TWI541349B - 經截短之甘油醛－３－磷酸脫氫酶啟動子 - Google Patents

Description

經截短之甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子

本發明係關於截短的甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子以及一構築體，其包含操作性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子之本發明之啟動子。

分子農場在各種醫藥蛋白質的製造方面已吸引大家的注意，包括酶、疫苗、抗體、荷爾蒙等。可食用蕈類被視為生產重組蛋白的適當宿主，特別是可食性疫苗的開發。使用蕈類作為分子農場具有基於植物系統合併包括完整複製、快速生長、控制條件下大規模製造及較低的基因汙染等優點。然而，蕈類分子農場的成功仰賴有效率的轉形及基因表現。

在合適之宿主中使用強效啟動子以表現異源基因為生物技術應用中的主要策略。甘油醛-3-磷酸去氫酶(GPD，EC 1.2.1.12)啟動子為可被任何碳源誘發之強效結構性啟動子，且已被廣泛使用於啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯得畢赤酵母菌(Pichia pastoris)及其他酵母菌中表現異源蛋白質。在糖解及糖新生途徑中，GPD為主要酵素之一，在啤酒酵母菌及其他高等真核細胞中，GPD最高為可溶性細胞蛋白質含量的5%。此外，gpd mRNA佔酵母菌中聚(A)+RNA的2~5%。這些觀察到的現象建議gpd基因係為高活性啟動子所調節。事實上，已有報導指出帶有同源gpd啟動子區域之載體可有效率地主導酵 母菌及絲狀真菌中異源基因之表現。然而，用於在子囊菌(ascomycetes)綱之絲狀真菌中表現的已知表現載體(其含基因調節元素)，無法有效率地在擔子菌(basidiomycetes)綱之絲狀真菌中表現。

gpd基因亦已從擔子真菌中選殖出，此等真菌包含裂褶菌(Schizophyllum commune)、白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、洋菇(Agaricus bisporus)(Harmsen等人，1992，)及香菇(Lentinula edodes)。在這些菇類中，僅在洋菇、金針菇(Flammulina velutipes)及香菇中成功地以同源gpd啟動子進行基因轉形(Hirano等人，2000；Kuo等人，2004；van de Rhee等人，1996)。雖然異源啟動子已經用於表現抗藥標記基因，以其進行之基因轉形並未成功地表現異源基因。為成功且有效地表現異源基因，很重要的一點是宿主細胞自己之轉錄機構要能辨識啟動子序列。Chun-Yi Kuo等人證實濕黴素B磷酸轉移酶(hygromycin B phosphotransferase)基因(hpt)(一種異源基因)可於金針菇中表現(Kuo等人，2004，Applied Microbiology and Biotechnology,65(5),593-9)。然而，亦發現在某些擔子菌中，gpd基因即使高度類似，其啟動子區域卻顯著不同。US 7,777,021提供一種Pleurotus之甘油醛-3-磷酸去氫酶(GPD)啟動子及一構築體，其包含操作性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子之啟動子。

然而，仍有需要增加擔子菌中甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子基因表現的需要。

本發明之一目的係提供一分離的核酸，其包含擔子菌甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子，其中在5'側翼區域(5' flanking region)中具有GC含量高於約40%的片段被刪除。

本發明之另一目的為提供一構築體，其包含本發明之啟動子，該啟動子操縱性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子。

本發明之進一步目的為提供一轉型菇類，其包含本發明之構築體。

圖1為全長1256bp的金針菇gpd啟動子。灰色陰影區為三個CAAT框；定位的迴回文序列以雙向箭頭表示，左向箭頭虛線表示D1至D4的每個刪除的片段。

圖2為具不同長度的gpd啟動子的轉形株的生長率。

圖3為基因組DNA的PCR產物的電泳圖。使用egfp專一性引子，產生的PCR產物的大小約720bp。P，N：陽性和陰性對照組；W：野生型金針菇。

圖4顯示南方印跡的結果。將10μg的金針菇基因組DNA用限制酶NcoI和BamHI消化。分析轉形株D0至D3，每一指出一個或兩個拷貝數。

圖5顯示D1到D4轉形株的西方印跡分析。大腸桿菌衍生重組EGFP作為陽性對照組(PC)，而陰性對照組為野生型金針菇的總可溶性蛋白質。其他為D0到D3，如圖所示。

圖6為螢光顯微鏡下篩選的轉化株的結果。以相同的顯微鏡設備(激發濾片，450~490nm；分色濾光器，505nm；屏障過濾器，520nm)。採取40倍視野取得影像。(A)野生型金針菇菌絲體使用亮視野顯微鏡(右)和落射螢光(epi-fluoresence)(左)檢查。當與帶有全長gpd啟動子的轉形株相較，D0(B)時，該D1(C)的轉形株顯示較強的螢光強度。Bar=50μm。

