CN111574604A

CN111574604A - 小麦抗病蛋白TaAFRK及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN111574604A
Application number: CN202010434683.7A
Authority: CN
Inventors: 张增艳; 吴天赐; 郭飞龙
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: CN111574604B

Abstract

本发明公开了小麦抗病蛋白TaAFRK及其相关生物材料与应用。TaAFRK是如下任一蛋白：A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物抗病性相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。本发明所提供的TaAFRK及其编码基因可作为真菌抑制剂和用于提高植物抗病性，对于培育新的植物抗病品种具有重要意义。

Description

小麦抗病蛋白TaAFRK及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中小麦抗病蛋白TaAFRK及其相关生物材料与应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，更是我国第二大主粮作物，因此保证小麦的品质优和产量高，对于保障我国乃至全球人民的粮食安全和生活品质非常重要。随着种植密度增加、肥水条件和耕作制度的改变，小麦纹枯病、根腐病、茎基腐病等土传真菌病害，已发展为我国小麦生产的主要根茎部病害，严重影响小麦籽粒的产量和品质，已成为我国小麦生产中亟待解决的主要问题之一。小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharpeyespot)。我国小麦纹枯病，主要由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)CAG-1引起的。纹枯病一般可使小麦减产10％～42％，严重地块则使小麦减产50％以上。据全国农技推广站报道，2005～2019年，我国小麦纹枯病每年发生面积约1.0-1.3亿亩，经济损失达数十亿元以上。小麦根腐病(common root rot)是由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)(有性态为禾旋孢腔菌Cochliobolus sativus)等引起的小麦根部病害，于世界各国小麦产区均有发生，一般减产5％～10％，严重地块减产20％～50％。小麦茎基腐病，主要由假禾谷镰刀菌(Fursarium pseudograminearum)引起，可导致小麦减产10％～70％。因此，选育和推广抗病小麦新品种，是防治上述土传真菌病害流行的最经济、生态安全和有效的途径，对于保障我国小麦稳产、高产非常重要。然而，由于缺乏易于利用的高抗上述土传真菌病的小麦种质资源，田间鉴定困难，使得常规育种方法培育小麦抗病品种的育种进展缓慢。分子生物学技术和基因工程的发展与应用，特别是抗病重要基因的分离克隆及功能研究的进步，为培育抗纹枯病、根腐病、茎基腐病的小麦新品种提供了一条新途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性(如植物对纹枯病的抗性)。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种小麦抗病蛋白TaAFRK及其相关生物材料与应用。

第一方面，本发明要求分别保护一种蛋白质和一种多肽。

本发明所要求保护的蛋白质命名为TaAFRK，来源于抗纹枯病的小麦品系CI12633，具体可为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物抗病性相关的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。

本发明所要求保护的多肽是来源于所述TaAFRK蛋白的多肽，具体可为如下A4)、A5)或A6)：

A4)氨基酸序列如SEQ ID No.2的第1-248位所示的多肽；

A5)将A4)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A4)所示的多肽具有90％以上的同一性且与抑菌相关的多肽；

A6)在A4)或A5)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合多肽。

上述蛋白质中，SEQ ID No.2由591个氨基酸残基组成。

上述蛋白质或多肽可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质或多肽中，所述标签(tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白或目的多肽一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白或目的多肽的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质或多肽中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对氨基酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质或多肽中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质或多肽中，所述TaAFRK可来源于小麦。

在本发明的具体实施方式中，所述多肽的结构自N端到C端为“His-TF-SEQ IDNo.1的第1-248个氨基酸”。该多肽是通过将SEQ ID No.1的第19-762位(即SEQ ID No.5)所示DNA片段插入到pCold-TF载体的BamHI位点处后得到的重组质粒经原核表达后所得。

第二方面，本发明要求保护与前文第一方面中所述蛋白质或多肽相关的生物材料。

本发明要求保护的生物材料具体可为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码前文第一方面中所述蛋白质或多肽的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低前文第一方面中所述蛋白质表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)所示的所述蛋白质的编码基因或如下b3)所示的所述多肽的编码基因：

b1)编码链的编码序列(ORF)是SEQ ID No.1的第19-1794位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

b3)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的第19-762位(即SEQ ID No.5)的cDNA分子或DNA分子。

上述生物材料中，B8)所述核酸分子具体可为与SEQ ID No.1所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子，如与SEQ ID No.1的第1588-1817位核苷酸所示的DNA片段(即SEQ ID No.3)反向互补的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1由2159个核苷酸组成，其ORF序列是SEQ ID No.1的第19-1794位，编码序列表中的序列2所示的蛋白质。

上述生物材料中，B2)所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述蛋白质或多肽的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶启动子("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1启动子(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

第三方面，本发明要求分别保护一种植物抗病剂和一种抑菌剂。

本发明所要求保护的植物抗病剂含有前文第一方面中所述蛋白质或/和前文第二方面中所述的与TaAFRK蛋白相关的生物材料；

本发明所要求保护的抑菌剂含有前文第一方面中所述多肽或/和前文第二方面中所述的与来源于TaAFRK蛋白的多肽相关的生物材料。

上述植物抗病剂可为抗小麦纹枯病和/或根腐病和/或茎基腐病的药剂。

上述抑菌剂可为真菌抑制剂。

进一步地，所述真菌可为小麦纹枯病致病菌、小麦根腐病致病菌和/或小麦茎基腐病致病菌。

在本发明的具体实施方式中，所述小麦纹枯病致病菌具体为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)；所述小麦根腐病致病菌具体为平脐蠕孢菌(Bipolarissorokiniana)；所述小麦茎基腐病致病菌具体为假禾谷镰孢菌(Fusariumpseudograminearum)。

