CN112513274B

CN112513274B - 一种miR396或其编码基因的突变体的应用

Info

Publication number: CN112513274B
Application number: CN202080003112.6A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: WO2021004270A1; CN112251433A; CN112513274A

Abstract

提供了一种miR396或其编码基因的突变体的应用。还提供了一种提高植物的氮肥利用率和/或降低氮肥的施用量的方法，一种包括miR396抑制剂的组合物及其用途，一种制备经基因编辑的植物组织或植物细胞或植物的方法，以及一种制备高氮素利用率植物的方法。

Description

一种miR396或其编码基因的突变体的应用

技术领域

本发明涉及作物遗传学领域，具体地涉及一种miR396或其编码基因的突变体的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国第一大粮食作物。20世纪50年代末至60年代初的矮化育种和70年代三系杂交籼稻的成功应用，使我国水稻单产实现了两次大的飞跃，为满足我国粮食自给自足的作出了巨大贡献。近十几年来，随着我国人口数量的不断增加，对水稻总产的要求日渐提高。在现代农业生产过程中，人们对化学肥料的使用，尤其是氮肥的施用，对促进农业生产的发展起到了举足轻重的作用。但是，在人们大量施用氮肥的同时，也带来了诸多问题和影响，不仅对经济和资源造成巨大的浪费，还导致生态环境受到严重威胁。过量的使用氮肥导致土壤酸化、次生盐渍化，还会导致温室效应和臭氧层空洞，水体的富营养化等。因此，如何在维持现有产量的基础上，提高农作物对氮肥的利用率，培育环境友好型的水稻新品种，是农业育种家需要解决的难题之一。

microRNA(miRNA)是一类20–24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子，它通过碱基配对结合靶基因的mRNA，从而引起mRNA的降解或翻译抑制。miRNA在植物中通过调控编码蛋白基因在原位细胞中的积累来控制植物的生长、发育、耐逆性等。近年来，miRNA也广泛应用于农作物改良中。一方面，miRNA可以通过调节分蘖、粒型和穗型等影响作物产量；另一方面，miRNA中的一些成员可以响应外界环境信号刺激，提高作物应对逆境胁迫的能力。因此，miRNA作为作物改良的潜在靶标亟待被人们进一步的挖掘。

而目前没有发现提高植物氮利用率的miRNA靶标。

因此，本领域迫切需要探究水稻氮素利用的调控机制，并靶标和调控目标基因，培育出“少投入、多产出、环境友好”的水稻新品种。

发明内容

本发明的目的是探究水稻氮素利用的调控机制，并靶标和调控目标基因，培育出“少投入、多产出、环境友好”的水稻新品种。

在本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物或其编码基因的突变体的用途，用于(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量，或用于制备一组合物或制剂，所述组合物或制剂用于(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量；

其中，所述核酸构建物具有5’-3’的式I结构：

X1-X2-X3 (I)

式中，X1为无或选自SEQ ID NO.:1的1-12位或SEQ ID NO.:2的1-9位；

X2选自miR396的成熟序列/保守序列；

X3为无或选自SEQ ID NO.:1的44-184位或SEQ ID NO.:2的41-176位；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述miR396的成熟序列/保守序列包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g和/或miR396h的成熟序列/保守序列。

在另一优选例中，所述miR396的成熟序列/保守序列包括miR396e和/或miR396f的成熟序列/保守序列。

在另一优选例中，所述miR396的成熟序列为miR396e和/或miR396f的成熟序列。

在另一优选例中，所述miR396的保守序列选自SEQ ID NO.:1的13-43位和/或SEQID NO.:2的10-40位。

在另一优选例中，所述提高植物的氮肥利用率指与野生型植物相比，所述植物的氮肥利用率提高了≥5％，较佳地，≥10％，更佳地，≥15％，更佳地，≥20％，更佳地，≥25％。

在另一优选例中，所述核酸构建物选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1或2所示的核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1或2所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％)的多核苷酸；

(c)在SEQ ID NO.:1或2所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述核酸构建物的序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

在另一优选例中，所述编码基因编码上述核酸构建物。

在另一优选例中，所述编码基因包括MIR396a、MIR396b、MIR396c、MIR396d、MIR396e、MIR396f、MIR396g和/或MIR396h。

