CN115942867A - 白粉菌抗性大麻植物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了对白粉菌(PM)显示出增强抗性的修饰的大麻植物。前述修饰的大麻植物包含靶向基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的大麻植物相比，所述靶向基因组修饰赋予至少一种大麻MLO(CsMLO)等位基因的减少表达。本发明进一步公开了用于使用基因组修饰生产修饰的大麻植物的方法。
Description
技术领域
本公开内容涉及在大麻植物中赋予病原体抗性。更具体地，本发明涉及通过控制赋予针对此类病原体的易感性的基因来生产真菌抗性大麻植物。
背景技术
大麻是最古老的驯化植物之一，具有通过大量古代文化使用的证据。它被认为起源于中亚，其通过人类从中亚传播到中国、欧洲、中东和美洲。因此，自农业社会出现以来，大麻已被许多不同的文化培育，用于各种用途例如食物、纤维和医学。在过去的几十年里，大麻育种已停止，因为这样做变得非法和不经济。随着最近在美国和加拿大立法将大麻重新合法化，越来越需要在未来的大麻育种计划中实施新的和先进的育种技术。这将允许加快经典育种的长期过程，并且加速获得用于纤维、食物和医药产品的新的和基因改良的大麻品种。开发和实施分子生物学工具以支持育种者，将允许创建新的真菌抗性性状并且跟踪此类所需性状跨越育种者种质的移动。
目前，大麻植物的育种主要由小型大麻种植者来完成。支持或引导育种过程的分子工具是非常有限的(如果存在的话)。传统的大麻育种通过将育种材料混合来完成，其希望是通过随机杂交找到所需的性状和表型。这些方法已允许构建当今市场上领先的大麻品种。随着大麻的栽培在受保护的结构例如温室和封闭生长室中增多，此类环境助长了某些疾病的流行，其中主因是真菌。
白粉病是一种真菌疾病，其影响广泛范围的植物。白粉病由白粉菌目(Erysiphales)中的许多不同的真菌物种引起，其中单囊壳白粉菌(
Podosphaera xanthii)是最常报道的原因。白粉病是一种较易于鉴定的植物疾病，因为它的症状非常独特。受感染植物在叶和茎上展示白色粉状斑点。下部叶是受影响最大的，但霉病可以出现在植物的任何地上部分上。随着疾病进展，由于形成大量无性孢子，斑点变得更大且更密，并且霉病可能蔓延并缩短植物的长度。
白粉菌在具有高湿度和适度温度的环境中生长良好。温室为疾病的传播提供了理想的潮湿的温和环境。这对其中白粉菌可能在温室环境中滋生的农业和园艺实践造成危害。在农业或园艺环境中，可以使用化学方法、生物有机方法和遗传抗性来控制病原体。了解白粉菌及其管理很重要，因为所得到的疾病可以显著减少重要作物的产率。
MLO蛋白充当针对白粉病的植物防御的负调控物。已报道大麦、拟南芥属(Arabidopsis)和番茄中mlo等位基因的功能丧失，导致对引起白粉病的真菌病原体产生广谱和持久的抗性。
US6211433和US6576814描述了通过产生包含玉蜀黍Mlo的突变诱导的隐性等位基因的转基因植物，来调节玉蜀黍中的Mlo基因表达。然而，此类方法需要对植物基因组进行遗传修饰，特别是用增强疾病抗性的外部外源基因来转化植物。
US2018208939公开了具有使MLO等位基因失活的突变的突变型小麦品系的生成，所述突变赋予对白粉菌真菌的可遗传抗性。
由于生长室或温室中的高湿度生长条件，大麻栽培一直遭受真菌疾病。
鉴于上文，迫切需要开发携带针对真菌疾病的遗传抗性的大麻植物，从而减少或消除在大麻栽培中使用杀真菌剂的需要。另外，还需要用于食物、医学和纤维(大麻)生产的非GMO、先进的大麻育种计划。
发明内容
本发明的一个目的是公开了对白粉菌(PM)显示出增强抗性的修饰的大麻植物，其中所述植物包含靶向基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的大麻植物相比，所述靶向基因组修饰赋予至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的减少表达。
本发明的一个进一步目的是公开了如上文定义的修饰的大麻植物，其中所述靶向基因组修饰在具有野生型基因组核苷酸序列的CsMLO等位基因中，所述CsMLO等位基因选自具有如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、具有如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及具有如SEQ ID NO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述功能变体与相应的CsMLO核苷酸序列具有至少80%的序列同一性。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中相对于缺乏所述至少一种基因组修饰的大麻植物，所述植物具有至少一种Mlo蛋白的表达水平降低。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中使用诱变、小干扰RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、人工miRNA (amiRNA)、DNA基因渗入、核酸内切酶或其任何组合引入所述基因组修饰。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中使用靶向基因组修饰引入所述遗传修饰，优选地使用核酸内切酶引入所述遗传修饰。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中使用CRISPR (成簇规律间隔短回文重复)和CRISPR相关(Cas)基因(CRISPR/Cas)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或其任何组合引入所述靶向基因组修饰。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述Cas基因选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1 (或CasA)、Cse2 (或CasB)、Cse3 (或CasE)、Cse4 (或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966及其任何组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码植物优化的Cas9核酸内切酶的核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述植物优化的Cas9核酸内切酶能够与所述植物基因组的基因组靶序列结合，并且在其中产生双链断裂。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述DNA构建体进一步包含靶向选自CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3的至少一种CsMLO等位基因的sgRNA。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述sgRNA靶向突变型CsMLO1基因，所述sgRNA核苷酸序列选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述植物包含至少一种突变的CsMLO1等位基因，其包含选自以下的核苷酸序列：如SEQ IDNO:875中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物及其组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述突变是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述基因组修饰是插入、缺失、插入缺失或取代。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述突变的CsMLO1等位基因包含具有如SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQ ID NO.:881中所示的核苷酸序列的缺失。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中与包含野生型CsMLO1等位基因序列的大麻植物相比，所述突变的等位基因赋予对白粉菌的增强抗性。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述野生型CsMLO1等位基因包含如SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879或SEQ IDNO:881中的至少一个中所示的核酸序列。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述基因组修饰是在所述等位基因的编码区中的诱导突变、在所述等位基因的调控区中的突变、在MLO病原体应答途径下游的基因和/或表观遗传因子中的突变。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述基因组修饰在植物中生成。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述靶向基因组修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:870及其任何组合的sgRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:10-870及其任何组合的sgRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述CsMLO1中的所述靶向基因组修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) CasDNA和选自SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:286及其任何组合的sgRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:10-286及其任何组合的sgRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述CsMLO2中的所述靶向基因组修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) CasDNA和选自SEQ ID NO:287-SEQ ID NO:625及其任何组合的sgRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:287-625及其任何组合的sgRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述CsMLO3中的所述靶向基因组修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) CasDNA和选自SEQ ID NO:626-SEQ ID NO:870及其任何组合的sgRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:626-870及其任何组合的gRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述sgRNA序列包含选自NGG (SpCas)、NNNNGATT (NmeCas9)、NNAGAAW (StCas9)、NAAAAC(TdCas9)和NNGRRT (SaCas9)的3’前间隔序列邻近基序(PAM)。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述构建体经由以下引入植物细胞内：土壤杆菌属(Agrobacterium)渗入，用于递送和/或表达基因组编辑分子的基于病毒的质粒，或者机械插入如聚乙二醇(PEG)介导的DNA转化、电穿孔或基因枪生物射弹。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述PM选自菊科高氏白粉菌(
Golovinomyces cichoracearum)、
Golovinomyces ambrosiae及其混合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述大麻植物选自包括(但不限于)以下的物种：大麻(
Cannabis sativa) (大麻(
C.
sativa))、印度大麻(
C. indica)、莠草大麻(
C. ruderalis)和大麻属(
Cannabis)的任何杂种或栽培品种。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述大麻植物不包含转基因。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物、后代植物、植物部分或植物细胞。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的植物的植物部分、植物细胞或植物种子。
本发明的一个进一步目的是公开了从如任何上文中定义的修饰的大麻植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的修饰的大麻植物，其中所述植物基因型可通过在登录号下的保藏由NCIMB Aberdeen AB21 9YA，Scotland，UK获得。
