KR20080083145A - 구성적 식물 프로모터 - Google Patents

Abstract

생물적 및/또는 비생물적 스트레스 조건하에서 구성적이고 강한 상태로 유지되며, 본원에서 AA6 프로모터로 언급되는, 강한 구성적 식물 프로모터를 제공한다. 또한, AA6 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 세포 및 유기체, 특히, 식물 및 식물들, 및 AA6 프로모터를 사용하여 세포 및 유기체에서 핵산 서열을 발현시키는 방법을 제공한다.

Description

구성적 식물 프로모터{CONSTITUTIVE PLANT PROMOTERS}

본 발명은 강한 구성적 식물 프로모터 부류 및 그의 용도에 관한 것이다. 프로모터는 식물 또는 식물 세포에서 상동성 또는 이종성 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있거나, 예로서, 센스 및/또는 안티-센스 RNA와 같은 활성 핵산 분자의 발현을 위해 사용될 수 있다. 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열 뿐만 아니라, 이들을 포함하는 키메라 유전자, 벡터, 및 재조합(트랜스제닉) 세포 및 유기체도 제공한다. 또한, 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 세포 및 유기체, 특히, 식물 및 식물 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 추가로, 시토졸 시스테인 신타아제 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.

트랜스제닉 식물 또는 식물 세포에서 단백질 또는 펩티드를 발현시키는데, 또는 유전자 또는 유전자 계열을 침묵화시키는데 유용한 도구인, 식물 프로모터 다수가 당업계에 공지되어 있다. 이는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 발생학적으로 조절되는 프로모터, 조직 선택성 또는 조직 특이성 프로모터를 포함한다. 통상 사용되는 구성적 프로모터의 예로는 하기를 포함한다: 단리물 CM 1841(문헌 [Gardner et al., 1981, Nucleic Acids Research 9, 2871-2887]), CabbB-S(문헌 [Franck et al, 1980, Cell 21, 285-294]) 및 CabbB-JI(문헌 [Hull and Howell, 1987, Virology 86, 482-493])의 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV: cauliflower mosaic virus)의 35S 프로모터 또는 증진된 35S 프로모터("35S 프로모터"); 문헌 [Odell et al 1985, Nature 313, 810-812] 또는 US5164316에 기재된 35S 프로모터, 유비퀴틴 계열로부터의 프로모터(예를 들면, 문헌 [Christensen et al, 1992, Plant Mol. Biol. 18, 675-689], EP 0 342 926의 옥수수 유비퀴틴 프로모터(또한 (문헌 [Cornejo et al. 1993, Plant Mol. Biol. 23, 567-581]도 참조할 수 있다)), gos2 프로모터(문헌 [de Pater et al, 1992 Plant J. 2, 837-844]), emu 프로모터(문헌 [Last et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 81,581-588]), 아라비돕시스(Arabidopsis) 액틴 프로모터, 예로서, 문헌 [An et al. 1996, Plant J. 10, 107-121]에 기재된 프로모터, 벼 액틴 프로모터, 예로서, 문헌 [Zhang et al. 1991, The Plant Cell 3, 1155-1165]에 기재된 프로모터, 및 US 5,641,876에 기재된 프로모터, 또는 WO 00/70067에 기재된 벼 액틴 2 프로모터; 카사바 베인 모자이크 바이러스(Cassava vein mosaic virus)의 프로모터(WO 97/48819, 문헌 [Verdaguer et al. 1998, Plant Mol. Biol. 37, 1055-1067]), 지하 토끼풀 스턴트 바이러스(Subterranean Clover Stunt Virus)로부터의 pPLEX 시리즈 프로모터(WO 96/06932, 특히, S7 프로모터), 알코올 탈수소효소 프로모터, 예를 들면, pAdh1S(진뱅크 수탁 번호(GenBank accession numbers) X04049, X00581), US 6 051 753 및 EP 426 641에 기재된 피그워트 모자이크 바이러스(Figwort Mosaic Virus) 프로모터, 히스톤 유전자 프로모터, 예로서, 아라비돕시스로부터의 Ph4a748 프로모터(문헌 [Plant Mol. Biol. 8: 179-191]), CoYMV(코멜리나 황색 반점 바이러 스(Commelina Yellow Mottle Virus)) 프로모터(문헌 [Medberry et al. 1992, The Plant Cell 4:185-192]), 또는 기타.

그러나, 공지된 구성적 프로모터들의 한가지 공통된 단점은 그들이 빈번하게도 여전히 활성에 변이를 나타낸다는 점이며, 예를 들면, 기관- 또는 발생학적으로 조절되는 발현에서 변이를 나타내거나, 발현에서 스트레스 유도성 변경을 나타낸다는 점이다. 본 발명자들은 트랜스제닉 식물에서 CaMV 35S 프로모터의 활성은 비생물적 스트레스, 특히, 트랜스제닉 식물이 스페인 야외에서 재배되었을 때 유발되는 열 스트레스에 감수성이었다는 것을 발견하게 되었다. 그러므로, 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 비감수성인 신규한 구성적 프로모터를 제공할 필요가 있다. 추가로, 트랜스제닉 식물 생성에서 식물로부터 유래된 프로모터를 사용한다는 것은 규제 관점에서 볼 때 바람직할 수 있다.

추가로, 숙주 식물 종의 형질전환을 위해서는 식물을 감염시킬 수 있는 바이러스로부터 유래된 바이러스 프로모터가 덜 바람직한데, 이는 바이러스로 식물을 감염시키는 것이 트랜스제닉 프로모터를 침묵화시킬 수 있기 때문이다(문헌 [Seemanpillai et al., 2003, Mol Plant Microbe Interact. 16(5): 429-38]; [Al-KafFef al, 2000, Nat Biotechnol. 18: 995-9]). 수개의 동일한 프로모토를 사용하는 것은 침묵화를 일으킬 수 있기 때문에 상이한 구성적 프로모터는 또한 유전자 적층 접근법에 필요하다(문헌 [Yang et al., 2005, Plant Mol Biol. 58: 351-66]).

본 발명의 요약

키메라 유전자가 상동성 또는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 구성적 프로모터를 포함하고, 여기서, 상기 프로모터가

(a) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 6-9중 임의 하나의 핵산 서열, 또는 둘 모두 CBS에 기탁된 벡터 pKG8135 또는 pKG8137 내로 클로닝된 프로모터 서열(각각 수탁 번호 CBS 120175 및 CBS 120176하에 2006년 8월 3일자로 네덜란드 CT 우트레흐트 3584 웁살라란 8에 소재하는 네덜란드 미생물 균주 보존 센터(Centraalbureau voor Schimmelcultures)에 기탁됨);

(b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2, 또는 (a)하에 언급된 서열중 임의의 것의 기능성 단편;

(c) 서열 번호 1 또는 2, 또는 (a)하에 언급된 서열중 임의의 것과 70% 이상의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열;

(d) (c)의 핵산 서열의 기능성 단편의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 그의 게놈내 통합된 키메라 유전자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포 또는 식물 조직 또는 기관을 제공한다.

(a) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2, 또는 서열 번호 6-9중 어느 하나의 핵산 서열, 또는 둘 모두 CBS에 기탁된 벡터 pKG8135 또는 pKG8137 내로 클로닝된 프로모터 서열(각각 수탁 번호 CBS 120175 및 CBS 120176하에 2006년 8월 3일자로 네덜란드 CT 우트레흐트 3584 웁살라란 8에 소재하는 네덜란드 미생물 균주 보존 센터에 기탁됨);

(b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2, 또는 (a)하에 언급된 서열중 임의의 것의 단편;

(c) 서열 번호 1 또는 2, 또는 (a)하에 언급된 서열중 임의의 것과 70% 이상의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열;

(d) (c)의 핵산 서열의 단편으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 식물 세포 내로 도입되었을 때 프로모터 활성을 갖는 단리된 핵산 서열 또한 제공한다.

상기 서열을 포함하는 벡터, 키메라 유전자 및 숙주 세포 또한 본 발명의 실시태양이다.