在另一优选例中，所述编码基因包括MIR396e和/或MIR396f。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因来源于水稻。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体来源于水稻。

在另一优选例中，所述组合物为农用组合物。

在另一优选例中，所述组合物包含(a)miR396抑制剂；和(b)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物或制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述裸子植物选自下组：苏铁科(Cycadaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、松科(Pinaceae)、杉科、柏科、三尖杉科、红豆杉科、麻黄科、买麻藤科、单型科、百岁兰科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述草本植物选自下组：茄科、禾本科植物、豆科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述木本植物选自下组：猕猴桃科、蔷薇科、桑科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：拟南芥、水稻、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、油菜、菠菜、生菜、黄瓜、茼蒿、空心菜、芹菜、油麦菜或其组合。

在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻或其组合。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编辑基因的突变体是天然的或人工合成的。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体包括对上述核酸构建物或其编码基因的碱基的替换、插入和/或缺失。

在另一优选例中，所述的碱基的替换、插入和/或缺失发生的部位至少包含一部分成熟序列区或保守序列区。

在另一优选例中，所述核酸构建物或其编码基因的突变体的表达或活性比野生型的核酸构建物或其编码基因的表达或活性降低了≥50％，更佳地，≥70％，更佳地，≥90％或100％。

在另一优选例中，当所述核酸构建物或其编码基因的突变体的活性E1与所述野生型的核酸构建物或其编码基因的突变体的本底活性E0之比≤1/2，较佳地≤1/5，更佳地≤1/10，更佳地，为0。

本发明第二方面提供了一种(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量的方法，包括：

降低植物中miR396的表达或活性。

在另一优选例中，所述降低miR396的表达或活性可以通过以下任一方式实现：

I、对miR396的前体序列进行突变从而降低miR396成熟序列的表达或活性；

II、对miR396的成熟序列进行突变从而降低其表达或活性。

在另一优选例中，所述miR396为miR396e和/或miR396f。

在另一优选例中，所述的降低植物中miR396的表达或活性是通过以下方式实现：

(1)使植物体内miR396或其编码基因突变获得上述核酸构建物或其编码基因的突变体，和/或

(2)在所述植物中导入miR396的抑制剂。

在另一优选例中，所述miR396的抑制剂包括miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g和/或miR396h的抑制剂。

在另一优选例中，所述miR396的抑制剂包括miR396e和/或miR396f的抑制剂。

在另一优选例中，所述的miR396的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述“降低”是指miR396的表达或活性降低满足以下条件：

A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；其中，A1为所述植株中miR396的表达或活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同miR396的表达或活性。

在另一优选例中，所述的降低指与野生型miR396的表达水平E0相比，所述植株中miR396的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％，更佳地，0-30％。在另一优选例中，所述的降低植株中miR396的表达或活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术、或其组合。

在另一优选例中，所述的降低植株中miR396的表达或活性通过用1个或多个sgRNA介导的Cas9核酸酶对miR396进行基因编辑。

本发明第三方面提供了一种(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量的组合物，包括：

(i)miR396抑制剂；和

(ii)农学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物包括农用组合物。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的组分(i)，以所述组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述组合物还包括其他可以(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量的物质。

在另一优选例中，所述其他可以(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量的物质选自下组：脲酶抑制剂(如无机金属、氨基苯磺酰胺、二硫代氨基甲酸盐、羟基草氨酸盐、有机汞化合物、酚类、醌类(氢醌)、磷胺类化合物或其转化物)；硝化抑制剂(如双氰胺、2-氯-6-(三氯甲基)吡啶、叠氮化钾、2-氨基-4-氯-9-甲基吡啶、磺胺噻唑、硫脲-N-2，5-二氯苯丁二酰胺、4-氨基-1，2，3-三唑盐酸盐、脒基硫脲)；氨稳定剂；植物生长调节剂(如胺鲜酯(DA-6)，氯吡脲，复硝酚钠，生长素、赤霉素、乙烯、细胞分裂素、脱落酸、油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸、多效唑和多胺)；生物菌剂；杀虫剂、或其组合。

