CN101240280B - 玉米根优先启动子及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了来自玉米的启动子，该启动子优先在植物根中，例如玉米植物根中，启动转录。
Description
本分案申请是基于申请号为03818391.9，申请日为2003年07月28日，发明名称为“玉米根优先启动子及其用途”的原始中国专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及玉米启动子的分离，该启动子能够指导与之可操作性相连的外源DNA序列优先地、选择性或专门地在植物(例如玉米植物)根中的转录。本发明还涉及嵌合基因用于在植物(例如玉米植物)根中优先地或选择性地表达生物活性目的RNA的用途。还提供了含有与外源DNA序列可操作性相连的玉米根优先或选择性启动子的植物，例如玉米植物，所述外源DNA序列转录后会优先地或选择性地在植物根中产生生物活性RNA。
相关技术说明
转基因植物生产中的一项重要考虑是，以优先或选择性的方式在目的组织中获得足够高的转基因表达水平。以这种方式，可以避免与转录物组成型表达有关的潜在缺陷，例如生产缓慢。对适宜启动子的选择是获得某一特定转基因的目的表达模式的关键。
转基因在植物(特别是谷类植物，例如玉米)根中的选择性表达，被认为是具有潜在商业重要性的，例如，对于根组织功能的改变、对于偏好攻击根的病原体或害虫的抗性(例如，线虫、玉米根虫，等)、对除草剂或不良环境条件(例如干旱或土壤组成)的抗性。
US 5,633,363描述了一个分离自玉米、命名为ZRP2的、4.7kb上游启动子区域，归结了该启动子区域在驱动异源基因的根优先表达中的特定用途。
WO 97/44448通常涉及植物中的基因表达机制，更特别涉及在植物中以组织特异性方式特别是在根中的基因表达调控。公开了促成组织优先(tissue-preferred)基因表达的转录调控元件的分离方法。
WO 00/15662描述了一种富甘氨酸蛋白(zmGRP3)的启动子，该蛋白质转录物按发育特异性模式仅在幼玉米秧苗根中累积。
WO 00/070068和WO 00/70066分别描述了玉米RS81和RS324启动子，它们是在玉米根组织但不在种子组织中表达的基因的启动子，并且在分子分析中它们被描述为具有根特异性表达模式。
尽管存在玉米根优先启动子(corn root preferentialpromoter)在现有技术中是可以获得的这一事实，还是仍然需要一种可以作为替代的、能够进行优先或选择性根选择性表达的启动子，例如对于几种外源的目的DNA序列的独立表达而不存在由于使用相同的启动子而导致出现转录后沉默的可能性。此外，已知的玉米根优先启动子各自指导特定的时间、空间和/或发育表达模式，它们并不总是能满足特定的目的。因此仍然需要新的、能够控制根中转录的、根玉米优先启动子，优选以更具选择性的方式控制转录、以及更优选产生高丰度的转录产物。
发明内容概述
本发明的一个目的是提供含有选自下组的核苷酸序列的玉米根优先启动子：
a)含有SEQ ID No 1自第1位核苷酸至第338位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID No 2自第11位核苷酸至第1196位核苷酸的核苷酸序列(“GL4启动子”)的核苷酸序列；
b)含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的核苷酸序列(“GL5启动子”)的核苷酸序列；
c)含有编码mRNA的玉米优先基因的5′末端约400bp至约1300bpDNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由该mRNA可以制备含有与核苷酸序列SEQ ID No 7或SEQ ID No 8或SEQ ID No 9或SEQID No 10的互补序列的cDNA；
d)含有编码mRNA的玉米优先基因的5′末端约400bp至约1300bpDNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由该mRNA可以制备包含编码具有氨基酸序列SEQ ID No 4或6的多肽的核苷酸序列的cDNA；
e)含有编码mRNA的玉米优先基因的5′末端约400bp至约1300bpDNA片段核苷酸序列的核苷酸序列，由该mRNA可以制备含有具有SEQ ID No 3、5或11之中任一核苷酸序列至少75％、优选至少80％、更优选至少90％、特别优选至少95％、更特别优选与之相同的核苷酸序列的cDNA；
f)含有具有a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所提及的任一所述核苷酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、特别优选至少95％、更特别优选与之相同的核苷酸序列的核苷酸序列；或
g)核苷酸序列，其含有在严紧条件下与具有a)、b)、c)、d)、
e)、或f)中所述核苷酸序列的DNA片段杂交的约400bp至约1300bp DNA片段的核苷酸序列。
玉米根优先启动子可以包含在玉米根优先启动子区域内，并且可以进一步含有SEQ ID No 1自第339位核苷酸至第366位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID No 14自第1281位核苷酸至第1308位核苷酸的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供含有以下可操作性连接的DNA区域的嵌合基因：本发明的玉米根优先启动子；编码生物活性目的RNA的异源DNA区域；和在植物细胞中有活性的转录终止和多聚腺苷酸化信号。生物活性RNA可以编码目的蛋白质，例如当在植物细胞中表达时会赋予所述植物害虫或病原体抗性的蛋白质。生物活性RNA还可以是对目的靶基因转录后沉默有用的反义、有义或双链RNA。
还提供了含有本发明嵌合基因的植物细胞和植物或其种子，特别是谷类植物，例如玉米植物。
另一个目的还是提供优先在植物(例如玉米植物)根中表达生物活性RNA的方法，包括步骤：提供带有本发明嵌合基因的所述植物的根细胞；并使该植物生长。
本发明进一步提供本发明玉米根优先启动子用于在植物(例如玉米植物)根中优先表达生物活性RNA的用途。
本发明的另一个目的是提供经分离的DNA分子、及其用于分离玉米根优先启动子或启动子区域的用途，该分离的DNA分子含有编码含有氨基酸序列SEQ ID No 4或SEQ ID No 6的蛋白质的核苷酸序列、特别是选自SEQ ID No 3、SEQ ID No 5和SEQ ID No 11的核苷酸序列。
在本发明的另一实施方式中提供了分离玉米根优先启动子区域的方法，包括步骤：鉴定编码RNA转录物的基因组片段或功能等同物，由该RNA转录物可以合成cDNA，该cDNA含有核苷酸序列SEQ ID NO 3或SEQ ID No 5；分离编码具有氨基酸序列SEQ ID No 4或SEQ IDNo 6的蛋白质的核苷酸序列的上游DNA区域或功能等同物。还提供了由此方法获得的玉米根优先启动子。
附图简述
附图1：cDNAs GL4、GL5和GL12的核苷酸序列比对。用破折号表示为优化比对而引入的缺口。
附图2：来自GL4的短玉米根优先启动子区域的核苷酸序列。
附图3：来自GL4的长玉米根优先启动子区域的核苷酸序列。
附图4：来自GL5的玉米根优先启动子区域的核苷酸序列。
附图5：pTWV011示意图。LB：左侧T-DNA边界；3′nos：胭脂碱合成酶基因3′末端；bar：双丙氨酰膦(bialaphos)抗性编码区域；P35S3：CaMV 35S转录物的启动子区域；3′35S：CaMV 35S转录物的3′末端；isp1a：短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)的抗虫分泌蛋白1a编码区域；5′gl4：GL4启动子区域的前导区域；Pgl4：玉米根选择性启动子GL4；isp2a：短芽孢杆菌的抗虫分泌蛋白2a编码区域；RB：右侧T-DNA边界区域；nptI同源区：与辅助Ti-质粒同源的区域；ORI colE1：colE1复制起点；ORI pVS1：假单胞菌复制起点；PaadA：产生链霉素和壮观霉素抗性的氨基糖苷腺苷酰转移酶的细菌启动子；aadA：氨基糖苷腺苷酰转移酶基因的编码区域；3′aadA：氨基糖苷腺苷酰转移酶基因3′末端。
附图6：pTWV018示意图。LB：左侧T-DNA边界；3’nos：胭脂碱合成酶基因3′末端；bar：双丙氨酰膦抗性编码区域；P35S3：CaMV 35S转录物的启动子区域；3′35S：CaMV 35S转录物的3′末端；isp1a：短芽孢杆菌的抗虫分泌蛋白1a编码区域；5′gl5：GL5启动子区域的前导区域；Pgl5：玉米根选择性启动子GL5；isp2a：短芽孢杆菌的抗虫分泌蛋白2a编码区域；RB：右侧T-DNA边界区域；nptI同源区：与辅助Ti-质粒同源的区域；ORI colE1：colE1复制起点；ORIpVS1：假单胞菌复制起点；PaadA：产生链霉素和壮观霉素抗性的氨基糖苷腺苷酰转移酶的细菌启动子；aadA：氨基糖苷腺苷酰转移酶基因的编码区域；3′aadA：氨基糖苷腺苷酰转移酶基因3′末端。
优选实施方式详述
本发明是以这一发现为基础的：本文所描述的启动子特别适于与之可操作性相连的外源DNA在植物(特别是象玉米这样的谷类植物)根中的优先且丰富的表达(即，转录、或转录和翻译)。
在本发明的一种实施方式中，提供了含有SEQ ID No 1约400bp的核苷酸序列的玉米根优先启动子区域。在另一种实施方式中，提供了含有SEQ ID No 2约1200bp的核苷酸序列的玉米根优先启动子区域。还在一种实施方式中，提供了含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的核苷酸序列玉米根优先启动子区域。
本文所使用的“玉米(corn)”指玉米(maize)，即玉蜀黍(Zea mays L.)。
如本文所使用的，术语“启动子”指在转录引发过程中被DNA依赖性RNA聚合酶识别并结合(直接或间接)的任何DNA。启动子包括转录起始位点、以及转录起始因子和RNA聚合酶的结合位点，并能够含有可以结合基因表达调控蛋白的各种其它位点(例如，增强子)。
如本文所使用的，术语“调控区域”，意指任何涉及驱动转录和控制(即，调控)给定DNA序列转录时间和水平的DNA，给定DNA序列例如编码蛋白质或多肽的DNA。例如，5′调控区域(或“启动子区域”)是位于编码序列上游(即，5′)的DNA序列，它包括启动子和5′-非翻译前导序列。3′调控区域位于编码序列下游的(即3′)DNA序列，它包括适宜的转录3′末端形成(和/或调控)信号，包括一个或多个腺苷酸化信号。
术语“基因”意指在适宜的调控区域(例如植物可表达性启动子区域)控制下在细胞内含有被转录成RNA分子(例如，mRNA)的DNA区域(“转录的DNA区域”)的任何DNA片段。因此基因可能含有几种可操作性连接的DNA片段，例如启动子、5′非翻译前导序列、编码区域、和含有多聚腺苷酸化位点的3′非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。嵌合基因是通常不在植物物种中发现的任何基因，或者是在天然情况下其启动子与部分或全部转录DNA区域或与该基因的至少一种另一调控区域无关的任何基因。
术语“基因表达”指其中的DNA区域在调控区域(特别是启动子)控制下转录成具有生物活性的RNA的过程，RNA具有生物活性是指该RNA或者能与另一核酸互作或者能被翻译成生物活性多肽或蛋白质。若基因表达的终产物为生物活性RNA，例如反义RNA或核酶，则认为该基因编码RNA。若基因表达的终产物为生物活性蛋白质或多肽，则认为该基因编码蛋白质。
关于本发明DNA表达的术语“根选择性”，是指，为特定目的，DNA在植物(例如玉米植物(“玉米根选择性”))根细胞中的高度特异性表达。换言之，植物的不同于根的组织中的DNA转录物水平要么是无法检测到的要么是非常低的(每微克总RNA低于约0.2皮克)。