또다른 실시태양은 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포 또는 식물 조직 또는 기관에서 센스 및/또는 안티센스 핵산 서열의 구성적 발현을 위한 시토졸 식물 시스테인 신타아제 유전자의 프로모터의 용도이다.

추가로,

(a) 전사시키고자 하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고, 임의로 추가로 3'UTR 핵산 서열에 연결된, 상기 기술된 바와 같은 프로모터를 포함하는 키메라 유전자, 또는 상기 키메라 유전자를 포함하는 벡터를 생성하는 단계;

(b) 상기 키메라 유전자 또는 벡터로 식물 또는 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및

임의로, (c) 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 재생시키는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

추가의 또다른 실시태양에서, 서열 번호 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

일반 정의

용어 "핵산 서열"(또는 핵산 분자)은 싱글 또는 더블 스트랜드 형태의 DNA 또는 RNA 분자, 특히, 본 발명에 따른 프로모터 활성을 갖는 DNA, 또는 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 DNA를 지칭한다. "단리된 핵산 서열"은 그가 단리된 천연 환경상에는 더 이상 존재하지 않는 핵산 서열로서, 예를 들면, 세균 숙주 세포중 또는 식물 핵 또는 색소체 게놈중의 핵산 서열을 지칭한다.

용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용되며, 이는 특정 작용 방식, 크기, 3차 구조 또는 기원과는 상관없이 아미노산 쇄로 구성된 분자를 지칭한다. 따라서, 단백질의 "단편" 또는 "일부"도 "단백질"로서 지칭될 수 있다. "단리된 단백질"은 그의 천연 환경에는 더 이상 존재하지 않는, 예를 들어, 시험관내 또는 재조합 세균 또는 식물 숙주 세포중의 단백질을 지칭하기 위하여 사용된다.

용어 "유전자"는 부위(전사되는 부위)를 포함하는 DNA 서열로서, 이는 세포내에서 적합한 전사 조절 부위(예를 들면, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 RNA 분자(예를 들면, mRNA)로 전사되는 DNA 서열을 의미한다. 따라서, 유전자는 수개의 작동가능하게 연결된 서열, 예로서, 프로모터, 예를 들면, 번역 개시에 관여하는 서열을 포함하는 5' 비-번역 리더 서열(5'UTR로도 지칭되며, 이는 번역 개시 코돈 상류의 전사된 mRNA 서열에 상응한다), (단백질) 코딩 부위(cDNA 또는 게놈 DNA) 및 예를 들면, 전사 종결 부위 및 폴리아데닐화 부위(예로서, AAUAAA 또는 그의 변이체)를 포함하는 3' 비-번역 서열(3' 비번역 부위, 또는 3'UTR로도 지칭된다)을 포함할 수 있다.

"키메라 유전자"(또는 재조합 유전자)는 보통 실제로는 하나의 종에서는 발견되지 않는 임의의 유전자, 특히, 실제로는 서로 관련이 없는 하나 이상의 핵산 서열 일부가 존재하는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 실제로는 전사 부위중 일부와 또는 그 모두와 관련이 없거나, 또다른 조절 부위와 관련이 없다. 용어 "키메라 유전자"는 프로모터 또는 전사 조절 서열이 하나 이상의 센스 서열(예를 들면, 코딩 서열)에, 또는 안티센스(센스 스트랜드의 역 보체) 또는 역위 반복 서열(센스 및 안티센스, 이로써, RNA 전사체는 전사시에 더블 스트랜드 RNA를 형성한다)에 작동가능하게 연결된, 발현 작제물을 포함하는 것으로 이해된다.

"3'UTR" 또는 "3' 비-번역 서열"(3' 비번역 부위, 또는 3' 말단으로도 종종 지칭된다)은 유전자의 코딩 서열 하류에서 발견되는 핵산 서열로, 이는 예를 들어, 전사 종결 부위 및 (대부분은 그러하지만, 모든 진핵 mRNAs에서 다 그러한 것은 아닌) 폴리아데닐화 신호(예로서, 예를 들면, AAUAAA 또는 그의 변이체)를 포함하는 핵산 서열을 지칭한다. 전사 종결 후, mRNA 전사체는 폴리아데닐화 신호의 하류에서 절단될 수 있고, 폴리(A) 테일이 첨가될 수 있는데, 이는 mRNA를 세포질(여기에서 번역이 일어난다)로 수송하는데 관여한다.

"유전자 발현"은, 적절한 조절 부위, 특히, 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 부위가 생물학적으로 활성인, 즉, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 펩티드(또는 활성인 펩티드 단편)로 번역될 수 있는 RNA로 전사되거나, 그 자체가 활성인(예를 들면, 전사 후 유전자 침묵화에서 또는 RNAi) RNA로 전사되는 과정을 지칭한다. 특정 실시태양에서, 활성인 단백질은 존재하는 억제 도메인에 기인하여 우성-음성 기능을 갖는 단백질을 지칭한다. 코딩 서열은 바람직하게 센스-배향이고, 이는 원하는, 생물학적으로 활성인 단백질 또는 펩티드, 또는 활성인 펩티드 단편을 코딩한다. 유전자 침묵화 접근법에서, DNA 서열은 안티센스로 또는 센스 및 안티센스 배향으로 짧은 표적 유전자 서열을 포함하며, 안티센스 DNA 또는 역위 반복 DNA 형태로 존재하는 것이 바람직하다. "이소성 발현"이란 보통은 유전자가 발현되지 않는 조직내 발현을 지칭한다.

본원에서 "전사 조절 서열"은 상기 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 속도를 조절할 수 있는 핵산 서열로서 정의된다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같이 전사 조절 서열은 전사 개시에 필요한 서열 요소(프로모터 요소), 예를 들면, 감쇠 인자 또는 인핸서 뿐만 아니라, 침묵 인자를 비롯한, 전사를 유지 및 조절하는데 필요한 서열 요소 모두를 포함할 것이다. 대개는 코딩 서열의 상류(5') 전사 조절 서열이 언급되지만, 코딩 서열의 하류(3')에서 발견되는 조절 서열 또한 이러한 정의에 포함된다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "프로모터"는 유전자의 전사 개시 부위의 전사 방향과 관련하여 상류(5')에 위치하고(전사 개시점을 서열의 위치 +1로 지칭하고, 그와 관련하여 상류에 있는 임의의 뉴클레오티드는 음수를 사용하여 지칭한다), DNA-의존 RNA 중합효소에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위, 및 전사 인자 결합 부위, 억제 인자 및 활성 인자 단백질 결합 부위, 및 프로모터로부터 전사량을 직접 또는 간접적으로 조절하는 작용을 하는 것으로 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 다른 DNA 도메인(시스 작용 서열)의 존재에 의해 구조적으로 동정되는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 갖는 핵산 단편을 지칭한다. 전사 개시점(+1) 상류에 있는 진핵생물의 시스 작용 서열의 일례로는 TATA 박스(통상 전사 개시점의 대략 -20 내지 -30 위치에 존재), CAAT 박스(통상 전사 개시점과 비교하여 대략 -75 위치에 존재), 5'인핸서 또는 침묵 인자 요소 등을 포함한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발생학적 조건하의 대부분의 조직(또는 기관)에서 활성인 프로모터이다. 더욱 바람직하게, 구성적 프로모터는 모든 주요 기관, 예로서, 적어도 잎, 줄기, 뿌리, 종자, 열매, 및 꽃에서 본질적으로 모든 생리학적 및 발생학적 조건하에 활성이다. 가장 바람직하게, 프로모터는 대부분 (바람직하게 모든) 생리학적 및 발생학적 조건하의 모든 기관에서 활성이다.

