CN113215127B - 广谱抗病的转TaWRK2A基因小麦的培育方法及其相关生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗病转TaWRK2A基因小麦的培育方法及其相关生物材料。本发明提供了TaWRK2A蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。实验表明，TaWRK2A是抗纹枯病和抗茎基腐病的重要基因。TaWRK2A基因过表达显著增强了转基因小麦对纹枯病和茎基腐病的抗病性。本发明提供了TaWRK2A蛋白或能够调控TaWRK2A蛋白编码基因表达的物质或能够调控TaWRK2A蛋白含量和/活性的物质在如下任一中的应用：调控植物抗病性；制备提高植物抗病性的产品；培育抗病植物；制备植物抗病产品；植物育种。本发明对于培育新的植物抗病品种具有重要意义。

Description

广谱抗病的转TaWRK2A基因小麦的培育方法及其相关生物 材料

技术领域

本发明涉及兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaWRK2A基因小麦的培育方法及其相关生物材料。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，全球约40％人口以小麦作为主粮作物，因此保证小麦的品质优和产量高，对于保障我国乃至全球人民的粮食安全和生活品质非 常重要。随着种植密度增加、免耕作方法等推广，小麦茎基腐病、纹枯病等土传真菌 病害与赤霉病，发展为我国小麦生产的重要病害，严重影响小麦产量和籽粒品质，已 成为我国小麦生产中亟待解决的主要问题之一。

小麦纹枯病(wheat sharp eyespot)，主要由腐生营养型病原真菌--禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的。纹枯病一般可使小麦减产10％～30％，严重地块则减 产50％以上。据全国农技推广站报道，2005-2020年我国小麦纹枯病每年发生面积约 1.0-1.3亿亩，经济损失达数十亿元以上。小麦茎基腐病(wheat Fusarium crown rot)， 主要由假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)引起，据全国农技推广站报道， 2020年全国小麦茎基腐病发生面积达4000万亩，导致小麦大面积减产，严重影响了 我国粮食安全。小麦茎基腐病不仅可造成小麦严重减产(损失可高达25％～75％)， 而且其病原菌产生的真菌毒素残留在小麦籽粒中，严重影响小麦籽粒的食用和饲用品 质。近年，我国小麦主产区小麦经常同时感染这2种病害。因此，选育和推广抗纹枯 病与茎基腐病的小麦新品种，是防治这些病害流行的最经济、安全和有效的途径，对 于保障小麦品质、高产稳产和粮食安全非常重要。

然而，由于缺乏易于利用的高抗茎基腐病、纹枯病的小麦种质资源，常规育种方法进行抗病小麦育种的进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展，特别是抗病重要基 因的分离克隆、功能验证、及抗病转基因小麦新种质的创制，为抗茎基腐病、纹枯病 小麦的高效育种提供了一条新途径。因此，目前迫切需要一种能同时抵抗抗茎基腐病、 纹枯病的小麦品种。

发明内容

本发明的目的是提供抗病转TaWRK2A基因小麦的培育方法及其相关生物材料。

本发明首先保护一种来源于小麦的抗茎基腐病、纹枯病的重要激酶，获自小麦CI12633，命名为TaWRK2A蛋白，为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)在(a1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)将序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物纹枯病抗病性相关的蛋白质。

所述标签见表1。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

TaWRK2A蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码TaWRK2A的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子可以是DNA， 如cDNA、基因组DNA或重组DNA。所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA 等。

编码TaWRK2A蛋白的基因命名为TaWRK2A基因。

TaWRK2A基因具体为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)的DNA分 子：

(b1)编码区如序列表的序列2中第25-2187位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(b3)编码区如序列表的序列3中第56-2215位核苷酸(不含终止子)所示的DNA 分子；

(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子杂交且编码所 述TaWRK2A蛋白的DNA分子；

(b5)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编 码所述TaWRK2A蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃条 件下杂交并洗膜。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分 比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明提供的TaWRK2A基因进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明 提供的TaWRK2A基因具有90％或者更高同一性的核酸，只要编码TaWRK2A蛋白且 具有TaWRK2A蛋白的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序 列。

含有所述TaWRK2A基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物 组织、转基因植物器官或重组微生物均属于本发明的保护范围。

所述表达盒自上游至下游依次包括启动子、TaWRK2A基因和终止子。进一步，所 述表达盒还可包括增强子。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组 织、器官和发育特异的启动子，诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜 花叶病毒的组成型启动子35S，来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶 ("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)，来自烟草的化学诱导型启 动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯) 诱导)，西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲 酯诱导)，热休克启动子(美国专利5，187，267)，四环素诱导型启动子(美国专利5， 057,422)，种子特异性启动子[如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国 专利200710099169.7)，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin 和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))]。 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引 用。可用于本发明的终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子), 花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子,tml终止子,豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼 氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141； Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990) Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

在本发明的实施例中，所述TaWRK2A基因表达盒中启动所述TaWRK2A基因转 录的启动子为玉米Ubiquitin启动子，终止所述TaWRK2A基因转录的终止子为胭脂碱 合成酶基因终止子PloyA。

可用现有的植物表达载体构建含有TaWRK2A基因的重组载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pWMB110.pWMB123、 pAHC25、pAHC20、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、 pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司) 等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和 任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷 酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶 基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。 使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增 强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编 码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子 的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始 区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物 的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相 关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉 素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因) 或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷 酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆 境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在单子叶植物表达载体pWMB110的多克隆位点(例 如BamHⅠ和SacⅠ酶切位点之间)插入TaWRK2A基因得到的重组质粒。

所述重组微生物的出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。

所述转基因植物组织或所述转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还保护TaWRK2A蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：

(c1)调控植物的抗病性；

(c2)调控小麦的抗病性；

(c3)提高植物的抗病性；

(c4)提高小麦的抗病性。

本发明还保护一种植物抗病剂，其活性成分为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)TaWRK2A蛋白；

