CN110862439A - 植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134及其编码基因和应用。本发明的植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的产量杂种优势相关蛋白及其编码基因对改良增强小麦产量杂种优势，提高产量、加速高产分子育种进程具有十分重要的理论和实际意义。

Description

植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134及其编码基因和应用。

背景技术

MADS-box转录因子是一个庞大的转录因子家族，广泛存在于动植物中，该转录因子具有多种生物学功能，不仅参与植物花器官的发育、调控花时、光合作用、营养代谢、激素信号转导，而且在根的形成、叶的生长和抗逆等方面，尤其在植物花和果实发育及成熟等多个过程中具有重要的调控作用。

MADS转录因子通过MADS-box结构域识别和绑定下游靶基因中调控区域的CArG盒[CC(A/T)₆GG]，即其N末端含有的一段约为60个氨基酸组成的高度保守的DNA结合结构域，从而调控下游目标基因表达，主要功能表现为激活或抑制靶基因的转录反应。根据结构域的不同，植物MADS-box基因家族可分为2个亚家族：Type I和Type II。Type I又称为M-type型，可继续分为Mα、Mβ、Mγ和Mδ组；Type II又称为MIKC型，因其含有4个保守结构域：MADS(M)盒、Intervening(I)区域、Keratin(K)盒和C-terminal(C)末端。

在植物中，MADS-box转录因子最初被鉴定为花器官决定基因。迄今为止，对MADS-box基因了解较深入的也是其在花中的作用。研究发现蕨类植物的大多数MADS-box基因在生殖器官和营养器官中均表达，而种子植物绝大多数MADS-box基因只专一在一种花器官内表达，只有少数在生殖器官和营养器官中都表达。随着对MADS-box的不断研究，花形成的分子调控机理已经从最初著名的ABC模型发展为ABCDE模型，且涉及的花发育相关基因多数都属于MADS-box基因家族。由于其中D类基因与C类基因在功能有重叠，所以目前更认同ABCE模型。ABC模型是根据模式植物金鱼草和拟南芥的研究而提出来的，它澄清了决定花器官同一性的一些Ⅱ型基因：花器官从外部到内部的四个轮状被(A)-,(A+B)-,(B+C)-and(C)类基因所识别。D和E类基因也参与了花器官的鉴定，它们的作用是形成蛋白质四聚体复合物。按照发育时期先后顺序，花器官发育主要有4轮发育过程：第1轮萼片发育，主要由A类(APETALA(AP1))和E类(SEPALLATA(SEP1、SEP2、SEP3和SEP4))基因调控；第2轮花瓣发育，主要由A类、B类(PISTILATA(PI)和AP3)和E类基因调控；第3轮雄蕊发育，主要由B类、C类(AGAMOUS(AG))和E类基因调控；第4轮雌蕊发育，主要由C类和E类基因调控；以及柱头发育，主要由D类(SEEDSTICK/AGAMOUS-LINE11(STK/AGL11))和E类基因调控。在小麦中，这4轮发育过程分别对应内稃、浆片、雄蕊、雌蕊以及柱头的发育。

MADS-box包括AP3和PI在花瓣和雄蕊中起到特异性的调控作用，拟南芥AP3在花瓣、雄蕊和子房中有表达，研究发现PeMADS1和PeMADS7在兰花合蕊柱和子房发育中起作用。水稻AP3同源基因OsMADS16在花瓣和雄蕊中有表达，OsMADS2对浆片发育具有一定作用，OsMADS3可以抑制浆片发育及决定雄蕊发育；玉米AP3同源基因SILKY1在萼片、花瓣、雄蕊和子房中均有表达。同时MADS-box基因还参与胚和胚乳的发育，拟南芥中可以克隆到了AGL23、AGL28、AGL61和AGL62，其中AGL23调控拟南芥雌配子体的发育并控制胚胎发育过程中细胞器的形成，AGL61和AGL62都参与胚乳细胞的形成。MADS-box基因也受表观遗传调控，如拟南芥中FLC是可负调控植物开花进程，可通过甲基化修饰改变染色质结构，抑制FLC表达，促进拟南芥开花。拟南芥根中优势表达的NMHC5(AGL17)、NMHC7，在营养组织中表达的AGL12、AGL19和ANR1、AGL15、AGL3]等。GmSEP1在大豆生殖器官花、荚和种子表达，在四轮花器官中有不同程度的表达，推测可能与大豆花器官特化和种子发育相关。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134。

本发明的再一目的是提供编码上述植物产量杂种优势相关蛋TaMADS134的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的再一目的提供上述植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134的应用。

本发明的再一目的在于提供上述编码基因的应用。

本发明的再一目的在于提供提高植物产量的方法。

根据本发明具体实施方式的产量杂种优势相关蛋白TaMADS134，来源于小麦，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

为了使蛋白TaMADS134便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

根据本发明具体实施方式的TaMADS134编码基因，其具有如SEQ ID NO.2所示cDNA序列：

根据本发明具体实施方式的含有TaMADS134基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用TaMADS134构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因。