圖7顯示IVIS頻譜評估的金針菇子實體。如照片所示的螢光強度，轉形株D1(a)及D3(b)可與野生型(d)區別，而全長的轉形株(c)顯示較截短的轉形株，呈現較低的落射螢光。

圖8顯示egfp蛋白定量的結果。以間接三明治ELISA法測定具不同啟動子長度的各組的EGFP表現量。前5個為具全長gpd啟動子(D0)，然 後為一系列的D1至D4轉形株。

本發明驚訝地發現部分刪除的甘油醛-3-磷酸去氫酶(gpd)啟動子可增強擔子菌綱真菌的基因表現(甚至異源基因表現)。藉由發現這些gpd啟動子，可構築在蕈類表現異源基因的表現系統。

根據本發明，本文中所用之名詞「經分離的」係指經分離之核酸分子其(經由人類操作)存在於其原生環境之外，因此並非天然產物。一經分離之核酸分子可以純化形式存在，或存在於非原生環境，例如基因轉殖之宿主細胞。

本文中所用之名詞「啟動子」係指一聚核苷酸分子，其自然狀態係位於開啟讀碼框(open reading frame，或蛋白質編碼區域)之轉譯起始密碼子之上游或5'端，且其牽涉RNA聚合酶II及其他蛋白質(反式調控轉錄因子)之辨識及結合，以開始進行轉錄。當啟動子操縱性連結至可轉錄聚核苷酸分子時，啟動子典型地以類似於正常連結於啟動子之聚核苷酸分子之轉錄方式，使此可轉錄聚核苷酸分子進行轉錄。啟動子可包含已知啟動子經處理後所製造之人工、嵌合或雜交之啟動子。此等啟動子亦可結合來自一或多個啟動子之順式元件(LB-element)，例如，以異源調節單元本身之部分或完整之調節單元加入至活性啟動子。

本文中所用之名詞「操縱性連結」係指兩核酸序列實際上或功能上相關。例如，如果啟動子或調節性DNA序列操縱性連結或處於調節性DNA序列會影響結構性DNA編碼之表現量之情況下，啟動子或調節性DNA序列係為與編碼RNA或蛋白質之DNA序列「相關」。

本文中所用之名詞「可轉錄聚核苷酸分子」係指可轉錄為RNA分子之任何聚核苷酸分子。

本文中所用之名詞「異源核酸序列」係指與所導入之宿主基因體非自然關聯之核酸序列，包含天然存在之核酸序列之非天然存在複數 複製體。

本文中所用之名詞「聚核苷酸構築體」係指衍生自任何來源之任何重組聚核苷酸(例如質體、黏質體(cosmid)、病毒、自動複製聚核苷酸分子、噬菌體或線性或環狀單股或雙股DNA或RNA聚核苷酸分子)，能夠進行基因體嵌合或獨立複製，包含由一或多個聚核苷酸分子以功能性操作方式連結成之聚核苷酸分子。名詞「聚核苷酸構築體」及「構築體」在本文中可交換使用。

本文中所用之名詞「經轉形的(transformed)」係指經導入外來聚核苷酸分子(例如構築體)之細胞、組織、器官或生物。較佳地，導入之聚核苷酸分子嵌入受體細胞、組織、器官或生物之基因體DNA，致使導入之聚核苷酸分子傳承至後代。

本文中所用之名詞「表現」包括涉及多肽生產的任何步驟，包括但不限於轉錄、後轉錄修飾、轉譯、後轉譯修飾及分泌。

本文中所用之名詞「表現載體」係指線狀或環狀DNA分子，其包括編碼多肽且操縱性連結至其他表現用的核苷酸的聚核苷酸。

本文中所用之名詞「宿主細胞」包括適合於以核酸構築體或包括本發明聚核苷酸之表現載體進行轉形、轉染、轉導及其類似的任何細胞類型。

本發明基於驚訝地發現擔子菌綱真菌的gpd啟動子可被截短以去除位於其5'側翼區域的高GC含量片段，及該截短的gpd啟動子可增強蛋白質表現。因此，本發明提供一種分離的核酸，包括擔子菌類之甘油醛-3-磷酸去氫酶(gpd)啟動子，其中位於5'側翼區域的GC含量高於40%的片段被刪除。

在另一具體實施例，gpd啟動子係得自擔子菌綱真菌。較佳地，gpd啟動子係得自Schizophyllum,Phanerochaete,Agaricus,Lentinula,Flammulina或Pleurotus。較佳地，gpd啟動子係得自Schizophyllum commune,Phanerochaete chrysosporium,Agaricus bisporus,Lentinula edodes,Flammulina velutipes,Pleurotus ostreatus,Pleurotus pulmonarius或Pleurotus populinus。更佳地，gpd啟動子具有如SEQ ID NO：1所示的核酸序列，其為擔子菌綱真菌的通用啟動子(universal promoter)。SEQ ID NO：1的序列如下所示：