(d2)TaWRK2A基因；

(d3)所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植 物器官或重组微生物。

所述植物抗病剂可为植物抗纹枯病制剂。所述纹枯病可由禾谷丝核菌引起。所述禾谷丝核菌具体可为禾谷丝核菌WK207。所述植物抗病剂可为植物抗茎基腐病制剂。 所述茎基腐病可由假禾谷镰刀菌引起。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包 括如下步骤：将TaWRK2A基因导入目的植物中，得到抗病性高于目标(受体)植物 的转基因植物。

上述方法中，TaWRK2A基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好 的表达效果：

①修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

②与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子； 启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或 器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于 双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选 择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物 中的表达；

③与适合的转录终止子连接，也可以提高基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明 基因进行连接；

④引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序 列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。

TaWRK2A基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电 导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法,转化植物细胞或组织，并将转化的植物组 织培育成植株。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中TaWRK2A基因的表达，得到抗病性低于目的植物的转基因植物。

“抑制目的植物中TaWRK2A基因的表达”具体可通过导入干扰片段实现。所述 干扰片段具体可如序列表的序列5所示。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中TaWRK2A蛋 白的含量和/或活性，从而增加目的植物的抗病性。

本发明还保护一种广谱抗病的转TaWRK2A基因小麦的培育方法、TaWRK2A蛋白、 能够调控TaWRK2A蛋白编码基因表达的物质、能够调控TaWRK2A蛋白含量和/活性 的物质在如下任一中的应用：

P1、调控植物抗病性；

P2、制备提高植物抗病性的产品；

P3、培育抗病植物；

P4、制备植物抗病产品；

P5、植物育种。本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaWRK2A基 因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在 该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种， 特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。 所述禾本科植物可为小麦属植物。所述小麦属植物可为小麦，例如小麦Fielder或小麦扬麦158或小麦CI12633。

所述广谱抗病或抗病性具体可为(1)对纹枯病的抗病性。所述纹枯病可由禾谷丝核 菌引起。所述禾谷丝核菌具体可为禾谷丝核菌WK207；(2)抗茎基腐病，所述茎基腐病 可由假禾谷镰刀菌引起。实验证明，使植物中的TaWRK2A基因表达水平增高(具体 可为过表达TaWRK2A基因)可以显著增强植物的抗病性，降低植物中的TaWRK2A 表达水平(具体可为抑制TaWRK2A基因表达)可以显著降低植物的抗病性。说明 TaWRK2A基因是小麦抗纹枯病、抗茎基腐病重要基因，正向参与小麦抗纹枯病、抗茎 基腐病反应。本发明的培育抗病性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意 义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

附图说明

图1为荧光定量PCR分析TaWRK2A基因在不同抗、感纹枯病小麦中表达的情况。

图2为荧光定量PCR分析TaWRK2A基因在不同抗、感茎基腐病小麦中表达情况。

图3为转TaWRK2A基因小麦的PCR检测。P为转基因载体质粒，WT为未转基 因小麦，N为转空载体小麦,1-17为转TaWRK2A基因阳性小麦。

图4为定量PCR分析转TaWRK2A基因小麦中TaWRK2A表达情况。VN代表转空 载体小麦-阴性对照，OW-4、OW-5、OW-6、OW-23和OW-26分别代表5个转基因植 株。

图5为定量PCR检测VIGS小麦中TaWRK2A基因的沉默情况。BSMV代表接种 BSMV的对照植株，BSMV:TaWRK2A代表TaWRK2A基因沉默的植株

图6为定量PCR分析VIGS小麦中禾谷丝核菌相对生物量(以RcActin表达量表 示)。BSMV代表接种BSMV的对照植株，BSMV:TaWRK2A代表TaWRK2A基因沉 默的植株

图7为TaWRK2A基因沉默小麦及对照的纹枯病感染严重度(照片)。BSMV代表 接种BSMV的对照植株，BSMV:TaWRK2A代表TaWRK2A基因沉默的植株。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。小麦CI12633、山红麦为高抗纹枯病材料，西风、山农0431为中抗 纹枯病材料。小麦温麦6号、扬麦9号为感纹枯病材料。

单子叶植物表达载体pWMB110(简称载体pWMB110)：参考文献：Liu HY,Wang K,JiaZM,Gong Q,Lin ZS,Lipu Du LP,Pei XW,Ye XG.Efficient induction of haploidplants in wheat by editing of TaMTL using an optimized Agrobacterium-mediatedCRISPR system.Journal of Experimental Botany,2020,71:1337–1349。

下述实施例中BSMV病毒载体的3个组分BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ质粒 从美国引入(Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue GP.2002.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.The Plant Journal 30,315-327。刘晓东, 张增艳,姚乌兰,辛志勇.Implement of barley stripe mosaic virus-basedinduced gene silencing in wheat.Acta Agron Sin(作物学报),2005,31(11):1518–1520；赵丹,赵继 荣,黄茜,李宁,刘艳,黄占景,张增艳.利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能.作物学报,2011,37(11):2106-2110)，公众可以从中国 农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

实施例中的小麦纹枯病致病菌均采用禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207(参 考文献：Ji,L.,Liu,C.,Zhang,L.,Liu,A.,and Yu,J.(2017).Variation of rDNAinternal transcribed spacer sequences in Rhizoctoniacerealis.Curr.Microbiol.74,877-884.doi: 10.1007/s00284-017-1258-2)。

小麦纹枯病病情分级标准，按照李斯深等方法(李斯深，李安飞，李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)，具体见表2。

表2小麦纹枯病病情分级标准

0级代表免疫，1级代表抗，2级代表中抗，3级-4级代表中感，5级代表高感。

菌麦粒的制备方法：将浸泡5-6小时麦粒煮20分钟，塞满三角瓶，灭菌后将小麦 纹枯病致病菌的菌丝块接种到三角瓶中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

菌牙签的制备方法：将牙签段竖立塞满小烧杯，倒入液体MS培养基，灭菌后将 小麦纹枯病致病菌的菌丝块接种到小烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。

进行表达与抗茎基腐病关联分析的小麦材料如下：抗茎基腐病小麦品种/系(CI12633、山红麦、Nivat14)、中感病小麦品种(扬麦16、济麦22)以及高感小麦品 种(扬麦158)。