关于本发明DNA表达的术语“根优先(root-preferential)”是指，DNA主要在根中表达，但是在植株的其它组织中也能鉴定到表达的表达模式。优选地，根中的表达比其它组织中的高约2至10倍。
在已经阅读过这些实施方式后，显然，本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用功能上等价的启动子。
具有本质上与含有SEQ ID NO 1第1位核苷酸至第338位核苷酸、或SEQ ID NO 2第11位核苷酸至第1196位核苷酸、或SEQ IDNO 14第1位核苷酸至第1280位核苷酸、或它们具有启动子活性的部分的核苷酸序列的玉米根优先启动子相似的启动子活性的DNA序列，是这些启动子的功能等价物。这些功能等价启动子能在严紧条件下与含有核苷酸序列SEQ ID NO 1或SEQ ID No 2或SEQ ID NO 14的玉米根优先启动子区域杂交。
本文所使用的“严紧杂交条件”意指，如果探针与靶序列间存在至少95％和优选至少97％序列同一性通常将会出现杂交。严紧杂交条件的实例有：在含有5％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s液、10％硫酸葡聚糖、和20μg/ml变性剪切载体DNA例如鲑鱼精子DNA的溶液中孵育过夜，之后于约65℃下在0.1×SSC中洗涤杂交支持物。其它的杂交和洗涤条件是熟知的，并在Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)，特别是第十一章中给出了举例说明。
其它功能等价启动子含有这样的核苷酸序列，即能用含有选自核苷酸序列SEQ ID 1或SEQ ID 2的至少约25、优选至少约50、特别是至少约100个连续核苷酸的寡核苷酸引物在聚合酶链式反应中扩增的核苷酸序列。这样的寡核苷酸引物的实例有GVK 29(SEQ ID No 9)和GVK 30(SEQ ID No 10)。
功能等价启动子可以分离自例如不同的玉米品种。它们还可以通过对分离的玉米根优先启动子进行核苷酸的添加、取代、缺失或插入修饰来制备。它们也可以被全部或部分合成。
作为选择，可以利用在植物(例如玉米植株)根中高水平表达的转录物的cDNA作为分离对应于该cDNA核苷酸序列上游的基因组DNA的探针来分离功能等价启动子。如本文所使用的，“cDNA”用于表示第一链cDNA(与mRNA互补的)及其互补链(由此与mRNA相同，除了用T替换U)二者或双链cDNA片段。根据本发明，玉米根选择性cDNA及其对应植物基因组DNA片段可根据下述进行鉴定：
1)可以从分离自根的mRNA起始构建cDNA文库，并对该cDNA文库作示差筛选以鉴定与其它组织，包括但不限于：叶、种子、茎、繁殖器官、及类似，相比优先存在于根中的mRNA。作为选择，可以用从某一已分离蛋白质的已确定氨基酸序列推定出的寡核苷酸筛选该cDNA文库，所述已分离的蛋白质已被鉴定优先存在于根中。此外，可能在巢式PCR步骤中使用与所述相同的寡核苷酸，并用所扩增的片段作为探针来筛选文库。可以从在不同玉米根发育阶段分离的mRNA池构建玉米根优先cDNA文库。一种鉴定和分离在特定组织(例如此处是根)中特别表达的RNA的cDNA 3’末端的方法，是如Prashar和Weismann或US专利5712126(这两篇文献都引入本文作为参考)中所描述的、所谓的READS分析或限制性酶消化的cDNA(Restriction-Enzymedigested cDNAs)。
2)可以分离出，反转录自优先在植物(例如玉米植物)根中转录的RNA的cDNA、或经READS差异显示分析鉴定为优先在植物根中表达的cDNA 3’末端，并通过例如核苷酸序列确定进一步鉴定其特征；全长cDNA可以用例如5’RACE(cDNA末端快速扩增法)技术分离。
3)可将该cDNA或其3’末端用作探针以鉴定和分离植物基因组中含有编码玉米根优先mRNA的核苷酸序列的区域。作为选择，例如，可以通过利用从cDNA序列推定的寡核苷酸作反向PCR分离基因组DNA。作为选择，可以利用TAIL-PCR(如Liu等人所描述的热不对称交错PCR(1995))分离编码区域侧翼的基因组序列，TAIL-PCR利用了衍生自所鉴定的cDNA(的5’末端)的核苷酸序列的巢式长特异性寡核苷酸、和短的随机简并引物。
4)可选地，在不同植物组织(包括目的根组织)的常规RNA-RNA原位杂交[参见，例如，De Block等人(1993)，Anal.Biochem.215：86]中构建并使用对应于cDNA的RNA探针，以验证由假定根优先表达的内源植物基因所产生的mRNA在这些根中的优先出现。
一旦获得了玉米根优先基因(也即，可以从玉米根优先cDNA制备的编码玉米根优先mRNA的基因组DNA片段)，将从编码由该mRNA所编码蛋白质的第一个氨基酸的密码子的上游(也即，位于5′)区域确定为包含玉米根优先启动子的启动子区域。优选，这样的启动子区域是起始密码子上游至少约400至500bp、优选至少约1000bp、更优选约1200bp、尤其是约1300bp、特别地至少约1500至2000bp。为方便起见，优选，这样的启动子区域在起始密码子上游延伸不超过约3000至5000bp。可以部分根据所存在的便利限制性位点来确定片段大小。实际的玉米根优先启动子是玉米根优先mRNA编码区域上游(也即，5′)的基因组DNA区域。含有与标记基因编码区域可操作性相连的玉米根优先启动子的嵌合基因将优先在转基因玉米植株的玉米根细胞中产生标记蛋白，该蛋白可以通过常规的原位组织化学技术进行检测。
可以获得玉米根优先启动子的玉米根优先基因的实例是编码可以优先在玉米根中探测到的mRNA的、且大小约为600nt的基因，从该mRNA可以制备cDNA，该cDNA包含对应于寡核苷酸GVK27(SEQ ID No
7)核苷酸序列的互补序列和/或寡核苷酸GVK28(SEQ ID No 8)的互补序列；和/或包含寡核苷酸GVK29(SEQ ID No 9)核苷酸序列的互补序列和/或对应于寡核苷酸GVK30(SEQ ID No 10)的互补序列。这样的玉米根优先cDNA可以包含前述提及的对应于寡核苷酸GVK27和GVK28以及GVK29或GVK30的各序列。
这样的基因是编码玉米根优先转录物的基因，从该转录物可以制备包含编码具有氨基酸序列SEQ ID 4的蛋白质的核苷酸序列的cDNA，且该转录物可以例如具有SEQ ID No 3的核苷酸序列。其它的玉米根优先基因是编码玉米根优先mRNA的基因，从该mRNA可以制备包含SEQ ID No 5或SEQ ID 11的序列、或包含编码含有氨基酸序列SEQID 6的蛋白质的核苷酸序列的cDNA。
本发明启动子的一种实施方式是包含在基因组克隆5′调控区域中的启动子，该基因组克隆含有对应于具有SEQ ID No 5、6或11之中任一核苷酸序列的cDNA的核苷酸序列，例如，具有SEQ ID No 2中自第11位核苷酸至第1196位核苷酸的核苷酸序列的5′调控区域，或含有SEQ ID No 2中始于第11位核苷酸至第859位核苷酸之间任何位置、并止于第1233位核苷酸(恰好在ATG翻译起始密码子之前)的序列的DNA片段，或含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的序列的DNA片段的核苷酸序列。这样的启动子区域含有本发明的玉米根优先启动子和5′非翻译引导区域，且可用于根优先嵌合基因、特别是玉米根优先嵌合基因的构建。然而，可将较小的DNA片段可用作本发明的启动子区域，据信可以使用含有翻译起始密码子上游至少约400碱基对的任何SEQ ID No 2 DNA片段。
可以构建人工启动子，其含有SEQ ID No 1或SEQ ID No 2或SEQID 14的5’调控区域的决定启动子的玉米根优先性的那些启动子内部序列。这些人工启动子可能包含能在植物中表达的另一启动子的“核心启动子”或“TATA盒区域”，例如WO 93/19188中所述的CaMV35S“TATA盒区域”。含有这样的人工启动子的启动子区域的适宜性可以通过它们与报告基因的适当融合以及报告基因在适宜组织、适当发育阶段的表达的检测进行鉴定。据信，含有SEQ ID No 1或2的5′调控区域那些决定玉米根优先性的内部部分的、这样的较小的启动子和/或人工启动子可以在玉米根细胞中提供更好的转录选择性和/或提高本发明玉米根优先嵌合基因转录区域的转录水平。本发明玉米根优先启动子区域的这样的较小部分可以包括与GL4和GL5启动子区域具有高度同源性的核苷酸序列例如：SEQ ID No 2自第1024位核苷酸至第1105位核苷酸的核苷酸序列(与SEQ ID No 14自第435位核苷酸至第510位核苷酸的核苷酸序列具有80％匹配)；SEQ ID No 2自第866位核苷酸至第994位核苷酸的核苷酸序列(与SEQ ID No 14自第236位核苷酸至第358位核苷酸的核苷酸序列具有77％匹配)；SEQID No 2自第544位核苷酸至第568位核苷酸的核苷酸序列(与SEQID No 15自第198位核苷酸至第222位核苷酸的核苷酸序列具有96％匹配)；SEQ ID No 2自第1122位核苷酸至第1143位核苷酸的核苷酸序列(与SEQ ID No 15自第485位核苷酸至第510位核苷酸的核苷酸序列具有73％匹配)。
除了实际的启动子，本发明玉米根优先基因的5′调控区域还含有编码位于转录起始位点和翻译起始位点之间的RNA 5′非翻译前导(5′UTL)序列的DNA片段。据信，GL4启动子的5′转录起始位点位于SEQ ID No 2中第1197位附近，形成长约30个核苷酸的5′UTL。据信，GL5启动子的5′转录起始位点位于SEQ ID No 14中第1280位附近，形成长约30个核苷酸的5′UTL。还据信，该区域可以用其它的5′UTL替换，例如另一植物表达性基因的5′UTL，而基本不会影响启动子的特异性。
因此，在本发明另一实施方式中提供含有选自下组的核苷酸序列的玉米根优先启动子或玉米根优先启动子区域：
a)含有SEQ ID No 1自第1位核苷酸至第338位核苷酸的核苷酸序列、或SEQ ID No 2自第11位至第1196位核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列；
b)含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列；
c)编码mRNA的玉米优先基因中(5′末端)约400bp至约1300bp的DNA片段的核苷酸序列，该mRNA优选大小为约600nt，由该mRNA可以制备含有对应于核苷酸序列SEQ ID No 7、SEQID No 8或SEQ ID No 9或SEQ ID No 10的核苷酸序列的互补序列的cDNA；
d)编码mRNA的玉米优先基因5′末端约400bp至约1300bp的DNA片段的核苷酸序列，该mRNA优选大小为约600nt，由该mRNA可以制备包含编码具有氨基酸序列SEQ ID No 4或6的多肽的核苷酸序列的cDNA；
e)位于编码mRNA的玉米优先基因5′末端约400bp至约1300bp的DNA片段的核苷酸序列，由该mRNA可以制备含有与SEQ IDNo 3、5或11之中任一核苷酸序列具有至少75％或至少80％或至少90％、或至少95％序列同一性、或与它们相同的核苷酸序列的cDNA；
f)与在a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所提及的核苷酸序列、特别是在a)中所提及的核苷酸序列具有至少70％或80％或90％或95％序列同一性、或与它们相同的核苷酸序列；或
g)约400bp至约1300bp DNA片段的核苷酸序列，该DNA片段在严紧条件下会与具有在a)、b)、c)、d)、e)、或f)中所提及的核苷酸序列、特别是在a)中所提及的核苷酸序列的DNA片段杂交。