在一本發明之較佳具體實施例，本發明提供一種分離的核酸，包括含有如SEQ ID NO：1所示的甘油醛-3-磷酸去氫酶(gpd)啟動子，其中位於5'側翼區域的GC含量高於40%的片段被刪除。

根據本發明，gpd啟動子之位於5'側翼區域的刪除片段具有GC含量大於約44%、約45%、約50%、約51%、約52%、約53%、約54%、約55%或約56%。在一具體實施例，gpd啟動子之位於5'側翼區域的刪除片段具有GC含量之範圍為約40%至約75%；較佳為約44%至約75%、約44%至約70%、約44%至約65%、約44%至約60%、約45%至約75%、約45%至約70%、約45%至約65%、約45%至約60%、約50%至約75%、約50%至約70%、約50%至約65%或約50%至約60%。

在一較佳具體實施例，gpd啟動子之位於5'側翼區域的刪除片段具有位於位置自-1256至-626(SEQ ID NO：4)的序列。較佳地，SEQ ID NO：1上之gpd啟動子之位於5'側翼區域的刪除片段具有位於選自下列群組的位置的序列：SEQ ID NO：1的-1256至-1149(SEQIDNO：2)、SEQ ID NO：1的-1256至-791(SEQ ID NO：3)及SEQ ID NO：1的-1256至-626(SEQ ID NO：4)。

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3

SEQ ID NO：4

根據本發明之具體實施例，截短的啟動子係選自SEQ ID NO：5-7 所組成之群組的序列。SEQ ID NO：5-7的序列如下所示： SEQ ID NO：5 GC ATTACTTCGC 121 TCTACGATGA GGTTTTGCAC AGAACCTTAG GTCGGGTGTC GGGCCCCTGC TGACCCGAGC 181 TACTTAATAC TTTCTTTCCT TCGACTTTGC TCAAACTTAA ACGAGAGTAA GTACCGGTTC 241 TGACAGTCAC TCAATATTCG TCTGATGCTC TCTCGGGGGA AATCTCTCTC CAACGACCAT 301 TCTTTATTAT CTGAAGCTGG TTGTCTTCGA TCGAGTATAC GACGTCCTGG GGCTTGTCTT 361 AGTCTCACGA AGGCCGACTC TATCGCTCTA GGACTCGCTT GATATAGATG TGCGTAACTT 421 TAAGTGAGCT CGTATTCATC TTATTCCATT CCCATTGAGT CGTGGGTCCA GCATTTTGTT 481 CGAGAGAGTC AAGACTCGAG GATACCGCTA GTCGCCTGTG GTCTGGATCG TTCCTTCTAT 541 GTTCGGTGTC TGGAGCATGG CCTTTCTAGA CTCTTGGCTG GTACTGGACG ACCAATCACG 601 AGGTGCCTGT GGCGCACATT ATGGCTCTCC GTGTGCTCCA GCCAATTAGG TTCCGGGGAG 661 GGGTTATGCA TTAGAAACGA TCTGTTCATC TGAAAGGTGG TATCGCGTTT GTTGTGTGGA 721 TGACCACCCT AGATGAGGCC TGGATGATAC TGCCTTAAAA TTGGAGGCGC GTCCAGGGCG 781 CGTCGTTCTC CGAGTCTGTT CCGCTGATGA ATTTTGCCTG CTCGACATCG TTTCTGCGGA 841 CATGCGATCG ACGAGATCTT TGCGTTAGAC GCCGTTGGGA AGGGACTCGG AGGTGGGTTT 901 AGACCTGCGT GGTAGAAGAA TGGGACGAGT ATATGAGTAG AGTACCGCGT CGATACCGCG 961 TAACCGTGCA TGTGCTACTA CTCCTTGACC GCTGATTGGT TGCGAACTCG ACATGATCTA 1021 GGTCGTCCTC GTCTGGACTC CTAATCAAGA GAGACAAGAG AATGGTTGAG GAGCTGCTCA 1081 AATTTTGGCG GATAACGTCG TCGGTATCCT ATGAATCTAC GTTGTGTATC TCTAATGCTT 1141 TGTACGTCTT TGACGCGGTA AGAATTTAGG ACGGAATGCA GACGAAATGA CAGCGATGAC 1201 GTAACATCCG ATTATCAGCG CGACAGTATA AAAGGCGCAG AATTTTGACA TCTCTCC

