TWI390036B - 甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子及異源基因表現 - Google Patents

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Description

甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子及異源基因表現
本發明係關於發現鮑魚菇中經分離之甘油醛-3-磷酸去氫酶啟動子以及一構築體，其包含操作性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子之本發明之啟動子。
為加強在微生物之蛋白質生產之經濟效益，對於改善轉錄及轉譯之效率、將所欲產物總蛋白質之產出比例最大化、加強經修飾宿主之存活率以及改善取得經修飾宿主之效率，已經投入大量之研發。在合適之宿主中使用強效啟動子以表現異源基因為生物技術應用中的主要策略。甘油醛-3-磷酸去氫酶(GPD，EC 1.2.1.12)啟動子為可被任何碳源誘發之強效結構性啟動子，且已被廣泛使用於啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )、巴斯得畢赤酵母菌(Pichia pastoris )及其他酵母菌中表現異源蛋白質。
在糖解及糖新生途徑中，GPD為主要酵素之一，在啤酒酵母菌及其他高等真核細胞中，GDP最高為可溶性細胞蛋白質含量的5%。此外，gdp mRNA佔酵母菌中聚(A)+ RNA的2~5%。這些觀察到的現象暗示gpd 基因係為高活性啟動子所調節。事實上，已有報導指出帶有同源gdp 啟動子區域之載體可有效率地主導酵母菌(Bitter及Egan，1998；Doring等人，1998；Eriksson等人，1995；Vassileva等人，2001)及絲狀真菌中異源基因之表現(Juge等人，1998；Punt等人，1987)。然而，用於在子囊菌(ascomycetes) 綱之絲狀真菌中表現的已知表現載體(其含基因調節元素)，無法有效率地在擔子菌(basidiomycetes)綱之絲狀真菌中表現。
gdp 基因亦已從擔子真菌中選殖出，此等真菌包含裂褶菌(Schizophyllum commune )、白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium )、洋菇(Agaricus bisporus )(Harmsen等人，1992)及香菇(Lentinula edodes )(Hirano等人，1999)。在這些菇類中，僅在洋菇、金針菇(Flammulina velutipes )及香菇中成功地以同源gpd啟動子進行基因轉型(Hirano等人，2000；Kuo等人，2004；van de Rhee等人，1996)。雖然異源啟動子已經用於表現抗藥標記基因，以其進行之基因轉型並未成功地表現異源基因(Ruiz-Diez，2002)。為成功且有效地表現異源基因，很重要的一點是宿主細胞自己之轉錄機構要能辨識啟動子序列。Chun-Yi Kuo等人證實濕黴素B磷酸轉移酶(hygromycin B phosphotransferase)基因(hpt)(一種異源基因)可於金針菇中表現(Kuo等人，2004)。然而，亦發現在某些擔子菌中，gpd 基因即使高度類似，其啟動子區域卻顯著不同。
鮑魚菇為熟知之可食菇類。名詞「蠔菇(oyster mushroom)」等同於鮑魚菇(Pleurotus ostreatus )、肺形側耳(Pleutotus pulmonarius ，其常為灰白色並於夏季出現)，以及泡囊側耳(Pleutotus populinus ，其係在白楊樹上發現)。在工業生產菇類之全球市場中，鮑魚菇佔第三位。此外，鮑魚菇生產各種醫用之二次代謝物。
對於藉由改善鮑魚菇中異源基因之表現以增加鮑魚菇的經濟及工業價值仍有開發之必要。