第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述蛋白质或多肽或前文第二方面中所述生物材料的下述P1-P7中的任一种应用：

P1、前文第一方面中所述蛋白质或前文第二方面中所述的与TaAFRK蛋白相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

P2、前文第一方面中所述蛋白质或前文第二方面中所述的与TaAFRK蛋白相关的生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

P3、前文第一方面中所述蛋白质或前文第二方面中所述的与TaAFRK蛋白相关的生物材料在培育抗病植物中的应用；

P4、前文第一方面中所述蛋白质或前文第二方面中所述的与TaAFRK蛋白相关的生物材料在制备植物抗病产品中的应用；

P5、前文第一方面中所述蛋白质或前文第二方面中所述的与TaAFRK蛋白相关的生物材料在植物育种中的应用；

P6、前文第一方面中所述多肽或前文第二方面中所述的与来源于TaAFRK蛋白的多肽相关的生物材料在抑菌中的应用；

P7、前文第一方面中所述多肽或前文第二方面中所述的与来源于TaAFRK蛋白的多肽相关的生物材料在制备抑菌产品中的应用。

在P6和P7所示应用中，所述抑菌中的“菌”为真菌。

第五方面，本发明要求保护一种培育抗病植物的方法。

本发明所要求保护的培育抗病植物的方法，可包括如下步骤：提高目的植物中前文第一方面中所述蛋白质或其编码基因的表达量或/和活性，得到抗病植物；所述抗病植物的抗病性高于所述目的植物的抗病性。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质或其编码基因的表达量可通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，其中所述蛋白质的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

所述蛋白质的编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

上述方法中，所述抗病植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。

第六方面，本发明要求保护一种培育抗病性降低的转基因植物的方法。

本发明所要求保护的培育抗病性降低的转基因植物的方法，可包括如下步骤：降低目的植物中前文第一方面中所述蛋白质的编码基因的表达量或/和活性，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。

上述方法中，降低所述目的植物中前文第一方面中所述蛋白质的编码基因的表达量可通过将与SEQ ID No.1的第1588-1817位核苷酸所示的DNA片段(即SEQ ID No.3)反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上文中，所述植物和所述目的植物均为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦。

上文中，所述抗病可为抗小麦纹枯病和/或抗小麦根腐病和/或抗小麦茎基腐病。

上文中，所述小麦纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起。所述小麦根腐病可由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)引起。所述小麦茎基腐病可由假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)引起。

实验证明：采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaAFRK基因，结果显示TaAFRK基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaAFRK是小麦抗纹枯病反应所必需的基因，也从反向证明TaAFRK是小麦抗纹枯病的重要基因。原核表达TaAFRK蛋白含有2个anti-fungal结构域部分肽，发现其可以抑制小麦纹枯病菌、根腐菌和茎基腐病致病菌菌丝的生长。本发明所提供的TaAFRK基因是与植物抗病相关的基因，TaAFRK可作为真菌抑制剂，其编码基因可用于提高植物抗病性，对于培育新的植物抗病品种具有重要意义。

附图说明

图1为定量PCR分析在山红麦和温麦6号中TaAFRK基因的转录表达。

图2为TaAFRK基因在不同品种的表达特性。

图3为定量PCR分析TaAFRK基因在CI12633不同组织中的表达特性。

图4为定量PCR检测BSMV感染小麦中TaAFRK基因的沉默情况。图中标注BSMV:TaAFRK的三个柱形图代表三个TaAFRK基因沉默的CI12633株系。

图5为定量PCR检测BSMV感染小麦中禾谷丝核菌相对生物量。图中标注BSMV:TaAFRK的三个柱形图代表三个TaAFRK基因沉默的CI12633株系。

图6为对照小麦与TaAFRK基因沉默小麦的病级鉴定结果。图中标注BSMV:TaAFRK的三个样本代表三个TaAFRK基因沉默的CI12633株系中的样本。

图7为TaAFRK蛋白抑制纹枯病致病菌(禾谷丝核菌R0301)、根腐病致病菌(平脐蠕孢菌)和茎基腐病致病菌(假禾谷镰孢菌)的生长。A中，上排右侧His-TF-TaAFRK对禾谷丝核菌R0301抑制，左侧为His-TF对照，下排右侧His-TF-TaAFRK对平脐蠕孢菌抑制，左侧为His-TF对照。B中，右侧His-TF-TaAFRK对假禾谷镰孢菌抑制，左侧为His-TF对照。

