact 3900

caaaagcgtc aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa 3960

ccccatcgac tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa 4020

gcttcccaag tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc 4080

gggcgagctg cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta 4140

tctggccagc cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct 4200

gttcgtggaa caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc 4260

caaaagagtg atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca 4320

cagggataag cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa 4380

cttgggcgcg cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac 4440

ctctacaaag gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga 4500

aacaagaatc gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag 4560

gaaggtgtga tctcttctcg agtcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct 4620

ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct 4680

atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt 4740

ttttttctgt acagacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag 4800

gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc 4830

<210> 2

<211> 388

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> gSED1表达框核苷酸序列

<400> 2

tctttgaaaa gataatgtat gattatgctt tcactcatat ttatacagaa acttgatgtt 60

ttctttcgag tatatacaag gtgattacat gtacgtttga agtacaactc tagattttgt 120

agtgccctct tgggctagcg gtaaaggtgc gcattttttc acaccctaca atgttctgtt 180

caaaagattt tggtcaaacg ctgtagaagt gaaagttggt gcgcatgttt cggcgttcga 240

aacttctccg cagtgaaaga taaatgatca gaggaggaag tgacatcggg ttttagagct 300

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc 360

ggtggtgctt tttttgtttt ttatgtct 388

<210> 3

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 供体DNA核苷酸序列

<400> 3

tactttggcc caattttcca acagtacatc tgcttcttaa accgatgtca cttcctcctc 60

ttccatctcc acttcctctg gctcagtaac tatcaca 97

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P1

<400> 4

taataatggt ttcttagtat ga 22

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P2

<400> 5

ccgatgtcac ttcctcctct gatcatttat ctttcactgc 40

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P3

<400> 6

agaggaggaa gtgacatcgg gttttagagc tagaaata 38

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P4

<400> 7

actaagaaac cattattatc at 22

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P5

<400> 8

ctaaagggaa caaaagctgg catagcttca aaatgtttct a 41

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P6

<400> 9

atacattatc ttttcaaaga gcaaattaaa gccttcgagc gtcc 44

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P7

<400> 10

gctcgaaggc tttaatttgc tctttgaaaa gataatgtat gat 43

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P8

<400> 11

agaaacattt tgaagctatg ccagcttttg ttccctttag t 41

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P9

<400> 12

tactttggcc caattttcca acagtacatc tgcttcttaa accgatgtca cttcctcct 59

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P10

<400> 13

tgtgatagtt actgagccag aggaagtgga gatggaagag gaggaagtga catcggttt 59

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P11

<400> 14

ccctcttttg aactgtcata 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P12

<400> 15

gtagttggtg ggaaagctga 20

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P13

<400> 16

taattaacta aactctagaa atgttacgtc ctgtagaaac cc 42

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P14

<400> 17

acatgatgcg gcccgtcgac tcattgtttg cctccctgct 40

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P15

<400> 18

tttacagtcg acgggccgca tcatgtaatt a 31

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P16

<400> 19

tttacactgc aggcaaatta aagccttcga g 31

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P17

<400> 20

tttacaggat ccattaccca taaggttgtt tga 33

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P18

<400> 21

gagcgatcta gagtttagtt aattatagtt cgt 33

Claims

1.一种构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体，其特征在于所述重组载体包括自5ʹ到3ʹ顺次连接Cas9表达框和gSED1表达框；

所述的Cas9表达框核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1核苷酸序列；

所述的gSED1表达框核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2核苷酸序列；

用于构建所述重组载体的出发载体为任意一种酿酒酵母载体。

2.根据权利要求1所述的构建酿酒酵母裂解工程菌的重组载体，其特征在于：

用于构建所述重组载体的出发载体为p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t和p414-TEF1p-Cas9-CYC1t载体。

3.一种酿酒酵母裂解工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

将权利要求1～2任一项所述的重组载体和供体DNA同时转化到酿酒酵母感受态细胞中，实现基因组中SED1基因的敲除，获得酿酒酵母突变株，即酿酒酵母裂解工程菌。

4.根据权利要求3所述的酿酒酵母裂解工程菌的构建方法，其特征在于：

所述的供体DNA核苷酸序列为序列表SEQ ID No.3核苷酸序列。

5.根据权利要求3或4所述的酿酒酵母裂解工程菌的构建方法，其特征在于：

所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741，酿酒酵母BJ5464或酿酒酵母CEN.PK2-1Ca。

6.一种酿酒酵母裂解工程菌，其特征在于：通过权利要求3～5任一项所述的构建方法构建得到。

7.一种酿酒酵母裂解方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将外源基因表达载体转化到权利要求6所述的酿酒酵母裂解工程菌中，得到重组突变菌株；

（2）培养重组突变菌株，加入裂解酶Zymolyase孵育，酿酒酵母细胞裂解，胞内物质释放到胞外；

（3）对释放到胞外的胞内物质进行酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和胞内蛋白高通量筛选。

8.根据权利要求7所述的酿酒酵母裂解方法，其特征在于：

所述裂解酶Zymolyase浓度为1～10 U/mL，孵育时间为1～6 h。

9.权利要求6所述的酿酒酵母裂解工程菌或权利要求7或8所述的酿酒酵母裂解方法在酶活检测、菌落PCR、质粒提取、蛋白鉴定和胞内蛋白高通量筛选中的应用。