本發明之一目的為提供一啟動子，其包含選自下列所組成之群之聚核苷酸序列：a)包含SEQ ID NO：1或2所示之核酸序列之聚核苷酸序列；及b)a)之聚核苷酸序列片段，該片段可調節操縱性連結之可轉錄聚核苷酸分子之轉錄。
本發明之另一目的為提供一構築體，其包含本發明之啟動子，該啟動子操縱性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子。
本發明之進一步目的為提供一轉型菇類，其包含本發明之構築體。
本發明發現鮑魚菇中兩個經分離之gpd啟動子。這些啟動子可有效地驅動異源基因之表現。這些gpd啟動子的發現，可在菇類中構築異源基因表現之表現系統。
根據本發明，本文中所用之名詞「經分離的」係指經分離之核酸分子其(經由人類操作)存在於其原生環境之外，因此並非天然產物。一經分離之核酸分子可以純化形式存在，或存在於非原生環境，例如基因轉殖之宿主細胞。
本文中所用之名詞「啟動子」係指一聚核苷酸分子，其自然狀態係位於開啟讀碼框(open reading frame，或蛋白質編碼區域)之轉譯起始密碼子之上游或5'端，且其牽涉RNA聚合酶II及其他蛋白質(反式調控轉錄因子)之辨識及結合，以開始進行轉錄。當啟動子操縱性連結至可轉錄聚 核苷酸分子時，啟動子典型地以類似於正常連結於啟動子之聚核苷酸分子之轉錄方式，使此可轉錄聚核苷酸分子進行轉錄。本發明之啟動子可包含已知啟動子經處理後所製造之人工、嵌合或雜交之啟動子。此等啟動子亦可結合來自一或多個啟動子之順式元件(LB-element)，例如，以異源調節單元本身之部分或完整之調節單元加入至活性啟動子。
本文中所用之名詞「操縱性連結」係指兩核酸序列實際上或功能上相關。例如，如果啟動子或調節性DNA序列操縱性連結或處於調節性DNA序列會影響結構性DNA編碼之表現量之情況下，啟動子或調節性DNA序列係為與編碼RNA或蛋白質之DNA序列「相關」。
本文中所用之名詞「可轉錄聚核苷酸分子」係指可轉錄為RNA分子之任何聚核苷酸分子。
本文中所用之名詞「異源核酸序列」係指與所導入之宿主基因體非自然關聯之核酸序列，包含天然存在之核酸序列之非天然存在複數複製體。
本文中所用之名詞「聚核苷酸構築體」係指衍生自任何來源之任何重組聚核苷酸(例如質體、黏質體(cosmid)、病毒、自動複製聚核苷酸分子、噬菌體或線性或環狀單股或雙股DNA或RNA聚核苷酸分子)，能夠進行基因體嵌合或獨立複製，包含由一或多個聚核苷酸分子以功能性操作方式連結成之聚核苷酸分子。名詞「聚核苷酸構築體」及「構築體」在本文中可交換使用。
本文中所用之名詞「經轉型的(transformed)」係指經導入外來聚核苷酸分子(例如構築體)之細胞、組織、器官或生物。較佳地，導入之聚核苷酸分子嵌入受體細胞、組織、器官或生物之基因體DNA，致使導入之聚核苷酸分子傳承至後代。
本發明之一目的為提供經分離之啟動子，其包含選自以下所組成之群之聚核苷酸序列：a)包含SEQ ID NO：1或2所示之核酸序列之聚核苷酸序列，及b)a)之聚核苷酸序列之片段，該片段可調節操縱性連結之可轉錄聚核苷酸分子之轉錄。SEQ ID NO：1及2之序列如下所示：
SEQ ID NO：1 AAATCAATGGCAGCCGTTCTTCAGGTGTCATATCTGGTCAGAGTCTCTTGTGCACTGACCTCCCGATTGGATCTGTGCTGCGACCTCTTCGTTTACCCTCAGATATATTGTCAGGTTGCCTACGATGTGTATCACGATATCTCAGTGGTATGTGGGGGGATATAATCAGTGCGCTAAAAGCGGAATACAGCTCGTCTCCGTCTTCATCTTAGGCCGAAGTTACAAGAAAGGTGACTAAATGCCGGGACATAAGGTATTTCGCATGACGAAACGTCTCCACTCTCAGAGAGTTCGCCCTTTGCAGGATCTGCTCACACAACTGCTGACATTAGCTAGATCTTGAGTGACCTTCAGACGATCGCGGCGGGCGTGGGACTTTCAAGATAACGGCGGCATTGATCATCTAATCACGCCGTCCTATATAAACCCCTGCCTCCTCTTTCACCCGCAATCTCCACTTTCACCACTACCATCCCAGCCCACCCATCCTTTGTAGATATGGTGAGTATACCAATATCTATGTACCATATTACACCTCAACCCGTATTCAGGTCAACGTC