"유도성" 프로모터는 생리학적으로 (예를 들면, 특정 화합물의 외적 적용에 의해), 또는 발생학적으로 조절되는 프로모터이다. "조직 특이성" 프로모터는 오직 특정 유형의 조직 또는 세포에서만 활성이다. 그러므로, 프로모터 활성이란, 프로모터가 프로모터 하류(3')에 작동가능하게 연결된 핵산 서열이 전사할 수 있게 하는 환경을 지칭함으로써 기술될 수 있다. 그러므로, 식물 또는 식물 세포에서 "구성적 활성을 갖는 프로모터" 또는 "구성적"인 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발생학적 조건하에 식물에서 또는 대부분의 조직(또는 기관)중 식물 세포에서 전사할 수 있게 하는 핵산 서열을 지칭한다. "하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 비감수성"이거나, 그의 활성이 "하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 노출되었을 때 감소되는 것이 아닌" 프로모터는 정상적인 생리학적 및 발생학적 조건하에 프로모터 활성을 갖고, 이로써, 상기 프로모터를 포함하는 유기체(예를 들면, 식물), 또는 세포 또는 조직 또는 기관에 생물적 및/또는 비생물적 스트레스가 가해질 때에도 활성이 양적으로 전혀 감소되지 않거나, 적어도 유의적으로 감소되지 않는 것인, 핵산 서열을 지칭한다.

"스트레스"는 식물 또는 식물 세포에 작용하여 식물에는 치명적이지는 않지만, 식물의 수율 손실 및/또는 질적 손실을 일으킬 수 있는, 물리적, 화학적 또는 생물학적 기원의 조건 또는 압력을 지칭한다.

본원에서 "비-스트레스 조건"은 본 조건하에 생리학적 및 발생학적 상태가 정상적이거나 최적인 조건을 지칭한다.

"생물적 스트레스"는 생물적(생) 물질, 예로서, 진균, 바이러스, 마이코플라스마-유사 미생물, 곤충, 세균, 선충류 등(즉, 특히, 식물 페스트 및 병원체)에 의해 유발된 스트레스를 지칭한다.

"비생물적 스트레스"는 비생물적(비-생) 물질, 예로서, 온도 스트레스(저온/냉동, 열), 염도(염), 바람, 금속, 일-주기(광주기), 수분-스트레스(예로서, 너무 적거나 너무 많은 수분 이용가능성, 즉, 가뭄, 탈수, 침수 등), 손상, 방사선 등에 의해 유발된 스트레스를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 기능적 관계에 있어서 폴리뉴클레오티드 요소의 결합에 관한 것이다. 핵산이 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때에 상기 핵산은 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 프로모터, 또는 전사 조절 서열이 코딩 서열의 전사에 영향을 준다면 이는 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결되었다는 것은 연결된 DNA 서열이 전형적으로는 인접성이고, 2개의 단백질 코딩 부위를 연결시키는 것이 필요할 경우, 연결된 DNA 서열은 "키메라 단백질"을 생산하도록 하기 위해 인접성이고 리딩 프레임내 존재한다는 것을 의미한다. "키메라 단백질" 또는 "하이브리드 단백질"은, 자연 상태에서는 그 자체로서 발견되지는 않지만, 연결됨으로써 기능성 단백질을 형성하고, 연결된 도메인(예를 들어, DNA 결합 도메인 또는 우성 음성 기능을 초래하는 억제 기능 도메인)의 관능성을 나타내는, 다양한 단백질 "도메인"(또는 모티프)으로 구성된 단백질이다. 키메라 단백질은 또한 자연 상태에서 발생하는 2개 이상의 단백질의 융합 단백질일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "도메인"은 적어도 상기 도메인의 기능적 특징을 갖는 새로운 하이브리드 단백질을 제공하기 위하여 또다른 단백질로 전달될 수 있는, 특이적인 구조 또는 기능을 갖는 단백질의 임의의 일부분(들) 또는 도메인(들)을 의미한다.

용어 "표적 펩티드"는 단백질을 세포내 소기관, 예로서, 색소체, 바람직하게, 엽록체, 미토콘드리아에 표적시키거나, 세포외 공간에 표적시키는(분비 신호 펩티드) 아미노산 서열을 지칭한다. 표적 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 단백질의 아미노 말단 단부(N-말단 단부)를 코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있다(프레임내 존재할 수 있다).

본원에서 "핵산 작제물" 또는 "벡터"는 재조합 DNA 기술을 사용함으로써 얻어지는 것으로서, 외인성 DNA를 숙주 세포 내로 전달하기 위하여 사용되는 인공 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 벡터 백본은 당업계에 공지되어 있고, 본원 어디에나 기술되어 있는 것과 같은, 예를 들면, 이진 또는 슈퍼이진 벡터(예를 들면, US 5,591,616, US2002138879 및 WO 95/06722를 참조할 수 있다), 통합체 벡터 또는 T-DNA 벡터일 수 있는데, 상기 벡터로 키메라 유전자가 통합되거나, 적합한 전사 조절 서열/프로모터가 이미 존재하는 경우에는, 오직 원하는 핵산 서열(예를 들면, 코딩 서열, 안티센스 또는 역위 반복 서열)만이 전사 조절 서열/프로모터 하류에 통합된다. 벡터는 일반적으로 분자 클로닝에서 그의 사용을 촉진시키기 위하여 추가의 유전자 요소, 예로서, 선별가능한 마커, 다중 클로닝 부위 등(하기를 참조할 수 있다)을 포함한다.

"숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포" 또는 "형질전환된 세포"는, 1종 이상의 핵산 분자를 세포에 도입시킨 결과 생성된 것으로서, 특히, 전사시에 표적 유전자/유전자 계열을 침묵화시키기 위한 안티센스 RNA 또는 역위 반복 RNA(또는 헤어핀 RNA)를 생성하는, 원하는 단백질 또는 핵산 서열을 코딩하는 키메라 유전자를 포함하는, 새로운 개체 세포(또는 유기체)를 지칭하는 용어이다. 숙주 세포는 바람직하게, 식물 세포이지만, 세균 세포, 진균 세포(효소 세포 포함) 등일 수도 있다. 숙주 세포는 염색체외(에피좀) 복제 분자로서 핵산 작제물을 함유할 수 있거나, 더욱 바람직하게, 숙주 세포의 핵 또는 색소체 게놈내 통합된 키메라 유전자를 포함한다.

용어 "선별가능한 마커"는 당업계의 숙련가에게 익숙한 용어이며, 본원에서는 발현될 경우 선별가능한 마커를 함유하는 세포 또는 세포들을 선별하기 위하여 사용될 수 있는 임의의 유전자 실체를 기술하기 위하여 사용된다. 선별가능한 마커 유전자 산물은 예를 들어, 항생제 내성, 또는 더욱 바람직하게, 제초제 내성 또는 기타 선별가능한 형질, 예로서, 표현형 형질(예를 들면, 색소침착 변화) 또는 영양 요구량을 부여한다. 용어 "리포터"는 주로 가시적 마커, 예로서, 녹색 형광 단백질(GFP: green fluorescent protein), eGFP, 루시퍼라제, GUS 등을 지칭하기 위하여 사용된다.

본원에서 유전자 또는 단백질의 "동등체(ortholog)"라는 용어는 또다른 종에서 발견되는 상동성 유전자 또는 단백질로서, 상기 유전자 또는 단백질과 동일한 기능을 갖지만, (일반적으로는) 상기 유전자를 포함하는 종이 분기되는 시점부터 서열이 분기된(즉, 유전자는 종분화에 의해 공통 조상으로부터 진화하였다), 상동성 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 따라서, 하나의 식물 종으로부터의 유전자 동등체는 서열 비교(예를 들면, 전체 서열에 상의 또는 특정 도메인 상의 서열 동일성(%)에 기초) 및 기능 분석, 이 둘 모두에 기초하여 다른 식물 종에서 동정될 수 있다.

"상동성" 및 "이종성"이라는 용어는 핵산 또는 아미노산 서열과 그의 숙주 세포 또는 유기체, 특히, 트랜스제닉 유기체와 관련하여, 그들 간의 관계를 지칭한다. 따라서, 상동성 서열은 자연적으로 숙주 종에서 발견되지만(예를 들면, 토마토 유전자로 형질전환된 토마토 식물), 이종성 서열은 자연적으로 숙주 세포에서 발견되지 않는다(예를 들면, 감자 식물로부터의 서열로 형질전환된 토마토 식물). 문맥에 따라, 용어 "상동체" 또는 "상동성"은 대안적으로 공통 조상 서열(예를 들면, 동등체일 수 있다)로부터의 후대인 서열을 지칭할 수 있다.