本发明的一个进一步目的是公开了用于生产对白粉菌(PM)具有增加抗性的修饰的大麻植物的方法，其包括使用靶向基因组修饰引入至少一种基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的大麻植物相比，所述至少一种基因组修饰赋予至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的减少表达。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述方法包括将靶向基因组修饰引入具有野生型基因组核苷酸序列的至少一种CsMLO等位基因中的步骤，所述至少一种CsMLO等位基因选自包含如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、包含如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及包含如SEQ ID NO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述功能变体与所述CsMLO核苷酸序列具有至少80%的序列同一性。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述方法包括将功能丧失突变引入CsMLO1、CsMLO2和CsMLO2核酸序列中的至少一种内的步骤。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述方法包括将缺失突变引入CsMLO1基因组序列的第一外显子内，以产生突变的CsMLO1等位基因的步骤，所述突变的CsMLO1等位基因包含选自以下的核苷酸序列：如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物及其组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中与野生型大麻植物相比，所述修饰的植物具有降低水平的至少一种Mlo蛋白。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中与包含野生型CsMLO1等位基因序列的大麻植物相比，所述修饰的植物具有降低水平的至少一种Mlo蛋白，所述野生型CsMLO1等位基因序列包含SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879或SEQ ID NO:881中的至少一个中所示的核酸序列。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中使用CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)和CRISPR相关(Cas)基因(CRISPR/Cas)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或其任何组合引入所述基因组修饰。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述Cas基因选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1 (或CasA)、Cse2 (或CasB)、Cse3 (或CasE)、Cse4 (或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966及其任何组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其包括引入包含与核苷酸序列可操作地连接的启动子的表达载体的步骤，所述核苷酸序列编码植物优化的Cas9核酸内切酶，以及靶向选自CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3的至少一种CsMLO等位基因的sgRNA。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中靶向CsMLO1的所述sgRNA核苷酸序列选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其包括以下步骤：在大麻植物中引入且共表达Cas9以及靶向CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3基因中的至少一种的sgRNA，并且在CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3基因中的至少一种中筛选诱导的靶向突变。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其包括在CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3基因中的至少一种中筛选诱导的靶向突变的步骤，其包括从转化的植物获得核酸样品，并且进行核酸扩增和任选地限制性酶消化，以检测CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3中的至少一种中的突变。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中用于筛选CsMLO1基因组序列中诱导的靶向突变的所述核酸扩增，使用具有如SEQ ID NO:871和SEQID NO:872中所示的核酸序列的引物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其进一步包括使用基于凝胶电泳的测定，来评价从转化的植物扩增的PCR片段或扩增子的步骤。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其进一步包括通过对CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3核酸片段或扩增子中的至少一种进行测序，来确认突变的存在的步骤。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述突变在所述等位基因的编码区中、为在所述等位基因的调控区中的突变、在MLO病原体应答途径下游的基因和/或表观遗传因子中的突变。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述突变选自沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变及其任何组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述突变是插入、缺失、插入缺失或取代突变。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述突变是在CsMLO1的第一外显子中的缺失，所述缺失包含选自SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQID NO.:881的核酸序列。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其进一步包括从转化的植物中选择对白粉菌抗性的植物的步骤，所述转化的植物包含突变的CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3核酸片段中的至少一种。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中与包含CsMLO1核酸的大麻植物相比，所述选择的植物的特征在于对白粉菌的抗性增强，所述CsMLO1核酸包含如SEQ ID NO:873中所示的核酸序列。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述CsMLO1中的所述遗传修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ IDNO:10-SEQ ID NO:286及其任何组合的gRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:10-286及其任何组合的gRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述CsMLO2中的所述遗传修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ IDNO:287-SEQ ID NO:625及其任何组合的gRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:287-625及其任何组合的gRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述CsMLO3中的所述遗传修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ IDNO:626-SEQ ID NO:870及其任何组合的gRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:626-870及其任何组合的gRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述gRNA核苷酸序列包含3'前间隔序列邻近基序(PAM)，所述PAM选自：NGG (SpCas9)、NNNNGATT(NmeCas9)、NNAGAAW (StCas9)、NAAAAC (TdCas9)和NNGRRT (SaCas9)。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述构建体使用以下引入植物细胞内：土壤杆菌属渗入，用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒，或者机械插入如聚乙二醇(PEG)介导的DNA转化、电穿孔或基因枪生物射弹。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其进一步包括使携带所述基因组修饰的植物再生的步骤。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其进一步包括在所述再生植物中筛选对白粉菌抗性的植物的步骤。
本发明的一个进一步目的是公开了用于赋予大麻植物对白粉菌的抗性的方法，其包括生产如任何上文中定义的植物。
本发明的一个进一步目的是公开了通过如任何上文中定义的方法获得或可获得的植物、植物部分、植物细胞、组织培养物或种子。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述PM选自菊科高氏白粉菌、
Golovinomyces ambrosiae及其混合物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述大麻植物选自包括(但不限于)以下的物种：大麻(
Cannabis sativa) (大麻(
C. sativa))、印度大麻、莠草大麻和大麻属的任何杂种或栽培品种。
本发明的一个进一步目的是公开了用于使用靶向基因组修饰，生产修饰的大麻植物的方法，与大麻野生型植物相比，所述修饰的大麻植物对白粉菌具有增加的抗性，所述靶向基因组修饰包括引入赋予至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的减少表达的至少一种遗传修饰，所述方法包括以下步骤：(a)鉴定至少一种大麻MLO (CsMLO)直向同源等位基因；(b)对所述至少一种鉴定的CsMLO的基因组DNA进行测序；(c)合成至少一种引导RNA(gRNA)，其包含与所述至少一种鉴定的CsMLO互补的核苷酸序列；(d)用包含以下的构建体转化大麻植物细胞：(a) Cas核苷酸序列和所述gRNA、或(b)包含Cas蛋白和所述gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物；(e)在所述转化的植物细胞的基因组中筛选所述CsMLO等位基因的至少一种中诱导的靶向突变，其包括从所述转化的植物获得核酸样品，并且进行核酸扩增和任选地限制性酶消化，以检测所述CsMLO等位基因的所述至少一种中的突变；(f)通过对所述至少一种CsMLO等位基因进行测序，确认在所述植物细胞的基因组中存在所述基因突变；(g)使携带所述遗传修饰的植物再生；并且(h)在所述再生的植物中筛选对白粉菌抗性的植物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述方法包括将靶向基因组修饰引入具有野生型基因组核苷酸序列的至少一种CsMLO等位基因中的步骤，所述至少一种CsMLO等位基因选自包含如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、包含如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及包含如SEQ ID NO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述功能变体与所述CsMLO核苷酸序列具有至少80%的序列同一性。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述植物具有降低水平的至少一种Mlo蛋白。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其进一步包括将靶向突变型CsMLO1基因的sgRNA引入所述植物内的步骤，所述sgRNA核苷酸序列选自SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中用于筛选CsMLO1基因组序列中诱导的靶向突变的所述核酸扩增，使用具有如SEQ ID NO:871和SEQID NO:872中所示的核酸序列的引物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述植物包含至少一种突变的CsMLO1等位基因，其包含选自以下的核苷酸序列：如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物及其组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述突变是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述突变的CsMLO1等位基因包含具有如SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQ ID NO.:881中所示的核苷酸序列的缺失。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中与包含野生型CsMLO1等位基因序列的大麻植物相比，所述突变的等位基因赋予对白粉菌的增强抗性。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述野生型CsMLO1等位基因包含如SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879或SEQ ID NO:881中的至少一个中所示的核酸序列。
本发明的一个进一步目的是公开了确定大麻植物中存在突变型CsMLO1核酸的方法，其包括用具有如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO: 872中所示的核酸序列的引物测定所述大麻植物。
本发明的一个进一步目的是公开了用于确定大麻植物中存在或不存在突变型CsMLO1核酸或多肽的方法，其包括检测如SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQ ID NO.:881中所示的核苷酸序列的缺失的存在或不存在。
本发明的一个进一步目的是公开了用于鉴定对白粉菌具有抗性的大麻植物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在所述大麻植物的基因组中，筛选选自以下的具有野生型基因组核苷酸序列的CsMLO1、CsMLO2和/或CsMLO3等位基因中的至少一种中诱导的靶向突变：包含如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、包含如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及包含如SEQ ID NO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3；(b)通过对所述至少一种CsMLO等位基因进行测序，确认在所述植物细胞的基因组中存在所述基因突变；(c)使携带所述遗传修饰的植物再生；并且(d)在所述再生的植物中筛选对白粉菌抗性的植物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中使用具有如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中所示的核酸序列的引物对，进行关于突变的CsMLO1等位基因的存在的所述筛选。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述方法包括筛选突变的CsMLO1等位基因的存在的步骤，所述突变的CsMLO1等位基因包含选自以下的核酸序列：如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物及其组合。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中所述方法包括在所述大麻植物中筛选CsMLO1中的缺失的存在的步骤，所述缺失包含选自SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879和SEQ ID NO.:881的核苷酸序列。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中选自SEQ IDNO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879和SEQ ID NO:881的至少一种核酸序列的存在，指示了大麻植物包含野生型CsMLO1核酸，并且选自SEQ ID NO:875、SEQ ID NO:877和SEQ IDNO:880的至少一种核酸序列的存在，任选地与选自SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879和SEQID NO:881的至少一种核酸序列的不存在组合，指示了大麻植物包含突变型CsMLO1核酸。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的方法，其中与包含所述野生型CsMLO1核酸的大麻植物相比，包含突变型CsMLO1核酸的所述大麻植物的特征在于对白粉菌的抗性增强。