实施例中的小麦茎基腐病致病菌均采用假禾谷镰刀菌(Fusariumpseudograminearum)(参考文献：Xia Yang,Yubo Pan,Pawan K.Singh,Xinyao He,YanRen,Lei Zhao, Ning Zhang,Shunhe Cheng and Feng Chen*.Investigation andgenome-wide association study for Fusarium crown rot resistance in Chinesecommon wheat，BMC Plant Biology(2019)19:153)。

小麦茎基腐病分级标准，按照周淼平等方法(周淼平，姚金保，张鹏，余桂 红，马鸿翔.小麦抗茎腐病种质筛选及鉴定新方法的建立.植物遗传资源学报2016， 17(2):377-382)，具体见3。

表3小麦茎基腐病分级标准

实施例1、抗纹枯病、抗茎基腐的小麦TaWRK2A及其编码基因的克隆

一、TaWRK2A基因的克隆

本发明的发明人从抗纹枯病小麦CI12633中分离克隆出一个小麦抗病重要蛋白，如 序列表的序列1所示，将其命名为TaWRK2A蛋白，属于小麦蛋白激酶。将编码 TaWRK2A蛋白的基因命名为TaWRK2A基因，其cDNA如序列表的序列2所示。

具体克隆步骤：提取接种小麦纹枯病致病菌的小麦CI12633的茎部的总RNA，根 据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将RNA反转录合成第一链cDNA，作 为基因克隆的模板，以TaWRK2A-OF1：5'-ATGGGTATCAGAGGAGGCCG-3'和 TaWRK2A-OR1：5'-GCCCAATAGCGCTTAGTTTGTT-3'为引物，进行第一轮PCR扩增， 反应体系：2×KOD-Fx buffer25μl、2.5mM dNTPs 10μl、10μM F/R primer 1.5μl、KOD-Fx 1μl、ddH2O 10μl，模板1μl；扩增程序为：先95℃预变性3分钟；然后98℃10秒，58℃ 30秒，68℃2.5分钟，共35个循环；68℃延伸7分钟；以稀释50倍的第一轮PCR扩增产 物作为模板，利用TaWRK2A-OF2：5'-CCGTGCGTGCAAAGCAATTTAG-3'和TaWRK2A-OR2：5'-TTCAACTCGGGGATACACGC-3'为引物，进行第二轮PCR扩增， 反应体系：2×KOD-Fx buffer 25μl、2.5mM dNTPs 10μl、10μM F/Rprimer 1.5μl、KOD-Fx 1μl、ddH2O 10μl，模板1μl；扩增程序为：扩增程序为：先95℃预变性3分钟；然后98℃ 10秒，58℃30秒，68℃2.5分钟，共35个循环；68℃延伸7分钟；第二轮PCR反应结 束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该第二轮PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序 列2(第1-2293位核苷酸)所示，其编码序列是序列表中序列2的第25-2187位核苷酸；编 码序列1所示的蛋白质TaWRK2A(第1-720位氨基酸)。

二、TaWRK2A基因表达量与小麦对纹枯病抗性紧密相关

供试小麦为：抗纹枯病小麦品种/系(CI12633、山红麦)、中抗小麦品种(西风、 山农0431)及感病小麦品种(温麦6号以及扬麦9号)。

将小麦纹枯病致病菌接种于供试小麦分蘖期幼苗的基部茎与叶鞘间(将菌牙签嵌入到植株基部第1叶鞘与茎部之间)；于接种2天，取不同小麦品种植株的叶鞘组织， 液氮速冻后储存于-80℃备用。

提取冻存组织/冻存器官的总RNA(每个样品约5μg)，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录得到cDNA。利用组成性表达的TaActin基因作为内 参基因，将cDNA浓度均一化。然后采用TaWRK2A基因的特异引物对,进行实时定量 PCR(RT-qPCR)分析，数据用2^-ΔΔCT方法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔCT method.Methods.25:402-408)计算TaWRK2A基因的相对表达水平。每种样品重复检测3次。

用于检测TaWRK2A基因的特异引物对

TaWRK2A-QF:5’-CGGGTGCCAGAGACAATGTA-3’

TaWRK2A-QR:5’-CAAGCAGCAACCCAACAGTT-3’

用于检测内参基因(TaActin基因)的引物对：

TaActin-F：5’-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3’；

TaActin-R：5’-GACCCAGACAACTCGCAAC-3’。

结果表明：如图1所示，在测试的6个材料中，抗病小麦CI12633和山红麦中TaWRK2A的表达量最高,高感小麦温麦6号中TaWRK2A的表达量最低；抗病小麦 CI12633和山红麦中TaWRK2A的表达量极显著地高于感病小麦温麦6号以及扬麦9号， 中抗小麦品系西风和中山农0431中TaWRK2A的表达量,显著高于感病小麦温麦6号 和扬麦9号，表明TaWRK2A基因在小麦中表达量与小麦对纹枯病抗性正相关， TaWRK2A基因是抗纹枯病的重要基因。

三、TaWRK2A基因表达量与茎基腐病抗性正相关

供试小麦为：抗茎基腐病小麦品种/系(CI12633、山红麦、Nivat14)、中感病小麦品种(扬麦16、济麦22)以及高感小麦品种(扬麦158)。

将小麦茎基腐病致病菌-假禾谷镰刀菌菌牙签接种于供试小麦分蘖期幼苗的基部第1叶鞘与茎部之间；于接种4天，取不同小麦品种植株的叶鞘组织，液氮速冻后储 存于-80℃备用。

提取冻存组织/冻存器官的总RNA，分析TaWRK2A基因的表达情况(具体方法同上)。每种样品重复检测3次。结果表明：如图2所示，在测试的6个材料中，抗病小 麦CI12633、山红麦和Nivat14中TaWRK2A的表达量最高,高感小麦扬麦158中 TaWRK2A的表达量最低。表明TaWRK2A基因在小麦中表达量与小麦对茎基腐病抗性 正相关，TaWRK2A基因是小麦抗茎基腐病的重要基因。

