CN117070531B - 水稻OsWAK123基因及其编码蛋白的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻OsWAK123基因及其编码蛋白的应用，所述水稻OsWAK123基因可以提高水稻抗白叶枯病，其CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明的发明人从水稻高抗品种IR24中获得了一个新的白叶枯病抗性基因OsWAK123，并通过将WAK123敲除后抗性品种变为感病品种，证明了OsWAK123基因确实为白叶枯病抗性基因，为水稻白叶枯病抗性育种提供了新的抗性遗传资源。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种水稻OsWAK123基因及其编码蛋白的应用。
背景技术
白叶枯病是水稻最严重的病害之一，由于病原菌的不断进化，近几年有爆发的趋势。利用水稻自身的抗病基因培育抗病品种是防控白叶枯病的最佳手段，目前已克隆的白叶枯病抗性基因包括Xa1、Xa2、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa7、xa13、Xa14、Xa10、Xa21、Xa23、xa25、Xa27、Xa31(t)和xa41(t)。
挖掘新的白叶枯病抗性遗传资源、阐明抗性分子机制以及培育新的优质白叶枯病抗性水稻品种，对保证水稻的安全生产和可持续发展非常有意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种水稻OsWAK123基因及其编码蛋白的应用。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了一种水稻OsWAK123基因在提高水稻抗白叶枯病中的应用，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种水稻OsWAK123基因的编码蛋白在提高水稻抗白叶枯病中的应用，所述水稻OsWAK123基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三方面，提供了插入有上述水稻OsWAK123基因的重组表达载体在提高水稻抗白叶枯病中的应用。
本发明的第四方面，提供了转化有上述重组表达载体的工程菌在提高水稻抗白叶枯病中的应用。
本发明的第五方面，提供了一种提高水稻抗白叶枯病的生物制剂，所述生物制剂的活性成分为上述重组表达载体。
本发明的第六方面，提供了一种提高水稻抗白叶枯病的方法，所述方法包括：在水稻中，提高水稻OsWAK123基因的表达，或其编码蛋白的表达。
本发明的发明人从水稻高抗品种IR24中获得了一个新的白叶枯病抗性基因OsWAK123，并通过将WAK123敲除后抗性品种变为感病品种，证明了OsWAK123基因确实为白叶枯病抗性基因，为水稻白叶枯病抗性育种提供了新的抗性遗传资源。
附图说明
图1为本发明实施例1中两个水稻品种接种白叶枯病菌后的叶片损伤(A)和表型(B)结果。
图2为本发明实施例2中F2代分离群体单株病斑长度的统计结果。
图3为本发明实施例2中池测序分析抗性基因的结果。
图4为本发明实施例2中白叶枯病抗性基因的精细定位结果。
图5为本发明实施例3中基因编辑OsWAK123水稻材料的编辑情况。
图6为本发明实施例3中Oswak123基因编辑材料和IR24接种白叶枯病菌后的叶片损伤(A)和表型(B)结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
在本发明中，首先从水稻品种中筛选到对白叶枯病菌Aust2031/GD5具有强抗性的水稻品种IR24，再将水稻品种IR24与感病品种IRBB21进行杂交，对F2代分离群体的高抗单株和高感单株进行混池测序，通过精细定位将抗性基因定位在SNPM46和SNPM168两个分子标记之间，并通过基因功能预测，推测抗性基因为水稻品种IR24中的OsWAK123。接着通过CRISPR/Cas9将IR24中的WAK123敲除，获得敲除株系，发现敲除WAK123使抗性品种IR24变为感病品种，证明了OsWAK123基因确实为白叶枯病抗性基因，为水稻白叶枯病抗性育种提供了新的抗性遗传资源。
在本发明的其中一些实施例中，公开了一种水稻OsWAK123基因在提高水稻抗白叶枯病中的应用，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
OsWAK123的CDS序列(SEQ ID NO.1)
ATGGCACAAGGAGTGATGCTGTGGTATGATGATTTCCTAGCAGTATTAGT
ACTTTCTGTGCTGGTGGCTACGTCGTCGACGGCGGCGAACTGCGGCAGGA
AGTGTGGCGACGTGCGCATCCCCTACCCGTTCGGCATCGGCGTCGACTGC
GCCTGGCCGGGCTTCGATGTCACATGCAACCATAGCTTTACCCCTCCCAG
ACCCTACTACGGCAACATAGAGATCATGGACATCTCGGTGGCGGAGGGG
GAGATGCGCGTCTACACTCCCGTGGTCTCCCAGTGCTACAACTCATCCAA
CACCACAGACTCTAACGGATTCGAGTCCTTGCAGCTCACCGTCGCCGACT
CGCCGTTCCTGGTCTCTCCTGGGAGAAACGAGTTCACGGCCATCGGCTGC
GACACCATGGCGTTGCTGCAGGGCAGGGACGACTGGAGCTTCCTCACCGG