本发明的一个进一步目的是公开了引物或引物对的分离的核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8以及SEQ ID NO:10-873、875、876、877、879、880和881的核酸序列具有至少75%的序列同一性。
本发明的一个进一步目的是公开了分离的氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:874、SEQ ID NO:878和SEQ ID NO:882的氨基酸序列具有至少75%的序列相似性。
本发明的一个进一步目的是公开了如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中的至少一个中所示的核苷酸序列，作为引物或引物对用于鉴定或筛选大麻植物的用途，所述大麻植物在其基因组内包含突变型CsMLO1核酸和/或多肽。
本发明的一个进一步目的是公开了如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中的至少一个中所示的核苷酸序列，作为引物或引物对用于鉴定或筛选对白粉菌抗性的大麻植物的用途。
本发明的一个进一步目的是公开了如SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:875、SEQ IDNO:876、SEQ ID NO:877、SEQ ID NO:879、SEQ ID NO:880和SEQ ID NO:881中所示的核苷酸序列，用于鉴定和/或筛选在其基因组内包含突变型CsMLO1核酸和/或多肽的大麻植物的用途，其中选自SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879和SEQ ID NO:881的至少一种核酸序列的存在，指示了大麻植物包含野生型CsMLO1核酸，并且选自SEQ ID NO:875、SEQID NO:877和SEQ ID NO:880的至少一种核酸序列的存在，任选地与选自SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879和SEQ ID NO:881的至少一种核酸序列的不存在相组合，指示了大麻植物包含突变型CsMLO1核酸。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的用途，其中与包含所述野生型CsMLO1核酸的大麻植物相比，包含突变型CsMLO1核酸的所述大麻植物的特征在于对白粉菌的抗性增强。
本发明的一个进一步目的是公开了如SEQ ID NO:10-870中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合，用于至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的靶向基因组修饰的用途。
本发明的一个进一步目的是公开了如SEQ ID NO:10-286中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合，用于大麻CsMLO1等位基因的靶向基因组修饰的用途。
本发明的一个进一步目的是公开了如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合，用于大麻CsMLO1等位基因的靶向基因组修饰的用途。
本发明的一个进一步目的是公开了如SEQ ID NO:287-625中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合，用于大麻CsMLO2等位基因的靶向基因组修饰的用途。
本发明的一个进一步目的是公开了如SEQ ID NO:626-870中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合，用于大麻CsMLO3的靶向基因组修饰的用途。
本发明的一个进一步目的是公开了用于确定大麻植物中存在或不存在突变型CsMLO1核酸或多肽的检测试剂盒，其包含选自SEQ ID NO:871和SEQ ID NO: 872的引物。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的检测试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于检测选自以下的核酸序列的引物或核酸片段：SEQ ID NO:873、SEQ IDNO:875、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:877、SEQ ID NO:879、SEQ ID NO:880和SEQ ID NO:881。
本发明的一个进一步目的是公开了如任何上文中定义的检测试剂盒，其中所述试剂盒可用于鉴定对白粉菌抗性的大麻植物。
附图说明
将参考实施方案的下述描述，与附图结合来描述所公开主题的示例性非限制性实施方案。这些图一般并未按比例显示，并且任何尺寸仅意欲是示例性的而不一定是限制性的。相应或相似的元件任选地由相同的数字或字母指定。
图1A-C呈现了在叶上显示出白色粉状斑点的PM症状的受感染大麻植物叶的照片说明(图1A)，在大麻叶组织上的菊科高氏白粉菌的真菌无性孢子携带体(分生孢子)的放大视图(X4) (图1B)和菊科高氏白粉菌孢子的显微成像(图1C)；
图2A-B示意性地呈现了被导致吸器建立以及通过次生菌丝的感染的真菌附着胞穿透的WT植物细胞(图2A)，以及其中真菌孢子不能穿透的mlo敲除植物细胞(图2B)；
图3示意性地呈现了如通过Xie，Kabin和Yinong Yang. "RNA-guided genomeediting in plants using a CRISPR–Cas system." Molecular plant 6.6 (2013):1975-1983描绘的CRISPR/Cas9作用模式；
图4A-D用照片呈现了在大麻腋芽(图4A)、叶(图4B)、愈伤组织(图4C)和子叶(图4D)的瞬时转化后的GUS染色；
图5呈现了再生的大麻组织；
图6用照片呈现了使用生物射弹转化的大麻植物的枝条中Cas9 DNA的PCR检测；
图7A-B示出了CRISPR/Cas9的体外切割活性；靶向用于编辑的基因组区域的方案显示于图7A中，并且显示含有gRNA序列的PCR扩增子通过含有Cas9和基因特异性gRNA的RNP复合物消化的凝胶显示于图7B中；
图8呈现了作为本发明的实施方案，用于转化的DNA质粒的示意图，所述DNA质粒含有植物密码子优化的来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9核酸酶(pcoSpCas9)和sgRNA序列；
图9示意性地呈现了作为本发明的实施方案，用于靶向CsMLO1第一外显子的sgRNA的基因组定位；
图10呈现了通过三种gRNA序列靶向的野生型CsMLO1的第一外显子(外显子1)的基因组核苷酸序列；
图11呈现了野生型CsMLO1的第一外显子(外显子1)的氨基酸序列；
图12用照片呈现了CsMLO1 PCR产物的检测，显示了由于Cas9介导的基因组编辑的长度变动；和
图13示意性地呈现了由本发明产生的基因组编辑的CsMLO1 DNA片段。
具体实施方式
在优选实施方案的下述详细描述中，参考了构成其部分的附图，在其中作为实例显示了本发明可以在其中进行实践的具体实施方案。应理解，可以利用其它实施方案并且可以进行结构改变，而不脱离本发明的范围。本发明可以根据权利要求进行实践，而无需这些具体细节中的一些或全部。为了清楚起见，在与本发明有关的技术领域中已知的技术材料没有详细描述，以免不必要地混淆本发明。
本发明提供了对白粉菌(PM)显示出增强抗性的修饰的大麻植物，其中所述植物包含靶向基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的大麻植物相比，所述靶向基因组修饰赋予至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的减少表达。
本发明旨在显示大麻中的霉病抗性基因座O (MLO)基因的缺乏与针对PM的抗性相关联。本文公开了MLO缺失很可能增加大麻中的PM抗性。根据本发明的进一步方面，某些MLO基因的缺乏用作病原体抗性的标记物，并且可能加速关于抗性更强的大麻品系的育种。
根据本发明的一个实施方案，靶向基因组修饰在具有野生型基因组核苷酸序列的CsMLO等位基因中，所述CsMLO等位基因选自具有如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、具有如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及具有如SEQ IDNO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3。
根据本发明的一个进一步实施方案，功能变体与相应的CsMLO核苷酸序列具有至少75%，优选80%的序列同一性。
根据本发明的一个进一步实施方案，相对于缺乏至少一种基因组修饰的大麻植物，修饰的大麻植物具有至少一种Mlo蛋白的表达水平降低。
根据本发明的一个进一步实施方案，使用诱变、小干扰RNA (siRNA)、微小RNA(miRNA)、人工miRNA (amiRNA)、DNA基因渗入、核酸内切酶或其任何组合引入基因组修饰。
根据本发明的一个进一步实施方案，使用靶向基因组修饰引入遗传修饰，优选地使用核酸内切酶引入所述遗传修饰。
根据本发明的一个进一步实施方案，使用引导RNA例如设计并靶向突变型CsMLO1基因的单引导RNA (sgRNA)引入基因组修饰，所述sgRNA核苷酸序列选自SEQ ID NO:17、SEQID NO:43和SEQ ID NO:50。
根据本发明的一个进一步实施方案，修饰的大麻植物包含至少一种突变的CsMLO1等位基因，其包含选自以下的核苷酸序列：如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列、如SEQID NO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、或与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物或其组合。
根据本发明的一个进一步实施方案，修饰的大麻植物在选自CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3的至少一种基因或等位基因中，包含至少一个沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
根据本发明的一个进一步实施方案，突变的CsMLO1等位基因包含具有如SEQ IDNO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQ ID NO.:881中所示的核苷酸序列的缺失。
根据本发明的一个进一步实施方案，与包含野生型CsMLO1等位基因序列的大麻植物相比，突变的CsMLO1等位基因赋予对白粉菌的增强抗性。
根据本发明的一个进一步实施方案，野生型CsMLO1等位基因包含如SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879或SEQ ID NO:881中的至少一个中所示的核酸序列。根据本发明的一个进一步实施方案，本发明提供了与野生型大麻植物相比，显示出对白粉菌(PM)的增强抗性的修饰的大麻植物，其中所述修饰的植物包含赋予至少一种大麻MLO(CsMLO)等位基因的减少表达的遗传修饰。本发明进一步提供了用于使用基因组编辑或修饰技术，产生上述修饰的大麻植物的方法。
白粉病(PM)是主要的真菌疾病，其威胁着成千上万的植物物种。白粉菌通常通过杀真菌剂的频繁施加进行控制，所述杀真菌剂对环境具有负面作用，并且导致关于种植者的额外成本。为了减少控制这种病原体所需的化学品的量，抗性作物品种的开发成为当务之急。
在本文中承认PM发病机制与在感染早期过程中特异性MLO基因的上调相关，所述特异性MLO基因的上调引起植物防御途径的下调。这些上调的基因负责PM易感性(S基因)，并且它们的敲除引起持久且广谱的抗性。
随着大麻合法市场在全球范围内扩大，这种农作物将逐渐从室内种植设施移动到简单的低成本温室，以致使以运营成本减少的大量生产成为可能。这种过渡面临的主要挑战之一是缺乏适合温室生长的相容遗传学(品系)，且更具体而言遗传真菌抗性。大麻对真菌疾病的易感性导致对种植者的损害和损失，并且迫使广泛使用杀真菌剂。过量杀真菌剂使用对大麻消费者造成健康威胁。
迄今为止，在市场上不存在真菌疾病抗性的大麻品种。由于此类计划涉及的有限的遗传变异、对遗传材料进口和出口的法律限制以及有限的学术知识和基因库，致力于最后创建真菌疾病抗性大麻品种的经典育种计划实际上是不可能的。另外，传统育种是漫长的过程，具有低成功率和确定性，因为它基于反复试验。
由本发明提出的解决方案是使用基因组编辑，例如CRISPR/Cas系统，以便创建真菌疾病抗性的大麻品种。使用基因组编辑的育种允许精确且显著缩短的育种过程，以便以高得多的成功率实现这些目标。因此，基因组编辑具有更快速地且以更低的成本生成改良品种的潜力。通过使用基因组编辑来生成白粉菌(PM)抗性的大麻品种，目前的公开内容将允许全世界范围的种植者能够向大麻消费者提供更安全的产品。
进一步注意到，使用基因组编辑被以色列监管机构视为非GMO的，并且在美国，USDA已经将十几种基因组编辑的植物分类为非监管和非GMO 的(https://www.usda.gov/media/press-releases/2018/03/28/secretary-perdue-issues-usda-statement-plant-breeding-innovation)。
大麻产业的价值链基于高质量的一致产品的稳定供应。由于缺乏适合集约式农业生产的合适遗传学，大多数种植方法都基于克隆作为营养体繁殖的手段，以便确保植物材料的遗传一致性。这些方法是过时、昂贵且不适合目的的。疾病抗性、稳定且一致的大麻品系的缺乏，对向该产业提供维持自身所需的原料的能力造成威胁。
法律限制和过时的育种技术显著阻碍了生成适合于集约式农业的新的和改良的大麻品种的努力。
某些国家的大麻合法化已显著增加了大麻种植者的数目和用于种植的面积。一种可能的解决方案是将生长中的大麻移动到温室(受保护的生长设施)内，如同过去几十年蔬菜产业一直在做的那样。与蔬菜产业不同，大麻基于营养体繁殖，而蔬菜通过种子生长。另外，大麻种植者正在使用为室内栽培而培育的大麻品系，并且现在将这些品系用于其温室操作。这种情况显然并不理想，并且对于种植者造成许多物流问题。例如，由于大麻植物需要较短的天数用于开花的诱导，种植者在温室中安装变暗的窗帘以控制植物的日长。这种人为变暗导致温室中的湿度增加，因此对于真菌病原体传播和滋生创造了最佳条件。这些条件迫使种植者集中使用杀真菌剂来控制病原体群体。在跨越合法化州严格的监管限制就位的情况下，这些条件对于可持续的大麻生产和消费者健康造成巨大挑战。