SEQ ID NO：2 AAATCAATGGCAGCCGTCTCAGGTGTCATATCTGGTACGCTGGAGCAGAGTCTCTTGTGCCACTGACCTCCCGATTGGATCTGTGCTGCGACCTCTTCGTTTACCCTCAGATATATTGTCAGGTTGCGTACGATGTGTATCACGATATCTCAGTGGTGTGTGGGGGGATATAATCAGTGCGCTAAAAGCGGAATACAGCTCGTCTCCGTCTTCATCTCAGGCCGAAGTTACAAGAAAGGTGACTAAATGCCGGGACATAAGGTATTTCGCATGACGAAACGTCTCCACTCTCAGAGGATCTGCTCACACAACTGCTGACATTAGCTAGATCTTGAGACTGAGTGACGATCGCGGCGGGCGTGGGACTTTCAAGATACGGCGGCATTGATCATCTAATCACGCCGTCCTATAAAAACCCCTGCCTCCTCTTTCACCCGCAATCTCCACTTTCACCACT ACCATCCAGCCCACCCATCCTTTGTAAATATGGTGAGCCTACGAATATCTATGCACCATATTACACCTCAACCCGTATTCAGGTCAACGTC
根據本發明，本發明之啟動子可以藉由使用一般分子生物技術而取得，例如選殖、PCR增幅及質體構築等。
可以技藝人士所熟知之方法辨識具有類似本發明啟動子活性之啟動子。例如，可以使用細胞或組織構築cDNA庫，並進行篩選以辨識具有類似於本發明之啟動子表現型態之基因。經辨識基因之DNA序列可接著用於分離此基因之啟動子以進行進一步之特徵辨識。另外，轉錄剖析(transcriptional profiling)或電子北方技術(electronic northern technique)亦可用於辨識具有類似於本發明之啟動子表現型態之基因。一旦辨識出該等基因，可分離其啟動子以進行進一步之特徵辨識。電子北方技術係以電腦進行序列分析，其可讓來自多個cDNA庫之序列基於研究者所辨識之參數進行電子化的比較，此等參數包含在多個cDNA庫中富含之EST族群。轉錄剖析為高產出方法，其係用於系統化監測上千個基因之基因表現。此基於DNA晶片之技術係將上千個cDNA序列排列於支持物表面。此等排列物同時與一群由不同細胞或組織型態之DNA樣品製備而來之經標記之cDNA雜交，得以直接分析其表現。此方法可用於分離調節序列，例如與該等基因相關之啟動子。
在另一具體實施例中，本發明所揭示之啟動子可經修飾。技藝人士可以創造聚核苷酸序列上具有變異之啟動子。SEQ ID NO：1及2所示之本發明之啟動子之聚核苷酸序列可經修飾或改變以增強其控制特徵。一種改變聚核苷 酸序列之較佳方法為使用PCR以修飾序列中所選擇之核苷酸或區域。此等方法為技藝人士所熟知。例如，基於PCR之DNA修飾方法中，序列可藉由模板序列之插入、刪除或置換加以修飾。在本發明之內文中，「變異體」為原始啟動子經一或多個核苷酸刪除、增加及/或取代而得之啟動子，較佳為實質上維持啟動子之功能。例如，可從啟動子之5'或3'端刪除一或多個鹼基對，以製造「經修剪」之啟動子。啟動子內部亦可插入、刪除或取代一或多個鹼基對。以啟動子片段而言，變異體啟動子可包含之改變為影響與最小啟動子(minimal promoter)操縱性連結者之轉錄。最小或基本啟動子(minimal or basal promoter)為能夠啟動或結合至基本轉錄機構之聚核苷酸分子。在真核細胞中一個基本轉錄機構之例子為RNA聚合酶II複合體及其輔助蛋白。變異體啟動子可以下列方法製得，例如，標準DNA突變技術，或者以化學合成變異體啟動子或變異體啟動子之一部份。