本发明第四方面提供了一种本发明第三方面所述的组合物的用途，用于(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量。

本发明第五方面提供了一种制备经基因编辑的植物组织或植物细胞的方法，包括步骤：

降低植物组织或植物细胞中的miR396的表达或活性，从而获得经基因编辑的植物组织或植物细胞。

II、对miR396的成熟序列进行突变从而降低其表达或活性。

在另一优选例中，所述miR396为miR396e和/或miR396f。

本发明第六方面提供了一种制备经基因编辑的植物的方法，包括步骤：

将本发明第五方面所述的方法制备的经基因编辑的植物组织或植物细胞再生为植物体，从而获得经基因编辑的植物。

本发明第七方面提供了一种制备高氮素利用率植物的方法，包括步骤：

降低植物组织或植物细胞中的miR396的表达或活性。

II、对miR396的成熟序列进行突变从而降低其表达或活性。

在另一优选例中，所述miR396为miR396e和/或miR396f。

本发明第八方面提供了一种经基因编辑的植物，所述的植物是用本发明第六方面所述的方法制备的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了mir396e/f成熟体的在野生型植株和编辑植株中的积累；其中WT为野生型中mir396ef的水平；mir396-1为突变植株中mir396e的水平；mir396-1为突变植株中mir396f的水平。

图2显示了不同氮素条件下，野生型和突变型对氮素的利用率，显示了不同植株中的氮积累量；其中，左图为正常栽培条件下植株的氮积累量，右图为不施用氮肥的情况下植株的氮积累量；其中WT为野生型，mir396ef为突变植株。

图3显示了与氮素吸收利用相关基因在野生型和突变型植株中的表达情况；其中，WT为野生型植株，mir396ef为突变植株。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现或合成一类新的miR396及其家族成员的式I所示的核酸构建物或其编码基因的突变体。本发明的核酸构建物或其编码基因的突变体可显著(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量。在此基础上，本发明人完成了本发明。

miR396

miR396是含有20–24个核苷酸长度的非编码单链小RNA分子，主要位于编码序列的5＇端，其5＇端与3＇端配部分碱基相互配对，使其形成颈环结构，其包含8个成员miR396a、miR396b、miR396c、miR396d、miR396e、miR396f、miR396g、miR396h。通过碱基配对结合靶基因的mRNA，从而引起mRNA的降解或翻译抑制，在植物生长发育过程中发挥着重要的调节作用。

在一优选实施方式中，miR396e的前体序列如SEQ ID NO.:1所示，miR396f的前体序列如SEQ ID NO.:2所示。

miR396的成熟序列/保守序列

在本发明中，成熟序列/保守序列指RNA前体序列经过剪切加工后形成的真正发挥功能的序列。

具体地，本发明中miR396代表RNA前体序列；所述的成熟序列是RNA前体序列经过剪切加工后形成的RNA序列；保守序列是指不同物种间序列一致的RNA片段，成熟序列可以等同于保守序列，成熟序列与保守序列可以存在交叉，保守序列可以比成熟序列长。MIR396代表编码miR396的DNA序列。

在miR396家族中，miR396家族的亚型a、b、c、d、e、f、g、h之间的成熟序列/保守序列的相似度非常高。所述miR396家族的成熟序列都是本领域公知的，例如，miR396e的成熟序列为uuccacaggcuuucuugaacug(SEQ ID NO.:1第12-33位)，miR396f的成熟序列为cuccacaggcuuucuugaacug(SEQ ID NO.:2第9-30位)。

本发明的核酸构建物或其编码基因的突变体

本发明提供了一种核酸构建物或其编码基因的突变体，用于(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量。

在本发明中，本发明的核酸构建物具有5’-3’的式I结构：

X1-X2-X3 (I)

式中，X1为无或选自SEQ ID NO.:1的1-12位或SEQ ID NO.:2的1-9位；

X2选自miR396的保守序列和/或其成熟序列；

X3为无或选自SEQ ID NO.:1的44-184位或SEQ ID NO.:2的41-176位；

并且，各“-”为键或核苷酸连接序列。

在本发明中，本发明的核酸构建物或其编码基因的突变体可以是单一突变，可以是双突变，可以是多突变，优选单突变或双突变，更优选miR396e和/或miR396f的突变。