大麻产业的下一步是采用和使用杂种种子用于繁殖，这是传统种子产业(从大田作物到蔬菜)中的常见实践。另外，对于目前可用的大麻品种中完全缺乏的基本农艺性状(重点在于疾病抗性)的育种将显著增加种植者的生产力。这将允许对于大麻产业种植且供应高质量的原料。
为了生成可重复的产品，大麻种植者目前正在使用营养体繁殖(克隆或组织培养)。然而，在常规农业中，大田作物和蔬菜的遗传稳定性通过使用F1杂种种子得到维持。这些杂种通过使纯合亲本系杂交而生成。
目前，大麻植物的育种主要由小型大麻种植者来完成。支持或引导育种过程的分子工具是非常有限的(如果存在的话)。传统的大麻育种通过将育种材料混合来完成，其希望是通过随机杂交找到所需的性状和表型。
本发明首次提供了对真菌疾病增强抗性的大麻植物。本发明公开了使用基因组编辑技术，例如CRISPR/Cas9工具，生成对白粉菌真菌疾病抗性的非转基因大麻植物。所生成的突变可以容易地快速引入良种或本地适应的大麻品系，伴随相对最低限度的努力和投资。
如本文使用的，术语“约”指示所限定的量或量度或值的± 25%。
如本文使用的，术语“相似的”指示约± 20%，特别是± 15%，更特别是约± 10%，且甚至更特别是约± 5%的对应或相似性范围。
如本文使用的，“植物”指处于任何发育阶段的任何植物，特别是种子植物。术语“植物”包括整株植物或其任何部分或衍生物，例如植物细胞、种子、植物原生质体、番茄植物可以由其再生的植物细胞组织培养物、一种或多种植物愈伤组织、分生细胞、小孢子、胚、未成熟胚、花粉、胚珠、花药、果实、花、叶、子叶、雌蕊、种子、种皮、根、根尖等等。
本文使用的术语“植物细胞”指植物的结构和生理单位，其包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养细胞的形式，或者作为更高组构单位例如植物组织、植物器官或整株植物的部分。
如本文使用的，术语“植物细胞培养物”意指植物单位的培养物，所述植物单位例如原生质体、可再生细胞、细胞培养物、细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和处于各个发育阶段的胚、叶、根、根尖、花药、分生细胞、小孢子、花、子叶、雌蕊、果实、种子、种皮或其任何组合。
本文使用的术语“植物材料”或“植物部分”指叶、茎、根、根尖、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、种皮、插条、细胞或组织培养物、或者植物的任何其它部分或产物或其组合。
如本文使用的，“植物器官”意指独特且可见地结构化和分化的植物部分，例如根、茎、叶、花、花芽或胚。
如本文使用的，术语“植物组织”意指组构成结构和功能单位的一组植物细胞。包括在植物或培养物中的任何植物组织。该术语包括但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物、原生质体、分生细胞、愈伤组织和组构成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与如上文列出或在其它方面由这个定义包含的任何具体类型的植物组织结合的使用、或在其不存在下的使用，并不预期排除任何其它类型的植物组织。
如本文使用的，术语“后代(progeny)”或“后代(progenies)”以非限制性方式指子代或后裔植物。根据某些实施方案，术语“后代(progeny)”或“后代(progenies)”指从公开或保藏的种子发育或生长或产生的植物，如尤其详述的。生长的植物优选具有所公开或保藏的种子的所需性状，即至少一种CsMLO基因的减少表达。
术语“大麻”在下文中指大麻科(Cannabaceae)中的开花植物属。大麻是一年生、雌雄同株、开花的草本植物，其包括但不限于三个不同的物种：大麻(
Cannabis sativa)、印度大麻和莠草大麻。该术语也指大麻(hemp)。大麻植物产生称为大麻素的一组化学物质。大麻素、萜类化合物和其它化合物由腺毛分泌，所述腺毛在雌性大麻植物的花萼和苞片上最丰富地存在。
如本文使用的，术语“遗传修饰”在下文中指遗传操纵或调节，其是使用生物技术对生物的基因的直接操纵。它还指用于改变细胞的基因构成的一组技术，包括在物种内和跨越物种的基因转移、靶向诱变和基因组编辑技术，以产生改良的生物。根据本发明的主要实施方案，使用基因组编辑机制生成对PM具有增强抗性的修饰的大麻植物。这种技术使得能够在植物中实现特异性基因的修饰，所述特异性基因涉及和/或控制大麻植物中的白粉菌感染。
术语“基因组编辑”或“基因组/遗传修饰”或“基因组工程”在下文中一般指其中DNA在活生物的基因组中插入、缺失、修饰或替换的一类遗传工程。与将遗传材料随机插入宿主基因组内的先前遗传工程技术不同，基因组编辑将插入靶向位点特异性位置。
在本发明的范围内的是，用于此类编辑的常见方法使用改造的核酸酶或“分子剪刀”。这些核酸酶在基因组中的所需位置处产生位点特异性双链断裂(DSB)。诱导的双链断裂通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)进行修复，导致靶向突变(‘编辑’)。由本发明使用的改造核酸酶家族包括但不限于：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)系统。
现在参考由本公开内容使用的示例性基因组编辑术语：
基因组编辑词汇表
| Cas = CISPR 相关基因 | Indel = 插入和/或缺失 |
| Cas9、Csn1 = 含有两个核酸酶结构域的CRISPR相关蛋白，其由小RNA编程以切割DNA | NHEJ = 非同源末端连接 |
| crRNA = CRISPR RNA | PAM = 前间隔序列邻近基序 |
| dCAS9 = 核酸酶缺陷型Cas9 | RuvC = 因涉及DNA修复的大肠杆菌(E.coli)蛋白命名的核酸内切酶结构域 |
| DSB = 双链断裂 | sgRNA = 单引导RNA |
| gRNA = 引导RNA | tracrRNA，trRNA = 反式激活crRNA |
| HDR = 同源定向修复 | TALEN = 转录激活因子样效应物核酸酶 |
| HNH = 因特征性组氨酸和天冬酰胺残基命名的核酸内切酶结构域 | ZFN = 锌指核酸酶 |
应注意，在本发明的范围内的是，术语gRNA也指或意指单引导RNA (sgRNA)。
根据本发明的具体方面，CRISPR (成簇规律间隔短回文重复)和CRISPR相关(Cas)基因首次用于在大麻植物中的靶向基因中生成基因组修饰。在本文中承认，CRISPR (成簇规律间隔短回文重复)和CRISPR相关(Cas)基因的功能在选择细菌和古细菌中的适应性免疫中是必需的，致使生物能够响应且消除入侵的遗传材料。这些重复最初在二十世纪八十年代在大肠杆菌中发现。不希望受理论束缚，现在参考一类CRISPR机制，其中将来自病毒或质粒的入侵DNA切割成小片段，并且掺入包含一系列短重复(约20 bp)的CRISPR基因座内。基因座被转录，然后转录物被加工，以生成小RNA (crRNA，即CRISPR RNA)，其用于指导基于序列互补性靶向入侵DNA的效应物核酸内切酶。
根据本发明的进一步方面，Cas蛋白例如Cas9 (也称为Csn1)是基因沉默所需的。Cas9参与crRNA的加工，并且负责靶DNA的破坏。Cas9在这两个步骤中的功能均依赖两个核酸酶结构域的存在：位于氨基末端处的RuvC样核酸酶结构域和位于蛋白质的中间区域的HNH样核酸酶结构域。为了实现位点特异性DNA识别和切割，Cas9与crRNA和分开的反式激活crRNA (tracrRNA或trRNA)两者复合，后者与crRNA部分互补。tracrRNA是来自编码多种前体crRNA的初级转录物的crRNA成熟所需的。这在RNA酶III和Cas9的存在下发生。
不希望受理论束缚，在本文中承认在靶DNA的破坏期间，HNH和RuvC样核酸酶结构域切割两条DNA链，在相关的crRNA转录物内在由20核苷酸靶序列限定的位点处生成双链断裂(DSB)。HNH结构域切割互补链，而RuvC结构域切割非互补链。
进一步注意到，Cas9的双链核酸内切酶活性还要求称为前间隔序列邻近基序(PAM)的短的保守序列(2-6个核苷酸)紧跟在crRNA互补序列的3'之后。
根据本发明的进一步方面，可以由本发明使用双组分系统，其将trRNA和crRNA组合成单个合成的单引导RNA (sgRNA)，用于指导靶向基因改变。
进一步在范围内的是，Cas9核酸酶变体包括野生型Cas9、Cas9D10A和核酸酶缺陷型Cas9 (dCas9)。
现在参考图3，其示意性地呈现了如通过Xie，Kabin和Yinong Yang. "
RNA-guided
genome editing in plants using a CRISPR–Cas system." Molecular plant 6.6
(2013): 1975-1983描绘的CRISPR/Cas9作用机制的实例。如该图中所示，Cas9核酸内切酶与嵌合RNA (称为引导RNA或gRNA)形成复合物，替换crRNA–transcrRNA异源双链体，并且gRNA可以被编程为靶向特异性位点。gRNA–Cas9应该包含在改造的gRNA的5'端和靶向基因组位点之间没有错配的至少15个碱基配对(gRNA种子区域)，以及称为前间隔序列邻近基序或PAM的基序，所述基序在靶向DNA的互补链中的碱基配对区域之后。来自化脓性链球菌的常用Cas9 (SpCas9)识别PAM序列5'-NGG-3' (其中“N”可以是任何核苷酸碱基)。
在本发明的范围内的其它Cas变体及其PAM序列(5'至3')包括识别NNNNGATT的NmeCas9 (分离自脑膜炎奈瑟球菌(
Neisseria meningitides))、识别NNAGAAW的StCas9(分离自嗜热链球菌(
Streptococcus thermophiles))、识别NAAAAC的TdCas9 (分离自齿垢密螺旋体(
Treponema denticola))、以及识别NNGRRT或NGRRT或NGRRN的SaCas9 (分离自金黄色葡萄球菌)。
如本文使用的，术语“大范围核酸酶”在下文中指特征在于大识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)的脱氧核糖核酸内切酶；因此，该位点一般在任何给定的基因组中仅出现一次。因此，大范围核酸酶被视为最特异性的天然存在的限制性酶。
如本文使用的，术语“前间隔序列邻近基序”或“PAM”在下文中指2-6个碱基对DNA序列，其紧接在通过CRISPR细菌适应性免疫系统中的Cas9核酸酶靶向的DNA序列之后。PAM是入侵病毒或质粒的组分，但不是细菌CRISPR基因座的组分。PAM是必需的靶向组分，其区分细菌自身DNA与非自身DNA，从而防止CRISPR基因座被核酸酶靶向且破坏。
如本文使用的，术语“下一代测序”或“NGS”在下文中指大规模、平行、高通量或深度测序技术平台，其对数百万个DNA小片段平行执行测序。通过将各个读数映射到参考基因组，生物信息学分析用于将这些片段拼凑在一起。
如本文使用的，术语“基因敲低”在下文中指通过其减少一种或多种生物的基因的表达的实验技术。减少可以通过遗传修饰即靶向基因组编辑或通过用试剂处理而发生，所述试剂例如具有与基因或mRNA转录物互补的序列的短DNA或RNA寡核苷酸。减少的表达可以是在RNA水平或蛋白质水平下。在本发明的范围内的是，术语基因敲低还指功能丧失突变和/或基因敲除突变，其中使得生物的基因不起作用或无功能。
如本文使用的，术语“基因沉默”或“沉默(silence)”或“沉默(silencing)”在下文中指细胞中的基因表达调控，以防止某一基因的表达。基因沉默可以在转录或翻译过程中发生。在本发明的某些方面，基因沉默被视为具有与基因敲减相似的含义。当基因被沉默时，其表达减少。相比之下，当基因被敲除时，它们完全不表达。基因沉默可以被视为基因敲减机制，因为用于沉默基因的方法，例如RNAi、CRISPR或siRNA，一般将基因的表达减少了至少70%，但并不完全消除表达。在本发明的一些实施方案中，通过靶向基因组修饰的基因沉默导致无功能的基因产物，例如转录物或蛋白质，例如无功能的CsMLO1外显子1片段。
术语“微小RNA”或“miRNA”在下文中指已在大多数真核生物中发现的小的非编码RNA。它们以序列特异性方式涉及在转录后水平下的基因表达调控。miRNA通过Dicer依赖性小RNA生物发生途径从其前体产生。miRNA是用于使用不同的基于RNA的基因沉默技术，研究基因功能的候选物。例如，靶向一种或几种目的基因的人工miRNA (amiRNA)是功能基因组学中的潜在工具。
在本发明的上下文中，术语“在植物中”意指在植物或植物细胞内。更具体而言，它意指将CRISPR/Cas复合物引入植物材料内，所述植物材料包含几个细胞的组织培养物、整株植物或单一植物细胞，而不引入外源基因或突变基因。它还用于描述非实验室环境(例如体内)中存在的条件。
如本文使用的，术语“白粉菌”或“PM”在下文中指真菌，其是真菌界的子囊菌门(Ascomycota)的专性、活体营养性寄生虫。它们引起的疾病是常见、普遍且易于识别的。受感染的植物在叶和茎上展示白色粉状斑点。高湿度而不是自由水有利于通过真菌的感染。白粉菌真菌趋于在植物表面上浅表或附生生长。在生长季节期间，菌丝优选在上下叶表面上产生。感染也可以在茎、花或果实上发生。专门的吸收细胞，称为吸胞，延伸到植物表皮细胞内以获得营养。
白粉菌真菌既可以有性繁殖又可以无性繁殖。有性繁殖是经由闭囊壳(chasmothecia) (闭囊壳(cleistothecium))，遗传材料在其中重组的一类子囊果。在每个子囊果内有几个子囊。在最佳条件下，子囊孢子成熟并且释放以引发新的感染。分生孢子(无性孢子)在生长季节期间也在植物表面上产生。它们在称为分生孢子的专门菌丝上或单独或成链发育。分生孢子起于附生菌丝，或者在内生菌丝的情况下，分生孢子通过叶气孔出现。应该注意的是，白粉菌真菌必须适应其宿主才能感染它们。本发明首次提供了对PM疾病具有增强抗性或耐受性的大麻植物。对PM的增强抗性通过基因组编辑技术生成，所述基因组编辑技术靶向沉默至少一种大麻霉病基因座(Cannabis Mildew Locus) (MLO)基因。与缺乏靶向修饰的大麻植物相比，修饰所得的大麻植物显示出对PM的增强抗性。
术语"MLO"或"Mlo"或"mlo"在下文中指编码植物特异性蛋白质的霉病基因座O(MLO)基因家族，所述蛋白质具有几个跨膜结构域，拓扑上暗示后生动物G蛋白偶联受体。在本发明的范围内的是，MLO家族的特异性同源物充当针对PM真菌的易感基因。要强调的是，本发明首次提供了大麻植物中MLO直向同源等位基因的鉴定。本文已鉴定了三种大麻MLO等位基因或基因(即MLO1、MLO2、MLO3)，即CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3。
如本文使用的，术语“直向同源物”在下文中指在不同物种中发现的两个或更多个同源基因序列之一。
如本文使用的，例如关于SEQ ID NO: 1、2或3的术语“功能变体”或者“核酸或蛋白质序列的功能变体”，指变体基因序列或基因序列的部分，其保留了完整的非变体等位基因(例如CsMLO等位基因)的生物学功能，并且因此具有调节对PM的应答的活性。功能变体还包含编码多肽的目的基因的变体，所述多肽具有例如在非保守残基中，不影响所得到的蛋白质的功能的序列改变。还包括的是这样的变体，其与如本文所示的等位基因的野生型核酸序列基本上等同，即仅例如在非保守残基中具有一些序列变异，并且是生物活性的。
本文使用的术语“品种”或“栽培品种”意指一组相似的植物，其通过结构特征和性能可以从同一物种内的其它品种中鉴定出来。