"엄격한 혼성화 조건"은 주어진 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 동정하는데 사용될 수 있다. 혼성화 조건의 엄격성은 서열에 의존하며, 이는 환경이 달라지면 달라질 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열적 융점(T_m)보다 약 5℃ 정도 낮은 것으로 선택된다. T_m은 표적 서열중 50%가 완전 매치 프로브에 혼성화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH하에서)이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7에서 약 0.02몰이고, 온도가 60℃ 이상인 것으로 선택되어 진다. 염 농도가 낮아질수록 및/또는 온도가 증가할수록 엄격성은 증가한다. RNA-DNA 혼성화(예를 들면, 100 nt의 프로브를 사용하는 노던 블롯)를 위한 엄격한 조건은 예를 들어, 63℃에서 20분 동안 0.2XSSC에서 1회 이상 세척하는 것을 포함하는 조건, 또는 등가인 조건이다. DNA-DNA 혼성화(예를 들면, 100 nt의 프로브를 사용하는 써던 블롯)를 위한 엄격한 조건은 예를 들어, 50℃ 이상, 일반적으로 약 55℃의 온도에서 20분 동안 0.2XSSC에서 1회 이상 세척하는 것을 포함하는 조건, 또는 등가인 조건이다. 또한, 문헌 ([Sambrook et al. (1989)] 및 [Sambrook and Russell (2001)])을 참조할 수 있다.

"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열의 길이에 따라 전역 또는 국부 정렬 알고리즘을 사용함으로써 2개의 펩티드 또는 2개의 뉴클레오티드 서열을 정렬하여 측정될 수 있다. 길이가 유사한 서열은 바람직하게, 전체 길이에 걸쳐 최적으로 서열을 정렬시키는 전역 정렬 알고리즘(예를 들면, 니들만 및 운쉬(Needleman Wunsch))을 사용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 길이가 상이한 서열은 바람직하게, 국부 정렬 알고리즘(예를 들면, 스미드 워터만(Smith Waterman))을 사용하여 정렬된다. 이어서, (디폴트 파라미터를 사용하여 예를 들어, 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되었을 때) 적어도 특정의 최소한의 서열 동일성(%)(하기 정의되는 바와 같음)을 공유하는 경우, 서열은 "실질적으로 동일한 것" 또는 "본질적으로 유사한 것"으로서 언급될 수 있다. GAP은 두 서열 전체 길이(전장)에 걸쳐 상기 2개의 서열을 정렬하기 위하여 니들만 및 운쉬 전역 정렬 알고리즘을 사용함으로써 매치수는 최대화시키고, 갭의 수는 최소화시킬 수 있다. 전역 정렬은 두 서열의 길이가 유사할 때 서열 동일성을 측정하기 위하여 적합하게 사용된다. 일반적으로, GAP 디폴트 파라미터가 사용되는데, 갭 생성 패널티 = 50(뉴클레오티드)/8(단백질)이고, 갭 확장 패널티 = 3(뉴클레오티드)/2(단백질)이다. 뉴클레오티드 경우, 사용되는 디폴트 점수화 매트릭스는 nwsgapdna이고, 단백질 경우, 사용되는 디폴트 점수화 매트릭스는 Blosum62이다(문헌 [Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919]). 서열 동일성(%)에 대한 서열 정렬과 점수는 컴퓨터 프로그램, 예로서, 미국 캘리포니아주 92121-3752 샌디에고 스클랜톤 로드 9685에 소재하는 엑설리스 인코포레이티드(Accelrys Inc.)로부터 이용가능한 GCG 위스콘신 패키지(GCG Wisconsin Package) 버전 10.3을 사용함으로써, 또는 오픈 소스 소프트웨어, 예로서, 프로그램 "니들"(전역 니들만 및 운쉬 알고리즘 사용) 또는 "워터"(국부 스미드 워터만 알고리즘 사용) EmbossWIN 버전 2.10.0을 사용함으로써 상기 GAP에 대한 것과 동일한 파라미터를 이용하거나, 디폴트 세팅값을 이용하여('니들' 및 '워터,' 둘 모두에 대하여, 및 단백질 및 DNA 정렬, 둘 모두에 대하여, 디폴트 갭 개방 패널티는 10.0이고, 디폴트 갭 확장 패널티는 0.5이며; 디폴트 점수화 매트릭스는 단백질 경우 Blossum62이고, DNA인 경우 DNAFull이다) 측정될 수 있다. 서열 전체 길이가 실질적으로 상이할 때에는 예로서, 스미스 워터만 알고리즘을 사용하여 국부 정렬하는 것이 바람직하다. 별법으로, 유사성(%) 또는 동일성(%)은 알고리즘, 예로서, FASTA, BLAST 등을 사용함으로써 공개 데이타베이스에 대한 검색을 통해 측정될 수 있다.

본 명세서 및 청구의 범위에서, "포함하다"라는 동사 및 그의 변형된 형태는 비-제한적 의미로, 그에 따르는 항목이 포함된다는 것을 의미하기 위하여 사용되는 것이며, 항목은 구체적으로 언급되지 않는다면 배제시키지 않는다. 추가로, 부정 관사 "하나(a)" 또는 "하나(an)"에 의해 요소를 언급하는 것은 문맥상 명확하게 하나 및 오직 하나의 요소만이 존재할 것을 필요로 하지 않는 한, 1 초과의 요소가 존재할 수 있음을 배제시키지 않는다. 따라서, 부정 관사 "하나(a)" 또는 "하나(an)"는 일반적으로 "1 이상"을 의미한다. 추가로, 본원에서 "서열"에 관하여 언급되는 경우, 일반적으로는 특정 서열의 하위유니트를 갖는 실제 물리적 분자(예를 들면, 아미노산)를 지칭하는 것으로 이해된다.

본 발명에 따라 "식물" 또는 "식물들"(또는 여러 식물들)에 관하여 언급되는 경우에는 언제나 달리 언급되지 않는다면, 식물 일부분(세포, 조직 또는 기관, 종자, 절단되거나 수확된 일부분, 잎, 묘목, 꽃, 화분, 열매, 줄기, 뿌리, 유합 조직, 원형질체 등), 모체와 구별되는 특징(예를 들면, 트랜스-진의 존재)을 보유하는 식물의 자손 또는 클론 증식물, 예로서, 자가 수분 또는 이종 교배에 의해 수득한 종자, 예를 들면, 하이브리드 종자(2개의 모체 순계를 교배하여 수득된 종자), 하이브리드 식물 및 그로부터 유래된 식물 일부분도 본원에 포함되는 것으로 이해된다.

상세한 설명

스페인에서 야외 시험으로, CaMV 35S 프로모터(문헌 [Franck et al, 1980, Cell 21, 285-294]에 기재된 단일 35S 프로모터)를 포함하는 트랜스제닉 식물을 시험하였을 때, 35S 프로모터의 활성은 고온의 여름 온도에 영향을 받는다고 밝혀졌다. 오랜 잎에서는 전체적인 발현 손실이 일어났다. 이로써, 본 발명자들은, 트랜스제닉 식물, 특히, 식물 발생시 또는 성숙기에 하나 이상의 스트레스 조건에 노출될 수 있는 식물에서 핵산 서열의 발현을 제어하는데에 본 프로모터가 바람직한 바, 식물 세포 및 기관에서 구성적 활성을 갖고, 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 대한 본질적으로 비감수성인 식물 프로모터를 단리시키는 프로그램을 개시하게 되었다. cDNA-AFLP를 사용함으로써, 예로서, 가뭄 스트레스, 저온 스트레스, 열 스트레스, 병원체 스트레스(CMV 감염), 일-주기 변동, 방사선(예를 들면, UV 유도성 스트레스), 수분-스트레스(과다 관수 및 관수 부족) 등과 같은 스트레스 조건하에서도 강한 구성적 전사 프로파일을 보유하는 토마토 식물로부터 강한 구성적 식물 프로모터의 유전자를 단리시켰다. (실시예를 참조할 수 있다). 상응하는 프로모터를 단리시킴으로써 식물에서 강한 구성적 발현을 부여하는(또는 부여할 수 있는) 부류의 프로모터를 발견하게 되었다. 프로모터 강도는 등가 이상이었고, 몇몇 숙주 종(토마토)에서는 CaMV 35S 프로모터의 강도보다 유의적으로 더 높았다. 추가로, 프로모터는 그를 포함하는 식물 또는 식물 일부분을 다양한 생물적 및/또는 비생물적 스트레스 조건에 가하였을 때에도 활성이 감소하지 않는다(즉, 강한 구성적 활성을 유지한다). 이러한 프로모터를 본원에서는 "AA6 프로모터"로 지칭한다.