实施例2、兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaWRK2A基因小麦的创制和抗病性鉴定

一、重组表达载体的构建

1、提取小麦CI12633的茎部的总RNA并反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用TaWRK2A-ZT-F1和TaWRK2A-ZT-R1 组成的引物对，在高保真扩增酶PrimeSTAR的作用下进行PCR扩增，回收PCR扩增 产物。

TaWRK2A-ZT-F1：

5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCATGACACCGCTACAAGAA-3’；(下划线表示载 体序列)

TaWRK2A-ZT-R1：

(下划线表示载体上TNOS的部分序列，方框内序列为6*HIS编码序列)

PCR反应程序：94℃预变性5min；98℃10s、60℃30s、72℃1.5min，35个循环； 72℃10min。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切， 回收酶切产物。

4、取载体pWMB110，用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切，回收载体骨架。

5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pWMB110-TaWRK2A，测序验证获得TaWRK2A转基因载体序列(序列3)是正确的。序 列表的序列3第56-2215(不含终止子)是序列表的序列2第25-2187位核苷酸。

二、转基因植物的获得

采用农杆菌介导法转化小麦。详细步骤和方法参考Wang et al.,2016(Ke

Huiyun

Lipu Du and Xingguo Ye*,Generation of marker-freetransgenic hexaploid wheat viaan Agrobacterium-mediated co-transformationstrategy in commercial Chinese wheat varieties,Plant Biotechnology Journal(2016),pp.1–10doi:10.1111/pbi.12660。)

1、将重组质粒pWMB110-TaWRK2A导入农杆菌C58C1。在侵染前4d，将C58C1 农杆菌(含pDE003-TaWOX5)分别接种于含Gent 50mg L-1、Spec 50mg L-1、Rif 50 mg L-1的YEP固体培养基上，28℃黑暗条件下复苏培养3d。挑取单菌落于10ml含 有相应抗生素的YEP液体培养基中，200rpm、28℃黑暗条件下过夜震荡培养。

2、室温下3,500rpm离心10min收集农杆菌菌体，倒掉上清，用MS重悬液(pH 6.0)重悬。

3、选择适宜大小的小麦Fielder的幼胚，与农杆菌重悬液混合进行侵染，然后平铺于AS基本共培养基上，25℃培养2-3d。

4、将共培养后的幼胚转移至恢复培养基WLS-RES(Cb 400mg L-1、Cef 100mg L-1)黑暗下培养5d。

5、将恢复培养后的幼胚转移至第一次筛选培养基WLS-P5(PPT 5mg L-1、Cb 400mg L-1、Cef 100mg L-1)黑暗下培养14d。

6、然后再将愈伤转移至第一次筛选培养基WLS-P10(PPT 10mg L-1、Cb 400mg L-1)黑暗下培养21d。

7、将上述愈伤转移至分化培养基LSZ-P5(MS培养基，PPT 5mg L-1)，光下培 养2周。将小麦绿芽分离出来放置生根培养基MSF-P5(MS培养基，PPT 5mg L-1、 IBA0.5mg L-1),培养14-21d。

8、待根长好的幼苗移栽到土中，移栽3周以后，有27株植株(T0代)成活，然 后利用PCR等方法进行阳性检测。

9、PCR鉴定

步骤6得到的各个成活植株，分别于4叶期取一个叶片，提取基因组DNA。将基 因组DNA作为模板，采用Ubi-110-F1和TaWRK2A-OE-R1组成的引物对进行PCR 扩增，如果得到扩增产物(约360bp)，该植株为转基因植株。将重组质粒 pWMB110-TaWRK2A作为阳性对照。将Fielder的基因组DNA作为阴性对照。

Ubi-110-F1:5'-gTCgATgCTCACCCTgTTgT-3'

TaWRK2A-OE-R1:5'-GAGCTTGCTCGTGTTCTTGC-3'

PCR反应程序：95℃3min；98℃10s、58℃30s、68℃40s，35个循环；68℃5 min；16℃保存。

图3显示了转TaWRK2A基因小麦的PCR检测结果，其中P为转基因载体质粒， WT为未转基因小麦，N为转空载体小麦,1-17为转基因小麦。

PCR鉴定结果表明，27株T0代成活植株中，17株为转基因植株。

10、定量分析转基因小麦与阴性对照中TaWRK2A基因的相对表达量

提取转基因小麦阳性植株的总RNA，反转录得到cDNA，检测TaWRK2A基因的 相对表达量。采用小麦内源TaActin基因作为内参基因。将小麦Fielder作为转基因植 株的对照植株。

用于检测TaWRK2A基因的特异引物对：

TaWRK2A-QF:5’-CGGGTGCCAGAGACAATGTA-3’

TaWRK2A-QR:5’-CAAGCAGCAACCCAACAGTT-3’

用于检测内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3’；

TaActin-R：5’-GACCCAGACAACTCGCAAC-3’。

部分转基因植株的TaWRK2A基因的相对表达量见图4。图4中，VN代表转空载 体小麦-阴性对照小麦，OW-4、OW-5、OW-6、OW-23和OW-26分别代表5个转基因 植株。转基因植株中TaWRK2A基因的相对表达量明显高于阴性对照小麦。

三、转空载体植物的获得

用载体pWMB110代替重组质粒pWMB110-TaWRK2A，其它同步骤二，得到转空载 体植株。

四、转基因小麦植物对纹枯病抗性的鉴定

供试植株：OW-4、OW-5、OW-6、OW-23和OW-26分别代表5个转基因植株、 转空载体株系的植株NV。

供试植株进行平行试验。

正常培养供试植株。在拔节期，将菌牙签接种到小麦基部叶鞘与茎之间，接种后用湿棉花保湿4天。持续观察发病情况。收获时调查病级。

接种小麦纹枯病致病菌约20天，转空载体小麦植株NV出现典型的纹枯病病症， 而转基因植株病症不明显。于接种25天，测量病斑大小，统计病级IT.