本文使用的术语“等位基因”意指在特定基因座处的基因或遗传单位的任何一种或多种替代或变体形式，所有这些等位基因都涉及在特定基因座处的一种性状或特性。在生物的二倍体细胞中，给定基因的等位基因定位于染色体上的特定位置或基因座(复数“多个基因座”)处。等位基因的替代或变体形式可能是单核苷酸多态性、插入、倒位、易位或缺失的结果，或者通过例如化学或结构修饰、转录调控或翻译后修饰/调控引起的基因调控的后果。
与定性性状相关的等位基因可以包含各种遗传单位的替代或变体形式，所述遗传单位包括与以下等同或相关的那些遗传单位：单一基因或多重基因或其产物、或者甚至是破坏遗传因子或由遗传因子控制的基因，所述遗传因子促成由基因座代表的表型。根据进一步的实施方案，术语“等位基因”指定在特定基因座处的基因的任何一种或多种替代形式。杂合等位基因是在同一基因座处的两个不同等位基因。纯合等位基因是在特定基因座处的两个等同等位基因。野生型等位基因是天然存在的等位基因。在本发明的上下文中，术语等位基因指三种鉴定的大麻MLO基因，即CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3，其分别具有如SEQ IDNO:1、2或3中所示的基因组核苷酸序列。
如本文使用的，术语“基因座(locus)”(复数复数多个基因座(loci)”)意指在染色体上的一个或多个特定位置或区域或位点，其中例如发现基因或遗传标记物元件或因子。在具体实施方案中，此类遗传元件促成性状。
如本文使用的，术语“纯合的”指当两个等同或相似的等位基因位于特定基因座处，但个别地置于二倍体生物的细胞中相应的同源染色体对上时存在的遗传条件或构型。
相反，如本文使用的，术语“杂合的”意指当两个不同或不相似的等位基因位于特定基因座处，但个别地置于二倍体生物的细胞中相应的同源染色体对上时存在的遗传条件或构型。在具体实施方案中，本发明的番茄植物包含与高产特性相关的遗传标记物的杂合构型。
如本文使用的，短语“遗传标记物”或“分子标记物”或“生物标记物”指个体的基因组中的特征，例如与一个或多个目的基因座或性状相关的核苷酸或多核苷酸序列。在一些实施方案中，遗传标记物在目的群体中是多态的，或者是由多态性占据的基因座，取决于上下文。遗传标记物或分子标记物包括例如单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(indels) (即插入缺失(insertions deletions))、简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA (RAFD)、切割扩增多态性序列(CAPS)标记物、多样性阵列技术(DArT)标记物和扩增片段长度多态性(AFLP)或其组合，以及许多其它实例，例如DNA序列本身。例如，遗传标记物可以用于定位染色体上含有等位基因的遗传基因座，其促成表型性状的变异性。短语“遗传标记物”或“分子标记物”或“生物标记物”还可以指与基因组序列互补或对应的多核苷酸序列，例如用作探针或引物的核酸序列。
如本文使用的，术语“种质”指群体或其它个体组(例如，物种)的基因型的整体。术语“种质”也可以指植物材料；例如，充当各种等位基因的储库的一组植物。此类种质基因型或群体包括具有证明的遗传优势的植物材料；例如，对于特定环境或地理区域，以及遗传价值未知或未证明的植物材料；其并非建立的育种群体的部分，并且与建立的育种群体的成员没有已知的关系。
本文使用的术语“杂种”、“杂种植物”和“杂种后代”指由遗传上不同的亲本产生的个体(例如，遗传上杂合的或大部分杂合的个体)。
如本文使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”指的是，当在指定的比较窗口上就最大对应比对时，在两个序列中相同的残基。当序列同一性的百分比在提及蛋白质使用时，认识到并非等同的残基位置经常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，并且因此并不改变分子的功能性质。该术语在下文中进一步指在两个不同序列之间精确匹配的字符量。因此，不计算缺口并且测量与两个序列中较短的序列有关。
进一步在范围内的是，术语“相似性”和“同一性”另外指局部同源性，鉴定同源或相似(在核苷酸和/或氨基酸序列方面)的结构域。认可的是生物信息学工具例如BLAST、SSEARCH、FASTA和HMMER计算局部序列比对，其鉴定两个序列之间最相似的区域。对于在不同蛋白质的不同序列上下文中发现的结构域，比对应该限于同源结构域，因为结构域同源性提供了以得分捕获的序列相似性。根据一些方面，术语相似性或同一性进一步包括序列基序，其是普遍的核苷酸或氨基酸序列模式，并且具有或推测具有生物学意义。蛋白质可以具有序列基序和/或结构基序，即由可能不相邻的氨基酸的三维排列形成的基序。
如本文使用的，术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”预期包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，天然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，以及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物。它可以是单链或双链的。此类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列、以及并不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调控序列。这些术语还包括基因。术语“基因”、“等位基因”或“基因序列”广泛用于指与生物学功能相关的DNA核酸。因此，基因可以包括如基因组序列中的内含子和外显子，或者可以仅包含如cDNA中的编码序列，和/或可以包括与调控序列组合的cDNA。因此，根据本发明的各个方面，可以使用基因组DNA、cDNA或编码DNA。在一个实施方案中，核酸是cDNA或编码DNA。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且指通过肽键连接在一起、以任何长度的聚合形式的氨基酸。
根据本发明的其它方面，“修饰的”或“突变型”植物是与天然存在的野生型(WT)植物相比，已改变的植物。具体而言，在大麻中的每个MLO同源物的内源核酸序列(核酸序列CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3)，与野生型序列相比，已使用如本文所述的诱变和/或基因组编辑方法进行改变。这引起内源性Mlo基因的失活，并且因此使Mlo功能失效。与野生型植物相比，此类植物具有改变的表型并且显示对PM的抗性或增加抗性。因此，抗性由大麻植物基因组中的至少一种突变的内源性CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3基因的存在赋予，所述大麻植物基因组已使用靶向基因组进行特异性靶向。
根据本发明的进一步方面，对PM的增加抗性并非通过大麻中表达的转基因的存在赋予。
应当注意，野生型等位基因的核酸序列使用大写字母进行命名，即CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3。突变型mlo核酸序列使用非大写字母。与野生型植物相比，本发明的大麻植物是修饰的植物，其包含并表达突变型mlo等位基因。
进一步在本发明的范围内的是，下调或破坏野生型Mlo序列的功能表达的mlo突变可以是隐性的，使得它们通过野生型序列的表达得到补充。
根据本发明的mlo突变表型的特征在于显示出针对PM的增加抗性。换言之，根据本发明的mlo突变体赋予对引起PM的病原体的抗性，其如尤其描述的进行鉴定。
进一步注意到，野生型大麻植物是并不具有任何突变型Mlo等位基因的植物。
本发明的主要方面涉及靶向诱变方法，具体地基因组编辑，并且排除仅仅基于通过传统育种方法生成植物的实施方案。在本发明的一个进一步实施方案中，如本文解释的，疾病抗性性状并非由于转基因的存在。
本发明人已生成了具有突变的突变型大麻品系，所述突变使至少一种CsMLO同源等位基因(homoeoallele)失活，这赋予对白粉菌的可遗传抗性。以这种方式，没有制备功能性CsMLO蛋白。因此，本发明涉及这些突变型大麻品系和相关方法。
根据一个实施方案，本发明提供了与野生型大麻植物相比，显示出对白粉菌(PM)的增强抗性的修饰的大麻植物。本发明的大麻植物包含赋予至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的减少表达的遗传修饰。
在本发明的范围内，CsMLO等位基因选自具有如SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列或其片段或功能变体的CsMLO1、具有如SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列或其片段或功能变体的CsMLO2、以及具有如SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列或其片段或功能变体的CsMLO3。
根据本发明的一个进一步实施方案，功能变体与CsMLO核苷酸序列具有至少75%的序列同一性。
在本发明的范围内的是，基因组编辑可以使用序列特异性核酸酶(SSN)来实现，并且导致染色体变化，例如在特定遗传基因座处的核苷酸缺失、插入或取代。SSN的非限制性实例包括锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应物核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统。
由本发明使用的Cas蛋白的非限制性实例包括Csn1、Cpf1 Cas9、Cas12、Cas13、Cas14、CasX及其任何组合。
根据本发明的进一步方面，使用CRISPR/Cas9技术生成对白粉菌真菌病原体抗性的大麻植物，所述CRISPR/Cas9技术基于通过单引导RNA (sgRNA)引导至特异性DNA靶的Cas9 DNA核酸酶。
在本文中承认霉病抗性基因座O (Mlo)的野生型等位基因(其编码具有七个跨膜结构域的膜相关蛋白)，赋予对引起白粉病的真菌的易感性。因此，纯合的功能丧失突变(mlo)导致对白粉菌的抗性。
根据本发明的某些实施方案，通过本发明首次实现了特异性基因的植物中修饰，所述特异性基因涉及和/或控制大麻植物中的白粉菌感染，即大麻MLO基因(CsMLO)。更具体而言，但非限制性地，对于大麻植物公开了基因编辑技术，例如CRISPR/Cas技术(例如Cas9或Cpf1)的使用，以便生成控制对白粉菌(PM)的抗性的基因(即MLO基因)的敲除等位基因。上述植物中的修饰可以基于替代基因编辑技术，例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA沉默(amiRNA等)和/或大范围核酸酶。
功能缺失突变可以是参考野生型CsMLO等位基因序列的缺失或插入(“插入缺失”)。缺失可以包含在一条或多条链中的1-20个或更多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18或20个或更多个核苷酸。插入可以包含在一条或多条链中的1-20个或更多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18或20个或更多个核苷酸。
本发明的植物包括其中该植物对于每个突变是杂合的植物。然而，在一个优选实施方案中，植物对于突变是纯合的。根据本领域已知的方法，也可以从这些植物生成纯合的后代。
进一步在范围内的是，根据本发明的各个方面，特定CsMLO核苷酸或氨基酸序列的变体，与如SEQ ID NO 1、2或3中所示的CsMLO等位基因的特定非变体CsMLO核苷酸序列具有至少约50%-99%，例如至少75%，例如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更多的序列同一性。确定序列同一性的序列比对程序是本领域众所周知的。
另外，本发明的各个方面不仅包括CsMLO核酸序列或氨基酸序列，而且还包括其片段。“片段”意指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分，以及由此由其编码的蛋白质的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白质片段，其保留天然蛋白质的生物活性，并且因此作用于调节对PM的响应。
根据本发明的一个进一步实施方案，本文新近鉴定的大麻MLO基因座(CsMLO)已使用三重sgRNA策略进行靶向。
根据本发明的进一步实施方案，可以通过土壤杆菌属渗入、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒和DNA的机械插入(PEG介导的DNA转化、生物射弹等)，来完成DNA引入植物细胞内。
另外，在本发明的范围内的是，Cas9蛋白连同gRNA (核糖核蛋白-RNP's)一起直接插入，以便绕过Cas9+gRNA质粒在植物中对体内转录和翻译的需要，以实现基因编辑。
还可能创建基因组编辑的植物并且将其用作砧木。然后，Cas蛋白和gRNA可以经由维管系统转运到植物的顶部，并且在接穗中创建基因组编辑事件。
在本发明的范围内的是，使用CRISPR/Cas系统用于生成PM抗性大麻植物，允许修饰预定的特异性DNA序列，而无需通过GMO技术将外源DNA引入基因组内。根据本发明的一个实施方案，这通过将Cas核酸酶(例如Cas9、Cpf1等等)与预定义的引导RNA分子(gRNA)组合来实现。gRNA与植物基因组中靶向用于编辑的特异性DNA序列互补，并且将Cas核酸酶引导至特异性核苷酸序列(例如参见图3)。将预定义的基因特异性gRNA克隆到与Cas基因相同的质粒内，并且将这种质粒插入植物细胞内。上述质粒DNA的插入可以但不限于使用不同的生物学和/或机械递送系统来完成，所述递送系统例如土壤杆菌属渗入、用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒和DNA的机械插入(PEG介导的DNA转化、生物射弹等)。
进一步在本发明的范围内的是，在到达特异性预定DNA序列后，Cas9核酸酶切割两条DNA链以产生双链断裂，留下平端。这个切割位点然后通过细胞非同源末端连接DNA修复机制进行修复，导致最终在切割位点处产生突变的插入或缺失。例如，认可的是，突变的缺失形式由至少1个碱基对缺失组成。由于这个碱基对缺失，基因编码序列被破坏，并且编码蛋白质的翻译因过早终止密码子或者蛋白质的功能或结构性质的破坏而受到损害。因此，DNA通过Cas9蛋白进行切割，并且通过细胞的DNA修复机制重新组装。
进一步在范围内的是，大麻植物中对PM的抗性通过以下而产生：生成与大麻基因组中的预定基因(即MLO基因)的特异性位点具有同源性的gRNA，将这种gRNA亚克隆到含有Cas9基因的质粒内，并且将质粒插入大麻植物细胞内。以这种方式，在MLO基因中生成位点特异性突变，因此有效地产生非活性分子，导致白粉菌和类似生物无法感染基因组编辑的植物。
现在参考图1A-C，其示意性地呈现了被真菌病原体菊科高氏白粉菌(白粉病的致病因子)感染的大麻植物。更具体而言，该图显示了(A) 显示出PM症状的大麻植物叶，(B)在大麻叶组织上的菊科高氏白粉菌的真菌无性孢子携带体(分生孢子)，以及(C)菊科高氏白粉菌孢子的显微镜视图。
现在参考图2A-B，其示意性地呈现了所提议的PM抗性的作用模式。该图显示了(A)被PM真菌(100)穿透的WT植物细胞。更具体地，WT植物细胞10被产生胚芽管30的PM孢子20感染，并且被PM真菌附着胞40穿透，这然后导致吸器50的建立以及通过次生菌丝的感染；以及(B)致使真菌孢子不能穿透植物细胞(200)的mlo敲除细胞15。
为了理解本发明并了解它可以如何在实践中实施，现在将参考下述实施例(仅作为非限制性示例)描述多个优选实施方案。
实施例1