各图中*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中小麦CI12633为来自江苏省农业种质资源保护与利用平台(江苏农业科学院种质资源库)的种质，小麦CI12633表现为抗纹枯病。温麦6号为来自国家植物种质资源共享平台(中国农业科学院种质资源库)的种质，温麦6号高感纹枯病。小麦品种山红麦为来自中国农业科学院种质资源库的种质，小麦品种山红麦表现为抗纹枯病(参考文献：Xiuliang Zhu,Chungui Lu,Lipu Du,Xingguo Ye'，Xin Liu,Anne Coules,ZengyanZhang,2017，The wheat NB-LRR gene TaRCR1is required for host defence responseto the necrotrophic fungal pathogen Rhizoctonia cerealis，Plant BiotechnologyJournal，15,674-687)。扬麦9号来源于江苏里下河地区农业科学研究所，扬麦9号表现为感纹枯病(参考文献：Xujiang Wu,Kai Cheng,Renhui Zhao,Shujiang Zang,Tongde Bie,Zhengning Jiang,Ronglin Wu,Derong Gao,Boqiao Zhang.2017,Quantitative traitloci responsible for sharp eyespot resistance in common wheat CI12633，Scientific Reports,7:11799)。小麦品系山农0431由山东农业大学李斯深教授赠送，小麦品系西风由江苏农业科学院种质资源库蔡士宾研究员赠送，小麦品系山农0431和西风均表现为中抗纹枯病(参考文献：Xiuliang Zhu,Chungui Lu,Lipu Du,Xingguo Ye'，Xin Liu,Anne Coules,Zengyan Zhang,2017，The wheat NB-LRR gene TaRCR1is required forhost defence response to the necrotrophic fungal pathogen Rhizoctoniacerealis，Plant Biotechnology Journal，15,674-687)。

下述实施例中的小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301(江苏省农业科学院)(冷苏凤,张爱香,李伟,陈怀谷.江苏省小麦新品种(系)对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报,2010，26(6)：1176-1180)；小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207(Ji L,Liu C,Zhang L,Liu A,Yu J.Variation of rDNAinternal transcribed spacer sequences in Rhizoctonia cerealis.CurrentMicrobiology.2017,74,877–884)，引自山东农农业大学植物保护学院于金凤教授。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)由山东农业大学植物保护学院于金凤教授分离、赠送(参考文献：Na Dong,Xin Liu,Yan Lu,Li-pu DU，Hui-jun XU，Zhiyong Xin，Zengyan Zhang，2010，Overexpression of TaPIEP1,a pathogen-inducedERF of wheat,confers host-enhanced resistance to fungal pathogen Bipolarissorokiniana，Functional and Integrative Genomics，10：215-226)，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。

下述实施例中假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)由山东农业大学植物保护学院于金凤教授分离、赠送。

下述实施例中BSMV病毒载体的3个组分BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ质粒(刘晓东,张增艳,姚乌兰,辛志勇.Implement of barley stripe mosaic virus-based induced genesilencing in wheat.Acta Agron Sin(作物学报),2005,31(11):1518–1520；赵丹，赵继荣，黄茜，李宁，刘艳，黄占景，张增艳.利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能.作物学报(Acta Agronomica Sinica)，2011,37(11):2106-2110)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中BSMV-γ：GFP质粒，从美国引入，参考文献：Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue GP.2002.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in amonocot plant.The Plant Journal 30,315-327。本实验室保存。

小麦纹枯病病级标准(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)，具体见表1。

表1小麦纹枯病病级标准

其中，0级代表免疫、1级代表抗、2级代表中抗、3级-4级代表中感、5级代表高感。

病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。

长满禾谷丝核菌的菌麦粒的制备方法：将浸泡5-6小时麦粒煮熟20分钟，塞满250-500毫升三角瓶，配制MS液体培养基，灭菌后，将新培养的禾谷丝核菌R0301、WK207的菌丝块接种到三角瓶中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

实施例1、小麦抗病蛋白TaAFRK及其编码基因的克隆

1、TaAFRK基因的克隆

本发明的发明人从抗纹枯病小麦种质CI12633中分离克隆出一个小麦抗病相关的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，将其命名为TaAFRK蛋白。将编码TaAFRK蛋白的基因命名为TaAFRK基因，如SEQ ID No.1所示，具体克隆方法如下：

提取接种小麦纹枯病菌(禾谷丝核菌菌株WK207)的小麦CI12633茎部总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，利用TaAFRK-OF和TaAFRK-OR为引物，以及TOYOBO公司的高保真TAQ酶(KOD FX)、KOD FX Buffer、dNTPs，进行PCR扩增。

TaAFRK-OF：5'-CGCGGTTAGGTAGCTAGCAT-3'；

TaAFRK-OR：5'-GTCGATCAGCCGCATTCTCT-3'。

扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后98℃变性10秒，58℃复性30秒，68℃延伸1.5分钟，共40个循环；68℃延伸5分钟；PCR反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1-1848位核苷酸所示，其编码序列(ORF)是SEQ ID No.1的第19-1794位核苷酸；编码SEQ ID No.2所示的蛋白质TaAFRK，共591个氨基酸残基组成。

设计3’RACE引物TaAFRK-3RACE-F1和TaAFRK-3RACE-F2，以接种2天纹枯病菌WK207的CI12633叶片RNA反转录的cDNA稀释5倍作为模板，对TaAFRK基因进行3’端扩增。