CTGCATCACGACGTGCGTGAGCTTAGACGAGGCTGCCCACGACGGCGAG
CAGTGCTCCGGGCTGGGTTGCTGCCAGGTGCCTTCCATCCCACCCAACCTT
ACCACCGTAGCGCTCGACTGGAGCAACCGTACTGAAAACCTGGCCTGGAC
ATACAGCCCATGCAGCTACGCCTTCGTGGCTGAGAAAGGATGGTACAAAT
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GCTGGAGATAGAAGTGTCGTTACAGTGCTTGATTGGGCTATCAGCAGCAA
CGGATCGTGCTCGTCAACATCGCGGGTTGCTCCTGCCTGTGTCAGCCCCA
ACAGCTACTGCGTCAACACCACCAATGGACAGGGATATCTTTGCAAGTGC
TCCACGGGATATGATGGCAATCCCTACGTCACCGGTGACAGTGGGTGTAC
AAATATTAATGAATGCAAGCTTAGAAGAGAAGACCCTGCCAAGTACAGA
GAACTTTATCCATGTTACGGTGGTAGCAAATGCCATGACACAGAGGGTGA
TTACAGGTGCAAATGCCGTTTGGGACGTAGAGGGGACGGCAAAATCGAT
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在本发明的另一些实施例中，公开了上述水稻OsWAK123基因在水稻白叶枯病抗性育种中的应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种水稻OsWAK123基因的编码蛋白在提高水稻抗白叶枯病中的应用，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
OsWAK123蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)
MAQGVMLWYDDFLAVLVLSVLVATSSTAANCGRKCGDVRIPYPFGIGVDCAWPGFDVTCNHSFTPPRPYYGNIEIMDISVAEGEMRVYTPVVSQCYNSSNTTDSNGFESLQLTVADSPFLVSPGRNEFTAIGCDTMALLQGRDDWSFLTGCITTCVSLDEAAHDGEQCSGLGCCQVPSIPPNLTTVALDWSNRTENLAWTYSPCSYAFVAEKGWYKFSRRDFSRAGSKSFMNRAGDRSVVTVLDWAISSNGSCSSTSRVAPACVSPNSYCVNTTNGQGYLCKCSTGYDGNPYVTGDSGCTNINECKLRREDPAKYRELYPCYGGSKCHDTEGDYRCKCRLGRRGDGKIDNGCQPIIPPPVIGILVIAGVVLFGLVFVCLRKKWKLKGCYDRNGGQMLEKTGVKIFTKQELDKITNNKSNKIGKGAFGVVYKGTHDDQPVAVKYSIEKSISRTRGKDEFVKEITVQLQVSHDNLVCLIGCCLEVDVPMLVFEFVPNGSLESVLHGPERCALPLLKRLDIAIGSAEALTYMHSHSRRCIFHGDIKPANILLDDNFMPKVSDFGSSESVLKTKHRSVCADMGYIDPVYMITGNFRLKSDVYSFGIVVLELITRKKAVYDGKSLPIEFTNCYEDDNARRNMYDQDILSAEALQPHCMECLDRMAGIAVQCLEYYIDKRPTMAEALQELIQLRAKVAAKMNAGPMFRQPVR
在本发明的另一些实施例中，公开了上述水稻OsWAK123基因的编码蛋白在水稻白叶枯病抗性育种中的应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种插入有水稻OsWAK123基因的重组表达载体在提高水稻抗白叶枯病中的应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种转化有上述重组表达载体的工程菌在提高水稻抗白叶枯病中的应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种提高水稻抗白叶枯病的生物制剂，所述生物制剂的活性成分为上述重组表达载体。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种提高水稻抗白叶枯病的方法，所述方法包括：在水稻中，提高水稻OsWAK123基因的表达，或其编码蛋白的表达。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1强抗性水稻品种的筛选
包括以下步骤：
1、使用PSA固体培养基在28℃培养白叶枯病菌Aust2031/GD5(保存于申请人实验室，可通过商业渠道购买得到)，随后用灭菌水将白叶枯病菌调OD600到0.5；
2、用剪刀蘸取菌液，在200多个品种的水稻叶尖3～5cm处剪断叶片，完成接种；
3、接种14天后，通过测量病斑长度，判定水稻对白叶枯病菌具有抗性还是感性；病斑越长越感病，病斑越短越抗病。
从200多水稻品种中筛选了两个病斑长短有极大显著差异的品种IR24和IRBB21。其病斑表型和病斑长度结果如图1所示，从图1可知，水稻品种IR24的病斑短，损伤小，水稻品种IRBB21病斑长，损伤大，因此，水稻品种IR24对白叶枯病菌Aust2031/GD5具有强抗性，说明IR24中含有对Aust2031/GD5具有抗性的抗性基因；而水稻品种IRBB21对Aust2031/GD5表现为高感。