本发明还提供一种提高植物产量的方法，包括在植物中过表达基因TaMADS134的步骤。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的TaMADS134基因导入植物细胞，可获得对产量优势增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。其中，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：小麦、小麦、小麦、小麦、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的有益效果：

本发明以京麦179种为实验材料，得到了产量杂种优势相关的TaMADS134蛋白及其编码基因，并将编码基因导入小麦，显著提高了植物的产量杂种优势。本发明的产量杂种优势相关蛋白及其编码基因对改良增强小麦产量杂种优势，提高产量、加速高产分子育种进程具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为小麦产量杂种优势相关TaMADS134基因的cDNA克隆结果，其中，M：Trans2KPlus DNAmarker；1，2为TaMADS134基因的cDNA扩增产物；

图2为TaMADS134基因在不同强、中、弱杂交组合中的表达模式分析，其中，P1为不同不育系材料；P2为不同恢复系材料；F1为不同杂交种材料；

图3为TaMADS134亚细胞定位分析结果，35S::GFP为空载体，35S:TaMADS134-GFP为融合载体，Bright为明场通道，GFP为绿色荧光蛋白通道，Merged为GFP和Bright两个通道的叠加(标尺长度＝10μm)；

图4为TaMADS134转基因小麦分子检测及与对照产量比较分析结果，M：Trans2KPlus DNAmarker；1为阳性对照；2-11为TaMADS134基因不同转基因株系；WT为野生型小麦Fieldier；T1、T2、T3为不同转基因小麦株系。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1小麦产量杂种优势相关TaMADS134基因的cDNA克隆

对生长15天左右的京麦179小麦幼苗用Trizol提取小麦总RNA。利用5’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)，设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，获得TaMADS134基因的全长序列684bp。

引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-ATGGGTCGCGGCAAGGTGGA-3’，

P2：5’-ATTCGTTGTTCAATTGATCCAG-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为700kb左右的条带，与预期结果相符，如图1所示。用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。

将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaMADS134基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至684bp位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ IDNo.2所示TaMADS134基因的重组载体命名为pTE-TaMADS134。

将TaMADS134基因的序列进行比对，在小麦中未发现同源蛋白基因，证明TaMADS134基因是一个新的基因。

进一步用引物P1和P2在小麦基因组中进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cDNA长度大小一致，不含有内含子序列。

实施例2 TaMADS134基因荧光定量差异表达分析

利用灌浆期的BS366不育系、恢复系14GF5771、14GF6613、14GF6849等及杂交种灌浆期籽粒取样，进行RNA提取及RT-PCR对TaMADS134基因在不同品系材料中的表达特性进行分析，研究TaMADS134基因与产量之间存在关系。

通过成熟期结实率统计分析筛选出了不同强中弱产量杂种优势类型材料进行荧光定量PCR分析。

如图2结果显示，TaMADS134基因在BS366不育系、恢复系14GF6613、14GF6849、14GF7029、14GF7789及杂交种中表达量差异显著，表现为超亲表达模式，结合产量水平分析发现这4个杂交组合为强优势杂交组合，产量水平显著高于其他杂交种。因此，TaMADS134基因在14GF6613、14GF6849、14GF7029、14GF7789强优势组合中发挥着重要作用。

实施例3 TaMADS134亚细胞定位分析

构建TaMADS134基因的GFP融合表达载体，并通过PEG渗透法转化小麦原生质体。通过激光共聚焦显微镜下观察GFP激发光、明场和叠加视野下TaMADS134在小麦原生质体细胞中的定位情况。

结果如图3所示，对照GFP可小麦原生质体中大量表达，绿色荧光信号在细胞质和细胞核中均有分布；与GFP对照相比，TaMADS134融合蛋白绿色荧光信号主要定位于细胞核中，证实TaMADS134作为转录因子都是主要分布于细胞核中发挥着重要转录调控作用。

实施例4 TaMADS134基因增强小麦的产量杂种优势

1)Ubi-TaMADS134重组表达载体的构建

以小麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和SpeI双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pBI221的玉米泛素启动子(Ubiquitin)之后SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体pUbi::TaMADS134。

引物序列如下：

TaMADS134[SmaI]5’-TCCCCCGGGG ATGGGTCGCGGCAAGGTGGA-3’，

TaMADS134[SpeI]5’-GGACTAGT ATTCGTTGTTCAATTGATCCAG-3’。

2)转基因小麦的获得

将上述构建的重组表达载体pUbi::TaMADS134分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用pUbi::TaMADS134的根癌农杆菌EHA105转化小麦，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。

P3(上游引物):5’-ACAAGACACTAGAGCGGTAC-3’，

P4(下游引物):5’-TAGTTTCTTGTATCTTCTTC-3’。

对Ubi::TaMADS134转基因小麦进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得350bp左右条带，结果获得转Ubi::TaMADS134小麦15株，结果如图4中A所示。