TaAFRK-3RACE-F1：5′-TCCGAGGGCCTATTCTCCAT-3′；

TaAFRK-3RACE-F2：5′-TGGGATGAGGGAAACTGGAT-3′。

根据3’-Full RACE Core Set Ver.2.0的说明书，以TaAFRK-3RACE-F1、TaAFRK-3RACE-F2作为上游引物，3’RACE试剂盒提供引物3’RACE Outer Primer和3’RACE InnerPrimer作为下游引物，用高保真酶KOD FX进行扩增。通过2轮PCR扩增，从抗病小麦CI12633cDNA中扩增到3′部分编码序列和非编码序列，3′非编码序列即SEQ ID No.1所示的自3′末端第1795-2159位核苷酸(即SEQ ID No.4)。

2、TaAFRK基因受纹枯病菌诱导的表达分析

在抗病小麦农家品种山红麦和感病的小麦品系温麦6号分蘖期的基部叶鞘与茎间，接种小麦纹枯病(禾谷丝核菌菌株WK207)菌丝牙签，在接种前(未接菌)以及接纹枯病菌WK207菌丝2d、4d、10d，采取抗纹枯病小麦品种山红麦及感病小麦品种温麦6号的接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述小麦材料的RNA，纯化。

将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成型表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaAFRK基因序列设计特异定量引物TaAFRK-QF/TaAFRK-QR，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析。

内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；

TaActin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

TaAFRK基因的特异引物对：

TaAFRK-QF：5’-AGGTTCGAGACTTTCATGTTCT-3’；

TaAFRK-QR：5’-GTGGAGCAGCTACAGATATAGC-3’

用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CTmethod.Methods.25:402-408)，分析未接菌以及接小麦纹枯病菌WK207菌丝2d、4d、10d抗病小麦山红麦和感病的小麦品系温麦6号中TaAFRK的表达情况，每组样品重复3次。

结果显示，在未接菌时，抗病小麦、感病小麦中TaAFRK的表达水平均较低；在接菌2d，4d和10d，TaAFRK基因在抗病小麦山红麦中的表达量极显著高于感病小麦温麦6号；在抗病小麦山红麦中TaAFRK表达显著受该病原菌诱导，接菌2d达到高峰(图1)，也表明TaAFRK基因可能参与小麦抗纹枯病反应。

实施例2、TaAFRK基因表达量与小麦对纹枯病抗性紧密相关

一、TaAFRK基因在不同品种的表达特性分析

接种小麦纹枯病菌(禾谷丝核菌WK207)两天，采取抗纹枯病的小麦品种/系(CI12633、山红麦)、中抗小麦品种(山农0431和西风)及感病小麦品种(温麦6号以及扬麦9号)接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述6个小麦材料的RNA，纯化。

将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaAFRK基因序列设计特异定量引物TaAFRK-QF/TaAFRK-QR(引物序列见前文)，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CTmethod.Methods.25:402-408)，计算TaAFRK基因在不同抗纹枯病小麦与感病小麦材料中TaAFRK的相对表达量。

结果如图2所示，抗病小麦CI12633以及山红麦中TaAFRK的表达量极显著的高于感病小麦温麦6号以及扬麦9号，中抗小麦品系山农0431和西风中TaAFRK的表达量显著高于感病小麦温麦6号以及扬麦9号，说明TaAFRK基因表达量与抗性正相关，TaAFRK基因应该是抗纹枯病的重要基因。

二、TaAFRK基因在抗病小麦CI12633不同组织中表达特性的分析

提取抗病小麦CI12633叶片、叶鞘、茎以及穗部组织的RNA，纯化。将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaAFRK基因序列设计特异定量引物TaAFRK-QF/TaAFRK-QR(引物序列见前文)，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)，分析TaAFRK基因在抗病材料CI12633不同组织中的表达情况。

结果如图3所显示的，TaAFRK基因在小麦茎中的表达量最高，在穗中的表达量最低；而小麦茎器官正是纹枯病发病部位，再次表明TaAFRK基因表达量与小麦抗性相关。

实施例3、培育纹枯病抗性降低的小麦进行TaAFRK基因功能反向验证

一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaAFRK基因

1、将SEQ ID No.1的第1588-1817位核苷酸(即SEQ ID No.3)所示的DNA片段的两末端分别带有NheI识别序列。NheI酶切后，将SEQ ID No.1的第1588-1817位核苷酸(即SEQID No.3)所示的DNA片段(230bp)以反向插入法插入到BSMV-γ链的NheI酶切位点，得到重组载体BSMV-γ：antiTaAFRK，使与SEQ ID No.1的第1588-1817位(即SEQ ID No.3)所示的DNA片段反向互补的DNA分子(antiTaAFRK)，被γ载体的T7启动子驱动。

2、制备转录反应液

(1)取BSMV-α质粒，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-α。取BSMV-β质粒，用限制性内切酶SpeI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-β。取重组质粒BSMV-γ：antiTaAFRK、BSMV-γ：GFP，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，分别命名为线性化的BSMV-γ：antiTaAFRK、线性化的BSMV-γ：GFP

(2)取线性化质粒，采用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7 kit(Promega)，进行体外转录反应，得到转录反应液。

线性化的载体为线性化的BSMV-α时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-α。线性化的载体为线性化的BSMV-β时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-β。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：GFP时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：GFP。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：antiTaAFRK时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：TaAFRK。