有許多方法可以用來設計或以工程方式製得新穎之嵌合啟動子。例如，將第一啟動子片段與第二啟動子片段融合可製得嵌合啟動子；所製得之嵌合啟動子可使操縱性連結之可轉錄聚核苷酸分子之表現增加。可以構築啟動子使啟動子片段或元素操縱性連結，例如，將此片段置於最小啟動子之上游。本發明構築嵌合及變異體啟動子之方法包含(但不限於)結合不同啟動子之控制元素或複製啟動子之部份或區域。本發明所屬技術領域中之技藝人士熟悉關於巨分子之構築、操作及分離之標準資源材料(例如，聚核苷 酸分子、質體等)，以及重組生物之產生及聚核苷酸分子之篩選及分離。
根據本發明之一具體實施例，包含SEQ ID NO：1及2所示之聚核苷酸序列之啟動子包含任何長度之聚核苷酸序列，其能夠調節操縱性連結之可轉錄聚核苷酸分子。例如，揭示於SEQ ID NO：1及2之啟動子可經修剪或部分刪除，且仍能夠調節操縱性連結之聚核苷酸分子之轉錄。包含SEQ ID NO：1及2所示之聚核苷酸序列之啟動子之任何片段、部份或區域均可作為調節性聚核苷酸分子。取代、刪除、插入或任何結合可用於製造最終之構築體。
本發明之另一目的為提供包含操縱性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子之本發明啟動子之構築體。較佳地，可轉錄聚核苷酸分子操縱性連結至3'轉錄終止聚核苷酸分子。
本發明之構築體典型地包含操縱性連結至可轉錄聚核苷酸分子之啟動子，此可轉錄聚核苷酸分子操縱性連結至3'轉錄終止聚核苷酸分子。此外，構築體可包含(但不限於)來自鮑魚菇基因之3'-不轉譯區域(3'-UTR)之額外調節性聚核苷酸分子。構築體亦可包含(但不限於)mRNA聚核苷酸分子之5'-不轉譯區域(5'-UTR)，其可在轉錄起始扮演重要角色，且亦能在菇類之表現構築體作為基因組份。此等額外之上游及下游調節性聚核苷酸分子可衍生自原存在於此啟動子構築體之其他元件或異源之來源。
因此，本發明之構築體包含如SEQ ID NO：1或2或如上所述之經修飾啟動子，其係操縱性連結至可轉錄聚核苷酸 分子，以直接轉錄該可轉錄聚核苷酸分子至所欲程度或所欲細胞。
根據本發明，任何適當之異源基因可以用做本發明之之異源可轉錄聚核苷酸分子。例示之用於併入本發明構築體之可轉錄聚核苷酸分子包含(但不限於)編碼a)抗體，包含其他診斷物質；b)二次代謝物，例如凝集素(lectin)；c)治療化合物，例如疫苗及類固醇；d)生物巨分子，例如干擾素、內皮抑制素(endostatin)及胰島素；e)醫用酵素，例如血栓溶解劑及腦苷脂酶；f)對於害蟲、疾病或除草劑提供抗性之基因，例如除蟲化合物蘇力菌(Bacillus thuringiensis)蛋白(Bt毒素)；g)給予或對於有增值特性有所貢獻之基因，例如營養組合物或新陳代謝之修飾。因此，在一個較佳實施例，可調節轉錄之SEQ ID NO：1或2所示之本發明聚核苷酸分子或其片段、變體或衍生物，係操縱性連結至可轉錄聚核苷酸分子，提供可供選擇、篩選或評比之標記。用於實施本發明之標記包含(但不限於)編碼葡萄糖醛酸酶(glucuronidase，GUS)、綠色螢光蛋白(GFP)、螢光酶(LUC)及提供抗生素抗性之蛋白質之可轉錄聚核苷酸分子。
將本發明之構築體導入細胞內，使得可轉錄聚核苷酸分子轉錄為功能性mRNA分子(其經轉譯而表現蛋白質產物)之方法為已知。實施本發明時，用於製備及使用構築體及宿主細胞之習知組合物及方法為技藝中已知。將重組分子導入細胞涉及機械式方法，例如DNA直接攝入、脂質體、 電穿孔(Guerche,P.等人)、顯微注射(Neuhaus,G.等人)，以及使用微撞射(microprojectile)及槍或其他裝置強制塗覆DNA之粒子進入細胞(Klein,T.M.等人)。
本發明之進一步目的為提供包含本發明構築體之轉型菇類。