本发明的构建物中所用的各种元件或者是本领域中已知的，或者可用本领域技术人员已知的方法制备。

将本发明的构建物的编码基因的突变体插入外源载体(尤其是适合转基因植物操作的载体)，就构成了本发明的载体。

将本发明的载体转化植物细胞从而介导本发明的载体对植物细胞染色体进行整合，制得含有外源基因的植物细胞。

将本发明的含有外源基因的植物细胞再生为植物体，从而获得含有外源基因的植物。

将本发明构建好的上述核酸构建物的编码基因的突变体，通过常规的遗传转化技术(例如农杆菌转染技术)，可以导入植物细胞，从而获得携带所述核酸构建物的编码基因(或带有所述核酸构建物的编码基因的载体)的植物细胞，或获得基因组中整合有所述核酸构建物的编码基因的突变体的植物细胞。

miR396的抑制剂

本发明还提供了一种针对miR396的抑制剂，所述miR396的抑制剂可抑制miR396的表达或活性。在本发明中，所述miR396的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。

用途

本发明还提供了本发明的式I所示核酸构建物或其编码基因的突变体或miR396抑制剂的用途，它们被用于(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量。在本发明中，本发明的式I所示核酸构建物或其编码基因的突变体来源于水稻，优选的，本发明的式I所示核酸构建物的序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

在本发明中，可通过基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、Crispr技术等技术抑制miR396的表达或活性。

在一优选实施方式中，可通过用1个或多个sgRNA介导的Cas9核酸酶对MIR396进行基因编辑。

植物(如水稻)改良

本发明还提供了一种改良植物(如水稻)的方法，所述的改良包括：(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量，包括步骤：降低植物中miR396的表达或活性、施用miR396的抑制剂或本发明所述的核酸构建物或其编码基因的突变体。

在本发明中，还可进一步用常规方法将其他可以(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量的物质处理植物或植物种子，从而改良对应植物的性状。

在一优选实施方式中，所述其他可以(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量的物质选自下组：脲酶抑制剂(如无机金属、氨基苯磺酰胺、二硫代氨基甲酸盐、羟基草氨酸盐、有机汞化合物、酚类、醌类(氢醌)、磷胺类化合物或其转化物)；硝化抑制剂(如双氰胺、2-氯-6-(三氯甲基)吡啶、叠氮化钾、2-氨基-4-氯-9-甲基吡啶、磺胺噻唑、硫脲-N-2，5-二氯苯丁二酰胺、4-氨基-1，2，3-三唑盐酸盐、脒基硫脲)；氨稳定剂；植物生长调节剂(如胺鲜酯(DA-6)，氯吡脲，复硝酚钠，生长素、赤霉素、乙烯、细胞分裂素、脱落酸、油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸、多效唑和多胺)；生物菌剂；杀虫剂、或其组合。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现一类新的miR396及其家族成员的式I所示的核酸构建物或其编码基因的突变体可显著(a)提高植物的氮肥利用率；和/或(b)降低氮肥的施用量。

(2)本发明的式I所示的核酸构建物或其编码基因的突变体还可提高农业收益，降低环境污染，保护环境。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如无特别说明，本发明实施例中所用的试剂或材料均为市售产品。

实施例1miR396ef突变体可以提高水稻的氮利用率

1、CRISPR-Cas9基因编辑工具的构建

A)设计分别靶向MIR396 a,b和c；MIR396d；MIR396e；MIR396e和f；MIR396g和MIR396h成熟区的small guide-RNA(sgRNA)序列(表1)：sgRNA为包含20nt的与MIR基因成熟区部分互补的序列和粘性末端的一段寡聚核苷酸序列。