3、BSMV接种小麦植株

取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl转录反应液BSMV-γ：TaAFRK或转录反应液BSMV-γ：GFP，混匀，然后加入60μl RNase-freeddH₂O，再加入90μl GKP溶液(溶剂为水，含50mM甘氨酸、30mM K₂HPO₄、1％Bentonite和1％Celite，pH9.2)，混合，得到BSMV:TaAFRK病毒混合液或BSMV:GFP病毒混合液。待小麦CI12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取BSMV:TaAFRK病毒混合液或BSMV:GFP病毒混合液，摩擦接种于幼苗的第二个叶片和第三个叶片上(每个叶片10μl)，然后在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，覆膜保湿24小时，之后每隔6h在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液。

4、接种第12天取第四片叶片，提取RNA，采用小麦内源TaActin基因作为内参基因，RT-qPCR检测TaAFRK基因沉默情况，所用引物如下：

TaAFRK-QF：5’-AGGTTCGAGACTTTCATGTTCT-3'；

TaAFRK-QR：5’-GTGGAGCAGCTACAGATATAGC-3’。

结果如图4所示：导入BSMV：TaAFRK的CI12633植株中TaAFRK基因表达量被显著降低，得到TaAFRK基因沉默的CI12633(命名为BSMV:TaAFRK-CI12633)；而导入BSMV：GFP的CI12633(命名为BMSV:GFP-CI12633，作为对照)与野生型小麦CI12633中TaAFRK基因的表达量没有显著变化。

二、被沉默植株的抗病性鉴定

步骤一的小麦转染BSMV病毒20天后，采用牙签接种法对其接种小麦纹枯病菌(禾谷丝核菌WK207)：将长满小麦纹枯病菌(禾谷丝核菌WK207)菌丝的牙签嵌入到上述小麦基部第1-2叶鞘之间，菌麦粒置于植株的茎基部，用湿润的脱脂棉将其轻轻包围，保湿7天，以后每天喷施2次DEPC水。在小麦纹枯病菌(禾谷丝核菌WK207)接种10天，采取小麦叶鞘，提取RNA，定量PCR分析小麦叶鞘中禾谷丝核菌相对生物量(以RcActin表达量表示，RcActin即禾谷丝核菌actin)。检测引物如下：

RcActin-F：5'-GCATCCACGAGACCACTTAC-3'；

RcActin-R：5’-GCGTCCCGCTGCTCAAGAT-3'。

结果如图5所示，TaAFRK基因表达沉默后的小麦叶鞘中禾谷丝核菌相对生物量显著高于对照(BMSV:GFP感染小麦CI12633植株作为对照)。

在禾谷丝核菌WK207接种30天后，对小麦茎部位进行纹枯病的病级鉴定与病情指数计算。

3次VIGS重复实验及抗病鉴定结果如表1和图6所示，TaAFRK基因表达沉默后的BSMV:TaAFRK小麦植株茎上纹枯病病斑、病级与病情指数明显大于对照(BMSV:GFP)植株的病斑、病级与病情指数，表明TaAFRK基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaAFRK是小麦抗纹枯病反应所必需的基因，也从反向证明TaAFRK是小麦抗纹枯病的重要基因。

表1 BSMV:GFP对照与TaAFRK基因沉默植株的病级与病情指数

注：**表示TaAFRK基因沉默植株与BSMV:GFP对照的纹枯病差异极显著p<0.01。

实施例4、TaAFRK蛋白抑制小麦纹枯病菌、根腐菌和茎基腐病致病菌的菌丝生长

一、原核表达载体的构建

利用带有pCold-TF载体的重组位点的接头引物pCold-TF-TaAFRK-F和pCold-TF-R，以连有测序正确序列的pMD18-T-TaAFRK质粒(将SEQ ID No.1的第19-762位所示DNA片段克隆到pMD18-T载体后得到的重组质粒)为模板，进行高保真PCR扩增TaAFRK蛋白含有2个anti-fungal结构域部分的序列(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码SEQ ID No.2的第1-248位氨基酸)，并在其两端加上pCold-TF载体的重组位点。

pCold-TF-TaAFRK-F：5’-ggtaccctcgagggatccATGCTGGGCGTCCTGCTGC-3’；

pCold-TF-R：5’-aagcttgaattcggatccATGATCGAAGAACATGAAAG-3’。

其中，小写字母代表pCold-TF重组位点序列。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，用普通DNA产物纯化回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收；同时用BamHI单酶切pCOLD-TF载体，对酶切产物进行纯化回收。

用重组的方法将TaAFRK蛋白含有2个anti-fungal结构域部分(核苷酸序列如SEQID No.5所示，编码SEQ ID No.2的第1-248位氨基酸)的序列克隆到原核表达载体pCold-TF(Takara)的BamHI位点，与该载体His标签和触发因子(Trigger Factor,TF)形成融合结构，构建成His-TF-TaAFRK的原核表达载体。

反应体系如下：

2×Assembly mix(北京全式金生物公司，CU101) 5μl

BamHI单酶切载体pCold-TF 1μl

TaAFRK基因加重组位点接头的PCR纯化产物 4μl

反应条件：50℃，15min。

二、His-TF-TaAFRK蛋白的原核诱导表达及纯化

将步骤一构建得到的His-TF-TaAFRK融合蛋白表达载体质粒转化到感受态细胞Escherichia coli(E.coli)BL21(DE3)中。将重组蛋白进行诱导表达，诱导条件为0.05mMisopropyl-β-D-thiogalactopyranose，100转/min摇床上培养16℃过夜。然后将诱导表达的蛋白用Ni⁺resin(TransGen Biotech,China)4℃孵育纯化，1×PBS溶液洗脱。用SDS-PAGE检测纯化的蛋白。该步骤所得重组蛋白命名为His-TF-TaAFRK蛋白。