핵산 서열, 키메라 유전자 및 벡터

하나의 실시태양에서, 식물 및 식물 조직 또는 기관에서 강한 구성적 전사 활성을 나타내는 것으로서, 식물에서 프로모터 활성을 갖는 단리된 핵산 서열(바람직하게, 게놈 또는 합성 DNA 서열)을 제공한다. 프로모터는 바람직하게 모든 식물 기관에서 활성이지만, 적어도 주요 기관에서 활성이며, 프로모터 강도는 35S(문헌 [Franck et al, 상기 동일]에 기재된 CaMV 35S 프로모터)의 것과 적어도 본질적으로 동등하다(또는 그보다 강하다). 바람직하게, 핵산 서열의 프로모터 활성은 트랜스제닉 식물, 또는 식물 조직 또는 기관이 하나 이상의 비생물적 및/또는 생물적 스트레스를 받는 경우에도 감소되지 않거나, 적어도 유의적으로 감소되지는 않는다. 이와 관련하여 유의적인 감소란 비-스트레스 조건하 동일 조직 또는 기관에서의 활성과 비교하여 1% 이상(예를 들면, 2%, 3%, 5%, 10% 등, 100% 이하) 만큼 프로모터 활성이 통계학상 유의적으로(양적으로) 감소하는 것을 지칭한다. 따라서, 바람직하게, 프로모터는 스트레스 조건하에서도 (바람직하게, 모든 기관, 특히, 적어도 주요 식물 기관에서) 여전히 강하고 구성적으로 유지된다.

하나의 실시태양에서, 서열 번호 1("3kb" 프로모터) 또는 서열 번호 2("5kb" 프로모터), 또는 서열 번호 6-9(서열 번호 6 및 8은 "3kb" 프로모터이고, 서열 번호 7 및 9는 "5kb"프로모터이며, 서열 번호 1 및 2와 비교하여 일부는 뉴클레오티드 모호성을 갖거나, 약간 다른 서열을 갖는다)중 어느 하나, 또는 pKG8135(CBS120175) 또는 pKG8137(CBS120176)로 클로닝된 프로모터 서열, 또는 적어도 식물에서 프로모터 활성을 갖는 것으로서, 상기 것들중 임의의 것의 활성(기능적) 단편, 예로서, 서열 번호 1 또는 2, 서열 번호 6-9, 또는 pKG8135(CBS120175) 또는 pKG8137(CBS120176)내의 프로모터의 적어도 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 800개, 900개, 1000개, 1200개, 1500개, 2000개, 2500개, 2800개, 2900개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개 이상의 연속 뉴클레오티드의 단편을 포함하는, 구성적 AA6 프로모터를 제공한다. "활성 단편" 또는 "기능적 단편," 또는 "프로모터 활성을 갖는 단편"은 서열 번호 1 또는 2, 서열 번호 6-9, 또는 pKG8135(CBS120175) 또는 pKG8137(CBS120176)내의 프로모터와 같이 식물 세포, 기관 및 식물, 바람직하게, 적어도 동일 조직 및 기관에서 구성적 전사를 부여할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다. 이는 하기와 같이, 바람직하게, 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된, 상기와 같은 단편으로 식물 세포를 형질전환시키고, 프로모터 활성을 정성적으로(시-공간적 전사) 및/또는 정량적으로 검정함으로써 시험될 수 있다.

본원에서 서열 번호 1을 언급하는 경우, 이는 또한 서열 번호 6 또는 8, 또는 pKG8135(CBS120175)에 존재하는 서열중 임의의 것도 언급하는 것이며, 이러한 문장은 이들 프로모터 서열중 임의의 것을 지칭하는 것으로 해독될 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게, 본원에서 서열 번호 2를 언급하는 경우, 이는 또한 서열 번호 7 또는 9, 또는 pKG8137(CBS120175)에 존재하는 서열중 임의의 것도 언급하는 것이며, 이러한 문장은 이들 프로모터 서열중 임의의 것을 지칭하는 것으로 해독될 수 있는 것으로 이해된다.

하나의 실시태양에서, 프로모터 단편의 강도는 정량적으로 서열 번호 1 및/또는 2의 것(및 그러므로 또한 35S의 것)과 본질적으로 동일하거나, 그보다 높다. 서열 번호 1 및 2는 번역 개시 코돈(mRNA 상의 AUG 또는 DNA 상의 ATG)의 직 상류부에 위치하는 서열이기 때문에 활성 단편은 바람직하게, 서열 번호 1 및/또는 2의 5' 말단에서의 결실에 의해 생성된다. 그러므로, 단편은 바람직하게 서열 번호 1 또는 2의 3' 부위의 200개, 300개, 400개, 500개 이상 등의 뉴클레오티드(상기와 같음)를 포함한다. 분명, DNA 단편은 다수의 방법으로, 예를 들면, 새로운 DNA 합성, 또는 제한 효소, 또는 말단 뉴클레아제 등을 사용함으로써 생성될 수 있다.

그러나, 특정의 시스-작용 요소(예로서, 인핸서 서열)를 제거할 경우 프로모터 활성은 저하될 수 있다. 그러므로, 상이한 실시태양에서, 프로모터 단편의 강도는 정량적으로 서열 번호 1 및/또는 2의 것(및 그러므로 또한 35S의 것)보다 낮다. 몇몇 적용에 있어서는 강도가 감소된 프로모터가 바람직하다. 당업자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 전장 프로모터 및 임의의 프로모터 단편의 활성을 용이하게 측정할 수 있고, 강도 및 조직 특이성을 35S의 것 또는 본원에서 제공되는 프로모터의 것과 비교할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Medberry et al. Plant Cell, 1992, Vol. 4: 185-192]에는 일과성 발현 검정법을 사용하여 프로모터 강도를 비교하는 방법이 기재되어 있다.

서열 번호 1 및 2의 프로모터, 및 그의 기능적 단편은 바람직하게 프로모터를 포함하는 식물 또는 식물 세포(들), 조직 또는 기관이 노출될 수 있는 적어도 하나의 (그러나, 바람직하게는, 추가로, 가장 바람직하게는 임의의) 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 대하여 비감수성이다(하기를 참조할 수 있다). 따라서, 활성은 스트레스 조건에 노출된 경우에도 구성적이고 강한 상태로 유지된다.

상기 AA6 프로모터의 "변이체" 및 상기 변이체의 기능적 단편 또한 제공한다. 이러한 변이체는 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2와 본질적으로 유사한 핵산 서열(및 상기 기술된 바와 같은, 이들 변이체 서열의 기능적 단편)을 포함하는데, 이는 구성적 프로모터 활성을 가지며, 즉, 서열 번호 1 및 2와 같이 식물, 식물 세포, 조직 또는 기관, 가장 바람직하게 적어도 동일 조직 및 기관에서 구성적 전사를 제공할 수 있다. 서열 번호 1 및/또는 2와 "본질적으로 유사한" 서열은 니들만 및 운쉬 페어와이즈 정렬(프로그램 GCG를 GCG로, "니들"을 Embosswin, 버전 2.10.0으로 하여, 갭 생성 패널티 = 50 및 갭 확장 패널티 = 3)을 사용할 때 서열 번호 1과 및/또는 서열 번호 2(전장에 걸쳐)와 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 포함하는 것으로서, 식물 또는 식물 세포에서 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이다. 바람직한 실시태양에서, 변이체(및 기능적 단편)의 활성은 모든 조직 및 기관에서 강하고, 즉, 정량적으로 적어도 서열 번호 1 또는 2만큼 강하다(또는 그보다 강하다). 추가의 실시태양에서, 이들 변이체(및 기능적 단편)의 활성은 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 대하여 비감수성이고, 즉, 강하고 구성적 상태로 유지된다.