SEQ ID NO：6 TCCA GCATTTTGTT 481 CGAGAGAGTC AAGACTCGAG GATACCGCTA GTCGCCTGTG GTCTGGATCG TTCCTTCTAT 541 GTTCGGTGTC TGGAGCATGG CCTTTCTAGA CTCTTGGCTG GTACTGGACG ACCAATCACG 601 AGGTGCCTGT GGCGCACATT ATGGCTCTCC GTGTGCTCCA GCCAATTAGG TTCCGGGGAG 661 GGGTTATGCA TTAGAAACGA TCTGTTCATC TGAAAGGTGG TATCGCGTTT GTTGTGTGGA 721 TGACCACCCT AGATGAGGCC TGGATGATAC TGCCTTAAAA TTGGAGGCGC GTCCAGGGCG 781 CGTCGTTCTC CGAGTCTGTT CCGCTGATGA ATTTTGCCTG CTCGACATCG TTTCTGCGGA 841 CATGCGATCG ACGAGATCTT TGCGTTAGAC GCCGTTGGGA AGGGACTCGG AGGTGGGTTT 901 AGACCTGCGT GGTAGAAGAA TGGGACGAGT ATATGAGTAG AGTACCGCGT CGATACCGCG 961 TAACCGTGCA TGTGCTACTA CTCCTTGACC GCTGATTGGT TGCGAACTCG ACATGATCTA 1021 GGTCGTCCTC GTCTGGACTC CTAATCAAGA GAGACAAGAG AATGGTTGAG GAGCTGCTCA 1081 AATTTTGGCG GATAACGTCG TCGGTATCCT ATGAATCTAC GTTGTGTATC TCTAATGCTT 1141 TGTACGTCTT TGACGCGGTA AGAATTTAGG ACGGAATGCA GACGAAATGA CAGCGATGAC 1201 GTAACATCCG ATTATCAGCG CGACAGTATA AAAGGCGCAG AATTTTGACA TCTCTCC

SEQ ID NO：7 TGTGCTCCA GCCAATTAGG TTCCGGGGAG 661 GGGTTATGCA TTAGAAACGA TCTGTTCATC TGAAAGGTGG TATCGCGTTT GTTGTGTGGA 721 TGACCACCCT AGATGAGGCC TGGATGATAC TGCCTTAAAA TTGGAGGCGC GTCCAGGGCG 781 CGTCGTTCTC CGAGTCTGTT CCGCTGATGA ATTTTGCCTG CTCGACATCG TTTCTGCGGA 841 CATGCGATCG ACGAGATCTT TGCGTTAGAC GCCGTTGGGA AGGGACTCGG AGGTGGGTTT 901 AGACCTGCGT GGTAGAAGAA TGGGACGAGT ATATGAGTAG AGTACCGCGT CGATACCGCG 961 TAACCGTGCA TGTGCTACTA CTCCTTGACC GCTGATTGGT TGCGAACTCG ACATGATCTA 1021 GGTCGTCCTC GTCTGGACTC CTAATCAAGA GAGACAAGAG AATGGTTGAG GAGCTGCTCA 1081 AATTTTGGCG GATAACGTCG TCGGTATCCT ATGAATCTAC GTTGTGTATC TCTAATGCTT 1141 TGTACGTCTT TGACGCGGTA AGAATTTAGG ACGGAATGCA GACGAAATGA CAGCGATGAC 1201 GTAACATCCG ATTATCAGCG CGACAGTATA AAAGGCGCAG AATTTTGACA TCTCTCC

根據本發明，本發明截短的啟動子可使用分子生物學的一般技術製備，如選殖、PCR放大及質體構築等。

可以技藝人士所熟知之方法辨識具有類似本發明啟動子活性之啟動子。例如，可以使用細胞或組織構築cDNA庫，並進行篩選以辨識具有類似於本發明之啟動子表現型態之基因。經辨識基因之DNA序列可接著用於分離此基因之啟動子以進行進一步之特徵辨識。另外，轉錄剖析(transcriptional profiling)或電子北方技術(electronic northern technique)亦可用於辨識具有類似於本發明之啟動子表現型態之基因。一旦辨識出該等基因，可分離其啟動子以進行進一步之特徵辨識。電子北方技術係以電腦進行序列分析，其可讓來自多個cDNA庫之序列基於研究者所辨識之參數進行電子化的比較，此等參數包含在多個cDNA庫中富含之EST族群。轉錄剖析為高產出方法，其係用於系統化監測上千個基因之基因表現。此基於DNA晶片之技術係將上千個cDNA序列排列於支持物表面。此等排列物同時與一群由不同細胞或組織型態之DNA樣品製備而來之經標記之cDNA雜交，得以直接分析其表現。此方法可用於分離調節序列，例如與該等基因相關之啟動子。