B)ddH₂O溶解引物至10μM，正/反向引物各1μl加入8μl退火缓冲液(annealbuffer：TE buffer加50mM NaCl)，混匀；

C)将混匀的引物运行annealling program，PCR仪升温至95℃保持5min，然后每1s降0.1℃，降至16℃；

D)用Bsa I酶切CRISPR-Cas9载体，回收载体片段，备用；

E)连接gRNA和Crispr-Cas9载体，

加水至10μl,16℃连接2hr。

F)转化大肠杆菌，挑单克隆M13F测序验证片段成功连入载体。

表1靶向MIR396基因的sgRNA序列

靶向miR类型	引物名	序列(5'-3')	SEQ ID NO.:
				miR396abc	miR396abc-sg-F	TGTGTGGTGCAGTTCAAGAAAGCTG	3
miR396abc	miR396abc-sg-R	AAACCAGCTTTCTTGAACTGCACCA	4
				miR396ef	miR396ef-sg-F	TGTGTGCACAGTTCAAGAAAGCCTG	5
miR396ef	miR396ef-sg-R	AAACCAGGCTTTCTTGAACTGTGCA	6
				miR396d	miR396d-sg-F	TGTGTGCGGGGGGCGGCATTTCCAC	7
miR396d	miR396d-sg-R	AAACGTGGAAATGCCGCCCCCCGCA	8
				miR396g	miR396g-sg-F	TGTGTGCGACGAGCUGCGCTTCCAC	9
miR396g	miR396g-sg-R	AAACGTGGAAGCGCAGCTCGTCGCA	10
				miR396h	miR396h-sg-F	TGTGTGTGGCCAAGGACATTTCCAC	11
miR396h	miR396h-sg-R	AAACGTGGAAATGTCCTTGGCCACA	12
				miR396e	miR396e-sg-F	TGTGTGCTCATGTTGGGATTGTGGT	13
miR396e	miR396e-sg-R	AAACACCACAATCCCAACATGAGCA	14

所述靶向miR396e和miR396f前体序列的gRNA序列为“caggctttcttgaactgtg”，上述gRNA靶向miR396e和miR396f前体序列后，可以使得miR396e的成熟序列(uuccacaggcuuucuugaacug)和miR396f的成熟序列(cuccacaggcuuucuugaacug)发生突变，从而达到失活miR396e和miR396f的目的。

2、载体遗传转化

A)上述构建质粒直接转化农杆菌EHA105：

1.农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA，之后冰浴30min,放入液氮中1min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴2min。

2.取出离心管，加入LB培养液，振荡培养3～5hr。

3.取出菌液与含相应抗生素的LB培养液平板上涂板，在培养箱中倒置培养。2天左右菌落可见。

B)水稻转基因：

1.愈伤组织诱导，去壳种子用NaClO浸泡消毒，无菌水冲洗后接种于NB诱导培养基中，在培养箱中培养10–15天。

2.愈伤组织继代，将诱导出的愈伤组织用单面刀切下，放入继代培养基，相同条件下培养。

3.农杆菌浸染与抗性愈伤组织筛选，将转入目的载体的农杆菌EH105菌株扩繁，后浸泡状态较好的愈伤组织。

4.吸出或倒掉菌液，将愈伤组织放在箱暗培养48–72h。

5.共培养结束后的愈伤组织用Carbenicillin抗性的无菌水浸泡冲洗，以除去农杆菌。

6.愈伤组织吸干液体，将其接种于含抗生素的筛选培养基上，光照培养两周。

7.愈伤组织分化培养，挑选生长旺盛的愈伤组织(抗性愈伤组织)转移到含抗生素的分化培养基上。一周时间内大部分愈伤组织快速生长，并在愈伤组织表明出现绿点，变绿的愈伤组织会快速分化出幼苗。

3、植株培养及突变体筛选

A)将分化出的健壮幼苗转移至含抗生素的生根培养基中生根培养一周，室温练苗2-3天后，温室基质栽培15-20天后移栽入大田。

B)取每株植物的叶片，提取基因组DNA，在靶向位点两侧设计引物。扩增得到的片段进行Sanger测序，确定每株植物的基因型。

C)检测MIR396e和MIR396f基因突变类型，在T0代筛选到在miR396e/f成熟区一系列的突变类型，并经过4-5代的不断扩繁，不断增加突变类型群体。

D)以miR396e/f作为检测探针，用Northern blot杂交检测mir396e/f突变体中成熟体miR396e和miR396f的积累水平。

4、氮素利用率的检测

A)选取野生型和三个mir396e/f突变体的纯合突变植株种子，将种子于全氮素和缺氮素的培养基中进行处理，并置于适宜光照、温度和湿度条件下培养2-3周。

B)随后，检测了野生型和突变体植株在不同培养条件下植物体内氮素积累水平；

C)并利用qRT-PCR技术，检测在低氮条件下水稻野生型和突变体miR396e/f氮素相关基因的表达水平，进一步明确OsmiR396e/f在应对植物逆境胁迫的调节作用。