病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。

表4转基因小麦与对照的纹枯病病情的调查结果

结果表明：TaWRK2A基因过表达显著增强了转基因小麦对纹枯病的抗病性。

五、转基因小麦植物对茎基腐病抗性的鉴定

供试植株：OW-8、OW-9、OW-10、OW-16和OW-18分别代表5个转基因植株、 转空载体株系的植株NV。

供试植株进行平行试验。

正常培养供试植株。在拔节期，将茎基腐病菌(假禾谷镰刀菌)牙签接种到小麦基部叶鞘与茎之间，接种后用湿棉花保湿保湿3天。持续观察发病情况。收获时调查病 级。

接种小麦纹枯病致病菌约20天，转空载体小麦植株NV出现典型的茎基腐病病症，而转基因植株病症不明显。于接种20天，测量病斑大小，统计病级IT.

表5转基因小麦与对照的茎基腐病情的调查结果

结果表明：TaWRK2A基因过表达显著增强了转基因小麦对茎基腐病的抗病性。

实施例3、培育纹枯病抗性降低和茎基腐病抗性降低的小麦进行TaWRK2A反向 功能分析

一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaWRK2A基因

1、将序列表中序列4所示的双链DNA分子反向插入BSMV-γ质粒的NheI酶切 位点，得到重组质粒BSMV-γ：TaWRK2A。序列表的序列4与序列表的序列2第2100-2293 位反向互补，被γ载体的T7启动子驱动。

2、制备转录反应液

(1)取BSMV-α质粒，用限制性内切酶Mlu I进行酶切，回收线性化质粒，命名 为线性化的BSMV-α。取BSMV-γ或BSMV-γ：TaWRK2A质粒，用限制性内切酶Mlu I进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-γ或BSMV-γ：TaWRK2A。取 BSMV-β质粒，用限制性内切酶Spe I进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的 BSMV-β。(2)取线性化质粒，采用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7 kit (Promega)，进行体外转录反应，得到转录反应液。

线性化质粒为线性化的BSMV-α时，得到的转录反应液命名为转录反应液 BSMV-α。线性化质粒为线性化的BSMV-β时，得到的转录反应液命名为转录反应液 BSMV-β。线性化质粒为线性化的BSMV-γ或BSMV-γ：TaWRK2A时，得到的转录反 应液命名为转录反应液BSMV-γ或BSMV-γ：TaWRK2A。

3、BSMV接种小麦植株

取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl 转录反应液BSMV-γ：TaWRK2A，混匀，然后加入60μl RNase-free ddH2O，再加入 90μl GKP溶液(溶剂为水，含50mM甘氨酸、30mM K2HPO4、1％Bentonite和1％Celite， pH9.2)，混合，得到BSMV：TaWRK2A病毒混合液。待小麦CI12633的幼苗生长至 三叶一心期时，吸取BSMV：TaWRK2A病毒混合液摩擦接种于幼苗的第二个叶片和 第三个叶片上(每个叶片10μl)，然后在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，覆膜保湿 24小时，之后每隔6h在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液。

取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl 转录反应液BSMV-γ，混匀，然后加入60μl RNase-free ddH2O，再加入90μl GKP溶液， 混合，得到BSMV病毒混合液。待小麦CI12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取 BSMV病毒混合液摩擦接种于幼苗的第二个叶片和第三个叶片上(每个叶片10μl)， 然后在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，覆膜保湿24小时，之后每隔6h在叶片表面 喷施0.1％DEPC水溶液。

4、步骤3中接种病毒混合液后第12天取第四片叶片，提取RNA，反转录得到cDNA，采用qRT-PCR检测TaWRK2A基因沉默情况。采用小麦内源TaActin基因作为内参基 因。

用于定量PCR检测TaWRK2A基因的特异引物对：

TaWRK2A-QF:5’-CGGGTGCCAGAGACAATGTA-3’；

TaWRK2A-QR:5’-CAAGCAGCAACCCAACAGTT-3’。

用于检测内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3’；

TaActin-R：5’-GACCCAGACAACTCGCAAC-3’。

TaWRK2A基因的相对表达量见图5。接种BSMV:TaWRK2A病毒混合液的植株 中TaWRK2A基因被沉默。将接种BSMV:TaWRK2A病毒混合液得到的TaWRK2A基 因沉默的植株命名为BSMV:TaWRK2A-CI12633植株。将接种BSMV病毒混合液的植 株命名为BSMV-CI12633植株。与小麦CI12633相比，BSMV-CI12633植株中TaWRK2A 基因的表达量没有显著变化,下面即以BSMV-CI12633(BSMV)小麦植株作为对照， BSMV:TaWRK2A-CI12633(BSMV:TaWRK2A)小麦植株作为沉默试材，进行TaWRK2A 基因功能的反向验证分析。

二、被沉默植株的纹枯病抗性鉴定

步骤一的3中小麦转染病毒混20天后，采用牙签接种法向植株接种小麦纹枯病致病菌WK207(具体方法：将菌牙签嵌入到植株基部第2叶鞘叶鞘与茎之间，用湿润的 脱脂棉将其轻轻包围，保湿4天，以后每天喷施2次DEPC水)。10天定量PCR分析 禾谷丝核菌相对生物量(以RcActin表达量表示)，结果如图6所示，TaWRK2A基因 表达沉默后的小麦叶鞘中禾谷丝核菌相对生物量显著高于对照(BSMV)

用于定量PCR检测禾谷丝核菌RcActin的特异引物对：

RcActin-F：5’-GCATCCACGAGACCACTTAC-3’；

RcActin-R：5’-GCGTCCCGCTGCTCAAGAT-3’。

用于检测内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3’；

TaActin-R：5’-GACCCAGACAACTCGCAAC-3’。

在禾谷丝核菌WK207接种35天后，对小麦接种茎部位进行纹枯病病级鉴定。 纹枯病病级鉴定结果表明：如图7所示，TaWRK2A基因表达沉默后的BSMV：TaWRK2A 植株茎部位的纹枯病病斑(平均病级3.31)明显大于对照(BMSV:GFP)植株的病斑 (平均病级1.26)。

结果表明：TaWRK2A基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述 结果说明TaWRK2A是小麦抗纹枯病所需的重要基因。TaWRK2A基因过表达可用于制 备植物抗病剂，或用于培育转基因抗病植物。