包含本發明啟動子之轉型構築體可以任何方法導入菇類中。實施本發明時藉由導入菇類表現構築體至菇類基因體之菇類轉型方法及物質可包含任何熟知及證實之方法，包含電穿孔、農桿菌(Agrobacterium )媒介之轉型及原生質體轉型。較佳地，此菇類係選自下列組成之群：類火菇屬(Flammunila )、傘菌屬(Agaricus )、側耳屬(Pleurotus )及香菇屬(Lentinula )。更佳地，此菇類係選自下列組成之群：鮑魚菇、肺形側耳及泡囊側耳。最佳地，此菇類為鮑魚菇。
以下包含之實施例為說明本發明之較佳具體實施例。本發明技術領域之技藝人士應瞭解以下實施例所揭露之技術代表發明人於實施本發明時所發現成功作用之技術。然而，技藝人士鑒於本說明書之揭露應瞭解，在所揭露之特定實施例中可以做許多改變而仍然獲得類似結果，並且不偏離本發明之精神及範圍。因此，應理解說明書所附圖式所記載或顯示之所有事項為例示而非限制用。
實施例 實施例1 選殖甘油醛-3-磷酸去氫酶之啟動子及基因品種及培養基
從生物資源保存及研究中心(台灣新竹)購得鮑魚菇BCRC 36249，並於25℃下種於PDA(馬鈴薯葡萄糖培養基，Difco,Detroit,MI,USA)或PDB(馬鈴薯葡萄糖汁，Difco)中。從含有30 g/ml濕黴素(hygromycin,A.G.Scientific,Inc.,San Diego,CA,USA)之PDA中選出轉型株。使用DH5大腸桿菌株(GIBCOBRL,Life Technologies,Grand Island,NY,USA)於DNA操作並讓其於37℃下生長於LB培養基(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO,USA)。純化PCR增幅之DNA片段，然後選殖至pGEM-T Easy載體(Promega,Madison,WI,USA)並定序。
gpd 基因之選殖
根據公開之擔子菌類gpd 基因(GenBank accession nos.AF515622,BAA83550 ,AAA33926 ,AAA33732 ,AAA32634 ,AAA32633 )之保守胺基酸序列設計兩個簡併引子：5'GKATCGGMCGYMYYGTMYYCMGHAATGC 3'對應於RIGRIVLRNA，及5' ARGCARTTGGTHGTGCAHGAAGCRTTYG 3'對應於SNASCTTNCL。使用這些簡併引子及鮑魚菇基因體DNA作為模板，經由PCR增幅選殖出鮑魚菇部分gpd (見圖1)。
以「快速基因體步行(Rapid Genome Walking)」(Kilstrup and Kristiansen,2000)及SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(BD Bioscience,Paolo Alto,CA,USA)選殖5'-側邊區域(5'-flanking region)及鮑魚菇gpd 之cDNA。基於此部分鮑魚菇gpd 序列設計基因特異性引子(GSP)。使用根據公開之擔子菌類gpd 基因保守胺基酸序列設計之簡併引子，從鮑魚 菇基因體DNA模板以PCR增幅出約0.6kb大小之片段。藉由使用GSP及快速基因體步行獲得兩個大小約1.0kb之PCR產物。序列間之差異顯示鮑魚菇之基因體中有至少兩套gpd (見圖2)。定序後，一套gpd 具有994對鹼基對(命名為PO1)，另一個則有1024對鹼基對(命名為PO2)。以排列cDNA及基因體步行產物之序列獲得這兩種鮑魚菇gpd 基因之5'-側邊區域。
實施例2 本發明之啟動子及異源聚核苷酸之構築以及構築體之轉型
質體構築
從pCAMBIA 1300(CAMBIA,Canberra,Australia)增幅具有花菜鑲嵌病毒(CaMV)35S終結子之濕黴素B磷酸轉移酶(htp )基因，然後將此增幅片段選殖入pGEM-T Easy載體，且將鮑魚菇gpd 基因的兩個0.6kb啟動子區導入以驅動hpt 基因表現。將兩個產生之質體pPOH1及pPOH2用於轉型實驗。
至於表現報告基因egfp 之表現，以質體pPOH1及pPOH2作為骨架；egfp 取代hpt 以構築pPOH1及pPOH2。所使用引子之細節於下方表1說明。從pHygEGFP(BD Bioscience,Palo Alto,CA,USA)增幅egfp 。產生之質體(圖3)用於所有研究報告之轉型實驗。