同时设置以pCold-TF空载体转化到感受态细胞Escherichia coli(E.coli)BL21(DE3)的对照，值得的相应蛋白命名为His-TF蛋白(作为对照)。

三、TaAFRK蛋白抑制小麦纹枯病致病菌(禾谷丝核菌R0301)、小麦根腐病致病菌(平脐蠕孢菌)和小麦茎基腐病致病菌(假禾谷镰孢菌)的生长

为了验证TaAFRK蛋白具备抑制上述真菌生长的活性，分别将10μM的His-TF-TaAFRK蛋白和10μM的His-TF蛋白均匀的注射到PDA培养基平板的小孔中，并接种纹枯病致病菌(禾谷丝核菌R0301)、根腐病致病菌(平脐蠕孢菌)和茎基腐病致病菌(假禾谷镰孢菌)(直径约0.5厘米的菌丝块)，观察PDA培养基平板上3种菌的生长状况。

结果如图7所示，与His-TF对照相比，注射His-TF-TaAFRK明显抑制了禾谷丝核菌R0301、平脐蠕孢菌和假禾谷镰孢菌的菌丝生长，表明TaAFRK含有2个anti-fungal结构域部分肽(TaAFRK)对禾谷丝核菌、平脐蠕孢菌和假禾谷镰孢菌生长有抑制作用，可望作为抗上述真菌的抑菌剂，创制抗纹枯病、根腐病、茎基腐的转TaAFRK基因小麦新材料。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 小麦抗病蛋白TaAFRK及其相关生物材料与应用

<130> GNCLN201427

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2159

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 1

cgcggttagg tagctagcat gctgggcgtc ctgctgctcc tcctcctgct catgccgctg 60

ccggcgactg caacggcaca gctctgtggc agcggcggca gctacgtagc caacggcacc 120

tacgagtcca acctcgccgc cctcgcctcc accctccccg ccaacgcctc atcctccccg 180

cagctcttcg ctgccgccac tgccggccaa tccccagacg cagtgcacgc gctcgcgctc 240

tgccggggcg acttcgccaa cgacaccgca tgcagggact gcgtcgccgc ctccttccag 300

cacgcgcagt ggacatgccc cagcgacaag gccgccaccg tctactacga gtacgacaac 360

gaccagagac caggctgcgt gctcggcttc tccggcgacg atggcttcct caacccagcg 420

gccaatctca ccgggaacgg cactctcttc caggcgtgga acacggggaa catctccggc 480

gtcgccagtg tcatcgccgc cggcgtccac gagctgctga ccgccacgtc cgaggacgca 540

gccgccaacg tgacgaggcg gtacgccacc gtggtcatgg attctgcccc gacgctctac 600

tctctagcgc agtgcacgcc ggacctgtcc gccggcgact gccaggcgtg cctccagcgg 660

ctcatcggca tggtcaacgc caccacgtct gtgcgcctgg gaggacggat cttcgtgctg 720

cgttgcaacg tcaggttcga gactttcatg ttcttcgatc atcccatgcg gcggatcagt 780

ccatcgtcca acgctccggc tcctcccaca ggtcatggaa cgcagccttg ggtaattgct 840

atatctgtag ctgctccact agcactggtt gctttctgcg tcactgtcta ctgtcgtcgc 900

ctcagaggaa gaaagaacaa aaatggtgca aagatactac gagaaaaacg tagttacaag 960

ttgcaagaag gagatcaaga actagtatgg gatatggaag caggattatc cggcttcaca 1020

gtttatgatt ttcacgagat attggaagct acaagtaact tttccgaaga aaataaactt 1080

ggagaaggag gatttggccc tgtatataag ggtcattttc ttcaaggatt ggagatagca 1140

gtcaagagac ttgcttcaca ttcaggacaa ggtgtcttag agttcaaaaa tgaagttcag 1200

ctcatagcca aacttcaaca tagaaatttg gttagactct tgggatgttg ctcccaagga 1260

gaggaaaaaa tattggtcta tgaatacttg ccaaacaaaa gtttggactt ctacatattt 1320

gatgaatgta gaaaagcttt attggattgg aacaaacgtc ttgcaataat tgaaggaata 1380

gcagaaggac ttctttacct acataagcac tctcgtttgc gtgtgataca tcgagatctt 1440

aaaccaagca acattctctt ggacgatgaa atgaatccta aaatttcaga ttttggccta 1500

gcaaaaatat ttagctcaaa taacacggaa gaagacacca caagaagagt ggttggtact 1560

tatggttaca tggctccgga gtatgcctcc gagggcctat tctccatcaa atccgatgta 1620

ttcagctttg gtgtcttaat tcttgagatc cttagtggga aaaggaattc tggtagccat 1680

caatgtggag gtttcatcaa cctcctcgga tattcttggc agttatggga tgagggaaac 1740

tggattgata ttgttgatgc gtcattgact cccaagtctc cccagcagaa atgatgaggt 1800

gcatcaacgt cggactacta tgtgtgcaag agaatgcggc tgatcgaccg aacatgttgg 1860

atgttactgc aatgctaagc agcaagacaa tgctcctgcg ggggccaaag cacccggcat 1920

atttcaacct aagggtaggc gatgaagagg attcctttgc tacccactcc tacagtgtta 1980

atgatataac catatctgta gcaactccta gatagttttt ctgtgtcatg tgttttttca 2040

ctgagccaat gcagaatcag tggtatagta cacgttgtac accacataat tttgagggtt 2100

atgtaagcac aattgcttct ctaaatcata taggattgaa gtgcaaaaaa aaaaaaaaa 2159

<210> 2

<211> 591

<212> PRT

<213> Triticum aestivum L.