同时将pBI221空载体导入小麦，方法同上，作为对照，获得8个株系的转空载体小麦(筛选获得的转基因小麦用T₂代表示)。

3)转基因小麦产量表型鉴定

将pUbi::TaMADS134重组表达载体转化农杆菌EHA105，再用含pUbi::TaMADS134的农杆菌EHA105转化小麦材料Fieldier，通过PCR分子检测得到阳性转基因植株。

对成熟期转基因小麦和对照产量统计分析，结果如图4中B及表2所示，

表2 TaMADS134转基因株系与对照产量比较考种分析

小区名称	株行(Kg)	折亩产(Kg)	较CK±％	穗粒数(个)	千粒重(g)
						T1	4.34	482.46	13.61	44	37.90
T2	4.23	470.24	10.73	43	38.62
						T3	4.25	472.46	11.26	43	39.24
Fieldier	3.82	424.67	-	36	36.69

过表达TaMADS134转基因小麦株系产量比对照Fieldier显著提高，增产幅度达到10％以上，穗粒数和粒重均比对照有所增加，从而证明了过表达TaMADS134基因能够增强转基因小麦的产量，其在小麦籽粒灌浆、粒重等方面发挥着重要的调控作用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 227

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 1

Met Gly Arg Gly Lys Val Glu Leu Lys Arg Ile Asp Asn Lys Ser Ser

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ala Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Ser Thr Arg Gly Arg Leu Phe Glu Phe Ser Thr Ser Ser Cys Met Tyr

50 55 60

Lys Thr Leu Glu Arg Tyr Arg Ser Cys Asn Phe Asn Ser Glu Ala Thr

65 70 75 80

Ala Ala Pro Glu Thr Glu Leu Asn Asn Tyr Gln Glu Tyr Leu Lys Leu

85 90 95

Lys Thr Arg Val Glu Phe Leu Gln Thr Thr Gln Arg Asn Leu Leu Gly

100 105 110

Glu Asp Leu Gly Pro Leu Asn Met Lys Glu Leu Glu Gln Leu Glu Asn

115 120 125

Gln Ile Glu Ile Ser Leu Lys His Ile Arg Ala Thr Lys Ser Gln Gln

130 135 140

Ser Leu Asp Gln Leu Phe Glu Leu Lys Arg Lys Glu Gln Gln Leu Gln

145 150 155 160

Asp Val Asn Lys Asp Leu Arg Lys Lys Ile Gln Glu Thr Ser Ala Glu

165 170 175

Asn Val Leu Gln Met Ser Cys Gln Asp Val Gly Pro Ser Gly Ser Ser

180 185 190

Gly His Ala Asn Gln Ala Asn Gln Gln Gln His Phe His Pro Ala Cys

195 200 205

Asp Pro Ser Met Arg Ile Gly Tyr Gln Arg Asn Phe Leu Asp Gln Leu

210 215 220

Asn Asn Glu

225

<210> 2

<211> 682

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 2

atgggtcgcg gcaaggtgga gctgaagcgg atcgacaaca agagcagccg gcaggtgacg 60

ttcgccaagc gccgcaacgg gctgctcaag aaggcgtacg agctgtcggt gctctgcgac 120

gccgaggtcg cgctcatcat cttctccacc cgcggccgcc tcttcgagtt ctccacatcc 180

tcatgcatgt acaagacact agagcggtac cgcagctgca acttcaactc cgaggcaact 240

gcagctccgg agactgaact aaacaattac caggagtact tgaagctgaa gacaagagtt 300

gagttcctac agacaactca gagaaatctt cttggcgagg acttgggccc acttaacatg 360

aaggaacttg agcagcttga gaaccaaatt gagatatctc tcaaacatat tagggcgaca 420

aagagccaac agtcacttga tcagcttttt gagctcaagc gcaaggaaca acaacttcaa 480

gatgttaata aagacttacg gaagaagata caagaaacta gtgcggaaaa tgtgctgcaa 540

atgtcttgcc aggatgttgg acctagtggg tctagtggcc atgctaatca agctaatcaa 600

cagcagcatt ttcatcctgc ttgtgaccct tccatgcgta tagggtatca acgaaatttc 660

ctggatcaat tgaacaacga at 682

Claims (10)

1.植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.植物产量杂种优势相关基因TaMADS134，其特征在于，编码权利要求1所述的植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134。

3.根据权利要求2所述的植物产量杂种优势相关基因TaMADS134，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述的植物产量杂种优势相关基因TaMADS134的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述的植物产量杂种优势相关基因TaMADS134的重组菌株。

6.权利要求1所述的植物产量杂种优势相关蛋白TaMADS134的应用。

7.权利要求2所述的植物产量杂种优势相关基因TaMADS134的应用。

8.权利要求2所述的植物产量杂种优势相关基因TaMADS134用于提高植物产量的应用。

9.提高植物产量的方法，其特征在于，所述方法包括在植物中过表达权利要求2所述的植物产量杂种优势相关基因TaMADS134的步骤。

10.根据权利要求9所述的提高植物产量的方法，其特征在于，所述植物包括小麦、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿。

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