본원에서 제공되는 핵산 서열의 변이체 또는 기능적 단편을 동정, 합성, 또는 단리시키는데 다수의 방법이 사용될 수 있다는 것은 분명하며, 그러한 예로는 핵산 혼성화, PCR 기술, 인 실리코 분석 및 핵산 합성 등이 있다. 예를 들어, 핵산 혼성화는 엄격하거나 적당히 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 번호 1 또는 2, 또는 이들 단편에 혼성화되는, 다른 식물 종 또는 변종중의 DNA 서열을 동정하는데 사용될 수 있다.

별법으로, 예로서, BLAST, FASTA 등과 같은 공지 알고리즘을 사용하여 변이체 서열에 대하여 서열 데이타베이스를 인 실리코로 스크리닝할 수 있다. 이러한 방식으로 다른 식물 종 또는 토마토의 다른 변종으로부터, 또는 전체적으로 다른 유기체로부터 변이체 서열을 단리시키는 것이 실행가능하다. 특히, 하기 기술되는 바와 같이, 토마토의 다른 변종에서 또는 다른 식물 종에서, 특히, 솔라눔(Solanum) 속의 종에서 발견되는 동일 유전자(시토졸 시스테인 신타아제 유전자 및 그의 동등체)의 다른 대립 유전자의 프로모터가 본원에 포함된다. 예를 들어, cDNA 라이브러리는 하나 이상의 식물 종, 하나 이상의 변종, 또는 하나의 종 또는 변종의 다른 조직으로부터 구성될 수 있다. cDNA 라이브러리는 (예를 들면, 서열 번호 4(토마토 시스테인 신타아제 cDNA)로부터 유래된 프로브 또는 프라이머, 또는 그의 단편 또는 변이체를 사용하여) 시스테인 신타아제 cDNAs에 대하여 스크리닝될 수 있다. 그와 동시에, 실시예에 기술되어 있는 바와 같이, 차별적 디스플레이 방법(예로서, cDNA-AFLP)을 사용하여 시스테인 신타아제 전사체를 동정할 수 있다. 방법, 예로서, 테일-PCR (문헌 [Liu et al. 1995, Genomics 25(3):674-81]; [Liu et al. 2005, Methods Mol Biol. 286:341-8]), 링커-PCR, 또는 역 PCR(IPCR: Inverse PCR)을 사용하여 유전자의 상류 전사 조절 부위를 단리시킬 수 있다.

핵산 서열(또는 변이체의 단편)이 구성적 프로모터 활성을 갖는지 여부, 즉, 모든 기관에서 구성적 전사를 부여할 수 있는지 여부, 활성이 "강한지" 여부, 및 핵산 서열의 활성이, 트랜스제닉 세포, 조직, 기관 또는 유기체(특히, 식물 또는 식물 세포)가 노출될 수 있는 적어도 하나의 (그러나, 바람직하게는, 추가로, 가장 바람직하게는 임의의) 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 대하여 비감수성인지 여부를 다양한 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 일반적으로, 정성적 방법 및 정량적 방법으로 식별될 수 있다. 정성적 방법(예로서, 조직학적 GUS 염색)을 사용하여 프로모터의 시-공간적 활성(프로모터는 특정 조직 또는 기관에서, 또는 특정 환경적/발생학적 조건하에서 활성인가? 또는 불활성인가?)을 측정할 수 있는 반면, 정량적 방법(예로서, 형광 GUS 검정법) 또한 대조군과 비교하여 활성 수준을 정량한다. 적합한 대조군은 예를 들어, 공 벡터(음성 대조군)로 형질전환되거나, 다른 프로모터, 예로서, CaMV 35S를 포함하는 작제물로 형질전환된 식물, 또는 비-트랜스제닉 식물이다.

상대적 활성 또는 절대적 활성을 시험하고, 임의로 정량하기 위하여 클로닝되거나 합성 핵산 분자, 예로서, 서열 번호 1, 2, 또는 그의 변이체, 또는 이들중 임의의 것의 단편을 공지된 핵산 서열(예를 들면, 리포터 유전자, 예로서, gusA, 또는 특정 단백질을 코딩하는 임의의 유전자)에 작동가능하게 연결시킬 수 있고, 이를 이용함으로써 공지 방법을 사용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 프로모터가 세포, 조직 또는 기관에서 활성인지 여부, 및 어느 정도까지 프로모터가 전사를 구동시키는지를 측정하기 위해 세포는 안정적인 방식으로 형질전환될 필요는 없으며, 즉, 일과성 발현 검정법(예를 들면, 원형질체 형질감염 또는 아그로박테리아 이용 침윤법(Agroinfiltration))이 사용될 수 있다. 프로모터의 활성은 예를 들어, 하류 핵산 서열의 RNA 전사체의 수준을 검출함으로써 검정(및 임의의 정량)될 수 있다. 이는 정량적 방법, 예를 들면, 정량적 RT-PCR 또는 다른 PCR 기초 방법 등을 사용함으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 리포터 단백질 또는 리포터 단백질의 활성을 검정하고 정량할 수 있다. 예를 들어, 리포터 유전자가 gus 유전자일 경우, 실시예에 기술되어 있는 바와 같이, 형광 GUS 검정법을 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, 정상적인 생리학적(비-스트레스) 조건하에서 유지되는 형질전환된 식물 또는 식물 세포의 정량적 프로모터 활성을, 하나 이상의 생물적 또는 비생물적 스트레스에 노출된 식물 또는 식물 세포의 수준과 비교할 수 있다. 또한, 상대적 또는 절대적 활성 수준을 구성적 제어 프로모터, 예로서, 35S 프로모터, 이중-35S 프로모터, 또는 서열 번호 1 및/또는 2와 비교할 수 있다. 바람직하게, 평균 프로모터 활성 수준을 측정하고, 통계학적 방법을 사용하여 비교하는 것이 이해된다.

따라서, 예를 들어, 식물 또는 식물 세포를 프로모터-리포터 유전자 작제물로 형질전환시키고, RNA 전사체 또는 리포터 단백질(또는 그의 활성)에 대하여 다양한 발생 단계 동안 다양한 조직을 분석함으로써 어떤 조직 또는 기관에서 본 발명에 따른 프로모터가 특정 시간에 활성인지(시-공간적 활성)를 시험할 수 있다. 하나의 간단한 시험은 예를 들어, 조직화학적 GUS 염색을 사용하는 것인데, 이를 통한 청색의 시각적 평가가 다양한 조직에서, 및 다양한 발생 단계에서 활성임을 지시한다.

이미 언급한 바와 같이, 식물 및 식물 세포, 특히, 서열이 도입되는 숙주 종 또는 변종에서 프로모터 활성이 구성적이고, 바람직하게는 강하기도 한 것이 바람직하다. 구성적 활성은, 프로모터에 작동가능하게 연결된 임의의 핵산 서열의 전사체가 대부분의(정상, 비-스트레스성) 생리학적 및 발생학적 조건하에 대부분의 조직(또는 기관)에서 바람직하게 생산된다는 것을 의미한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 프로모터는 실시예에서 시험된 조직 또는 기관, 예로서, 잎(어린 잎 및 오랜 잎), 뿌리, 꽃, 종자, 줄기(주 줄기), 열매(예를 들면, 미성숙 열매 및 성숙 열매), 발아 종자 등에서 적어도 활성이다.