用于通过基因组编辑生产白粉菌抗性大麻植物的示例性方法
可以通过下述育种/栽培方案中的至少一种来实现白粉菌抗性的大麻品系的生产：
方案1：
● 通过自花授粉的品系稳定
● F6亲本品系的生成
● 亲本品系的基因组编辑
● 使编辑的亲本品系杂交，以生成F1杂种PM抗性植物
方案2：
● 鉴定目的基因
● 设计gRNA
● 用Cas9+gRNA构建体转化植物
● 筛选且鉴定编辑事件
● 亲本品系的基因组编辑
应注意可以通过下述执行品系稳定：
● 在雌性(XX)植物上诱导雄性开花
● 自花授粉
根据本发明的一些实施方案，品系稳定需要6次自交(6代)并且通过单粒传法(SSD)方法来完成。
F1杂种种子生产：通过不同大麻品系之间的杂交产生新型杂种。
根据本发明的一个进一步方面，缩短品系稳定通过双单倍体(DH)来执行。更具体而言，将CRISPR-Cas9系统转化到小孢子内，以实现DH纯合亲本品系。双单倍体(DH)是单倍体细胞经历染色体加倍时形成的基因型。双单倍体的人工生产在植物育种中是重要的。在本文中承认，传统的近亲繁殖程序需要六代才能实现近似完全的纯合性，而双单倍体在一代内实现这点。
在本发明的范围内的是，通过本发明开发且提供了对于大麻特异性的遗传标记物：
● 性别标记物 - 分子标记物用于本文公开的育种程序中雌性相对于雄性植物的鉴定和选择
● 基因分型标记物 - 本发明中使用的种质使用分子标记物进行基因分型，以便允许更有效的育种过程和MLO编辑事件的鉴定。
进一步在本发明的范围内的是，对于所使用的大麻品系分析等位基因和遗传变异。
现在参考已通过基因组编辑用于生产白粉菌抗性的大麻植物的任选阶段：
第1阶段：鉴定大麻(
Cannabis sativa) (大麻(
C. sativa)) MLO直向同源物。在本文中已鉴定了大麻中的三种MLO直向同源物，即CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3。这些同源基因已进行测序和映射。已发现CsMLO1定位于染色体5上的位置58544241bp和位置58551241bp之间，并且具有如SEQ ID NO:1中所示的基因组序列。CsMLO1基因具有如SEQ ID NO:2中所示的编码序列，并且它编码如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
已发现CsMLO2定位于染色体3上的位置92616000bp和位置92629000bp之间，并且具有如SEQ ID NO:4中所示的基因组序列。CsMLO2基因具有如SEQ ID NO:5中所示的编码序列，并且它编码如SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
已发现CsMLO3定位于染色体5上的位置23410000bp和位置23420000bp之间，并且具有如SEQ ID NO:7中所示的基因组序列。CsMLO3基因具有如SEQ ID NO:8中所示的编码序列，并且它编码如SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。
第2阶段：设计且合成对应于靶向用于编辑的序列(即基因CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3各自的序列)的gRNA分子。应注意，编辑事件优选靶向独特的限制性位点序列，以允许更容易地筛选在其基因组内携带编辑事件的植物。根据本发明的一些方面，gRNA的核苷酸序列应该与靶基因的基因组序列完全相容。因此，例如，应该对于不同大麻品系的不同MLO同源物构建合适的gRNA分子。
现在参考表1、2和3，其分别呈现了为了使CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3沉默而构建的gRNA分子。在表1、2和3中，术语'PAM'指前间隔序列邻近基序，其为2-6个碱基对的DNA序列，其紧接在通过CRISPR细菌适应性免疫系统中的Cas9核酸酶靶向的DNA序列之后。CsMLO基因组DNA有义链标记为"1"，且反义链标记为"-1"。
表1：CsMLO1靶向的gRNA序列
表2：CsMLO2靶向的gRNA序列
表3：CsMLO3靶向的gRNA序列
参考表4，其概括了与在本发明的范围内的WT CsMLO有关的序列。
表4：WT CsMLO序列表
| 序列类型表征 | CsMLO1 | CsMLO2 | CsMLO3 |
| 基因组序列 | SEQ ID NO:1 | SEQ ID NO:4 | SEQ ID NO:7 |
| 编码序列(CDS) | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:5 | SEQ ID NO:8 |
| 氨基酸序列 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:9 |
| gRNA序列 | SEQ ID NO:10- SEQ IDNO:286 (表1) | SEQ ID NO:287- SEQ IDNO:625 (表2) | SEQ ID NO:626- SEQ IDNO:870 (表3) |
上述gRNA分子已被克隆到合适的载体内，并且其序列已进行验证。另外，还已对于不同的Cas9形式在大麻植物中的Cas9蛋白活性和gRNA分子之间的最佳相容性进行分析。
第3阶段：使用土壤杆菌属或生物射弹(基因枪)方法转化大麻植物。对于土壤杆菌属和生物射弹，可以使用携带(Cas9 +基因特异性gRNA)的DNA质粒。构建了含有选择标记物、Cas9基因和有关基因特异性gRNA的载体。对于生物射弹，使用携带(Cas9蛋白+基因特异性gRNA)的核糖核蛋白(RNP)复合物。RNP复合物通过将Cas9蛋白与有关基因特异性gRNA混合而产生。
根据本发明的一些实施方案，使用以下的粒子轰击执行各种大麻组织的转化：
● DNA载体
● 核糖核蛋白复合物(RNP)
根据本发明的进一步实施方案，通过以下使用土壤杆菌属(根瘤土壤杆菌(
Agrobacterium tumefaciens))执行各种大麻组织的转化：
● 基于再生的转化
● 浸花转化
● 幼苗转化
已将通过根瘤土壤杆菌的转化效率与通过瞬时GUS转化实验的轰击方法进行比较。在转化后，已执行转化体的GUS染色。
现在参考图4A-D，其用照片呈现了下述大麻组织的瞬时转化后的GUS染色：(A)腋芽、(B)叶、(C)愈伤组织和(D)子叶。
图4证实了使用生物射弹系统已成功地瞬时转化了各种大麻组织。转化已执行到大麻的愈伤组织、叶、腋芽和子叶内。
根据本发明的进一步实施方案，在大麻中使用了另外的转化工具，包括但不限于：
● 原生质体PEG转化
● 扩展RNP的使用
● 使用荧光标签的定向编辑筛选
● 电穿孔
第4阶段：组织培养中的再生。当将DNA构建体转化到植物内时，抗生素用于选择阳性转化的植物。本文对于大麻植物建立了改良的再生方案。
现在参考呈现大麻组织的再生的图5。在该图中，箭头指示了新的分生组织出现。
第5阶段：阳性转化体的选择。一旦再生植物出现在组织培养中，就从转化的植物的叶样品中提取DNA，并且使用侧接编辑区域的引物执行PCR。然后用识别原始gRNA序列附近的限制性位点的酶消化PCR产物。如果发生编辑事件，则限制性位点将被破坏，并且PCR产物将不被切割。没有编辑事件将导致切割的PCR产物。
现在参考图6，其显示了转化的大麻植物的枝条中Cas9 DNA的PCR检测。从使用生物射弹用Cas9转化的植物的枝条中提取DNA。该图显示了在转化后三周，在转化的植物的枝条中检测到Cas9 DNA。
关于CRISPR/Cas9基因编辑事件的筛选已通过下述分析方法中的至少一种执行：
● 限制性片段长度多态性(RFLP)
● 下一代测序(NGS)
● PCR片段分析
● 基于荧光标签的筛选
● 高分辨率解链曲线分析(HRMA)
现在参考图7，其呈现了CRISPR/Cas9切割活性的体外分析结果。图7A示意性地显示了靶向用于编辑，并且通过反向和正向设计的引物进行扩增的基因组区域(PAM以红色进行标记)。图7B用照片呈现了凝胶，其显示了含有基因特异性gRNA序列的所得到的PCR扩增子通过含有Cas9的RNP复合物的成功消化。分析包括下述步骤：
1)通过侧接由预先设计的sgRNA靶向的目的基因序列的引物，从两个示例性大麻品系中分离扩增子。
2)使RNP复合物与分离的扩增子一起温育。
● 3)然后将反应混合物加载到琼脂糖凝胶上，以评估在靶位点处的Cas9切割活性。
第6阶段：通过建立适合大麻的方案来选择呈现针对PM的抗性的转化的大麻植物。在范围内的是，测试了不同的gRNA启动子，以便使编辑效率达到最大。
实施例2
鉴定对于大麻特异性的白粉菌(PM)病原体
白粉菌是感染大麻的最具破坏性的真菌病原体之一。它是专性活体营养生物，其可以血管化到植物组织内并且保持对于种植者不可见。在理想条件下，白粉菌具有4-7天的接种后(dpi)窗口，在其中当它在植物内部构建网络时，它保持不可见。在本文中承认，在分生孢子生成之前，用基于PCR DNA的测试可检测到大麻中的白粉菌维管化网络。在后期阶段，白粉菌感染和分生孢子生成导致真菌快速传播到其它植物。这趋于在2周内出现并生成孢子而繁荣，因此破坏非常成熟的作物，具有严重的经济后果。基于DNA的工具可以促进受感染的植物材料的早期检测和快速去除或进入克隆的筛选。
迄今为止，在市场上不存在真菌疾病抗性的大麻品种。菊科高氏白粉菌因在几种葫芦科植物和大麻上引起PM而已知(Pépin等人，2018)。为了鉴定影响大麻的具体真菌类型，已执行了分子分析。从在我们的温室中生长的大麻品系获得的PM样品的内部转录间隔区(ITS) DNA已进行分离且测序。如下文使用的，术语内部转录间隔区(ITS)指位于染色体中的小亚基核糖体RNA (rRNA)和大亚基rRNA基因之间的间隔区DNA区域、或多顺反子rRNA前体转录物中的相应转录区。在本文中承认，内部转录间隔区(ITS)区域被视为对于最广泛范围的真菌具有最高的成功鉴定概率，在种间和种内变异之间具有最明确定义的条形码间隙(barcode gap)。因此，提议采用ITS作为主要的真菌条形码标记物，即作为真菌的潜在DNA标记物或指纹(Schoch C.L.等人，PNAS，2012 109 (16) 6241-6246)。从大麻中分离的PM的分子分析结果揭示了
Golovinomyces ambrosiae或菊科高氏白粉菌是该疾病的原因。
本发明的进一步成果是建立了用于大麻的接种测定和指标，或换言之，建立了用于大麻中的白粉菌接种的生物测定。此类测定建立可能包括：
• 易感性指数的开发
• 通过在几个植物发育阶段测试不同的接种方法来设计方案
实施例3
基因组编辑的大麻MLO基因的产生
设计并合成了靶向CsMLO1基因的第一外显子(外显子1)的三种单引导RNA(sgRNA)。这些sgRNA包括在SEQ ID NO:1的位置99、369和453处起始的sgRNA，其具有如SEQID NO:17 (第一引导)、SEQ ID NO:43 (第二引导)和SEQ ID NO:50 (第三引导)中所示的核苷酸序列。由这些引导RNA指导的预测的Cas9切割位点被设计为与限制性酶的核酸识别位点重叠：分别用于第一gRNA、第二gRNA和第三gRNA的Hinf1、BseLI和BtsI (参见图9)。使用DNA质粒执行转化，所述DNA质粒例如图8中呈现的植物密码子优化的化脓性链球菌Cas9(pcoSpCas9)质粒。该质粒含有植物密码子优化的SpCas9和上文提到的至少一种sgRNA。
转化后两个月，对来自成熟植物的叶进行取样，并且提取其DNA并用合适的酶消化。使用侧接CsMLO1的第一外显子的5'和3'端的引物对，将消化的基因组DNA用作PCR的模板。正向引物(fwd) (5-GAGTGGAACTAGAAGAAATGC-3)包含如SEQ ID NO:871中所示的核苷酸序列，并且反向引物(rev) (5-CCCTCCAAACACAACAGTGA-3)包含如SEQ ID NO:872中所示的核苷酸序列(参见图9和图10)。如图10中所示，上述引物对(用箭头标记的)生成包含CsMLO1的完整外显子1的778 bp扩增子，其具有如SEQ ID NO:873中所示的核苷酸序列(SEQ IDNO:1的核苷酸位置4-782)。在图10中，用于靶向CsMLO1基因组序列的外显子1的三种gRNA序列是加下划线的。翻译起始密码子ATG (编码甲硫氨酸氨基酸)用正方形进行标记。图11呈现了如SEQ ID NO:874中所示的CsMLO1第一外显子的氨基酸序列。
现在参考用照片呈现了CsMLO1 PCR产物的检测的图12，其显示了由于Cas9介导的基因组编辑的长度变动(即截短的片段)。使用具有如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中所示的核酸序列的引物，将来自转化后两个月的植物的DNA用作PCR的模板。通过PCR反应获得比预计的WT 780 bp扩增子更短的DNA片段，并且将其亚克隆到测序质粒内并进行测序。测序结果在下文进行描述。
在图12中可以看出，WT或未编辑的PCR产物导致780 bp的条带，而从编辑的植物中提取的DNA显示出比预计的780 bp WT外显子1长度更短的条带，即样品1和2显示了450 bp片段，而样品3和4显示了350 bp片段。
图13示意性地呈现了WT和通过本发明首次获得的基因组编辑的CsMLO1 DNA片段的序列。在该图中，sgRNA序列是加下划线的。具有如SEQ ID NO:17 (第一引导)中所示的核苷酸序列与Hinf1限制性位点的sgRNA出现在外显子1的左侧上，并且具有如SEQ ID NO:50(第三引导)中所示的核苷酸序列与BtsI限制性位点的sgRNA出现在外显子1片段的右侧上。PAM序列(NGG)以斜体和粗体进行标记并且圈出。ATG密码子位置用正方形进行标记。
测序结果显示了，通过本发明获得了三种CsMLO1外显子1基因组编辑的片段。
现在参考表5，其概括了与通过本发明获得的CsMLO1的突变的(基因组编辑的)外显子1片段有关的序列。
表5：突变的CsMLO1外显子1的序列
所得到的突变的CsMLO1片段包括下述：
(1)片段1：标记为65-L4 Δ447的CsMLO1片段包含如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列(约330 bp)。这个片段含有447 bp的缺失(SEQ ID NO:1的位置109-556)，其具有如SEQ ID NO:876中所示的核苷酸序列。应该注意的是，这个片段编码两个氨基酸的肽(SEQID NO:882，如表5中所示)。预计通过靶向基因组编辑生成的短CsMLO1外显子1肽导致无功能的、沉默的CsMLO1基因或等位基因。
(2)片段2：标记为65-L5 Δ373的CsMLO1片段包含如SEQ ID NO:877中所示的核苷酸序列(约405 bp)。这个片段含有373 bp的缺失(SEQ ID NO:1的位置128-501)，其具有如SEQ ID NO:879中所示的核苷酸序列。应该注意的是，这个片段编码八个氨基酸的短肽(SEQID NO:878，如表5中所示)。预计此类短外显子1片段导致无功能的CsMLO1等位基因。
(3)片段3：标记为85-4 Δ456的CsMLO1片段包含如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列(约320 bp)。这个片段含有456 bp的缺失(SEQ ID NO:1的位置96-552)，其具有如SEQ ID NO:881中所示的核苷酸序列。要强调的是，对片段3进行编辑，使得它缺少ATG翻译起始密码子，因此并不生成翻译的蛋白质。预计所得到的截短的CsMLO1基因/蛋白质是无功能的。
本发明的基因组编辑的CsMLO1截短片段的特征在于CsMLO1基因的第一外显子序列的显著部分的缺失。因此，这些基因组编辑的片段产生截短的CsMLO1蛋白。截短的蛋白质缺乏开放读码框(ORF)的显著部分，例如不存在翻译起始密码子或外显子1蛋白质编码序列的显著部分，并且因此将是无功能的。
本发明显示了，沉默的CsMLO1基因通过在大麻植物中的靶向基因组修饰来实现。