在另一具體實施例中，本發明所揭示之啟動子可經修飾。技藝人士可以創造聚核苷酸序列上具有變異之啟動子。本發明之啟動子之聚核苷酸序列可經修飾或改變以增強其控制特徵。一種改變聚核苷酸序列之較佳方法為使用PCR以修飾序列中所選擇之核苷酸或區域。此等 方法為技藝人士所熟知。變異體啟動子可以下列方法製得，例如，標準DNA突變技術，或者以化學合成變異體啟動子或變異體啟動子之一部份。

有許多方法可以用來設計或以工程方式製得新穎之嵌合啟動子。例如，將第一啟動子片段與第二啟動子片段融合可製得嵌合啟動子；所製得之嵌合啟動子可使操縱性連結之可轉錄聚核苷酸分子之表現增加。可以構築啟動子使啟動子片段或元素操縱性連結，例如，將此片段置於最小啟動子之上游。本發明構築嵌合及變異體啟動子之方法包含(但不限於)結合不同啟動子之控制元素或複製啟動子之部份或區域。本發明所屬技術領域中之技藝人士熟悉關於巨分子之構築、操作及分離之標準資源材料(例如，聚核苷酸分子、質體等)，以及重組生物之產生及聚核苷酸分子之篩選及分離。

本發明亦提供包含操縱性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子之本發明啟動子之構築體。較佳地，可轉錄聚核苷酸分子操縱性連結至3'轉錄終止聚核苷酸分子。

本發明之構築體典型地包含操縱性連結至可轉錄聚核苷酸分子之啟動子，此可轉錄聚核苷酸分子操縱性連結至3'轉錄終止聚核苷酸分子。此外，構築體可包含(但不限於)來自鮑魚菇基因之3'-不轉譯區域(3'-UTR)之額外調節性聚核苷酸分子。構築體亦可包含(但不限於)mRNA聚核苷酸分子之5'-不轉譯區域(5'-UTR)，其可在轉錄起始扮演重要角色，且亦能在菇類之表現構築體作為基因組份。此等額外之上游及下游調節性聚核苷酸分子可衍生自原存在於此啟動子構築體之其他元件或異源之來源。

因此，本發明之構築體包含如啟動子，其係操縱性連結至可轉錄聚核苷酸分子，以直接轉錄該可轉錄聚核苷酸分子至所欲程度或所欲細胞。

根據本發明，任何適當之異源基因可以用做本發明之之異源可轉錄聚核苷酸分子。例示之用於併入本發明構築體之可轉錄聚核苷酸分子包含(但不限於)編碼a)抗體，包含其他診斷物質；b)二次代謝物，例如凝集素(lectin)；c)治療化合物，例如疫苗及類固醇；d)生物巨分子，例如干擾素、內皮抑制素(endostatin)及胰島素；e)醫用酵素，例如血栓溶解劑及腦苷脂酶；f)對於害蟲、疾病或除草劑提供抗性之基因，例如除蟲化合物蘇力菌(Bacillus thuringiensis)蛋白(Bt毒素)；g)給予或對於有增值特性有所貢獻之基因，例如營養組合物或新陳代謝之修飾。因此，在一個較佳實施例，可調節轉錄之本發明聚核苷酸分子或其片段、變體或衍生物，係操縱性連結至可轉錄聚核苷酸分子，提供可供選擇、篩選或評比之標記。用於實施本發明之標記包含(但不限於)編碼葡萄糖醛酸酶(glucuronidase，GUS)、綠色螢光蛋白(GFP)、螢光酶(LUC)及提供抗生素抗性之蛋白質之可轉錄聚核苷酸分子。

將本發明之構築體導入細胞內，使得可轉錄聚核苷酸分子轉錄為功能性mRNA分子(其經轉譯而表現蛋白質產物)之方法為已知。實施本發明時，用於製備及使用構築體及宿主細胞之習知組合物及方法為技藝中已知。將重組分子導入細胞涉及機械式方法，例如DNA直接攝入、脂質體、電穿孔(Guerche,P.等人)、顯微注射(Neuhaus,G.等人)，以及使用微撞射(microprojectile)及槍或其他裝置強制塗覆DNA之粒子進入細胞(Klein,T.M.等人，1987,Nature 327：70-73)。