为本发明目的，以百分数表示的两条相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”是指，两条经过优化的比对后的序列中具有相同残基(×100)位点的数目除以经过比较的位点的数目。缺口，也就是，比对时某残基在一条序列中存在而在另一条中却不存在的位点，被视作具有非相同残基的位点。根据Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)完成两条序列的比对。可以用例如GAP这样的标准软件程序方便地完成上述的计算机辅助的序列比对，GAP是采用了缺口生成罚分为50以及缺口衍生罚分为3的默认记分矩阵的WisconsinPackage Version 10.1(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)的一部分。
不消说，本发明的启动子和启动子区域还可以含有已知改进转录效率的元件，例如增强子、内含子，等。
本发明进一步包括DNA分子，含有与编码生物活性RNA、肽或蛋白质的一个或多个异源区域可操作性相连的本发明玉米根优先启动子。本发明的启动子可用于表达任何目的异源编码区域。
因此在本发明的另一实施方式中提供了嵌合基因，它含有：
a)玉米根优先启动子区域；含有选自下组的核苷酸序列：
i)SEQ ID No 1自第1位核苷酸至第338位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID No 2自第11位核苷酸至第1196位核苷酸的核苷酸序列；
ii)含有SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280为核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列；
iii)编码mRNA的玉米优先基因中(5′末端)约400bp至约1300bp的DNA片段的核苷酸序列，该mRNA优选大小为约600nt，从该mRNA可以制备含有对应于核苷酸序列SEQ IDNo 7、SEQ ID No 8或SEQ ID No 9或SEQ ID No 10的核苷酸序列的互补序列的cDNA；
iv)编码mRNA的玉米优先基因5′末端约400bp至约1300bp的DNA片段的核苷酸序列，该mRNA优选大小为约600nt，从该mRNA可以制备包含编码具有氨基酸序列SEQ ID No4或6的多肽的核苷酸序列的cDNA；
v)位于编码mRNA的玉米优先基因5′末端约400bp至约1300bp的DNA片段的核苷酸序列，从该mRNA可以制备含有与SEQ ID No 3、5或11之中任一核苷酸序列具有至少75％或80％或90％或95％序列同一性、或与它们相同的核苷酸序列的cDNA；
vi)与在i)、ii)、iii)、iv)、v)、或vi)中所提及的核苷酸序列、特别是在i)中所提及的核苷酸序列具有至少70％或80％或90％或95％序列同一性、或与它们相同的核苷酸序列；或
vii)约400bp至约1300bp DNA片段的核苷酸序列，该DNA片段在严紧条件下会与具有在i)、ii)、iii)、iv)、v)、或vi)中所提及的核苷酸序列、特别是在i)中所提及的核苷酸序列的DNA片段杂交。
b)目的DNA区域，其被转录时产生生物活性RNA；和
c)含有在植物细胞中有3′转录终止和多聚腺苷酸化信号功能的DNA区域。
因此目的DNA区域、或所转录的RNA可以编码蛋白质或多肽，但还可以编码生物活性RNA，例如反义RNA、有义RNA、或同时含有能进行碱基配对并形成双链RNA的有义和反义RNA片段的dsRNA，如WO99/53050(引入本文作为参考)中所描述可用于靶序列的转录后基因沉默。
为使植物，例如玉米植物，以根选择性或根优先方式产生玉米根虫抗性，优选为针对Diabrotica barberi、Diabroticaundecimpuncata、Diabrotica virgifera的抗性，与本发明的玉米根虫选择性启动子可操作性连接的适宜候选DNA区域包括：与PCT公开WO 96/10083的成熟VIP2Aa或VIP2Ab蛋白结合的成熟VIP1Aa蛋白；Photorhabdus或Xhenorhabdus spp.的玉米根虫毒素，例如，Photorhabdus luminescens W-14的抗虫蛋白(Guo等人，1999，J.Biol.Chem.274，9836-9842)；WO 00/26378的CryET70蛋白质；如WO 97/40162中所述的由Bt菌株PS80JJ1、PS149B1和PS167H2产生的抗虫蛋白，尤其是Bt菌株PS149B1的约14kD和约44kD的蛋白质；US专利6,023,013的Cry3Bb蛋白；如大豆N2和R1半胱氨酸蛋白酶抑制剂这样的蛋白酶抑制剂(Zhao等人，1996，PlantPhysiol.，111，1299-1306)或oryzastatine例如水稻胱蛋白酶抑制剂(Genbank登录号S49967)、玉米胱蛋白酶抑制剂(Genbank登录号D38130、D10622、D63342)例如在由lrie等人所述的植株中表达的玉米胱蛋白酶抑制剂(1996，Plant Mol.Biol.，30，149-157)。还包括所有的等价物和变体，例如上述任一蛋白质的保持抗虫活性的截短的蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，用于赋以根优先方式产生根虫抗性的嵌合基因含有编码来自短芽孢杆菌的抗虫分泌蛋白(ISP)的核苷酸序列，当该抗虫分泌蛋白与一种ISP互补蛋白组合被昆虫摄食后，它是具有抗虫性的，ISP互补蛋白例如是另一种ISP蛋白，如作为WO01/87931公开的PCT申请PCT/EP01/05702中所述(引入本文作为参考；特别是WO 01/87931的DNA序列SEQ ID No 7和9)。编码ISP蛋白的核苷酸序列可以是经过修饰的DNA。
本发明进一步提供优先在植物(例如玉米植物)根中表达外源目的DNA的方法，包括以下步骤：
a)提供带有本发明嵌合基因的植物细胞，优选该嵌合基因在植物细胞基因组(特别是核基因组)中稳定整合以产生转基因细胞；
b)由所述转基因细胞再生出植株。
一种提供带有本发明嵌合基因的植物细胞的便利方法是用常规的转化方法导入DNA。显然，转化植物(尤其是谷类植物)的切实方法对于现在描述的方法来说并不重要，并且在现有技术中可以获得几种将外源DNA导入植物细胞基因组的方法，包括但不限于直接原生质体转化(参见，对于玉米例如US 5792936，引入本文作为参考)、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(参见，对于玉米例如US 6074877或US 6140553，引入本文作为参考)、微粒轰击、致密胚性愈伤组织的电穿孔(参见，对于玉米例如US 5641664，引入本文作为参考)或硅晶须(silicon whisker)介导的DNA导入。
外源目的DNA与本发明玉米根优先启动子的可操作性连接，还可以通过同源重组使目的DNA替换玉米根优先启动子天然连接的DNA而实现，如果所述目的DNA含有与玉米根优先启动子天然连接的DNA的同源区域。通过同源重组将目的DNA导入植物基因组的方法是可以得到的(例如US专利5744336，将其引入本文作为参考)。
可将已经获得的转化植株用于常规的育种方案，以产生更多具有相同特征的转化植株或将本发明玉米根优先表达嵌合基因导入相同或相关植物物种的其它品种、或杂交植株中。从转化植物获得的种子含有作为稳定基因组插入的本发明嵌合基因，并且也包括在本发明之内。
可以理解，本发明的手段和方法尤其是对玉米有用，但是也可以以类似的效果用于其它植物，尤其是用在谷类植物包括玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、水稻、草坪草、高梁、谷子或甘蔗。
以下非限制性实施例描述玉米根优先启动子的分离、和在玉米根中选择性表达的嵌合基因的构建。除非在实施例中指明，所有重组DNA技术都根据Sambrook等人(1989) Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，和Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA，第1和2卷中所述的标准程序完成。由R.D.D.Croy编著，BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications，UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)描述了植物分子工作的标准材料和方法。
贯穿整个说明书和实施例，给出了序列表所示的以下序列作参考：
SEQ ID No 1：约400bp玉米根优先启动子(GL4启动子)的核苷酸序列
SEQ ID No 2：约1200bp玉米根优先启动子(GL4启动子)的核苷酸序列
SEQ ID No 3：在具有SEQ ID No 1(GL4)核苷酸序列的玉米根优先启动子的控制下转录出的天然相关mRNA的cDNA的核苷酸序列
SEQ ID No 4：由cDNA GL4编码的蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID No 5：玉米根优先cDNA GL5的核苷酸序列
SEQ ID No 6：由cDNA GL5编码的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID No 7：寡核苷酸引物GVK27
SEQ ID No 8：寡核苷酸引物GVK28
SEQ ID No 9：寡核苷酸引物GVK29
SEQ ID No 10：寡核苷酸引物GVK30
SEQ ID No 11：玉米根优先cDNA GL12的核苷酸序列
SEQ ID No 12：质粒pTWV011的核苷酸序列
SEQ ID No 13：质粒pTWV018的核苷酸序列
SEQ ID No 14：约1300bp玉米根优先启动子(GL5启动子)的
核苷酸序列
SEQ ID No 15：寡核苷酸引物GVK22
SEQ ID No 16：寡核苷酸引物GVK23
SEQ ID No 17：寡核苷酸引物GVK24
SEQ ID No 18：寡核苷酸引物GVK25
SEQ ID No 19：寡核苷酸引物GVK26
SEQ ID No 20：寡核苷酸引物GVK31
SEQ ID No 21：寡核苷酸引物GVK32
SEQ ID No 22：寡核苷酸引物GVK33
SEQ ID No 23：寡核苷酸引物GVK38
SEQ ID No 24：寡核苷酸引物GVK39
SEQ ID No 25：寡核苷酸引物GVK45
SEQ ID No 26：寡核苷酸引物MDB285
SEQ ID No 27：寡核苷酸引物MDB286
SEQ ID No 28：寡核苷酸引物MDB363
SEQ ID No 29：寡核苷酸引物MDB364
SEQ ID No 30：寡核苷酸引物MDB552
SEQ ID No 31：寡核苷酸引物MDB556
实施例
实施例1.根优先玉米cDNA的分离
利用已知为READS的差异RNA cDNA显示法(Prashar和Weismann，1999，Methods in Enzymology 303：258-272)鉴定了在玉米根中优先表达的RNA转录物标签。
之后，从获自不同发育阶段(从64日龄的植株到成熟植株)的玉米植株制备了不同组织(根、茎、叶)的总RNA样品。根据Prashar和Weismann(1999，supra)的描述，对各样品用严紧PCR条件和寡核苷酸扩增了经不同内切限制性核酸酶消化的cDNA分子的3′末端片段。
对由各RNA样品产生的cDNA限制性片段3′末端的凝胶图形进行比较，使得能够对于仅在玉米根组织RNA样品中出现、或在根组织RNA中比在其它玉米组织中更显著的片段作出初级鉴定。分离这些3′末端片段并进行测序。将它们的核苷酸序列与公共或私有数据库比较，并且仅将新序列用于进一步的Northern分析，该分析利用来自不同玉米组织的RNA样品作为起始物、各分离的cDNA 3′末端片段为探针。分析杂交的RNA转录物的大小、丰度、和特异性。表1中归纳了在玉米根中具有最高特异性的3′末端结果，表1中的丰度和特异性以降序排列。
表1.