通过沉默编码MLO蛋白的基因(例如CsMLO1、CsMLO2和/或CsMLO3)，生成了与缺乏靶向基因组修饰的植物相比，对白粉病具有增强抗性的大麻植物。这些PM抗性植物对于医用大麻行业是高度期望的，因为显著减少或避免了使用化学试剂来控制病原体疾病。
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Schoch CL, Seifert KA, Huhndorf S, Robert V, Spouge JL, Levesque CA,Chen W和Fungal Barcoding Consortium. "Nuclear ribosomal internal transcribedspacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi". PNAS, 2012109 (16) 6241-6246。
Claims (98)
1.一种对白粉菌(PM)显示出增强抗性的修饰的大麻植物，其中所述植物包含靶向基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的大麻植物相比，所述靶向基因组修饰赋予至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的减少表达。
2.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述靶向基因组修饰在具有野生型基因组核苷酸序列的CsMLO等位基因中，所述CsMLO等位基因选自具有如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、具有如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及具有如SEQ ID NO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3。
3.根据权利要求2的修饰的大麻植物，其中所述功能变体与相应的CsMLO核苷酸序列具有至少80%的序列同一性。
4.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中相对于缺乏所述至少一种基因组修饰的大麻植物，所述植物具有至少一种Mlo蛋白的表达水平降低。
5.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中使用诱变、小干扰RNA (siRNA)、微小RNA(miRNA)、人工miRNA (amiRNA)、DNA基因渗入、核酸内切酶或其任何组合引入所述基因组修饰。
6.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中使用靶向基因组修饰引入所述遗传修饰，优选地使用核酸内切酶引入所述遗传修饰。
7.根据权利要求6的修饰的大麻植物，其中使用CRISPR (成簇规律间隔短回文重复)和CRISPR相关(Cas)基因(CRISPR/Cas)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或其任何组合引入所述靶向基因组修饰。
8.根据权利要求7的修饰的大麻植物，其中所述Cas基因选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1 (或CasA)、Cse2 (或CasB)、Cse3 (或CasE)、Cse4 (或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966及其任何组合。
9.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述植物包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与编码植物优化的Cas9核酸内切酶的核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述植物优化的Cas9核酸内切酶能够与所述植物基因组的基因组靶序列结合，并且在其中产生双链断裂。
10.根据权利要求9的修饰的大麻植物，其中所述DNA构建体进一步包含靶向选自CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3的至少一种CsMLO等位基因的sgRNA。
11.根据权利要求10的修饰的大麻植物，其中所述sgRNA靶向突变型CsMLO1基因，所述sgRNA核苷酸序列选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50。
12.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述植物包含至少一种突变的CsMLO1等位基因，其包含选自以下的核苷酸序列：如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列、如SEQ IDNO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物及其组合。
13.根据权利要求1和12中任一项的修饰的大麻植物，其中所述突变是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
14.根据权利要求1和12中任一项的修饰的大麻植物，其中所述基因组修饰是插入、缺失、插入缺失或取代。
15.根据权利要求12的修饰的大麻植物，其中所述突变的CsMLO1等位基因包含具有如SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQ ID NO.:881中所示的核苷酸序列的缺失。
16.根据权利要求12的修饰的大麻植物，其中与包含野生型CsMLO1等位基因序列的大麻植物相比，所述突变的等位基因赋予对白粉菌的增强抗性。
17.根据权利要求16的修饰的大麻植物，其中所述野生型CsMLO1等位基因包含如SEQID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879或SEQ ID NO:881中的至少一个中所示的核酸序列。
18.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述基因组修饰是在所述等位基因的编码区中的诱导突变、在所述等位基因的调控区中的突变、在MLO病原体应答途径下游的基因和/或表观遗传因子中的突变。
19.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述基因组修饰在植物中生成。
20.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述靶向基因组修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:870及其任何组合的sgRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:10-870及其任何组合的sgRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
21.根据权利要求2的修饰的大麻植物，其中所述CsMLO1中的所述靶向基因组修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:286及其任何组合的sgRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:10-286及其任何组合的sgRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
22.根据权利要求2的修饰的大麻植物，其中所述CsMLO2中的所述靶向基因组修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ ID NO:287-SEQ ID NO:625及其任何组合的sgRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:287-625及其任何组合的sgRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
23.根据权利要求2的修饰的大麻植物，其中所述CsMLO3中的所述靶向基因组修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ ID NO:626-SEQ ID NO:870及其任何组合的sgRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:626-870及其任何组合的gRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
24.根据权利要求20-23中任一项的修饰的大麻植物，其中所述sgRNA序列包含选自NGG(SpCas)、NNNNGATT (NmeCas9)、NNAGAAW (StCas9)、NAAAAC (TdCas9)和NNGRRT (SaCas9)的3’前间隔序列邻近基序(PAM)。
25.根据权利要求20中任一项的修饰的大麻植物，其中所述构建体经由以下引入植物细胞内：土壤杆菌属渗入，用于递送和/或表达基因组编辑分子的基于病毒的质粒，或者机械插入如聚乙二醇(PEG)介导的DNA转化、电穿孔或基因枪生物射弹。
26.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述PM选自菊科高氏白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、Golovinomyces ambrosiae及其混合物。
27.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述大麻植物选自包括但不限于以下的物种：大麻(Cannabis sativa) (大麻(C. sativa))、印度大麻(C. indica)、莠草大麻(C. ruderalis)和大麻属的任何杂种或栽培品种。
28.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述大麻植物不包含转基因。
29.根据权利要求1的修饰的大麻植物、后代植物、植物部分或植物细胞。
30.根据权利要求1的修饰的植物的植物部分、植物细胞或植物种子。
31.从根据权利要求1的修饰的大麻植物获得的可再生细胞、原生质体或愈伤组织的组织培养物。
32.根据权利要求1的修饰的大麻植物，其中所述植物基因型可通过在登录号下的保藏由NCIMB Aberdeen AB21 9YA，Scotland，UK获得。
33.一种用于生产对白粉菌(PM)具有增加抗性的修饰的大麻植物的方法，其包括使用靶向基因组修饰引入至少一种基因组修饰，与缺乏所述靶向基因组修饰的大麻植物相比，所述至少一种基因组修饰赋予至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的减少表达。
34.根据权利要求33的方法，其中所述方法包括将靶向基因组修饰引入具有野生型基因组核苷酸序列的至少一种CsMLO等位基因中的步骤，所述至少一种CsMLO等位基因选自包含如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、包含如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及包含如SEQ ID NO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3。
35.根据权利要求34的方法，其中所述功能变体与所述CsMLO核苷酸序列具有至少80%的序列同一性。
36.根据权利要求33的方法，其中所述方法包括将功能丧失突变引入CsMLO1、CsMLO2和CsMLO2核酸序列中的至少一种内的步骤。
37.根据权利要求33的方法，其中所述方法包括将缺失突变引入CsMLO1基因组序列的第一外显子内，以产生突变的CsMLO1等位基因的步骤，所述突变的CsMLO1等位基因包含选自以下的核苷酸序列：如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物及其组合。
38.根据权利要求33的方法，其中与野生型大麻植物相比，所述修饰的植物具有降低水平的至少一种Mlo蛋白。
39.根据权利要求33的方法，其中与包含野生型CsMLO1等位基因序列的大麻植物相比，所述修饰的植物具有降低水平的至少一种Mlo蛋白，所述野生型CsMLO1等位基因序列包含SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879或SEQ ID NO:881中的至少一个中所示的核酸序列。
40.根据权利要求33的方法，其中使用CRISPR (成簇规律间隔短回文重复)和CRISPR相关(Cas)基因(CRISPR/Cas)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或其任何组合引入所述基因组修饰。
41.根据权利要求40的方法，其中所述Cas基因选自Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cast10d、Cas12、Cas13、Cas14、CasX、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1 (或CasA)、Cse2 (或CasB)、Cse3 (或CasE)、Cse4 (或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn1、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cpf1、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966及其任何组合。
42.根据权利要求33的方法，其包括引入包含与核苷酸序列可操作地连接的启动子的表达载体的步骤，所述核苷酸序列编码植物优化的Cas9核酸内切酶，以及靶向选自CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3的至少一种CsMLO等位基因的sgRNA。
43.根据权利要求42的方法，其中靶向CsMLO1的所述sgRNA核苷酸序列选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50。
44.根据权利要求33的方法，其包括以下步骤：在大麻植物中引入且共表达Cas9以及靶向CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3基因中的至少一种的sgRNA，并且在CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3基因中的至少一种中筛选诱导的靶向突变。
45.根据权利要求33的方法，其包括在CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3基因中的至少一种中筛选诱导的靶向突变的步骤，其包括从转化的植物获得核酸样品，并且进行核酸扩增和任选地限制性酶消化，以检测CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3中的至少一种中的突变。
46.根据权利要求45的方法，其中用于筛选CsMLO1基因组序列中诱导的靶向突变的所述核酸扩增，使用具有如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中所示的核酸序列的引物。