三、被沉默植株对茎基腐病的抗病性鉴定

步骤一的3中小麦CI12633转染BSMV病毒20天后，采用牙签接种法:在这些 小麦的基部叶鞘与茎间接种假禾谷镰刀菌(将长满假禾谷镰刀菌菌丝的牙签嵌入到基 部第2叶鞘与茎之间，用湿润的脱脂棉将其轻轻包围，保湿5天，以后每天喷施1-2 次水)。在假禾谷镰刀菌接种30天后，对小麦接种的茎部位进行茎基腐病的病级鉴定。 结果如表2所示，TaWRK2A基因表达沉默后的BSMV：TaWRK2A-CI12633植株茎部 位的茎基腐病病斑(平均病级3.0)明显大于对照(BSMV)-CI12633植株的病斑(平 均病级1.8)。

结果表明：TaWRK2A基因沉默降低了小麦CI12633对茎基腐菌的防御能力，上述 结果说明TaWRK2A是小麦抗茎基腐病反应所需的重要基因。TaWRK2A过表达基因可 用于制备植物抗病剂，或用于培育转基因抗病植物。

表6.TaWRK2A沉默小麦茎基腐病的病级鉴定

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 广谱抗病的转TaWRK2A基因小麦的培育方法及其相关生物材料

<130> P210066

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> PRT

<213> 抗纹枯病小麦CI12633(Triticum aestivum)

<400> 1

Met Thr Pro Leu Gln Glu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Val Phe His Ala