| 用作探针的3′末端的鉴定 | 杂交转录物1的定量 | 杂交转录物2的估测长度 | 杂交转录物存在的特异性 |
| GL4 | 18 | 约600 | 根选择性 |
| GL5 | 15 | 约600 | 根选择性 |
| GL12 | 13 | 约600 | 根选择性 |
| GL11 | 3 | 约820 | 根选择性 |
| GL3 | 1 | 约1200 | 根选择性 |
| GL9 | 7 | 约900 | 根优先 |
| GL7 | 2 | 约700 | 根优先 |
| GL16 | ＜2 | 约1500 | 低表达 |
| GL17 | ＜2 | 约650 | 低表达 |
| GL6 | --- | --- | 无可视杂交 |
1以皮克/μg总RNA表示
2以核苷酸表示
进一步分析了与在玉米根中具有最高特异性表达的最高丰度RNA转录物杂交的3′末端(GL4；GL5和GL12)。
用CLONTECH Laboratories的SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒和巢式寡核苷酸引物分离了GL4和GL5的全长cDNA，GL4的巢式引物是GVK22(SEQ ID No 15)/GVK23(SEQ ID No 16)，GL5的巢式引物是GVK24(SEQ ID No 17)/GVK25(SEQ ID No 18)。全长cDNA的核苷酸序列分别示于SEQ ID 3和5。对两条核苷酸序列进行的比较显示，GL4和GL5具有约89％的序列同一性。
在所述二序列中都可以鉴定出一个小的ORF(对于GL4，始于SEQID 3第32位核苷酸至第319位核苷酸；对于GL5，始于SEQ ID 5第27位核苷酸至第307位核苷酸)。由该ORF编码的多肽的氨基酸序列示于SEQ ID No 4或6。GL4和GL5 cDNA间，ORF编码区域中的核苷酸序列比片段中的其它部分更为保守。
以GL4 cDNA核苷酸序列为查询序列，鉴定了一条在322个核苷酸重叠区中与之具有91％序列同一性的核苷酸序列(WO 00/32799的SEQID No 19)。未曾描述WO 00/32799中所述的源自玉蜀黍的SEQ IDNo 19以根选择性或根优先的方式被转录。此外，鉴定到一条具有99％序列同一性的大于582nt的核苷酸序列(来自苗(seedling)和丝(silk)cDNA文库的克隆MEST23-CO7.T3)。
以GL5 cDNA核苷酸序列为查询序列，鉴定了一条与来自玉蜀黍的FtsZ1相关序列(Geneseq中的A47325)具有85％序列同一性的核苷酸序列。未曾描述该序列以根选择性或根优先的方式被转录。此外，鉴定到一条具有100％序列同一性的大于525nt的核苷酸序列(来自苗和丝cDNA文库的克隆MEST523-G12(3′))。
实施例2.转录mRNA的基因的玉米根优先启动子区域的分离，该mRNA的cDNA对应于GL4或GL5 cDNA。
如Liu等人所述(1995，The Plant Journal 8(3)：457-463)，用热不对称交错PCR分离了GL4 cDNA和GL5 cDNA对应序列的上游基因组片段，该片段含有启动子区域。
根据Dellaporte等人所述，纯化了用作起始模板DNA的玉米基因组DNA。用于TAIL-PCR以分离位于GL4 cDNA序列所对应的基因组DNA序列上游的基因组片段的特异性巢式寡核苷酸序列示于SEQ ID No7(GVK27)、SEQ ID No 8(GVK28)和SEQ ID No 9(GVK 29)；各独立反应中所使用的非特异性简并引物是6个简并引物MDB285、MDB286、MDB363、MDB364、MDB552或MDB556中的各个引物。PCR条件如Liu等人所述(1995，supra)。
分离了约400bp的基因组片段(对应于用引物对(GVK29/MDB285)获得的扩增产物)，将其克隆进了pGEM-T Easy
并测序。
根据约400bp片段的核苷酸序列，设计了新的巢式引物寡核苷酸(GVK 31/SEQ ID No 20；GVK32/SEQ ID No 21如GVK33/SEQID No 22)，并与上述简并引物结合用于分离所分离的启动子区域片段更上游的相邻DNA区域。由此分离了一个约350nt的DNA片段(对应于用引物对GVK33/MDB286获得的扩增产物)。在第三个循环中，将新的特异性巢式寡核苷酸组GVK33/SEQ ID No 22、GVK38/SEQID No 23和GVK39/SEQ ID No 24与上述简并引物(对应于用引物对GVK39/MDB363获得的扩增产物)联用分离了约800nt的相邻上游DNA片段。
为了验证所分离的基因组上游片段的连续性，用GVK29和GVK45(SEQ ID 25)引物扩增了完整的1200bp DNA片段，并克隆进pGEM-T Easy
。约1200bp上游DNA片段的完整核苷酸序列示于SEQ ID2。
引物GVK27、GVK28和GVK30(SEQ ID No 10)与上述简并引物结合使用。扩增了一条约1300nt、具有序列SEQ ID NO 14的片段(对应于MDB364和GVK30的扩增产物)。
实施例3.用所分离的GL4/GL5玉米根优先启动子区域构建嵌合基因。
用标准重组DNA方法制备了位于GL4启动子区域或GL5启动子区域控制下的以下嵌合ISP1A/ISP2A构建体：
含有以下DNA片段的GL4::ISP1A：
●GL4启动子区域(SEQ ID No 2)
●编码来自短芽孢杆菌的isp1A蛋白的DNA片段(SEQ ID 12自第2003位核苷酸至第4511位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)；
●35S转录物的3′末端片段(SEQ ID No 12自第1767位核苷酸至第1991位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)。
含有以下DNA片段的GL4::ISP2A：
●GL4启动子区域(SEQ ID No 2)
●编码来自短芽孢杆菌的isp2A蛋白的DNA片段(SEQ ID 12自第6001位核苷酸至第7228位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)；
●35S转录物的3′末端片段(SEQ ID No 12自第5765位核苷酸至第5989位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)。
含有以下DNA片段的GL5::ISP1A：
●GL5启动子区域(SEQ ID No 13自第4518位核苷酸至第5822位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)
●编码来自短芽孢杆菌的ispA1蛋白的DNA片段(SEQ ID 13自第2003位核苷酸至第4511位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)；
●35S转录物的3′末端片段(SEQ ID No 13自第1767位核苷酸至第1991位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)。
含有以下DNA片段的GL5::ISP2A：
●GL5启动子区域(SEQ ID No 13自第8628位核苷酸至第7324位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)
●编码来自短芽孢杆菌的isp2A蛋白的DNA片段(SEQ ID No12自第6090位核苷酸至第7317位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)；
●35S转录物的3′末端片段(SEQ ID No 12自第5765位核苷酸至第5989位核苷酸的核苷酸序列的互补序列)。
实施例4.含有GL4和GL5启动子的嵌合基因在稳定转化的玉米植株中的表达分析。
将实施例3中所描述的嵌合基因与嵌合bar基因一起导入了T-DNA载体(例如US专利5,561,236中所述的)以产生pTWV011(GL4启动子构建体)和pTWV018(GL5启动子构建物)。将这些T-DNA载体导入含有辅助Ti-质粒pGV4000或pEHA101的土壤根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
用US 6,140,553中所述的农杆菌介导的转化技术获得了用上述嵌合基因稳定转化的玉米植株。
如US 5,767,367中所述将DNA直接转移至玉米原生质体也可以获得用上述嵌合基因稳定转化的玉米植株。
从这些(体外或体内生长的)玉米植株的根、叶、茎组织分离了RNA，并以ISP1A特异性探针对它们作Northern分析。各独立结果示于表2。
总之，用核糖体RNA探针杂交载样修正后，GL5启动子区域平均在根中的启动转录是叶中的11倍、是茎中的19倍。GL4启动子区域平均在根中的启动转录是叶中的2倍、是茎中的10倍(尽管个别转化体可能表现一种更显著的玉米根选择性表达发方式)。
表1.GL4/GL5转录数据总结
| 平均值 | SD | ||||
| n＝3 | |||||
| G14启动子 | 根 | 1.25 | 1.18 | 根/叶 | 2 |
| 叶 | 0.61 | 0.73 | 根/茎 | ＞10 | |
| 茎 | ＜0.06 | ||||
| G15启动子 | 根 | 1.32 | 0.24 | 根/叶 | 11 |
| 叶 | 0.12 | 0.05 | 根/茎 | 19 | |
| 茎 | 0.07 | 0.03 |
表2.Northern分析数据总结
实施例5.含有GL4和GL5启动子的嵌合基因在稳定转化的玉米植株子代中的表达分析。
将实施例4含有GL4和GL5启动子的玉米植株的各九个转基因T0系与未经转化的B73杂交，对T1植株作DNA印迹、RNA印迹和ELISA分析以检测不同植株部分中ISP1 mRNA或蛋白质的存在。
在V4期做了Southern分析以确定转基因的拷贝数。除了两个含有两个转基因拷贝的品系之外，所有的分析事件都是单拷贝事件。
如实施例4，对源自V11-V13期的根、叶和茎材料的RNA做了Northern分析。用图像定量分析对转录物水平进行了定量。用核糖体探针做了载样误差修正。
对于带有GL4启动子的含转基因植物，估计isp1 mRNA介于0.17至0.74pg/μg总RNA之间。根中的平均isp1a mRNA水平(n＝9)为0.42pg/μg总RNA(SE＝0.18)。根vs叶的isp1a mRNA平均比率(n＝9)＞6.3。根vs茎的isp1a mRNA平均比率(n＝8)＞7.1。除了一个样品的根/茎比率是1.9之外，在茎中未见表达。
对于带有GL5启动子的含转基因植物，估计isp1 mRNA介于0.95至2.55pg/μg总RNA之间。根中的平均isp1a mRNA水平(n＝9)为1.57pg/μg总RNA(SE＝0.53)。根vs叶的isp1a mRNA平均比率(n＝9)＞17.6。根vs茎的isp1a mRNA平均比率(n＝8)＞26.6。在茎中未见表达。
在蛋白质水平用ELISA分析在V8期收获的根、叶和茎材料中ISP1a蛋白质的存在。各事件分析了两个植株。作为阴性对照，检查了wtB73的根、叶和茎材料的ISP1A蛋白质。在对照试验中没有探测到ISP1A蛋白质。
对于所有事件在叶或茎中都没有探测到ISP1A蛋白质表达。
在根中探测到的ISP1A蛋白质水平平均值是：
-0.07pg/ml，对应于含有由GL4启动子驱动的转基因的植物的根的约0.024％总蛋白质水平(n＝18)。
-0.12pg/ml，对应于含有由GL5启动子驱动的转基因的植物的根的约0.041％总蛋白质水平(n＝18)。
在蛋白质水平用ELISA分析在开花期收获的根、叶、茎和花粉材料中ISP1a蛋白质的存在。各事件分析了一个植株。作为阴性对照，检查了wtB73的根、叶和茎和花粉材料的ISP1A蛋白质。在对照试验中没有探测到ISP1A蛋白质。
对于所有事件在花粉中都没有探测到ISP1A蛋白质表达。
在含有由GL4启动子驱动的转基因植株的根、叶和茎中探测到的平均ISP1A蛋白质水平是：
平均值(n＝9)：
-根：0.286μg isp1a/ml～0.116％isp1a总蛋白质水平
-叶：0.018μg isp1a/ml～0.0022％isp1a总蛋白质水平(6％根水平)
-茎：0.020μg isp1a/ml～0.0043％isp1a总蛋白质水平(7％根水平)
在含有由GL4启动子驱动的转基因植株的根、叶和茎中探测到的平均ISP1A蛋白质水平是：
平均值(n＝9)：
-根：0.265μg isp1A/ml～0.142％isp1a总蛋白质水平
-叶：0.013μg isp1A/ml～0.0015％isp1a总蛋白质水平(5％根水平)
-茎：0.024μg isp1A/ml～0.0058％isp1a总蛋白质水平(9％根水平)
结籽后，检测了转基因植株核仁中的ISP1A蛋白质水平。在转基因植株种子中不能检测到ISP1A蛋白质，在wtB73对照中也不能。
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<220>
<221>misc_feature
<222>(339)..(370)
<223>5’UTR
<400>1
tactacagat aacacgacag ttaacgagcg ggtatgggtt gttttccttg agcactgttg 60
ttctctagaa tctctgaatc tctctctgtc ttgatgacac cgagcggaaa tagcagttgg 120
aagaggtgat tgggcttcag cgcgcgatcc aacccaagtg ggttccacaa cgtgaacctc 180
atgcagctta aaatacagcc agttgtgatc catctgccac agctgtttct acctcagatg 240
tgctacacag tgtattacct gtttctacct cgcagatgtg ctacacagtt gcttatgact 300
gcctataaaa tggccgggat cggtgaggct gctggaacca aggagagaga gcatatatat 360
ccaccgatcc atggcatg 378
<210>2
<211>1236
<212>DNA
<213>玉米黍
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(1196)
<223>启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(1197)..(1228)
<223>5’UTR
<400>2
cgggatcccg gctttctgca ctggacgtag tgtactttat acttgaaact tgtataaatt 60
tgtgtctttt atactccctc agtttgaaat atagttcttt ctagcctctt tttttccgtc 120
cacactcatt tgaatgataa taaatataga tatacataca aactatattc ataggttaat 180
taataaatgt atatttagtc taaaatgaaa tatattttac ccatcgtatt ccttatgcat 240
gaaatgttga tctacttgtc tgatggaaaa atactatgac gttgttgtac cagaccgcac 300
ctaaatcaaa ctgttttcag agatggccat tctattattg tagatttgtg atacgtacga 360
tgtacttttt tatccataaa ataccgtacc attatgatat ggatatcttg atgagaggga 420
ctcattatct ctctctatat atataaacac ctatatatca aacaggcatc aagaaaaata 480
gatgattttt ttttctgaag tagagtgaca gaagcagctg aagtgtgagt ctttttgttt 540
caattttata atgtgtaaag aaaatgacgc caatgaaata tgtgtctggg ctgacgtgtt 600
gtttggtgaa agccaatttt gttgtatata ggggggccag agcccagttg tatttgttgc 660
ccggactggc gccaaaaaaa aaaatccgga tagtactatt ccgctaactg tgtcacactt 720
tatctaaaat tagtcatcca aattaaagaa ctaaccttag atacaaaaaa ttaaacaaag 780
tatgacaagt taggtagcaa actaaactaa agaggataac acaacagtta accgtcgacg 840
tgcgcggcct gaatttacta ctacagataa cacgacagtt aacgagcggg tatgggttgt 900
tttccttgag cactgttgtt ctctagaatc tctgaatctc tctctgtctt gatgacaccg 960
agcggaaata gcagttggaa gaggtgattg ggcttcagcg cgcgatccaa cccaagtggg 1020