本發明之進一步目的為提供包含本發明構築體之轉形菇類。

包含本發明啟動子之轉型構築體可以任何方法導入菇類中。實施本發明時藉由導入菇類表現構築體至菇類基因體之菇類轉型方法及物質可包含任何熟知及證實之方法，包含電穿孔、農桿菌(Agrobacterium)媒介之轉型及原生質體轉型。較佳地，此菇類係選自下列組成之群：類火菇屬(Flammunila)、傘菌屬(Agaricus)、側耳屬(Pleurotus)及香菇屬 (Lentinula)。更佳地，此菇類係選自下列組成之群：金針姑、鮑魚菇、肺形側耳及泡囊側耳。最佳地，此菇類為鮑魚菇。

gpd啟動子之5'側翼區域的片段的刪除造成較高的異源基因表現。gpd啟動子之部分刪除提供增強異源基因表現的可行策略。根據本發明，本發明之部分刪除的gpd啟動子推動的異源基因表現量，相較於全長的gpd啟動子，提高至少約500倍、1,000倍、2,000倍、3,000倍、4,000倍或5,000倍。

以下包含之實施例為說明本發明之較佳具體實施例。本發明技術領域之技藝人士應瞭解以下實施例所揭露之技術代表發明人於實施本發明時所發現成功作用之技術。然而，技藝人士鑒於本說明書之揭露應瞭解，在所揭露之特定實施例中可以做許多改變而仍然獲得類似結果，並且不偏離本發明之精神及範圍。因此，應理解說明書所附圖式所記載或顯示之所有事項為例示而非限制用。

實例1 包含截短啟動子之質體的構築 菌株及培養基

從生物資源保存及研究中心(台灣新竹)購得金針菇(F.velutipes)BCRC 37086，並於25℃下培養並維持於CYM瓊脂或培養液。DH5大腸桿菌株(用於DNA操作及質體保存)生長於LB培養基(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO,USA)。農桿菌菌株LBA4404，由Yee-Yung Charng博士(農業生物技術研究中心，中央研究院(台灣台北))提供，用於轉形，在28℃下培養於LB培養基。

金針菇的子實體

將木屑65%及35%米糠組成的基質放入聚丙烯瓶，並高壓滅菌1小時。以菌絲體棉塞接種至具基質的加蓋的瓶，並在23℃培養3~4週。待瓶中菌絲完全菌落化後，藉由加水和從23到10℃的溫度變化誘導出菇。

質體構築

骨架質粒，p0390-AH，帶有得自A.bisporus之gpd啟動子控制下的大腸桿菌潮黴素B(E.coli hygromycin B)磷酸轉移酶(hph)，藉由插入pGPD-hph卡匣(郭等人，2004，Appl Microbiol Biotechnol.65,593-599)至pCAMBIA0390而構建(http：//www.cambia.org.au)。根據CAAT盒的位置，具1257bp的金針菇gpd啟動子在長度上被截短。在5'-上游區具各種長度的截短gpd啟動子分別被命名為：Pgpd△d1(1149bp)，Pgpd△d2(791bp)，Pgpd△d3(626bp)和Pgpd△d4(248bp)。增強型綠色螢光蛋白基因(egfp)，由金針菇全長或部分截短的gpd啟動子含其第1個內含子(intron)驅動，插入p0390-AH，且所得到的質體分別稱為pFiegfp，pFiegfp△d1，pFiegfp△d2，pFiegfp△d3和pFiegfp△d4。啟動子和相應的質體如下表所示：

實例2 農桿菌介導的轉形 金針菇的轉形

基於陳等人所報告之技術經修飾(陳等人，2000，Applied and Environmental Microbiology,66(10),4510-4513)進行農桿菌介導的轉形。以電穿孔將所有表現載體導入到根癌農桿菌(A.tumefaciens)。攜帶標的質體的根癌農桿菌在含50μg/mL卡那黴素(kanamycin)的LB，在 220rpm振盪下培養過夜，接著在混合有金針菇改質菌絲體顆粒(MMP)的誘導培養基(IM)(其含有200μM的乙酰丁香酮(acetosyringone；AS)中培養6小時。將著將MMP轉移至新鮮培養基中培養5天。然後將MMP洗淨並轉移到含有30μg/mL潮黴素B和200μM頭孢子菌素(cefotoxime)的CYM培養皿，並在23℃下培養直到菌絲生長。含有pFiegfp，pFiegfp△d1，pFiegfp△d2，pFiegfp△d3和pFiegfp△d4的金針菇分別命名為D0，D1，D2，D3和D4轉形株。

具不同長度gpd啟動子的質體，pFiegfp，pFiegfp△d1，pFiegfp△d2，pFiegfp△d3和pFiegfp△d4，藉電穿孔引入根癌農桿菌並使用相應的引子以菌落PCR確認。在選擇壓力下，以含有pFiegfp系列質體的根癌農桿菌共培養4週後，金針菇MMP被轉移到含30μg/mL潮黴素B的新鮮培養基。使用經由ATMT的不同質體，達到至少30%的轉形效率。為防止偽陽性結果，所有推定的轉形株被繼代培養於新鮮的選擇性培養基上三次以確認基因的嵌入。其後，在選擇壓力下，將所得的轉形株轉移到新鮮的瓊脂培養皿，藉測定菌絲體的直徑決定它們的生長率，如圖2所示。不同長度的gpd啟動子間的生長率沒有顯著差異。