47.根据权利要求45的方法，其进一步包括使用基于凝胶电泳的测定来评价从转化的植物扩增的PCR片段或扩增子的步骤。
48.根据权利要求45的方法，其进一步包括通过对CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3核酸片段或扩增子中的至少一种进行测序来确认突变的存在的步骤。
49.根据权利要求45的方法，其中所述突变在所述等位基因的编码区中、为在所述等位基因的调控区中的突变、在MLO病原体应答途径下游的基因或表观遗传因子中的突变。
50.根据权利要求45的方法，其中所述突变选自沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变及其任何组合。
51.根据权利要求45的方法，其中所述突变是插入、缺失、插入缺失或取代突变。
52.根据权利要求45的方法，其中所述突变是在CsMLO1的第一外显子中的缺失，所述缺失包含选自SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQ ID NO.:881的核酸序列。
53.根据权利要求33的方法，其进一步包括从转化的植物中选择对白粉菌抗性的植物的步骤，所述转化的植物包含突变的CsMLO1、CsMLO2和CsMLO3核酸片段中的至少一种。
54.根据权利要求53的方法，其中与包含CsMLO1核酸的大麻植物相比，所述选择的植物的特征在于对白粉菌的抗性增强，所述CsMLO1核酸包含如SEQ ID NO:873中所示的核酸序列。
55.根据权利要求34的方法，其中所述CsMLO1中的所述遗传修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:286及其任何组合的gRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:10-286及其任何组合的gRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
56.根据权利要求34的方法，其中所述CsMLO2中的所述遗传修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ ID NO:287-SEQ ID NO:625及其任何组合的gRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:287-625及其任何组合的gRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
57.根据权利要求34的方法，其中所述CsMLO3中的所述遗传修饰经由引入包含以下的构建体在植物中生成：(a) Cas DNA和选自SEQ ID NO:626-SEQ ID NO:870及其任何组合的gRNA序列，或(b)包含Cas蛋白和选自SEQ ID NO:626-870及其任何组合的gRNA序列的核糖核蛋白(RNP)复合物。
58.根据权利要求55-57中任一项的方法，其中所述gRNA核苷酸序列包含3'前间隔序列邻近基序(PAM)，所述PAM选自：NGG (SpCas9)、NNNNGATT (NmeCas9)、NNAGAAW (StCas9)、NAAAAC (TdCas9)和NNGRRT (SaCas9)。
59.根据权利要求55-57中任一项的方法，其中所述构建体使用以下引入植物细胞内：土壤杆菌属渗入，用于递送基因组编辑分子的基于病毒的质粒，或者机械插入如聚乙二醇(PEG)介导的DNA转化、电穿孔或基因枪生物射弹。
60.根据权利要求33的方法，其进一步包括使携带所述基因组修饰的植物再生的步骤。
61.根据权利要求60的方法，其进一步包括在所述再生植物中筛选对白粉菌抗性的植物的步骤。
62.一种用于赋予大麻植物对白粉菌的抗性的方法，其包括根据权利要求33的方法生产植物。
63.一种植物、植物部分、植物细胞、组织培养物或种子，其通过权利要求33的方法获得或可获得。
64.根据权利要求33的方法，其中所述PM选自菊科高氏白粉菌、Golovinomyces ambrosiae及其混合物。
65.根据权利要求33的方法，其中所述大麻植物选自包括但不限于以下的物种：大麻(Cannabis sativa) (大麻(C. sativa))、印度大麻、莠草大麻和大麻属的任何杂种或栽培品种。
66.一种用于使用靶向基因组修饰生产修饰的大麻植物的方法，与大麻野生型植物相比，所述修饰的大麻植物对白粉菌具有增加的抗性，所述靶向基因组修饰包括引入赋予至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的减少表达的至少一种遗传修饰，所述方法包括以下步骤：
a. 鉴定至少一种大麻MLO (CsMLO)直向同源等位基因；
b. 对所述至少一种鉴定的CsMLO的基因组DNA进行测序；
c. 合成至少一种引导RNA (gRNA)，其包含与所述至少一种鉴定的CsMLO互补的核苷酸序列；
d. 用包含以下的构建体转化大麻植物细胞：(a) Cas核苷酸序列和所述gRNA、或(b)包含Cas蛋白和所述gRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物；
e. 在所述转化的植物细胞的基因组中筛选所述CsMLO等位基因的至少一种中诱导的靶向突变，其包括从所述转化的植物获得核酸样品，并且进行核酸扩增和任选地限制性酶消化，以检测所述CsMLO等位基因的所述至少一种中的突变；
f. 通过对所述至少一种CsMLO等位基因进行测序，确认在所述植物细胞的基因组中存在所述基因突变；
g. 使携带所述遗传修饰的植物再生；和
h. 在所述再生的植物中筛选对白粉菌抗性的植物。
67.根据权利要求66的方法，其中所述方法包括将靶向基因组修饰引入具有野生型基因组核苷酸序列的至少一种CsMLO等位基因中的步骤，所述至少一种CsMLO等位基因选自包含如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、包含如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及包含如SEQ ID NO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3。
68.根据权利要求67的方法，其中所述功能变体与所述CsMLO核苷酸序列具有至少80%的序列同一性。
69.根据权利要求66的方法，其中所述植物具有降低水平的至少一种Mlo蛋白。
70.根据权利要求66的方法，其进一步包括将靶向突变型CsMLO1基因的sgRNA引入所述植物内的步骤，所述sgRNA核苷酸序列选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50。
71.根据权利要求66的方法，其中用于筛选CsMLO1基因组序列中诱导的靶向突变的所述核酸扩增，使用具有如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中所示的核酸序列的引物。
72.根据权利要求66的方法，其中所述植物包含至少一种突变的CsMLO1等位基因，其包含选自以下的核苷酸序列：如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物及其组合。
73.根据权利要求72的方法，其中所述突变是沉默突变、敲低突变、敲除突变、功能丧失突变或其任何组合。
74.根据权利要求72的方法，其中所述突变的CsMLO1等位基因包含具有如SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQ ID NO.:881中所示的核苷酸序列的缺失。
75.根据权利要求72的方法，其中与包含野生型CsMLO1等位基因序列的大麻植物相比，所述突变的等位基因赋予对白粉菌的增强抗性。
76.根据权利要求75的方法，其中所述野生型CsMLO1等位基因包含如SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879或SEQ ID NO:881中的至少一个中所示的核酸序列。
77.一种确定大麻植物中存在突变型CsMLO1核酸的方法，其包括用具有如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO: 872中所示的核酸序列的引物测定所述大麻植物。
78.一种用于确定大麻植物中存在或不存在突变型CsMLO1核酸或多肽的方法，其包括检测如SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879或SEQ ID NO.:881中所示的核苷酸序列的缺失的存在或不存在。
79.一种用于鉴定对白粉菌具有抗性的大麻植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在所述大麻植物的基因组中，筛选在选自以下的具有野生型基因组核苷酸序列的CsMLO1、CsMLO2和/或CsMLO3等位基因中的至少一种中诱导的靶向突变：包含如SEQ ID NO:1中所示的序列或其功能变体的CsMLO1、包含如SEQ ID NO:4中所示的序列或其功能变体的CsMLO2、以及包含如SEQ ID NO:7中所示的序列或其功能变体的CsMLO3；
b. 通过对所述至少一种CsMLO等位基因进行测序，确认在所述植物细胞的基因组中存在所述基因突变；
c. 使携带所述遗传修饰的植物再生；和
d. 在所述再生的植物中筛选对白粉菌抗性的植物。
80.根据权利要求79的方法，其中使用具有如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中所示的核酸序列的引物对，进行关于突变的CsMLO1等位基因的存在的所述筛选。
81.根据权利要求79的方法，其中所述方法包括筛选突变的CsMLO1等位基因的存在的步骤，所述突变的CsMLO1等位基因包含选自以下的核酸序列：如SEQ ID NO:875中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:877中所示的核苷酸序列、如SEQ ID NO:880中所示的核苷酸序列、与所述至少一种突变的CsMLO1等位基因的核苷酸序列具有至少80%序列同一性的同源物及其组合。
82.根据权利要求79的方法，其中所述方法包括在所述大麻植物中筛选CsMLO1中的缺失的存在的步骤，所述缺失包含选自SEQ ID NO.:876、SEQ ID NO.:879和SEQ ID NO.:881的核苷酸序列。
83.根据权利要求79的方法，其中选自SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879和SEQ ID NO:881的至少一种核酸序列的存在，指示了大麻植物包含野生型CsMLO1核酸；并且选自SEQ ID NO:875、SEQ ID NO:877和SEQ ID NO:880的至少一种核酸序列的存在，任选地与选自SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879和SEQ ID NO:881的至少一种核酸序列的不存在组合，指示了大麻植物包含突变型CsMLO1核酸。
84.根据权利要求83的方法，其中与包含所述野生型CsMLO1核酸的大麻植物相比，包含突变型CsMLO1核酸的所述大麻植物的特征在于对白粉菌的抗性增强。
85.一种引物或引物对的分离的核苷酸序列，其与选自SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8以及SEQ ID NO:10-873、875、876、877、879、880和881的核酸序列具有至少75%的序列同一性。
86.一种分离的氨基酸序列，其与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQID NO:874、SEQ ID NO:878和SEQ ID NO:882的氨基酸序列具有至少75%的序列相似性。
87.如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中的至少一个中所示的核苷酸序列作为引物或引物对用于鉴定或筛选大麻植物的用途，所述大麻植物在其基因组内包含突变型CsMLO1核酸和/或多肽。
88.如SEQ ID NO:871和SEQ ID NO:872中的至少一个中所示的核苷酸序列作为引物或引物对用于鉴定或筛选对白粉菌抗性的大麻植物的用途。
89.如SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:875、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:877、SEQ ID NO:879、SEQ ID NO:880和SEQ ID NO:881中所示的核苷酸序列用于鉴定和/或筛选在其基因组内包含突变型CsMLO1核酸和/或多肽的大麻植物的用途，其中选自SEQ ID NO:873、SEQ IDNO:876、SEQ ID NO:879和SEQ ID NO:881的至少一种核酸序列的存在，指示了大麻植物包含野生型CsMLO1核酸；并且选自SEQ ID NO:875、SEQ ID NO:877和SEQ ID NO:880的至少一种核酸序列的存在，任选地与选自SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:879和SEQ ID NO:881的至少一种核酸序列的不存在相组合，指示了大麻植物包含突变型CsMLO1核酸。
90.根据权利要求89的用途，其中与包含所述野生型CsMLO1核酸的大麻植物相比，包含突变型CsMLO1核酸的所述大麻植物的特征在于对白粉菌的抗性增强。
91.如SEQ ID NO:10-870中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于至少一种大麻MLO (CsMLO)等位基因的靶向基因组修饰的用途。
92.如SEQ ID NO:10-286中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于大麻CsMLO1等位基因的靶向基因组修饰的用途。
93.如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:50中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于大麻CsMLO1等位基因的靶向基因组修饰的用途。
94.如SEQ ID NO:287-625中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于大麻CsMLO2等位基因的靶向基因组修饰的用途。
95.如SEQ ID NO:626-870中的至少一个中所示的核苷酸序列及其任何组合用于大麻CsMLO3的靶向基因组修饰的用途。
96.一种用于确定大麻植物中存在或不存在突变型CsMLO1核酸或多肽的检测试剂盒，其包含选自SEQ ID NO:871和SEQ ID NO: 872的引物。
97.根据权利要求96的检测试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于检测选自以下的核酸序列的引物或核酸片段：SEQ ID NO:873、SEQ ID NO:875、SEQ ID NO:876、SEQ ID NO:877、SEQ ID NO:879、SEQ ID NO:880和SEQ ID NO:881。
98.根据权利要求96的检测试剂盒，其中所述试剂盒可用于鉴定对白粉菌抗性的大麻植物。
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