ttccacaacg tgaacctcat gcagcttaaa atacagccag ttgtgatcca tctgccacag 1080
ctgtttctac ctcagatgtg ctacacagtg tattacctgt ttctacctcg cagatgtgct 1140
acacagttgc ttatgactgc ctataaaatg gccgggatcg gtgaggctgc tggaaccaag 1200
gagagagagc atatatatcc accgatccat ggcatg 1236
<210>3
<211>592
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>GL4转录本的cDNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(540)..(540)
<223>于540位上n表示任何核苷酸
<400>3
caaggagaga gagcatatat atccaccgat catgatgaag ggtggcagca agaaggaagt 60
ggccggtgcg gcggcggtgg tggccatact gctggttctg cagctgatgg cagctccacc 120
gacggccatg gccgcccgct cgccgcgcgg agccgtgccg gatggctccc tcgccacgac 180
gcccaaggtg acgatgctgt cagccacgct gtgctacacg ggggagacat gcaaatacat 240
tacctgcctc actcctgctt gctcctgtaa ctatgatgat cgtcgctgct acatcatatt 300
tactcctgct gctgcttgag gccattctgt gtacgtgaat gaagccacta ctactctcac 360
acagcatgcg ccggccgacg acgtgcgtac gtatatatat acgctctacc tcgtgagctt 420
ttgttcgagt gatacgtgtt tcaaggcatc catccatcca tggatgctta tgtacgtata 480
tgtgttagtc gtgtgtcagg caaccgggca gcagaagggg gtgttgtatt atatatattn 540
acgtcttctg gtgattaaat aataaagggg ggcatgttgg atgtgtgcaa aa 592
<210>4
<211>95
<212>PRT
<213>玉米黍
<400>4
Met Met Lys Gly Gly Ser Lys Lys Glu Val Ala Gly Ala Ala Ala Val
1 5 10 15
Val Ala Ile Leu Leu Val Leu Gln Leu Met Ala Ala Pro Pro Thr Ala
20 25 30
Met Ala Ala Arg Ser Pro Arg Gly Ala Val Pro Asp Gly Ser Leu Ala
35 40 45
Thr Thr Pro Lys Val Thr Met Leu Ser Ala Thr Leu Cys Tyr Thr Gly
50 55 60
Glu Thr Cys Lys Tyr Ile Thr Cys Leu Thr Pro Ala Cys Ser Cys Asn
65 70 75 80
Tyr Asp Asp Arg Arg Cys Tyr Ile Ile Phe Thr Pro Ala Ala Ala
85 90 95
<210>5
<211>535
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>GL5转录本的cDNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(82)..(82)
<223>n表示任何核苷酸
<400>5
ccaatcagat agagagcata gtcgatcatg aagggtggca agaagaaagt ggccggtgcg 60
gtggtggcca tactgctggt tntgcagctc atggcagctc caccgacggc catggccgcc 120
cgctcgccgc gcggagccgt gccggatggc tccctcgcca cgacgcccaa ggtgacgatg 180
ctgtcggcca cgctgtgcta cacgggggag acatgcaaat acattggctg cctcactcct 240
gcttgctcct gcaactatag tgatcgtcta tgctacatca tatttactcc tgttgcttga 300
ggccattccg cgaagccaca actcttacaa tatgcatgcg ccggccgacg acgacgcgcg 360
ctgcctctcg tgagcttctg ttcaagtgat gcatgtttca aggcatccat ggatgcttta 420
cgtatatgcg tattaattag ccgtgtcagg gaaccggaca gaagggggtg ttgttttata 480
tttacgtctt ctggtgatca aataaagggg aaatatatgt tggatgtgtg caaaa 535
<210>6
<211>90
<212>PRT
<213>玉米黍
<400>6
Met Lys Gly Gly Lys Lys Glu Val Ala Gly Ala Val Val Ala Ile Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Gln Leu Met Ala Ala Pro Pro Thr Ala Met Ala Ala Arg
20 25 30
Ser Pro Arg Gly Ala Val Pro Asp Gly Ser Leu Ala Thr Thr Pro Lys
35 40 45
Val Thr Met Leu Ser Ala Thr Leu Cys Tyr Thr Gly Glu Thr Cys Lys
50 55 60
Tyr Ile Gly Cys Leu Thr Pro Ala Cys Ser Cys Asn Tyr Ser Asp Arg
65 70 75 80
Leu Cys Tyr Ile Ile Phe Thr Pro Val Ala
85 90
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物6VK27
<400>7
gctgacagca tcgtcacctt gggc 24
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK28
<400>8
gctgcagaac cagcagtatg gccac 25
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK29
<400>9
catgccatgg atcggtggat atatatg 27
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK30
<400>10
catgccatgg atcgactatg ctctc 25
<210>11
<211>164
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>GL12转录本的3’端的cDNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(45)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(53)..(53)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(59)..(59)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(61)..(61)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(88)..(88)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(93)..(93)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(96)..(96)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(126)..(126)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(157)..(157)
<223>n＝任何核苷酸
<400>11
ttttacacac atccaacatg ccccccttta ttatttaatc accanaagac gtnaatntnt 60
nttattcaac accccctttt gctgcccngg tgnctnacac accactaaca catttccgtt 120
cataancatt catgctgggc cgcgctgtgc ccgacanctt aaac 164
<210>12
<211>8514
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>质粒pTWV011
<220>
<221>misc_feature
<222>(52)..(1)
<223>LB＝T-DNA左边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(318)..(58)
<223>3’nos
<220>
<221>misc_feature
<222>(888)..(337)
<223>bar基因的编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(1721)..(889)
<223>35S启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(1991)..(1767)
<223>3’端的35S
<220>
<221>misc_feature
<222>(4511)..(2003)
<223>isp1a编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(4546)..(4515)
<223>玉米GL4转录本的前导序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(5732)..(4547)
<223>玉米优先启动子GL4
<220>
<221>misc_feature
<222>(5989)..(5765)
<223>3’端的35S
<220>
<221>misc_feature
<222>(7228)..(6001)
<223>isp2a编码区
<220>
<221>misc_feature
<222>(7263)..(7232)
<223>GL4转录本的前导序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(8449)..(7264)
<223>玉米根优先启动子GL4
<220>
<221>misc_feature
<222>(8514)..(8490)
<223>RB＝T-DNA右边界
<400>12
cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atcttcccga 60
tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg 120
ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata 180
aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat 240
atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg 300
tttgaacgat ctgcttcgga tcctagacgc gtgagatcag atctcggtga cgggcaggac 360
cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt catgccagtt 420
cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg 480
catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct tgaagccctg 540
tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg 600
gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca 660
ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga gccagggata 720
gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg 780
gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc 840
cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggtccatgg ttatagagag 900
agagatagat ttatagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa 960
cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg 1020
tcagtggaga tgtcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt 1080
tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct 1140
tgaatgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc ttccttttct 1200
actgtccttt cgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgaa 1260
attatccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgaca 1320
tttttggagt agaccagagt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca 1380
ttgagtcgta aaagactctg tatgaactgt tcgccagtct tcacggcgag ttctgttaga 1440
tcctcgattt gaatcttaga ctccatgcat ggccttagat tcagtaggaa ctaccttttt 1500
agagactcca atctctatta cttgccttgg tttatgaagc aagccttgaa tcgtccatac 1560
tggaatagta cttctgatct tgagaaatat gtctttctct gtgttcttga tgcaattagt 1620
cctgaatctt ttgactgcat ctttaacctt cttgggaagg tatttgatct cctggagatt 1680
gttactcggg tagatcgtct tgatgagacc tgctgcgtag gaacgcggcc gcgtatacgt 1740
atcgatatct tcgaattcat atgcatgatc tggattttag tactggattt tggttttagg 1800
aattagaaat tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt 1860
atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac 1920
tcacacatta ttatggagaa aatagagaga gatagatttg tagagagaga ctggtgattt 1980
cagcgtgtcc aagcttgcta gcctcagtcc acagcgaaga tcctcaccac agcggtcctg 2040
gtggagcccc acaggtcgtc cttgcaggac agggtgtaca ggaaggacct gtcggacttc 2100
acgttcttga agtccaggtt gatcctgtta gcgttcttgc cggaaccgga gtccagcacg 2160
gtcttggtct gctcaccgat caccttgtag gtgaaggaga aggtacctgg ggtctgggta 2220