實例3 EGFP基因插入的確認 基因組DNA PCR(Genmomic DNA PCR)及南方印跡法(Southern blotting)

以基因組PCR和南方印跡法確認hph和egfp基因嵌入金針菇轉形株的染色體中。從生長於含30μg/mL潮黴素B的CYM培養基的4週大菌絲，使用基因組DNA迷你試劑盒(Geneaid，台北，台灣)萃取基因組DNA。

根據郭等人的方法進行南方印跡法(Kuo等人，2004，Applied Microbiology and Biotechnology,65(5),593-9)。簡單地說，將10μg的金針菇基因組DNA用限制酶NcoI和BamHI消化，以0.8%瓊脂糖凝膠分離 並真空下轉移到Immobilon-Ny+轉印膜(Millipore，Billerica的，MA)。使用引子EGFP-F(5'-ATGGTGAGCAAGG-3')(SEQ ID NO：5)與EGFP-R(5'-TACTTGTACAGCTCGTCCA-3')(SEQ ID NO：6)產生egfp探針，而引子組hph-F(ATGAAAAAGCCTGAACTCACC)(SEQ ID NO：7)與hph-R(ACAACTTAATAA-CACATTGCG)(SEQ ID NO：8)用於產生hph探針。隨後的探針標記，雜交和訊號檢測的進行係藉由地高辛(digoxigenin；DIG)探針合成及檢測試劑盒(Roche，Mannheim，德國)根據製造商的說明。

為使抗生素篩選導致的變異最小化，所有質體之潮黴素抗性性狀係由A.bisporus gpd啟動子驅動。篩選後，具各種長度的金針菇gpd啟動子驅動的EGFP基因的存在係由基因組PCR檢查。720 bp片段指出所有推定轉形株中egfp的插入(圖3)。藉PCR放大的24個抗生素抗性培養株中，沒有偽陽性物被檢測出。為檢測轉形DNA，進行南方印跡分析。圖4顯示egfp基因的一個或兩個拷貝被嵌入測試的轉形株中，以及各種尺寸的條帶為可見的。此結果表明引入的片段隨機嵌入基因組金針菇。

實例3 轉形株中EGFP的檢測

egfp的表現以西方印跡確認，如圖5所示。具抗株抗-GFP抗體的免疫印跡檢測到27-kDa的條帶之陽性對照(PC)及D1，D2和D3轉形株的總細胞蛋白質，而D4轉形株未顯示信號(數據未示出)。

以螢光顯微鏡(Eclipse E600,Nikon,Tokyo,Japan)，使用nikon B-2A濾片(激發濾片，450~490 nm；分色濾光器，505 nm；屏障過濾器，520 nm)檢測推定的轉形株的菌絲。活體成像系統(IVIS)頻譜儀(Caliper Life Science,Hopkinton,MA,USA)被用於使子實體可視化。圖6顯示野生型、D0與D1轉形株的菌絲體的螢光顯微照片。相較之下，在相同的曝光條件下，D0與D1呈現較密集的螢光。但是，D4則沒有觀察到明顯的螢光(數據未示出)，其與蛋白質印跡分析的結果相符。

為了發育子實體，篩選出的雙核菌絲接種到木屑培養基。經過6~8週的低溫誘導，所有轉形株已成功長出子實體。野生形金針菇、D0、D1與D3的子實體以IVIS觀察的結果如圖7所示。D1及D3較D0顯示更密集的螢光，而只有野生型子實體觀察到自發螢光。EGFP螢光主要分佈在菌傘，尤其是菌摺組織。

實例4 EGFP在金針姑菌絲體的表現量

收集菌絲體，並隨後用研缽和研杵在液氮中研磨。總量為50毫克菌絲體粉末與1毫升蛋白質萃取緩衝液(50 mM磷酸鈉、300mM氯化鈉、1 mM PMSF、0.1% Triton X-100，pH7.4)在冰上混合中1小時，在冰上。在13,000 g下離心20分鐘後，收集上清液作為可溶性蛋白質。100 l的每一蛋白質萃取物進行三明治ELISA。將樣品在塗覆有EGFP單株抗體(ab1218,Abcam,Cambridge,UK)的ELISA板(PerkinElmer,Boston,MA,USA)上培育1小時。各樣品的測定在每一板上重複3次。以1：10,000稀釋的兔抗-GFP多株抗體(ab6556，Abcam,Cambridge,UK)加入到各孔中，並在4℃培育1小時。抗兔IgG結合HRP酶(PerkinElmer)的1：5,000稀釋的山羊多株抗體加入每孔中，並在4℃下培育1小時。每孔加入100 l的TMB-HRP微孔基質(BioFX，Owings Mills，MD,USA)。5分鐘後，測定各孔樣品在650nm處的吸光度，使用96孔平板讀數器(VERSAmax,Sunnyvale,CA)。使用BCA^TM的蛋白測定試劑盒(Pierce,Rockford,IL,USA)測定蛋白質濃度。藉pET21a(+)表現於大腸桿菌BL21(DE3)的EGFP作為標準品。