<400> 2

Met Leu Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Met Pro Leu Pro Ala

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ala Gln Leu Cys Gly Ser Gly Gly Ser Tyr Val Ala Asn

20 25 30

Gly Thr Tyr Glu Ser Asn Leu Ala Ala Leu Ala Ser Thr Leu Pro Ala

35 40 45

Asn Ala Ser Ser Ser Pro Gln Leu Phe Ala Ala Ala Thr Ala Gly Gln

50 55 60

Ser Pro Asp Ala Val His Ala Leu Ala Leu Cys Arg Gly Asp Phe Ala

65 70 75 80

Asn Asp Thr Ala Cys Arg Asp Cys Val Ala Ala Ser Phe Gln His Ala

85 90 95

Gln Trp Thr Cys Pro Ser Asp Lys Ala Ala Thr Val Tyr Tyr Glu Tyr

100 105 110

Asp Asn Asp Gln Arg Pro Gly Cys Val Leu Gly Phe Ser Gly Asp Asp

115 120 125

Gly Phe Leu Asn Pro Ala Ala Asn Leu Thr Gly Asn Gly Thr Leu Phe

130 135 140

Gln Ala Trp Asn Thr Gly Asn Ile Ser Gly Val Ala Ser Val Ile Ala

145 150 155 160

Ala Gly Val His Glu Leu Leu Thr Ala Thr Ser Glu Asp Ala Ala Ala

165 170 175

Asn Val Thr Arg Arg Tyr Ala Thr Val Val Met Asp Ser Ala Pro Thr

180 185 190

Leu Tyr Ser Leu Ala Gln Cys Thr Pro Asp Leu Ser Ala Gly Asp Cys

195 200 205

Gln Ala Cys Leu Gln Arg Leu Ile Gly Met Val Asn Ala Thr Thr Ser

210 215 220

Val Arg Leu Gly Gly Arg Ile Phe Val Leu Arg Cys Asn Val Arg Phe

225 230 235 240

Glu Thr Phe Met Phe Phe Asp His Pro Met Arg Arg Ile Ser Pro Ser

245 250 255

Ser Asn Ala Pro Ala Pro Pro Thr Gly His Gly Thr Gln Pro Trp Val

260 265 270

Ile Ala Ile Ser Val Ala Ala Pro Leu Ala Leu Val Ala Phe Cys Val

275 280 285

Thr Val Tyr Cys Arg Arg Leu Arg Gly Arg Lys Asn Lys Asn Gly Ala

290 295 300

Lys Ile Leu Arg Glu Lys Arg Ser Tyr Lys Leu Gln Glu Gly Asp Gln

305 310 315 320

Glu Leu Val Trp Asp Met Glu Ala Gly Leu Ser Gly Phe Thr Val Tyr

325 330 335

Asp Phe His Glu Ile Leu Glu Ala Thr Ser Asn Phe Ser Glu Glu Asn

340 345 350

Lys Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Pro Val Tyr Lys Gly His Phe Leu

355 360 365

Gln Gly Leu Glu Ile Ala Val Lys Arg Leu Ala Ser His Ser Gly Gln

370 375 380

Gly Val Leu Glu Phe Lys Asn Glu Val Gln Leu Ile Ala Lys Leu Gln

385 390 395 400

His Arg Asn Leu Val Arg Leu Leu Gly Cys Cys Ser Gln Gly Glu Glu

405 410 415

Lys Ile Leu Val Tyr Glu Tyr Leu Pro Asn Lys Ser Leu Asp Phe Tyr

420 425 430

Ile Phe Asp Glu Cys Arg Lys Ala Leu Leu Asp Trp Asn Lys Arg Leu

435 440 445

Ala Ile Ile Glu Gly Ile Ala Glu Gly Leu Leu Tyr Leu His Lys His

450 455 460

Ser Arg Leu Arg Val Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Leu

465 470 475 480

Leu Asp Asp Glu Met Asn Pro Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys

485 490 495

Ile Phe Ser Ser Asn Asn Thr Glu Glu Asp Thr Thr Arg Arg Val Val

500 505 510

Gly Thr Tyr Gly Tyr Met Ala Pro Glu Tyr Ala Ser Glu Gly Leu Phe

515 520 525

Ser Ile Lys Ser Asp Val Phe Ser Phe Gly Val Leu Ile Leu Glu Ile

530 535 540

Leu Ser Gly Lys Arg Asn Ser Gly Ser His Gln Cys Gly Gly Phe Ile

545 550 555 560

Asn Leu Leu Gly Tyr Ser Trp Gln Leu Trp Asp Glu Gly Asn Trp Ile

565 570 575

Asp Ile Val Asp Ala Ser Leu Thr Pro Lys Ser Pro Gln Gln Lys

580 585 590

<210> 3

<211> 230

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 3

tccgagggcc tattctccat caaatccgat gtattcagct ttggtgtctt aattcttgag 60

atccttagtg ggaaaaggaa ttctggtagc catcaatgtg gaggtttcat caacctcctc 120

ggatattctt ggcagttatg ggatgaggga aactggattg atattgttga tgcgtcattg 180

actcccaagt ctccccagca gaaatgatga ggtgcatcaa cgtcggacta 230

<210> 4

<211> 365

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 4

tgaggtgcat caacgtcgga ctactatgtg tgcaagagaa tgcggctgat cgaccgaaca 60

tgttggatgt tactgcaatg ctaagcagca agacaatgct cctgcggggg ccaaagcacc 120

cggcatattt caacctaagg gtaggcgatg aagaggattc ctttgctacc cactcctaca 180

gtgttaatga tataaccata tctgtagcaa ctcctagata gtttttctgt gtcatgtgtt 240

ttttcactga gccaatgcag aatcagtggt atagtacacg ttgtacacca cataattttg 300

agggttatgt aagcacaatt gcttctctaa atcatatagg attgaagtgc aaaaaaaaaa 360

aaaaa 365

<210> 5

<211> 744

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<400> 5

atgctgggcg tcctgctgct cctcctcctg ctcatgccgc tgccggcgac tgcaacggca 60

cagctctgtg gcagcggcgg cagctacgta gccaacggca cctacgagtc caacctcgcc 120

gccctcgcct ccaccctccc cgccaacgcc tcatcctccc cgcagctctt cgctgccgcc 180

actgccggcc aatccccaga cgcagtgcac gcgctcgcgc tctgccgggg cgacttcgcc 240

aacgacaccg catgcaggga ctgcgtcgcc gcctccttcc agcacgcgca gtggacatgc 300

cccagcgaca aggccgccac cgtctactac gagtacgaca acgaccagag accaggctgc 360

gtgctcggct tctccggcga cgatggcttc ctcaacccag cggccaatct caccgggaac 420

ggcactctct tccaggcgtg gaacacgggg aacatctccg gcgtcgccag tgtcatcgcc 480

gccggcgtcc acgagctgct gaccgccacg tccgaggacg cagccgccaa cgtgacgagg 540

cggtacgcca ccgtggtcat ggattctgcc ccgacgctct actctctagc gcagtgcacg 600

ccggacctgt ccgccggcga ctgccaggcg tgcctccagc ggctcatcgg catggtcaac 660

gccaccacgt ctgtgcgcct gggaggacgg atcttcgtgc tgcgttgcaa cgtcaggttc 720

gagactttca tgttcttcga tcat 744

Claims

1.蛋白质或多肽；

所述蛋白质是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质；

所述多肽是如下A4)、A5)或A6)的多肽：

A4)氨基酸序列如SEQ ID No.2的第1-248位所示的多肽；

A6)在A4)或A5)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合多肽。

2.与权利要求1所述蛋白质或多肽相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质或多肽的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B8)降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的所述蛋白质的编码基因，或如下b3)所示的所述多肽的编码基因：

b1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的第19-1794位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

b2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

b3)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的第19-762位的cDNA分子或DNA分子。

4.植物抗病剂或抑菌剂，其特征在于：所述植物抗病剂含有权利要求1所述蛋白质或/和权利要求2或3中所述的与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料；

所述抑菌剂含有权利要求1所述多肽或/和权利要求2或3中所述的与权利要求1所述多肽相关的生物材料。

5.权利要求1所述蛋白质或多肽或权利要求2或3所述生物材料的下述P1-P7中的任一种应用：

P1、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

P2、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

P3、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在培育抗病植物中的应用；

P4、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在制备植物抗病产品中的应用；

P5、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3中所述的与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；

P6、权利要求1所述多肽或权利要求2或3中所述的与权利要求1所述多肽相关的生物材料在抑菌中的应用；

P7、权利要求1所述多肽或权利要求2或3中所述的与权利要求1所述多肽相关的生物材料在制备抑菌产品中的应用。

6.一种培育抗病植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量或/和活性，得到抗病植物；所述抗病植物的抗病性高于所述目的植物的抗病性。

7.一种培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量或/和活性，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。

8.根据权利要求4所述抗病剂或抑菌剂或权利要求5所述应用或权利要求6或7所述的方法，其特征在于：权利要求4或5中的所述植物、权利要求6或权利要求7中所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中权利要求1所述蛋白质或其编码基因的表达量是通过将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的；

所述降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量是通过将与SEQ IDNo.1的第1588-1817位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。

10.根据权利要求1所述的蛋白质或多肽或权利要求4或8所述的抗病剂或抑菌剂或权利要求5或8所述的应用或权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述抗病为抗纹枯病、根腐病和/或茎基腐病；

所述抑菌中的“菌”为真菌；

进一步地，所述真菌为纹枯病致病菌、根腐病致病菌和/或茎基腐病致病菌；

更进一步地，所述纹枯病致病菌为禾谷丝核菌，所述根腐病致病菌为平脐蠕孢菌，所述茎基腐病致病菌为假禾谷镰孢菌。