atcagtgggg agtcgatgaa gtaggtagcg tcgtggtact tcacggccag tgggtcaccg 2280
aagaagtcga agtcaccctc gatgatgtcg aactgtggca ctgggtcctt gtactcgatc 2340
tcctcagcac ccacctccac gaaggacacg tcgtcccagt acacgttggt ctggccgtca 2400
cccttgatgg agatggtgtt gatctcgttg ccctccaggt ttggcaccag gatgttgatc 2460
ctctggtaac ccacgtggtc cagggtgatg ttgtcggtca cgatggactc ctgcttaccg 2520
tcgatctcga tgtccacgga caccttggag tcagccttca tgtacaggga cacgtagtag 2580
tcgatgttct tcttcagctt gttcttggac tcggtggaca gctcggtgaa agcacccttg 2640
ttagcggacc tgtactgctt cttaccggtg ttaccaccgt tcaccacgta ggtgtagtac 2700
cagttgccga tcttggtgtt gtcggactca ccaccgtcgt acagggtgga ggtctttatt 2760
gtgaagttca tcttcggttc gagcttcacg tcgtacaggt tcttcacgtc cttgaaggaa 2820
ccggtggagt cgttcagctg cttcctgatc tgcttagcgg tgtactcgtc cacgtaggac 2880
tgcacggaag cctcgaagat cggctggtcg ttgtagaaca gcaggccgtc cttctcctcg 2940
atctcgtctg ggtaggccag cttcagggcc tccttcacgg ataaatttgg ggtcttgtcc 3000
tctgggttgg tgtagtcctt agcagccacc ctcttctcgg acatctggtt gccgttgtcg 3060
acgatgatgc tggcggtctt ggcggagatc tcgtcggtga tgccgttcca gtcaccagcg 3120
atggtgatgt tgccgttggt gtccttgatg gcgtacttgc cctccacctg gtcggtttcg 3180
agcaggatcg gcttcttgtt ggacaggtag gtgttcagct gctccttgtt cagtgggatc 3240
ggcctggagt tgaagtcgtc catcgtgttg atggcgatgc cgttcttgcc cttctctggg 3300
taggactggt ctggcaggat ggtcagagcg gtggtgttct ccttggcctt gatggtgccg 3360
atggtggtgc cgtccaggat gaaggaggtg gttggcttgg tctcgtagat agcaccggtg 3420
cccacgttgt tgtacctcac gttggcgttc aggtaggcgg actcagcacc gttgatgtgg 3480
gtgccgtcgt tggtggcgga gccccactcg ttggccacgg tctcggagtg ctggtagttc 3540
acggacacgc cgaaggatgg acccagaccg gaccaaccag cgttcacgtt cacgccctcg 3600
gtgttggtgt aggaccagtt ggtggactgg gaggactcca cggagtggga caggtcctcg 3660
ttcttggaca ggatcacctt ttcgagggac acgttcacgg atgggaaagc agccaccagt 3720
gggttgaagg tctccttggc gttggacagt ggcatgtccc tagcagcctt ctcgtagtcg 3780
gagtatgggt cgcccacggt gtgggcttcg agtgggttgc tggtgaactt ctggtagccc 3840
ttggaggcca gggagtcgtc ccacttcacg gccaccttgt tctggatggt gtagccgttc 3900
tcctcccaca cgtccgggat ggagtcgccg tcggtgtcgg tgtcctcgtc gatgtccctc 3960
ttggtcttct gggtgaacag gttggtcttg gaggccttct tcaggaacac ctgggtctcc 4020
ttcttgttga actctgggtt cctcagctcg tcctgctgca cctgctggga gtggttctgg 4080
gagtcgatct tgaacagctt cagctccttg aagatcttgt tgtcgatgtg cagggcgtcg 4140
tcggactggt actcgatctt gatctgcacc agctggccct tttcgaggtg cacggactgc 4200
ttgttgttgc ccttctcgga gatcaccttg ccgtccagct cgatgatggc gttctcgtcg 4260
tcggacagct tgaaggtgaa gtcaccagtg gcggaggact ggatcaggcc gatccagcgg 4320
atggagtggt actcctggtg cttctggtcc acgagggtgt tagcggtctg ctggtcgtag 4380
atcagggtgt tgtccctggt tggagcgaac agggtcaggt cgttgaagtc cttgcccttg 4440
aagtagtagc ccagcaggcc ctccctgtcg atctggttgt ccttcgaagc ctgggtggtg 4500
gtggcgatag ccatggatcg gtggatatat atgctctctc tccttggttc cagcagcctc 4560
accgatcccg gccattttat aggcagtcat aagcaactgt gtagcacatc tgcgaggtag 4620
aaacaggtaa tacactgtgt agcacatctg aggtagaaac agctgtggca gatggatcac 4680
aactggctgt attttaagct gcatgaggtt cacgttgtgg aacccacttg ggttggatcg 4740
cgcgctgaag cccaatcacc tcttccaact gctatttccg ctcggtgtca tcaagacaga 4800
gagagattca gagattctag agaacaacag tgctcaagga aaacaaccca tacccgctcg 4860
ttaactgtcg tgttatctgt agtagtaaat tcaggccgcg cacgtcgacg gttaactgtt 4920
gtgttatcct ctttagttta gtttgctacc taacttgtca tactttgttt aattttttgt 4980
atctaaggtt agttctttaa tttggatgac taattttaga taaagtgtga cacagttagc 5040
ggaatagtac tatccggatt tttttttttg gcgccagtcc gggcaacaaa tacaactggg 5100
ctctggcccc cctatataca acaaaattgg ctttcaccaa acaacacgtc agcccagaca 5160
catatttcat tggcgtcatt ttctttacac attataaaat tgaaacaaaa agactcacac 5220
ttcagctgct tctgtcactc tacttcagaa aaaaaaatca tctatttttc ttgatgcctg 5280
tttgatatat aggtgtttat atatatagag agagataatg agtccctctc atcaagatat 5340
ccatatcata atggtacggt attttatgga taaaaaagta catcgtacgt atcacaaatc 5400
tacaataata gaatggccat ctctgaaaac agtttgattt aggtgcggtc tggtacaaca 5460
acgtcatagt atttttccat cagacaagta gatcaacatt tcatgcataa ggaatacgat 5520
gggtaaaata tatttcattt tagactaaat atacatttat taattaacct atgaatatag 5580
tttgtatgta tatctatatt tattatcatt caaatgagtg tggacggaaa aaaagaggct 5640
agaaagaact atatttcaaa ctgagggagt ataaaagaca caaatttata caagtttcaa 5700
gtataaagta cactacgtcc agtgcagaaa gccgggatcc ccgggctagg cgcgccatat 5760
gcatgatctg gattttagta ctggattttg gttttaggaa ttagaaattt tattgataga 5820
agtattttac aaatacaaat acatactaag ggtttcttat atgctcaaca catgagcgaa 5880
accctatagg aaccctaatt cccttatctg ggaactactc acacattatt atggagaaaa 5940
tagagagaga tagatttgta gagagagact ggtgatttca gcgtgtccaa gcttgctagc 6000
ctcacttggt cagcagggta gcgtccacta cgtacctctt cacacccttg atcaccacct 6060
cggtgatctt gtcgatgtgg tagttggagt ccttgtcgat caggatctcc ttctcggaag 6120
cgaagccacc gatagcggac aggtaggcac cagtggaacc ctttggcacc tgcagcctca 6180
ggatgaactt cctggagccg aaagcggaca gcctctcgga ggacagggag gtggacatgt 6240
aacccttgtc ctccttcatg gtgttcagga acttctcctc catctccttc agggatggca 6300
gtgggtcgga aatctggtaa ccgaactcgg ccataccgca ccacctgtac acggtgatgt 6360
tctctgggat cggctgcttc tccagagcct cggagatgtt cttgatctgg gtgtccagct 6420
tctcgttgcc ggagccaccc tggttccgca ggtagtcgtt gatctgcttg tagtcctgcc 6480
tagcgtagcc gtccagggcc tccctctgtg ggtcggtcag gttcttagcc caaccctcgt 6540
agttcttcat gccccacctg tgagcctcgg cgttgatgtc gttcttgaag tccagggact 6600
tcttcagggt accctggatc tgcaggcact cgtaaccctt cttcaccacc ttggagatgt 6660
tgtccacgtg cagcacgtag ccgttgtcga tcagcatctt gtactcgttg ttgttcagga 6720
tcacaccagc cttggtcggg atggtggagc ccttgccgga tggcacggtc acttggagga 6780
tgatcctctc cttggaggac acgttctgag cagtcaggtg ggtgtccagg taggagtcga 6840
acttgatgtc cttgcccagg aactgctcct tgaactgggc ctgcacgtcg gtgttgatgg 6900
tgttgccctc ggtcagtggc ttgttaaatc cgatggtgga tggctccacg ttcttgtagg 6960
tcacgatgga ggaggacagg ttggccttgt cgaacatctt gtcgatctcc ttcaggtcct 7020
tgatctcgtc ctcgaaggag ccagccatgc tgaaggtgat ctccttgtag ttcttcttga 7080
tgtcgttctt gttgtccagg aaattattca tacgcgtctt ctcggtcacg gtcagcttcc 7140
actccttctc cttctccttg ccccactcct tggccttctc cttgtcctcc ttgaagtcct 7200
cggtgttgtt ggtggtcttc actagtgcca tggatcggtg gatatatatg ctctctctcc 7260
ttggttccag cagcctcacc gatcccggcc attttatagg cagtcataag caactgtgta 7320
gcacatctgc gaggtagaaa caggtaatac actgtgtagc acatctgagg tagaaacagc 7380
tgtggcagat ggatcacaac tggctgtatt ttaagctgca tgaggttcac gttgtggaac 7440
ccacttgggt tggatcgcgc gctgaagccc aatcacctct tccaactgct atttccgctc 7500
ggtgtcatca agacagagag agattcagag attctagaga acaacagtgc tcaaggaaaa 7560
caacccatac ccgctcgtta actgtcgtgt tatctgtagt agtaaattca ggccgcgcac 7620
gtcgacggtt aactgttgtg ttatcctctt tagtttagtt tgctacctaa cttgtcatac 7680
tttgtttaat tttttgtatc taaggttagt tctttaattt ggatgactaa ttttagataa 7740
agtgtgacac agttagcgga atagtactat ccggattttt ttttttggcg ccagtccggg 7800
caacaaatac aactgggctc tggcccccct atatacaaca aaattggctt tcaccaaaca 7860
acacgtcagc ccagacacat atttcattgg cgtcattttc tttacacatt ataaaattga 7920
aacaaaaaga ctcacacttc agctgcttct gtcactctac ttcagaaaaa aaaatcatct 7980
atttttcttg atgcctgttt gatatatagg tgtttatata tatagagaga gataatgagt 8040
ccctctcatc aagatatcca tatcataatg gtacggtatt ttatggataa aaaagtacat 8100
cgtacgtatc acaaatctac aataatagaa tggccatctc tgaaaacagt ttgatttagg 8160
tgcggtctgg tacaacaacg tcatagtatt tttccatcag acaagtagat caacatttca 8220
tgcataagga atacgatggg taaaatatat ttcattttag actaaatata catttattaa 8280
ttaacctatg aatatagttt gtatgtatat ctatatttat tatcattcaa atgagtgtgg 8340
acggaaaaaa agaggctaga aagaactata tttcaaactg agggagtata aaagacacaa 8400
atttatacaa gtttcaagta taaagtacac tacgtccagt gcagaaagcc gggatccccg 8460
ggcaggcctg caggtcgacg gccgagtact ggcaggatat ataccgttgt aatt 8514
<210>13
<211>8692
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>质粒pTW018 T-DNA序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(1)