1 5 10 15

Ala Leu Leu Thr Ala Ala Val Ser Gly Ala Pro Ser Gly Pro Pro Glu

20 25 30

Ala Lys Asn Cys Pro Ser Lys Cys Gly Glu Ile Asp Ile Pro Tyr Pro

35 40 45

Phe Gly Ile Gly Pro Gly Cys Ser Leu Ser Gly Arg Phe Ala Leu Thr

50 55 60

Cys Asn Glu Thr Thr Ser Pro Pro Thr Leu Leu Arg Arg Asp Ile Lys

65 70 75 80

Val Ala Asn Ile Thr Leu Glu Thr Ala Gln Met Val Val Tyr Thr His

85 90 95

Leu Thr Tyr Ser Cys Asp Leu Pro Ser Ser Lys Asn Thr Ser Lys Leu

100 105 110

Thr Thr Thr Arg Val Ser Ala Val Leu Arg Val Arg Asn Pro Phe Leu

115 120 125

Leu Ser Ala Ser Ala Asn Val Phe Thr Ala Ile Gly Cys Arg Ser Thr

130 135 140

Ala Arg Leu Arg Ser Arg Ser Val Ser Asp Tyr Leu Thr Gly Cys Ile

145 150 155 160

Thr Thr Cys Leu Arg Val Asn Asp Thr Gly Asp Asp Gly Thr Pro Cys

165 170 175

Ser Gly His Gly Cys Cys Glu Thr Ser Leu Ile Ser Arg Leu Asn Gln

180 185 190

Val Asn Val Ser Trp Ser Thr Arg Ala Leu Gly Ser Asn Pro Val Pro

195 200 205

Glu Ser Pro Cys Gln Tyr Ala Phe Val Ser Thr Lys Gly Trp Tyr His

210 215 220

Phe Lys Lys Thr Asp Leu Ile Gly Asn Met Thr Phe Ile Asn Arg Leu

225 230 235 240

Gly His Gly Pro Val Val Pro Val Val Leu Asp Trp Ala Ile Arg Asp

245 250 255

Gly Thr Cys Pro Ser Ala Pro Glu Gly Asp Asn Ser Glu Asn Val Pro

260 265 270

Tyr Ala Cys Val Ser Ala Gln Ser Tyr Cys Val Asn Ala Ser Asn Gly

275 280 285

Ala Arg Gly Tyr Phe Cys Arg Cys Ser Lys Gly Tyr Ser Gly Asn Pro

290 295 300

Tyr Ile Lys Asn Gly Cys Thr Asn Ile Asn Glu Cys Glu Leu Arg Arg

305 310 315 320

Ser Pro Asn Ser Thr Ile Tyr Lys Asn Met Tyr Pro Cys His Gly Gly

325 330 335

Arg Cys His Asp Arg Glu Gly Asp Tyr Glu Cys Lys Cys Asn Phe Gly

340 345 350

Arg Arg Gly Asp Gly Lys Ser Gln Lys Gly Cys Glu Phe Val Val Ser

355 360 365

Thr Thr Ala Val Ala Val Ile Gly Thr Ile Gly Ala Ile Ala Leu Leu

370 375 380

Ala Val Leu Leu Ile Phe Leu His Met Glu Asn Glu Lys Arg Lys Leu

385 390 395 400

Arg Asp Cys Phe Asn Lys Asn Gly Gly Gln Leu Leu Lys Ser Leu Lys

405 410 415

Val Glu Ile Phe Thr Lys Glu Lys Leu Asp His Ile Thr Asn Asn Tyr

420 425 430

Arg Cys Ile Ile Gly Gln Gly Ala Phe Gly Lys Val Tyr Lys Gly Ala

435 440 445

Thr Gly Ala Arg Asp Asn Val Arg Val Ala Val Lys Cys Ser Ile Pro

450 455 460

Ile Asn Gln Asp Trp Lys Lys Glu Ser Phe Ala Asn Glu Ile Thr Ile

465 470 475 480

Gln Ser Asn Ile Ser His Arg Asn Leu Val Gln Leu Leu Gly Cys Cys

485 490 495

Leu Glu Thr Glu Val Pro Met Leu Val Tyr Glu Tyr Val Pro Arg Gly

500 505 510

Ser Leu His Asp Val Leu His Gly Asp Asn Lys Glu Pro Leu Pro Leu

515 520 525

Glu Thr Arg Leu Asp Ile Ala Ile Tyr Ser Ala Val Ala Leu Val Tyr

530 535 540

Met His Ser Glu Ala Ser Gln Thr Ser Ile Ile Leu His Gly Asp Val

545 550 555 560

Lys Ser Gly Asn Ile Leu Leu Asp Asp Gly Phe Thr Pro Lys Val Ser

565 570 575

Asp Phe Gly Thr Ser Arg Leu Met Ser Ile Asp Lys Asp His Thr Asn

580 585 590

Trp Val Val Gly Asp Ser Ser Tyr Ile Asp Pro Val Tyr Met Lys Thr

595 600 605

Gly Leu Leu Thr Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Ile Val Leu

610 615 620

Leu Glu Leu Leu Thr Arg Lys Lys Ala Arg Tyr Asp Gly Asn His Ser

625 630 635 640

Leu Pro Leu Asp Tyr Val Lys Ala Ser Met Gly Gly Ala Val Arg Glu

645 650 655

Met Phe Asp Pro Glu Val Ala Ser Gly Gly Lys Glu Asn Glu Glu Cys

660 665 670

Leu Glu Glu Val Gly Lys Ile Ala Val Gln Cys Leu Lys Glu Asp Val

675 680 685

Asn Asp Arg Pro Thr Met Ser Glu Val Ala Glu Arg Leu Lys Met Cys

690 695 700

Lys Cys Arg Trp Leu Glu Ser Gly Arg Lys Thr Asn Glu Ile Cys Thr

705 710 715 720

<210> 2

<211> 2293

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequences)

<400> 2

ccgtgcgtgc aaagcaattt agctatgaca ccgctacaag aaaccttgct cctcctactt 60

gttttccatg ccgcgctcct caccgccgcc gtctccggcg cgccgtctgg gccacccgag 120

gcaaaaaact gccctagcaa atgcggggaa atagacatcc cctacccatt cggcatcggc 180

cccgggtgct ccctgtcggg ccggttcgcc ctcacatgca acgagacgac gagtcctccc 240

accctgctcc ggcgcgacat caaggtcgcc aacatcacgc tggagacggc gcagatggtg 300

gtctacaccc acctgaccta tagctgcgac ctgccgagca gcaagaacac gagcaagctc 360

acgaccacga gggtgagcgc ggtgctccgc gttcgcaacc cgttcctgct ctcggcgtcg 420

gccaacgtgt tcacggccat cgggtgccgg tcgacggcca ggctcaggag ccgcagcgtc 480

agcgactacc tcaccggctg catcacgacg tgcctaaggg tgaacgacac cggggacgac 540

ggcacgccct gcagcggaca cggctgctgc gagacctcgc tgatttcccg cctcaaccaa 600

gtcaacgtca gctggagcac gcgcgcgctg ggcagcaacc ctgtgcctga aagcccgtgc 660

cagtacgcct tcgtctccac caaaggctgg taccatttca agaaaactga tctaattggg 720

aatatgacat tcataaatag acttggacat ggccccgtcg ttcctgttgt ccttgactgg 780

gcaatacggg atggaacatg cccgtcggcg ccagagggtg acaacagtga gaatgttccc 840

tacgcatgtg ttagcgccca gagctattgc gtaaatgcca gcaatggagc acgcggctat 900

ttctgcagat gttctaaggg atacagtggc aacccataca ttaaaaatgg atgcacaaat 960

attaacgagt gtgagctacg gagatcccca aactcaacaa tttacaagaa catgtatcct 1020

tgtcatggag ggagatgcca cgatagagaa ggtgactatg agtgtaaatg caatttcgga 1080

cgaagaggtg atggtaaaag ccagaagggt tgtgaatttg tagtgtccac gactgctgta 1140

gcggtgatag gaacaattgg tgccattgca ttactcgccg tgttactgat attcttacat 1200

atggagaacg agaaaagaaa actgagagat tgtttcaaca aaaacggcgg acaattactc 1260

aaaagcctca aggtcgagat cttcacaaag gaaaagctag accacatcac aaataactat 1320

cgctgcataa tcggccaagg cgccttcggc aaggtctaca agggagccac gggtgccaga 1380

gacaatgtac gggttgccgt gaaatgctcg atccccatca accaggactg gaagaaggag 1440

tcttttgcga atgagatcac aatccagtcc aatatcagcc accggaacct ggtccaactg 1500

ttgggttgct gcttggagac ggaggtgccc atgctggtct acgagtacgt gcccaggggg 1560

agcctccacg acgtactcca cggtgacaat aaggaacctc tcccgctgga aacacgcctg 1620

gatatcgcta tctattcagc agttgcgctc gtttacatgc actcggaggc gagtcagaca 1680

tcaatcatcc tccacggaga tgtgaagtcg ggcaacatcc tcctggacga cgggttcacg 1740

cccaaggtgt cggacttcgg gacgtcgagg ctcatgtcca tcgacaagga ccacaccaac 1800

tgggtggtcg gggacagcag ctacatcgac cccgtgtaca tgaagaccgg gctgctcacc 1860

gagaaaagtg acgtgtacag cttcggcatc gtactactgg agctcctgac ccggaaaaaa 1920

gcaaggtatg acgggaacca tagcctgcca ctggattatg tcaaggcttc catgggtggg 1980

gcggtgaggg agatgtttga tccagaggtt gcgtctggtg ggaaggaaaa tgaggagtgc 2040

cttgaggagg tgggcaagat cgcggtgcag tgtctcaagg aggatgtgaa cgacaggccc 2100

accatgagtg aagtggctga gagacttaaa atgtgcaagt gccggtggtt ggagtctggc 2160

aggaagacga atgagatatg cacttagtta ctgtcagaaa aaagtactac tcctatctac 2220

ttaagatttt ttttacagtt gacttgtact ttgagtaatt agctagtatg ctcgcgtgta 2280

tccccgagtt gaa 2293

<210> 3

<211> 2258

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequences)