選擇螢光檢測確認的轉形株用於EGFP的檢測。清洗D0，D1，D2，D3和D4的隨機篩選的轉形株的菌絲體使不含培養基，冷凍並研磨成細粉，接著進行蛋白萃取。圖8顯示從每一構築的前5個轉形株的EGFP產生。D1，D2和D3轉形株的EGFP生產分別可達到0.84±0.04 μg/g，5136.66±35.02 μg/g及409.66±21.22 μg/g的總可溶性蛋白(TSP)。相對 地，D0轉形株平均只有0.12±0.03 μg/g的TSP。序列分析顯示D1刪除的片段呈現最高的GC核苷酸比例。高GC含量片段具相應的吉布斯自由能(Gibb's free energy)容易形成二級結構。此外，gpd-D1的刪除片段存有3個迴文序列，增加了形成二級結構的可能性，因此限制了基因表現。

<110> 蘑法生物科技股份有限公司

<120> 經截短之甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子TRUNCATED GLYCERALDEHYDE-3-PHOSPHATE DEHYDROGENASE PROMOTER

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1257

<212> DNA

<213> 擔子菌

<400> 1

<210> 2

<211> 108

<212> DNA

<213> 擔子菌

<400> 2

<210> 3

<211> 466

<212> DNA

<213> 擔子菌

<400> 3

<210> 4

<211> 631

<212> DNA

<213> 擔子菌

<400> 4

<210> 5

<211> 1149

<212> DNA

<213> 擔子菌

<400> 5

<210> 6

<211> 791

<212> DNA

<213> 擔子菌

<400> 6

<210> 7

<211> 626

<212> DNA

<213> 擔子菌

<400> 7

<210> 8

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP-F

<400> 8

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP-R

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hph-F

<400> 10

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hph-R

<400> 11

Claims (13)

1. 一種經分離之核酸，其包含擔子菌甘油醛-3-磷酸去氫酶(gpd)啟動子，其具有選自下列所組成群之序列：SEQ ID NOs：5及7。
2. 一種構築體，其包含操作性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子之如請求項1之啟動子。
3. 如請求項2之構築體，其中該可轉錄聚核苷酸分子係操作性連結至3'轉錄終止聚核苷酸分子。
4. 如請求項2之構築體，其中該可轉錄聚核苷酸分子為編碼抗體、二次代謝物、治療化合物、生物巨分子或醫用酵素之基因；對於害蟲、疾病或除草劑提供抗性之基因；或給予或對於有增值特性有所貢獻之基因。
5. 如請求項4之構築體，其中該二次代謝物為凝集素(lectin)，該治療化合物為疫苗，該生物巨分子為干擾素、內皮抑制素(endostatin)或胰島素，該醫用酵素為血栓溶解劑及腦苷脂酶，該對於害蟲、疾病或除草劑提供抗性之基因為除蟲化合物蘇力菌(Bacillus thuringiensis)蛋白(Bt毒素)。
6. 如請求項2之構築體，其中該可轉錄聚核苷酸分子為標記基因(marker gene)。
7. 如請求項2之構築體，其中該可轉錄聚核苷酸分子為綠色螢光蛋白基因(green fluorescence gene)。
8. 一種經轉形之細胞，其包含如請求項2之構築體。
9. 一種經轉形之蕈類，其包含如請求項2之構築體。
10. 如請求項9之經轉形之蕈類，其中該蕈類係選自由以下所組成之群：Flammulina、Agaricus、Pleurotu及Lentinula。
11. 如請求項9之經轉形之蕈類，其中該蕈類係選自由以下所組成之群：自裂褶菌(Schizophyllum commune)、白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、洋菇(Agaricus bisporus)、香菇(Lentinula edodes)、金針菇(Flammulina velutipes)、Pleurotus ostreatus、Pleurotus pulmonarius及Pleurotus populinus。
12. 如請求項9之經轉形之蕈類，其中該蕈類係金針菇。
13. 一種於蕈類細胞中介導可轉錄聚核苷酸序列表現之方法，其包含使如請求項1之啟動子操作性連結至該聚核苷酸分子，及以該操作性連結至該聚核苷酸分子之啟動子轉形蕈類細胞。