<223>LB＝左边界区(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(318)..(58)
<223>3’nos(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(888)..(337)
<223>bar基因的编码区(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1721)..(889)
<223>35S启动子(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1991)..(1767)
<223>3’35S(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(4511)..(2003)
<223>isp1a编码区(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(4542)..(4518)
<223>源于玉米GL5转录本的前导序列(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(5630)..(5630)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(5822)..(4543)
<223>GL5启动子(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(6078)..(5854)
<223>3’35S(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(7317)..(6090)
<223>isp2a编码区(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(7348)..(7324)
<223>玉米GL5转录本的前导序列(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(8436)..(8436)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(8628)..(7349)
<223>玉米GL5转录本的启动子(互补)
<220>
<221>misc_feature
<222>(8692)..(8688)
<223>T-DNA右边界(互补)
<400>13
cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctctagagg atcttcccga 60
tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg 120
ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata 180
aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat 240
atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg 300
tttgaacgat ctgcttcgga tcctagacgc gtgagatcag atctcggtga cgggcaggac 360
cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag aaacccacgt catgccagtt 420
cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg 480
catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct tgaagccctg 540
tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg 600
gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca 660
ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga gccagggata 720
gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg 780
gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc 840
cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggtccatgg ttatagagag 900
agagatagat ttatagagag agactggtga tttcagcgtg tcctctccaa atgaaatgaa 960
cttccttata tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg 1020
tcagtggaga tgtcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt 1080
tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct 1140
tgaatgatag cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc ttccttttct 1200
actgtccttt cgatgaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttcccgaa 1260
attatccttt gttgaaaagt ctcaatagcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgaca 1320
tttttggagt agaccagagt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca 1380
ttgagtcgta aaagactctg tatgaactgt tcgccagtct tcacggcgag ttctgttaga 1440
tcctcgattt gaatcttaga ctccatgcat ggccttagat tcagtaggaa ctaccttttt 1500
agagactcca atctctatta cttgccttgg tttatgaagc aagccttgaa tcgtccatac 1560
tggaatagta cttctgatct tgagaaatat gtctttctct gtgttcttga tgcaattagt 1620
cctgaatctt ttgactgcat ctttaacctt cttgggaagg tatttgatct cctggagatt 1680
gttactcggg tagatcgtct tgatgagacc tgctgcgtag gaacgcggcc gcgtatacgt 1740
atcgatatct tcgaattcat atgcatgatc tggattttag tactggattt tggttttagg 1800
aattagaaat tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt 1860
atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac 1920
tcacacatta ttatggagaa aatagagaga gatagatttg tagagagaga ctggtgattt 1980
cagcgtgtcc aagcttgcta gcctcagtcc acagcgaaga tcctcaccac agcggtcctg 2040
gtggagcccc acaggtcgtc cttgcaggac agggtgtaca ggaaggacct gtcggacttc 2100
acgttcttga agtccaggtt gatcctgtta gcgttcttgc cggaaccgga gtccagcacg 2160
gtcttggtct gctcaccgat caccttgtag gtgaaggaga aggtacctgg ggtctgggta 2220
atcagtgggg agtcgatgaa gtaggtagcg tcgtggtact tcacggccag tgggtcaccg 2280
aagaagtcga agtcaccctc gatgatgtcg aactgtggca ctgggtcctt gtactcgatc 2340
tcctcagcac ccacctccac gaaggacacg tcgtcccagt acacgttggt ctggccgtca 2400
cccttgatgg agatggtgtt gatctcgttg ccctccaggt ttggcaccag gatgttgatc 2460
ctctggtaac ccacgtggtc cagggtgatg ttgtcggtca cgatggactc ctgcttaccg 2520
tcgatctcga tgtccacgga caccttggag tcagccttca tgtacaggga cacgtagtag 2580
tcgatgttct tcttcagctt gttcttggac tcggtggaca gctcggtgaa agcacccttg 2640
ttagcggacc tgtactgctt cttaccggtg ttaccaccgt tcaccacgta ggtgtagtac 2700
cagttgccga tcttggtgtt gtcggactca ccaccgtcgt acagggtgga ggtctttatt 2760
gtgaagttca tcttcggttc gagcttcacg tcgtacaggt tcttcacgtc cttgaaggaa 2820
ccggtggagt cgttcagctg cttcctgatc tgcttagcgg tgtactcgtc cacgtaggac 2880
tgcacggaag cctcgaagat cggctggtcg ttgtagaaca gcaggccgtc cttctcctcg 2940
atctcgtctg ggtaggccag cttcagggcc tccttcacgg ataaatttgg ggtcttgtcc 3000
tctgggttgg tgtagtcctt agcagccacc ctcttctcgg acatctggtt gccgttgtcg 3060
acgatgatgc tggcggtctt ggcggagatc tcgtcggtga tgccgttcca gtcaccagcg 3120
atggtgatgt tgccgttggt gtccttgatg gcgtacttgc cctccacctg gtcggtttcg 3180
agcaggatcg gcttcttgtt ggacaggtag gtgttcagct gctccttgtt cagtgggatc 3240
ggcctggagt tgaagtcgtc catcgtgttg atggcgatgc cgttcttgcc cttctctggg 3300
taggactggt ctggcaggat ggtcagagcg gtggtgttct ccttggcctt gatggtgccg 3360
atggtggtgc cgtccaggat gaaggaggtg gttggcttgg tctcgtagat agcaccggtg 3420
cccacgttgt tgtacctcac gttggcgttc aggtaggcgg actcagcacc gttgatgtgg 3480
gtgccgtcgt tggtggcgga gccccactcg ttggccacgg tctcggagtg ctggtagttc 3540
acggacacgc cgaaggatgg acccagaccg gaccaaccag cgttcacgtt cacgccctcg 3600
gtgttggtgt aggaccagtt ggtggactgg gaggactcca cggagtggga caggtcctcg 3660
ttcttggaca ggatcacctt ttcgagggac acgttcacgg atgggaaagc agccaccagt 3720
gggttgaagg tctccttggc gttggacagt ggcatgtccc tagcagcctt ctcgtagtcg 3780
gagtatgggt cgcccacggt gtgggcttcg agtgggttgc tggtgaactt ctggtagccc 3840
ttggaggcca gggagtcgtc ccacttcacg gccaccttgt tctggatggt gtagccgttc 3900
tcctcccaca cgtccgggat ggagtcgccg tcggtgtcgg tgtcctcgtc gatgtccctc 3960
ttggtcttct gggtgaacag gttggtcttg gaggccttct tcaggaacac ctgggtctcc 4020
ttcttgttga actctgggtt cctcagctcg tcctgctgca cctgctggga gtggttctgg 4080
gagtcgatct tgaacagctt cagctccttg aagatcttgt tgtcgatgtg cagggcgtcg 4140
tcggactggt actcgatctt gatctgcacc agctggccct tttcgaggtg cacggactgc 4200
ttgttgttgc ccttctcgga gatcaccttg ccgtccagct cgatgatggc gttctcgtcg 4260
tcggacagct tgaaggtgaa gtcaccagtg gcggaggact ggatcaggcc gatccagcgg 4320
atggagtggt actcctggtg cttctggtcc acgagggtgt tagcggtctg ctggtcgtag 4380
atcagggtgt tgtccctggt tggagcgaac agggtcaggt cgttgaagtc cttgcccttg 4440
aagtagtagc ccagcaggcc ctccctgtcg atctggttgt ccttcgaagc ctgggtggtg 4500
gtggcgatag ccatggatcg actatgctct ctatctgatt ggtttggctt tgctccagca 4560
gccagccatt ttataggcag cagtcactaa actgtaggct gtagcacgtc tgacagacag 4620
gtagatggat cacaactggc tgtattttaa aaagctgcac gaggttcacg ttgtgtcgtc 4680
gtggtataga taaatgtgca tgcagcaatg gaacaatatt ggggttgatg actgaatcgc 4740
tcaagctagc tagcccaatc atctcttcca actgctaccc gctgtgtctc ataaacacgc 4800
aggtccagcg attctaaacc gcaacagtgc tcaacgaaaa ctacccttac ccgctggtta 4860
attattgtgt tatcatattt aaatgctgtc attttcttta caaattataa aacttgggac 4920
gtgtttggtt cgctgcctat acttatttta tgtattggat tctatgcgca aagagcaaaa 4980
ttccagtacc aaatgtttgt tgtattttat tgggtagcgt gtacgtcgca cattctgtaa 5040
tacaacctcc gttcacagat atatgacatg ttgatttttt taaaaaactt tgaccattta 5100
tcttattcaa aagtataaaa ttttaattaa gcacaaacta ccttaagtga taaaacaaac 5160
cacacaaaaa ataaatgaca actcattatt ttttaaataa gacaagtgat taaagttttt 5220
taaaaagtca gcgatgtcat atatttatga acggtatata tatatatata tataacaccc 5280
atatcgagca ggcatcaaga aaaacatatc gatgattttt gttttcctaa agtagagtga 5340
caagctaaac aaatgacata tttttgtttc agttttgtaa ggccattctc agtggtgagc 5400
ttcagaacat gtgacatatt ttttttgttt tagttttgta aggcctttct cagtggtgag 5460
ctttagaaca agtgacatct ttttgtttca gttttgtaag gtcattctta gtggtgagct 5520