<400> 3

gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggt cgactctaga ggatcatgac 60

accgctacaa gaaaccttgc tcctcctact tgttttccat gccgcgctcc tcaccgccgc 120

cgtctccggc gcgccgtctg ggccacccga ggcaaaaaac tgccctagca aatgcgggga 180

aatagacatc ccctacccat tcggcatcgg ccccgggtgc tccctgtcgg gccggttcgc 240

cctcacatgc aacgagacga cgagtcctcc caccctgctc cggcgcgaca tcaaggtcgc 300

caacatcacg ctggagacgg cgcagatggt ggtctacacc cacctgacct atagctgcga 360

cctgccgagc agcaagaaca cgagcaagct cacgaccacg agggtgagcg cggtgctccg 420

cgttcgcaac ccgttcctgc tctcggcgtc ggccaacgtg ttcacggcca tcgggtgccg 480

gtcgacggcc aggctcagga gccgcagcgt cagcgactac ctcaccggct gcatcacgac 540

gtgcctaagg gtgaacgaca ccggggacga cggcacgccc tgcagcggac acggctgctg 600

cgagacctcg ctgatttccc gcctcaacca agtcaacgtc agctggagca cgcgcgcgct 660

gggcagcaac cctgtgcctg aaagcccgtg ccagtacgcc ttcgtctcca ccaaaggctg 720

gtaccatttc aagaaaactg atctaattgg gaatatgaca ttcataaata gacttggaca 780

tggccccgtc gttcctgttg tccttgactg ggcaatacgg gatggaacat gcccgtcggc 840

gccagagggt gacaacagtg agaatgttcc ctacgcatgt gttagcgccc agagctattg 900

cgtaaatgcc agcaatggag cacgcggcta tttctgcaga tgttctaagg gatacagtgg 960

caacccatac attaaaaatg gatgcacaaa tattaacgag tgtgagctac ggagatcccc 1020

aaactcaaca atttacaaga acatgtatcc ttgtcatgga gggagatgcc acgatagaga 1080

aggtgactat gagtgtaaat gcaatttcgg acgaagaggt gatggtaaaa gccagaaggg 1140

ttgtgaattt gtagtgtcca cgactgctgt agcggtgata ggaacaattg gtgccattgc 1200

attactcgcc gtgttactga tattcttaca tatggagaac gagaaaagaa aactgagaga 1260

ttgtttcaac aaaaacggcg gacaattact caaaagcctc aaggtcgaga tcttcacaaa 1320

ggaaaagcta gaccacatca caaataacta tcgctgcata atcggccaag gcgccttcgg 1380

caaggtctac aagggagcca cgggtgccag agacaatgta cgggttgccg tgaaatgctc 1440

gatccccatc aaccaggact ggaagaagga gtcttttgcg aatgagatca caatccagtc 1500

caatatcagc caccggaacc tggtccaact gttgggttgc tgcttggaga cggaggtgcc 1560

catgctggtc tacgagtacg tgcccagggg gagcctccac gacgtactcc acggtgacaa 1620

taaggaacct ctcccgctgg aaacacgcct ggatatcgct atctattcag cagttgcgct 1680

cgtttacatg cactcggagg cgagtcagac atcaatcatc ctccacggag atgtgaagtc 1740

gggcaacatc ctcctggacg acgggttcac gcccaaggtg tcggacttcg ggacgtcgag 1800

gctcatgtcc atcgacaagg accacaccaa ctgggtggtc ggggacagca gctacatcga 1860

ccccgtgtac atgaagaccg ggctgctcac cgagaaaagt gacgtgtaca gcttcggcat 1920

cgtactactg gagctcctga cccggaaaaa agcaaggtat gacgggaacc atagcctgcc 1980

actggattat gtcaaggctt ccatgggtgg ggcggtgagg gagatgtttg atccagaggt 2040

tgcgtctggt gggaaggaaa atgaggagtg ccttgaggag gtgggcaaga tcgcggtgca 2100

gtgtctcaag gaggatgtga acgacaggcc caccatgagt gaagtggctg agagacttaa 2160

aatgtgcaag tgccggtggt tggagtctgg caggaagacg aatgagatat gcactcatca 2220

tcaccatcat cactaggagc tcgaatttcc ccgatcgt 2258

<210> 4

<211> 193

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequences)

<400> 4

accatgagtg aagtggctga gagacttaaa atgtgcaagt gccggtggtt ggagtctggc 60

aggaagacga atgagatatg cacttagtta ctgtcagaaa aaagtactac tcctatctac 120

ttaagatttt ttttacagtt gacttgtact ttgagtaatt agctagtatg ctcgcgtgta 180

tccccgagtt gaa 193

Claims (4)

1.TaWRK2A蛋白或能够调控TaWRK2A蛋白编码基因表达的物质或能够调控TaWRK2A蛋白含量和/活性的物质或TaWRK2A蛋白相关的生物材料在如下任一中的应用：

P1、调控植物抗病性；

P2、制备提高植物抗病性的产品；

P3、培育抗病植物；

P4、制备植物抗病产品；

所述TaWRK2A蛋白为如下（a1）或（a2）：

（a1）由序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（a2）在（a1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述TaWRK2A蛋白相关的生物材料为下述（b1）-（b5）中至少一种：

（b1）编码所述TaWRK2A蛋白的核酸分子；

（b2）编码区如序列表的序列2中第25-2187位核苷酸所示的核酸分子；

（b3）序列表的序列2所示的核酸分子；

（b4）编码区如序列表的序列3中第56-2215位核苷酸所示的核酸分子；

（b5）含有（b1）-（b4）所述核酸分子的重组表达载体、表达盒或重组微生物；

所述植物为小麦；

所述抗病为抗纹枯病和/或茎基腐病。

2.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1中所述TaWRK2A蛋白相关的生物材料导入目的植物中，得到抗病性高于目的植物的转TaWRK2A基因植物，所述植物为小麦，所述抗病性为对纹枯病和/或茎基腐病的抗病性。

3.一种培育转TaWRK2A基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1中所述TaWRK2A蛋白相关的生物材料的表达，得到抗病性低于目的植物的转基因植物，所述植物为小麦，所述抗病性为对纹枯病和/或茎基腐病的抗病性。

4.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中权利要求1中所述TaWRK2A蛋白质的含量和/或活性，从而增加目的植物的抗病性，所述植物为小麦，所述抗病性为对纹枯病和/或茎基腐病的抗病性。

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