实施例2IR24中白叶枯病抗性基因的预测
通过池测序和精细定位获得候选抗性基因OsWAK123，具体步骤如下：
1、将高抗水稻品种IR24与高感水稻品种IRBB21进行杂交，对F2代分离群体的病斑长度进行统计(图2)，筛选高抗单株和高感单株；
2、将F2代分离群体的高抗单株和高感单株进行混池测序，通过Gradedpool-seq分析，发现抗性基因位于11号染色体尾端(图3)；
3、通过精细定位将抗性基因定位在SNPM168和SNPM46两个分子标记之间，两个分子标记之间有七个编码基因(图4)；
4、通过基因功能预测，推测抗性基因为水稻品种IR24中的OsWAK123；
5、利用WAK123-F(SEQ ID NO.3)和Wak123-R(SEQ ID NO.4)作为引物对，扩增得到OsWAK123基因。OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
WAK123-F(SEQ ID NO.3)：ATGGCACAAGGAGTGATGCTGTGG
Wak123-R(SEQ ID NO.4)：TCAACGTACGGGTTGTCTGAACATCG实施例3OsWAK123基因的功能验证
包括以下步骤：
1、利用表1的4条引物，参考文章Arobust CRISPR/Cas9 vector system formultiplex targeting ofgenomic sites in monocot and dicotplants，构建得到CRISPR/Cas9-OsWAK123载体；
表1
2、通过愈伤转化将CRIPSR/Cas9-OsWAK123载体转入IR24水稻中，对IR24中的Oswak123基因进行基因编辑，获得基因编辑水稻oswak123；
3、利用引物WAK123-dna-3-F(SEQ ID NO.9)和cr-wak-R(SEQ ID NO.10)对基因编辑水稻oswak123的基因组DNA进行PCR扩增；
WAK123-dna-3-F(SEQ ID NO.9)：CCGTAATGGTGGCCAAATGCT
cr-wak-R(SEQ ID NO.10)：ACGTACGGGTTGTCTGAAC
扩增程序如下：
4、随后用WAK123-dna-3-F(SEQ ID NO.8)对PCR产物进行测序，获得基因编辑结果，最终得到敲除株系Oswak123-2和Oswak123-3(图5)。
5、通过白叶枯病菌接种(方法同实施例1)发现，敲除株系Oswak123-2和Oswak123-3对Aust2031/GD5为感病反应(图6)。说明敲除抗性水稻IR24中的OsWAK123基因，会使得抗性水稻品种IR24变为感病品种，由此证明OsWAK123基因为白叶枯病抗性基因。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种水稻OsWAK123基因在提高水稻抗白叶枯病中的应用，其特征在于，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.一种水稻OsWAK123基因在水稻白叶枯病抗性育种中的应用，其特征在于，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.一种水稻OsWAK123蛋白在提高水稻抗白叶枯病中的应用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种水稻OsWAK123蛋白在水稻白叶枯病抗性育种中的应用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.插入有水稻OsWAK123基因的重组表达载体在提高水稻抗白叶枯病中的应用，其特征在于，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
6.插入有水稻OsWAK123基因的重组表达载体在水稻白叶枯病抗性育种中的应用，其特征在于，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
7.转化有水稻OsWAK123基因的重组表达载体的工程菌在提高水稻抗白叶枯病中的应用，其特征在于，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
8.转化有水稻OsWAK123基因的重组表达载体的工程菌在水稻白叶枯病抗性育种中的应用，其特征在于，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
9.一种提高水稻抗白叶枯病的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂的活性成分为插入有水稻OsWAK123基因的重组表达载体，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQID NO.1所示；或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
10.一种提高水稻抗白叶枯病的方法，其特征在于，所述方法包括：在水稻中提高水稻OsWAK123基因的表达，或提高水稻OsWAK123基因的编码蛋白的表达，所述水稻OsWAK123基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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