바람직하게, 본 발명에 따른 프로모터는 쌍자엽 종 및 단자엽 종, 둘 모두의 모든 식물 종에서 강한 구성적 활성을 제공한다. 예를 들어, 서열 번호 1 및 서열 번호 2가 다양한 식물 종, 예로서, 토마토, 담배, 브라시카(Brassica), 멜론 및 상추에서 강한 구성적 발현을 제공하였다는 것을 발견하게 되었다(실시예를 참조할 수 있다).

하류(3')에 연결된 핵산 서열의 발현을 구동시킬 수 있다는 그의 능력에 의하여 본 발명에 따른 AA6 프로모터(단편 또는 변이체 포함)의 강도(정량적 활성)는 다양한 공지 방법을 사용함으로써 정량적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 전사된 전사체(mRNA)의 양은 정량적 RT-PCR 또는 노던 블롯팅을 사용함으로써 정량화될 수 있다. 바람직하게, 프로모터 강도는 정상적인(비-스트레스성) 조건하에서 적어도 본질적으로 CaMV 35S(문헌 [Franck et al., 상기 동일])의 것과 동등하다. 따라서, "강하다"라는 의미는 프로모터 강도가 정상적인, 비-스트레스성 조건하에서 35S의 것과 바람직하게는 적어도 거의 동일하지만, 더욱 바람직하게는 그보다 더 강하다는 것을 의미하는 것이다. 가장 바람직하게, 다양한 조직 및 기관에서 평균 정량적 프로모터 활성은 CaMV 35S 프로모터 활성과 적어도 동등하거나, CaMV 35S 프로모터 평균 활성보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75% 이상 더 높다. 형질전환체의 동일한 카피수 및 접합 상태 수준, 예를 들면, 트랜스진에 대한 이형접합성 또는 동형접합성이 비교되어야 한다는 것이 이해된다. 단일 카피의 형질전환체가 동정되고 비교되는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명에 따른 프로모터의 강도는, 프로모터를 포함하는 식물 조직 또는 기관 또는 식물이 가뭄 스트레스, 열 스트레스, 수분-스트레스(수분이 너무 많은 경우 및 너무 적은 경우, 둘 모두), 병원체 스트레스(예를 들면, 바이러스 감염, 예로서, CMV, 진균 감염, 세균 감염 등), 페스트 스트레스(예를 들면, 곤충 사육), 손상, 염 스트레스, 방사선 스트레스 등의 것중 1 이상, 또는 바람직하게 수개 이상으로부터 선택되는 스트레스 조건에 노출될 경우, 바람직하게는 본질적으로 변함없이 유지되거나, 적어도 감소되지 않는다(또는 유의적으로 감소되지 않는다). 또한, 상기를 측정하기 위하여 정량적 시험이 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로모터를 포함하는 재조합 식물을 정상적인 온도 환경으로부터 가온 환경(예로서, 약 27℃ 내지 약 50℃ 이하)으로 옮기고, 다양한 조직에서의 프로모터 활성을 정상적인 온도 조건, 및 가온 온도 조건하의 동일 조직에서의 활성과 비교할 수 있다.

상기 AA6 프로모터의 변이체 또한, 식물에서 강한 구성적 활성을 나타내고, 바람직하게는, 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 대하여 본질적으로 비감수성인, 식물 시스테인 신타아제 유전자의, 특히, 시토졸 시스테인 신타아제 유전자의 임의의 단리된 핵산 프로모터(즉, 시스테인 신타아제 효소, 특히 시토졸 이소폼을 코딩하는 식물 유전자의 프로모터)를 포함한다. 이미 언급한 바와 같이, 다른 식물 시스테인 신타아제 유전자 또한 하나 이상의 스트레스 조건하에서 구성적 발현을 보유하는, 강한 구성적 프로모터를 가질 수 있다. 식물 시스테인 신타아제 유전자는 O-아세틸-L-세린[티올]-리아제(EC 4.2.99.8)로도 지칭되는 효소 시스테인 신타아제를 코딩하는 유전자이다. 수개의 시스테인 신타아제 유전자가 클로닝되었지만(예를 들면, 실시예에서 TC162833으로 지칭되는 것을 참조할 수 있다), 트랜스제닉 식물에서 상동성 또는 이종성 서열의 강한 구성적 발현을 구동시키는 그들 프로모터의 유용성에 관하여 기술된 바는 없다. 따라서, 상기와 같이 공지되었거나, 아직 공지되지 않은 시스테인 신타아제 유전자의 프로모터를 단리시키고 그의 활성에 관하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, cDNA-AFLP, 기타 PCR 기초 방법 또는 노던 혼성화를 사용함으로써 기타 시스테인 신타아제 유전자, 특히, 구성적으로, 그리고 또한 하나 이상의 스트레스 조건하에서 내재적으로 시스테인 신타아제 mRNA를 생산하는 유전자를 단리 또는 동정할 수 있다. 이어서, 원하는 발현 패턴을 갖는 그러한 시스테인 신타아제 유전자를 선별하고, 그의 프로모터를 공지 방법을 이용함으로써 클로닝할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 프로모터는 솔라나세아에(Solanaceae) 과, 예로서, 솔라눔(재분류된 리코페르시콘(Lycopersicon) 종 포함), 니코티아나(Nicotiana), 카프시쿰(Capsicum), 페튜니아(Petunia), 코페아(Coffea) 속 등등에 속하는 식물로부터의 시스테인 신타아제 유전자로부터 수득된다.

본 발명에 따른 프로모터는 바람직하게, 잡초 식물, 예로서, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 프로모터가 아니며, 바람직하게, 문헌 [Gutierrez-Alcala et al. J. of Exp. Botany 56, p24872494]에 기재되어 있는 바와 같은 아라비돕시스 탈리아나의 OASA1 유전자의 프로모터, 또는 그의 단편은 아니다.

(서열 번호 5의 시스테인 신타아제 효소를 코딩하는) 서열 번호 4에 제공되는 시스테인 신타아제 유전자와는 별도로, 기타 시스테인 신타아제 유전자가 동정될 수 있고, 그의 프로모터가 단리될 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, 다양한 방법이 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서는 식물 및/또는 식물 세포에서 구성적 활성을 갖고, 그를 통해 활성은, 식물 또는 식물 세포, 조직 또는 기관이 예로서, 기술되어 있는 바와 같은, 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 노출된 경우에도 감소되지 않거나, 유의적으로 감소되지 않는, 식물(시토졸) 시스테인 신타아제 유전자의 프로모터를 제공한다.

그러한 프로모터는 (a) 식물로부터 수득될 수 있고, 식물 시스테인 신타아제 유전자의 발현을 구동시키는 임의의 프로모터, 특히, 서열 번호 5의 단백질을 코딩하는 임의의 유전자의 프로모터; (b) (전체 길이에 걸쳐) 서열 번호 5와 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% 이상의 아미노산 동일성을 갖는, 시스테인 신타아제 효소를 코딩하는 식물 유전자의 프로모터; (c) 시스테인 신타아제 효소를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 구동시키며, 이를 통해 핵산 서열은 (전체 길이에 걸쳐) 서열 번호 4와 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 포함하게 되는 식물 프로모터를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 재조합 세포 또는 유기체, 특히, 식물 세포 또는 식물에서 상동성 또는 이종성 핵산 서열의 구성적 과다-발현을 위한 식물 시스테인 신타아제 유전자의 프로모터의 용도를 제공한다. 이러한 용도는 기술되어 있는 바와 같이, 프로모터를 상동성 또는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결시키고, 식물 또는 식물 세포를 형질전환시키는 것을 포함한다.

비록 상기에서는 관심이 식물 및 식물 세포에서의 본 발명에 따른 프로모터의 용도에 집중되어 있지만, 다른 세포 및 유기체, 예로서, 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 유기체, 예를 들면, 세균, 진균(효소, 예로서, 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula) 등을 포함), 포유동물, 인간 세포 또는 세포주 등에서 상동성 또는 이종성 핵산 서열의 발현을 위해 프로모터를 사용하는 것도 본 발명의 실시태양이다.