轉型步驟
基於先前研究(Kuo等人，2004)所報告之技術經修飾進行鮑魚菇轉型。從鮑魚菇子實體收集擔孢子，將之懸浮於PDB，然後於25℃和緩搖盪下過夜培養。以2000 g離心5分鐘獲取這些發芽之擔孢子，再懸浮於含有3 mg/ml溶解酶(Sigma)之P緩衝液(0.02 M磷酸緩衝液，pH 5.8，0.6 M甘露醇)。培養2小時後，這些孢子在無酵素下清洗，轉移至小量電穿孔緩衝液(1 mM HEPES，pH 7.5，0.6 M甘露醇)。擔孢子(107 -108 )與10 μg質體DNA混合，於冰上冷置10分鐘，進行電穿孔。使用0.2 cm透光槽以BTX ECM 630(BTX,San Diego,CA,USA)、25 μF電脈衝傳輸設定之電容、100 Ω之電阻及12.5 kv/cm設定之電場強度進行電穿孔。從含有30 μg/ml濕黴素之PDA培養皿挑選轉型株。
以pPOH1或pPOH2轉型之擔孢子可於含有30 μg/ml濕黴素之PDA形成菌落，表示兩種啟動子均可驅動下游基因表現。轉型效率級數(order)為每μg DNA 5至20個轉型株，而 在無添加質體DNA之對照實驗並無觀察到濕黴素抗性菌落。就吾人所能測定，轉型株及野生株間並未存在顯著生長速率及型態上之差異。此為第一個不需使用繁雜原生質體製備的鮑魚菇轉型方法。
無篩選壓力之培養基上之繼代培養轉型株於後續之濕黴素抗性測試顯示在五個月的有絲細胞分裂期間，其仍保有穩定之濕黴素抗性特徵。這兩個持續驅動濕黴菌抗性特徵之鮑魚菇gpd 啟動子顯示下游基因表現之可能性。以PCR增幅確認經由轉型導入之hpt DNA之存在，在50個抗生素抗性的培養物中並無偵測到偽陽性。
於轉型株中偵測EGFP
以裝配Nikon B-2A濾鏡(450-490 nm激發濾鏡；505 nm雙色濾鏡；520 nm阻隔濾鏡)之螢光顯微鏡(E600,Nikon,Tokyo,Japan)篩選EGFP轉型株。
西方雜合法
於EGFP之西方雜合分析，將轉型株及野生株於PDB中培養7天，收集菌絲並接著以研缽及杵於液態氮中研磨。將總量為50 mg的菌絲粉末與1 ml蛋白質萃取緩衝液(50 mM磷酸鈉，pH=7.4，1 mM PMSF，0.1% X-100，0.5M NaCl)混合，並於冰上冷卻5分鐘。以13,000g離心20分鐘後，收集之上清液為全部細胞蛋白質。樣品以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)分離，使用半乾式轉漬系統(Genmedika,Taipei,Taiwan)轉移至PVDF定序膜(Millipore,Bedford,MA,USA)。使用(1：8,000)抗GFP活色 肽單株抗體(BD Bioscience)及BCIP/NBT西方雜合偵測套組(PerkinElmer,Boston,MA,USA)，以製造商所述之步驟進行EGFP偵測。
以ELISA定量EDFP
以100 μl之各蛋白質萃取物進行EGFP之三明治ELISA。樣品於塗覆EGFP單株抗體(Abcam,Cambridge,UK)之ELISA盤(PerkinElmer,Boston,MA)上留置1小時(每一盤上各均為三重複)，兔子抗-GFP多株抗體(Abcam,Cambridge,UK)以1：10,000稀釋加入每一孔中，於4℃留置1小時。接合HRP酵素之抗兔子IgG山羊抗體(PerkinElmer,Boston,MA)以1：5,000稀釋加入每一孔中，於4℃留置1小時。每一孔加入100 μl HRP受質(BioFX,MD)。5分鐘後加入50 μl 1.0 M H2 SO4 停止反應。以96孔盤讀取儀(VERSAmax,Sunnyvale,CA)側量每一孔之450 nm吸光度。以二金雞鈉酸(bicinchoninic acid)檢測(Pierce,Dallas,TX)測定蛋白質濃度。以pET21a(+)於E.coli 表現之EGFP作為標準物。以標準物平均值計算標準曲線，並用以估算EGFP在萃取樣品中之量。從ELISA方法所得之EGFP估算值以每公克可溶性蛋白質含有之EGFP毫克表示。