tcagaacaag tgagatgaga tctttttgtt tcagttttgt taggccagtt tcatcggtga 5580
gcttcacaac aagtgacatc ttcttttcag ttttgtaagg ccattttcan cggtgagctt 5640
cggtacaatg ttttccatgt tgtcacacca tatttaaact aggtaattgt atatatagaa 5700
ttttatctct atgaaactct accatctccc ataagctctt tctatatctc tgcttttaat 5760
tgtatgtcat gtcactatgt atgatggtgt atcatcgtat ataatgagta tgaaattccg 5820
ccaatcacta ggggctaggc gcgccatatg catgatctgg attttagtac tggattttgg 5880
ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 5940
gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 6000
gaactactca cacattatta tggagaaaat agagagagat agatttgtag agagagactg 6060
gtgatttcag cgtgtccaag cttgctagcc tcacttggtc agcagggtag cgtccactac 6120
gtacctcttc acacccttga tcaccacctc ggtgatcttg tcgatgtggt agttggagtc 6180
cttgtcgatc aggatctcct tctcggaagc gaagccaccg atagcggaca ggtaggcacc 6240
agtggaaccc tttggcacct gcagcctcag gatgaacttc ctggagccga aagcggacag 6300
cctctcggag gacagggagg tggacatgta acccttgtcc tccttcatgg tgttcaggaa 6360
cttctcctcc atctccttca gggatggcag tgggtcggaa atctggtaac cgaactcggc 6420
cataccgcac cacctgtaca cggtgatgtt ctctgggatc ggctgcttct ccagagcctc 6480
ggagatgttc ttgatctggg tgtccagctt ctcgttgccg gagccaccct ggttccgcag 6540
gtagtcgttg atctgcttgt agtcctgcct agcgtagccg tccagggcct ccctctgtgg 6600
gtcggtcagg ttcttagccc aaccctcgta gttcttcatg ccccacctgt gagcctcggc 6660
gttgatgtcg ttcttgaagt ccagggactt cttcagggta ccctggatct gcaggcactc 6720
gtaacccttc ttcaccacct tggagatgtt gtccacgtgc agcacgtagc cgttgtcgat 6780
cagcatcttg tactcgttgt tgttcaggat cacaccagcc ttggtcggga tggtggagcc 6840
cttgccggat ggcacggtca cttggaggat gatcctctcc ttggaggaca cgttctgagc 6900
agtcaggtgg gtgtccaggt aggagtcgaa cttgatgtcc ttgcccagga actgctcctt 6960
gaactgggcc tgcacgtcgg tgttgatggt gttgccctcg gtcagtggct tgttaaatcc 7020
gatggtggat ggctccacgt tcttgtaggt cacgatggag gaggacaggt tggccttgtc 7080
gaacatcttg tcgatctcct tcaggtcctt gatctcgtcc tcgaaggagc cagccatgct 7140
gaaggtgatc tccttgtagt tcttcttgat gtcgttcttg ttgtccagga aattattcat 7200
acgcgtcttc tcggtcacgg tcagcttcca ctccttctcc ttctccttgc cccactcctt 7260
ggccttctcc ttgtcctcct tgaagtcctc ggtgttgttg gtggtcttca ctagtgccat 7320
ggatcgacta tgctctctat ctgattggtt tggctttgct ccagcagcca gccattttat 7380
aggcagcagt cactaaactg taggctgtag cacgtctgac agacaggtag atggatcaca 7440
actggctgta ttttaaaaag ctgcacgagg ttcacgttgt gtcgtcgtgg tatagataaa 7500
tgtgcatgca gcaatggaac aatattgggg ttgatgactg aatcgctcaa gctagctagc 7560
ccaatcatct cttccaactg ctacccgctg tgtctcataa acacgcaggt ccagcgattc 7620
taaaccgcaa cagtgctcaa cgaaaactac ccttacccgc tggttaatta ttgtgttatc 7680
atatttaaat gctgtcattt tctttacaaa ttataaaact tgggacgtgt ttggttcgct 7740
gcctatactt attttatgta ttggattcta tgcgcaaaga gcaaaattcc agtaccaaat 7800
gtttgttgta ttttattggg tagcgtgtac gtcgcacatt ctgtaataca acctccgttc 7860
acagatatat gacatgttga tttttttaaa aaactttgac catttatctt attcaaaagt 7920
ataaaatttt aattaagcac aaactacctt aagtgataaa acaaaccaca caaaaaataa 7980
atgacaactc attatttttt aaataagaca agtgattaaa gttttttaaa aagtcagcga 8040
tgtcatatat ttatgaacgg tatatatata tatatatata acacccatat cgagcaggca 8100
tcaagaaaaa catatcgatg atttttgttt tcctaaagta gagtgacaag ctaaacaaat 8160
gacatatttt tgtttcagtt ttgtaaggcc attctcagtg gtgagcttca gaacatgtga 8220
catatttttt ttgttttagt tttgtaaggc ctttctcagt ggtgagcttt agaacaagtg 8280
acatcttttt gtttcagttt tgtaaggtca ttcttagtgg tgagcttcag aacaagtgag 8340
atgagatctt tttgtttcag ttttgttagg ccagtttcat cggtgagctt cacaacaagt 8400
gacatcttct tttcagtttt gtaaggccat tttcancggt gagcttcggt acaatgtttt 8460
ccatgttgtc acaccatatt taaactaggt aattgtatat atagaatttt atctctatga 8520
aactctacca tctcccataa gctctttcta tatctctgct tttaattgta tgtcatgtca 8580
ctatgtatga tggtgtatca tcgtatataa tgagtatgaa attccgccaa tcactagggg 8640
caggcctgca ggtcgacggc cgagtactgg caggatatat accgttgtaa tt 8692
<210>14
<211>1316
<212>DNA
<213>玉米黍
<400>14
ggcggaattt catactcatt atatacgatg atacaccatc atacatagtg acatgacata 60
caattaaaag cagagatata gaaagagctt atgggagatg gtagagtttc atagagataa 120
aattctatat atacaattac ctagtttaaa tatggtgtga caacatggaa aacattgtac 180
cgaagctcac cgctgaaaat ggccttacaa aactgaaaag aagatgtcac ttgttgtgaa 240
gctcaccgat gaaactggcc taacaaaact gaaacaaaaa gatctcatct cacttgttct 300
gaagctcacc actaagaatg accttacaaa actgaaacaa aaagatgtca cttgttctaa 360
agctcaccac tgagaaaggc cttacaaaac taaaacaaaa aaaatatgtc acatgttctg 420
aagctcacca ctgagaatgg ccttacaaaa ctgaaacaaa aatatgtcat ttgtttagct 480
tgtcactcta ctttaggaaa acaaaaatca tcgatatgtt tttcttgatg cctgctcgat 540
atgggtgtta tatatatata tatatatacc gttcataaat atatgacatc gctgactttt 600
taaaaaactt taatcacttg tcttatttaa aaaataatga gttgtcattt attttttgtg 660
tggtttgttt tatcacttaa ggtagtttgt gcttaattaa aattttatac ttttgaataa 720
gataaatggt caaagttttt taaaaaaatc aacatgtcat atatctgtga acggaggttg 780
tattacagaa tgtgcgacgt acacgctacc caataaaata caacaaacat ttggtactgg 840
aattttgctc tttgcgcata gaatccaata cataaaataa gtataggcag cgaaccaaac 900
acgtcccaag ttttataatt tgtaaagaaa atgacagcat ttaaatatga taacacaata 960
attaaccagc gggtaagggt agttttcgtt gagcactgtt gcggtttaga atcgctggac 1020
ctgcgtgttt atgagacaca gcgggtagca gttggaagag atgattgggc tagctagctt 1080
gagcgattca gtcatcaacc ccaatattgt tccattgctg catgcacatt tatctatacc 1140
acgacgacac aacgtgaacc tcgtgcagct ttttaaaata cagccagttg tgatccatct 1200
acctgtctgt cagacgtgct acagcctaca gtttagtgac tgctgcctat aaaatggctg 1260
gctgctggag caaagccaaa ccaatcagat agagagcata gtcgatccat ggcatg 1316
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK22
<400>15
gctgtgtgag agtagtagtg gcttc 25
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK23
<400>16
cacaagcgtg gctgacagca tcgt 24
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK24
<400>17
gctcacgaga ggcagcgcgc gtcgtc 26
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK25
<400>18
gtaaaagttg tggcttcccg g 21
<210>19
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK26
<400>19
ccgcgctgtg cccgacagct taaac 25
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK31
<400>20
gggttggatc gcgccaatca cctcttc 27
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK32
<400>21
ccgctcggtg tcatcaagac agag 24
<210>22
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK33
<400>22
gctcaaggaa aacaacccat acccgc 26
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK38
<400>23
ggcgccagtc cgggcaacaa atac 24
<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK39
<400>24
gggctctggc ccccctatat acaac 25
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物GVK45
<400>25
cgggatcccg gctttctgca ctggacg 27
<210>26
<211>15
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物MDB285
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n＝任何核苷酸
<400>26
ntcgastwts gwgtt 15
<210>27
<211>16
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>寡核苷酸引物MDB286
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>n＝任何核苷酸
<220>
<221>misc_feature
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cngasnagwt wgcata 16
Claims (15)
1.玉米根优先启动子片段，其由SEQ ID No 14自第1位核苷酸至第1280位核苷酸的核苷酸序列组成。
2.含有根据权利要求1的玉米根优先启动子的玉米根优先启动子区域。
3.根据权利要求2的玉米根优先启动子区域，进一步含有SEQID No 14的自第1281位核苷酸至第1308位核苷酸的核苷酸序列。
4.根据权利要求2的玉米根优先启动子区域，进一步含有SEQID No 1的自第339位核苷酸至第366位核苷酸的核苷酸序列。
5.根据权利要求2的玉米根优先启动子区域，进一步含有SEQID NO：13的自第4518位核苷酸至第4542位核苷酸的核苷酸序列的互补序列。
6.含有以下可操作性连接DNA区域的嵌合基因：
a)根据权利要求1的玉米根优选启动子；
b)编码目的生物活性的RNA的异源DNA区域；和
c)转录终止和多聚腺苷酸化信号。
7.根据权利要求6的嵌合基因，其中所述生物活性RNA编码目的蛋白质。
8.根据权利要求7的嵌合基因，其中所述蛋白质是一种当其在植物细胞中表达后会赋予所述植物对害虫或病原体抗性的蛋白质。
9.根据权利要求8的嵌合基因，其中所述蛋白质是Brevibacillus laterosporus的ISPA1或ISPA2。
10.含有根据权利要求6至9之中任一权利要求的嵌合基因的植物细胞。
11.根据权利要求10的植物细胞，其是玉米植物细胞。
12.优先在植物根中表达生物活性RNA的方法，所述方法包括：
a)提供带有根据权利要求6-9之中任一项的嵌合基因的所述植物的根细胞；和
b)使该植物生长。
13.根据权利要求12的方法，其中所述植物是玉米植物。
14.权利要求1的玉米根优先启动子用于在植物根中优先表达生物活柱RNA的用途。
15.根据权利要求14的用途，其中所述植物是玉米植物。
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