5、与氮素吸收和利用相关基因在野生型和mir396ef突变体植株的表达量检测

NIR1、NIR2、GOGAT2和GS1.2基因编码了参与氮吸收和同化的酶，OsAAPs基因与氨基酸转运相关，调控氮素利用率，决定氨基酸从源到库的传递。采用RT-qPCR技术检测上述基因在野生型和突变体中的表达量。

6、实验结果

经检测在mir396e/f突变体(mir396e和mir396f双突变)几乎检测不到mir396e/f成熟体的积累(图1)。说明，我们对miR396e/f成熟体区域的碱基改变，使miR396e/f丧失了生物学功能。

对植株体内氮元素积累进行测定，结果显示：在施用的正常栽培条件下和不施用氮肥的低氮条件下，mir396e/f突变体相比野生型可以积累更多的氮素(图2)。

通过对与氮素吸收、利用相关基因表达情况的检测，结果显示：与野生型相比，我们检测的NIR1、NIR2、GOGAT2、GS1.2、OsAAPs基因在mir396ef突变体幼苗中的表达均有所增加(图3)。

7、实验结论

MIR396e和MIR396f与氮素的同化率和利用率密切相关，且MIR396e和/或MIR396f基因沉默或失去功能，可以使与氮同化和利用相关的基因上调表达，提高农作物对氮素利用率。

通过上述实验表明，我们可以通过调控植物中MIR396e和/或MIR396f基因或其编码RNA来提高植物对氮素的利用率，在保证产量的同时，降低氮肥使用量，降低对环境的污染。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 一种miR396或其编码基因的突变体的应用

<130> P2020-1094

<150> CN201910605771.6

<151> 2019-07-05

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 184

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gcgggcaugc uuuccacagg cuuucuugaa cugugaacuc gugggggugu augugcucau 60

guugggauug uggucggugg ccuccaauuc ucugaaaaga aagcugaauu gucgagcucc 120

ccguucuguc uuuggucguc ucuaccuguu gaugguucaa gaaagcccau ggaaaccaug 180

ccgc 184

<210> 2

<211> 176

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

gccaugcucu ccacaggcuu ucuugaacug ugaacucgug ugugcaugcu ccucauauau 60

uguucuagau cccaugcaug augcauaucg aucgaucuga ucugaauuag gucaucgaug 120

cgcaucugga uccccaucuu guugauaguu caagaaaguc cuuggaaaac auggug 176

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

tgtgtggtgc agttcaagaa agctg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

aaaccagctt tcttgaactg cacca 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tgtgtgcaca gttcaagaaa gcctg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

aaaccaggct ttcttgaact gtgca 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

tgtgtgcggg gggcggcatt tccac 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

aaacgtggaa atgccgcccc ccgca 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

tgtgtgcgac gagcugcgct tccac 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

aaacgtggaa gcgcagctcg tcgca 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

tgtgtgtggc caaggacatt tccac 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

aaacgtggaa atgtccttgg ccaca 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

tgtgtgctca tgttgggatt gtggt 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

aaacaccaca atcccaacat gagca 25

Claims

1.一种降低氮肥的施用量的方法，其特征在于，包括：降低植物中miR396的表达或活性；所述miR396为miR396e和miR396f，所述植物为水稻。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低植物中miR396的表达或活性可以通过以下任一方式实现：

II、对miR396的成熟序列进行突变从而降低其表达或活性。

3.一种组合物的用途，所述组合物包括：(i)miR396抑制剂；和(ii)农学上可接受的载体；其特征在于，用于降低氮肥的施用量；所述miR396为miR396e和miR396f。