已報導egfp在一些擔孢子表現時存在插入序列(Burns等人，2005；Lugones等人，1999；Ma等人，2001)。因而在此將具有gpd 基因第一個插入序列之啟動子區域用來測試其作為驅動egfp 之可能工具。約80%以第一插入序列製得之鮑魚菇轉型株呈現綠色螢光。在無任何選擇壓力下數代 的繼代培養後，egfp 之表現仍能維持穩定。相反地，在無第一插入序列所製備之構築體並未觀察到有表現(未顯示數據)。此等結果顯示在鮑魚菇內表現egfp 需要5'插入序列之存在。
egfp之表現亦經西方雜合法確認，如圖4所示。以抗GFP單株抗體進行之免疫轉漬法偵測到存在於陽性對照組中的27 kDa多肽(第1行)，此多肽亦存在於衍生自轉型株之總細胞蛋白質(第3至9行)，而在未轉型株並未偵測到任何訊號(第2行)。
萃取樣品中EGFP之平均量範圍為每公克可溶性蛋白質(從不同轉型株而來)0.4至5 mg。在具有最高EGFP表現量之轉型株中，總可溶性蛋白質中EGFP之百分比為5.4×10-3 (0.5%)。
參考文獻
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圖1顯示鮑魚菇之部分gpd 序列。
圖2顯示鮑魚菇基因體中2套gpd 之序列。
圖3顯示質體pPOH1及pPOH2之限制圖譜。
圖4顯示egfp 表現之西方墨點圖。

Claims (16)

  1. 一種經分離之啟動子，其包含選自由下列所組成之群之聚核苷酸序列：a)包含SEQ ID NO：1或2所示核酸序列之核苷酸序列；及b)a)之聚核苷酸序列之片段，其可調節操縱性連結可轉錄聚核苷酸分子之轉錄。
  2. 一種構築體，其包含如請求項1之啟動子，該啟動子操縱性連結至異源可轉錄聚核苷酸分子。
  3. 如請求項2之構築體，其中該可轉錄聚核苷酸分子操縱性連結至3'轉錄終止聚核苷酸分子。
  4. 如請求項2之構築體，其中該可轉錄聚核苷酸分子為編碼抗體、二次代謝物、治療化合物、生物巨分子、醫用酵素之基因；對於害蟲、疾病或除草劑提供抗性之基因；或給予或對於增值特性有所貢獻之基因。
  5. 如請求項4之構築體，其中該二次代謝物為凝集素(lectin)，該治療化合物為疫苗，該生物巨分子為干擾素、內皮抑制素(endostatin)或胰島素，該醫用酵素為血栓溶解劑或腦苷脂酶，且該對於害蟲、疾病或除草劑提供抗性之基因為除蟲化合物蘇力菌(Bacillus thuringiensis)蛋白(Bt毒素)。
  6. 如請求項2之構築體，其中該可轉錄聚核苷酸分子為標記基因。
  7. 如請求項2之構築體，其中該可轉錄聚核苷酸分子為綠色螢光基因。
  8. 一種轉型細胞，其包含如請求項2之構築體。
  9. 一種轉型菇類，其包含如請求項2之構築體。
  10. 如請求項9之轉型菇類，其中該菇類係選自由下列所組成之群：類火菇屬(Flammunila )、傘菌屬(Agaricus )、側耳屬(Pleurotus )及香菇屬(Lentinula )。
  11. 如請求項9之轉型菇類，其中該菇類係選自由下列所組成之群：鮑魚菇(Pleurotus ostreatus )、肺形側耳(Pleutotus pulmonarius )及泡囊側耳(Pleutotus populinus )。
  12. 如請求項9之轉型菇類，其中該菇類為鮑魚菇。
  13. 一種在菇類細胞中主導表現可轉錄聚核苷酸序列之方法，其包含將如請求項1之啟動子操縱性連結至該聚核苷酸序列，及以該操縱性連結至該聚核苷酸序列之啟動子轉型菇類細胞。
  14. 如請求項13之方法，其中該菇類係選自由下列所組成之群：類火菇屬、傘菌屬、側耳屬及香菇屬。
  15. 如請求項13之方法，其中該菇類係選自由下列所組成之群：鮑魚菇、肺形側耳及泡囊側耳。
  16. 如請求項13之方法，其中該菇類為鮑魚菇。
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