본 발명에 따른 키메라 유전자 및 벡터

본 발명의 하나의 실시태양에서, 프로모터 활성을 갖는 상기 핵산 서열중 임의의 것을 사용하여 키메라 유전자를 제조하고, 키메라 유전자를 숙주 세포로 전달하고, 숙주 세포, 예로서, 형질전화된 세포(들)로부터 유래된 세포, 조직, 기관 또는 전체 유기체에서 작동가능하게 연결된 상동성 또는 이종성 핵산 서열을 발현시키기 위한, 키메라 유전자를 포함하는 벡터를 제조할 수 있다.

숙주 세포는 바람직하게, 식물 세포이다. 임의의 식물은 적합한 숙주가 될 수 있으며, 예로서는, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물, 예를 들어, 옥수수/콘(옥수수 종, 예를 들면, Z. 메이스(Z. mays), Z. 디플로페레니스(Z. diploperennis)(차풀(chapule)), 지 럭셔리안스(Zea luxurians)(과테말란 테오신테), Z. 메이스 아종 휴휴테난겐시스(Zea mays subsp. huehuetenangensis)(산안토니오 후이스타 테오신테), Z. 메이스 아종 멕시카나(Z. mays subsp. mexicana)(멕시칸 테오신테), Z. 메이스 아종 파르비글루미스(Z. mays subsp. parviglumis)(발사스 테오신테), Z. 페리니스(Z. perennis)(페레니알 테오신테) 및 Z. 라모사(Z. ramosa), 밀(트리티쿰(Triticum) 종), 보리(예를 들면, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare)), 귀리(예를 들면, 아베나 사티바(Avena sativa), 수수(소르검 바이컬러(Sorghum bicolor)),호밀(세칼레 세레알레(Secale cereale)), 대두(글라이시네(Glycine) 종, 예를 들면, G.맥스(G. max)), 목화(고시피움(Gossypium) 종, 예를 들면, G. 히르수툼(G. hirsutum)), G. 바르바덴스(G. barbadense)), 브라시카 종(예를 들면, B. 나푸스(B. napus), B. 준세아(B. juncea), B. 올레라세아(B. oleracea), B. 라파(B. rapa) 등), 해바라기(헬리안투스 안누스(Helianthus annus)), 담배(니코티아나 종), 알팔파(메디카고 사티바(Medicago sativa)), 벼(오리자(Oryza) 종, 예를 들면, O. 사티바 인디카(O. sativa indica) 품종-군 또는 자포니카(japonica) 품종-군), 마초, 진주 조(페니세툼(Pennisetum) 종, 예를 들면, P. 글라우쿰(P. glaucum)), 나무 종, 채소 종, 예로서, 리코페르시콘 아종(최근 솔라눔 속에 속하는 것으로 재분류됨), 예를 들면, 토마토(L. 에스쿨렌툼(L. esculentum), 동의어: 솔라눔 리코페르시쿰(Solanum lycopersicum)) 예로서, 체리 토마토, 변종 세라시폼(cerasiforme) 또는 현 토마토, 변종 핌피넬리포리움(pimpinellifolium) 또는 나무 토마토(S. 베타세움(S. betaceum), 동의어: 시포만드라 베타세아에(Cyphomandra betaceae)), 감자(솔라눔 튜베로숨(Solanum tuberosum) 및 기타 솔라눔 종, 예로서, 가지(솔라눔 멜론게나(Solanum melongena)), 페피노(S. 무리카툼(S. muricatum)), 코코나(S. 세실리플로룸(S. sessiliflorum)) 및 나란질라(S. 퀴토엔세(S. quitoense)); 고추(카프시쿰 안누움(Capsicum annuum), 카프시쿰 푸르트센스(Capsicum frutescens)), 완두(예를 들면, 피숨 사티붐(Pisum sativum)), 콩(예를 들면, 파세오루스(Phaseolus) 종), 당근(다우쿠스 캐로타(Daucus carota)), 락투카(Lactuca) 종(예로서, 락투카 사티바(Lactuca sativa), 락투카 인디카(Lactuca indica), 락투카 페리니스(Lactuca perennis)), 오이(쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus)), 멜론(쿠쿠미스 멜로(Cucumis melo)), 주키니(쿠크르비타 페포(Cucurbita pepo)), 호박(squash)(쿠크르비타 맥시마(Cucurbita maxima), 쿠크르비타 페포, 쿠크르비타 믹스타(Cucurbita mixta)), 호박(pumpkin)(쿠크르비타 페포(Cucurbita pepo)), 수박(시트룰루스 라나투스(Citrullus lanatus), 동의어: 시트룰루스 불가리스(Citrullus vulgaris)), 육질과(fleshy fruit) 종(포도, 복숭아, 자두, 딸기, 망고, 멜론), 관상용 종(예를 들면, 장미, 페튜니아, 크리산테뭄(Chrysanthemum), 백합, 튤립, 거베라(Gerbera) 종), 목본 나무(예를 들면, 포풀루스(Populus), 셀릭스(Salix), 쿠에르쿠스(Quercus), 유칼립투스(Eucalyptus)의 종), 섬유 종, 예를 들면, 아마(리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum)) 및 대마(칸나비스 사티바(Cannabis sativa))일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 채소 종, 특히, 솔라눔 종(리코페르시콘 종 포함)이 바람직하다.

따라서, 예를 들어, 하기 종의 속이 형질전환될 수 있다: 쿠크르비타, 로사(Rosa), 비티스(Vitis), 쥬글란스(Juglans), 프라가리아(Fragaria), 로투스(Lotus), 메디카고, 오노브리치스(Onobrychis), 트리폴룸(Trifolium), 트리고넬라(Trigonella), 비그나(Vigna), 시트러스(Citrus), 리눔, 게라니움(Geranium), 마니하트(Manihot), 다우쿠스, 아라비돕시스, 브라시카, 라파누스(Raphanus), 시나피스(Sinapis), 아트로파(Atropa), 카프시쿰, 다투라(Datura), 쿠쿠미스, 히오스키아무스(Hyoscyamus), 리코페르시콘, 솔라눔, 니코티아나, 말루스(Malus ), 페튜니아, 디기탈리스(Digitalis), 마조라(Majora), 시아호리움(Ciahorium), 헬리안투스, 락투카, 브로무스(Bromus), 시트룰루스, 아스파라거스(Asparagus), 안티르히눔(Antirrhinum), 헤테로칼리스(Heterocallis), 네메시스(Nemesis), 펠라르고늄(Pelargonium), 파니에움(Panieum), 페니세툼, 라눈쿨루스(Ranunculus), 세네시오(Senecio), 샐피글로시스(Salpiglossis), 브로와알리아(Browaalia), 글라이시네, 피숨, 파세오루스, 고시피움, 글라이시네, 롤리움(Lolium), 페스투카(Festuca), 아그로스티스(Agrostis). 추가로 각각의 쿠크르비타, 브라시카, 리코페르시콘, 솔라눔, 오리자 및 지에 대한 것이 바람직하다. 각각의 아베나, 메디카고, 카프시쿰, 니코티아나, 락투카, 피숨, 쿠쿠미스, 쿠크르비타, 브라시카, 솔라눔(리코페르시콘 포함), 오리자 및 지에 대한 것이 바람직하다.

키메라 유전자, 및 키메라 유전자를 숙주 세포의 게놈 내로 도입시키기 위한 벡터의 작제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 키메라 유전자를 생성하기 위하여 표준 분자 생물학적 기법을 사용함으로써 숙주 세포에서 전사되는 또다른 핵산 서열에 AA6 프로모터 서열을 작동가능하게 연결시킨다. 프로모터 서열이 벡터내 이미 존재할 수 있고, 그 결과 전사되는 핵산 서열은 간단하게 벡터내 프로모터 서열의 하류로 삽입된다. 이어서, 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 키메라 유전자는 바람직하게 핵 게놈 또는 색소체, 미토콘드리아, 또는 엽록체 게놈내로 삽입되어, 하류 핵산 서열은 프로모터의 활성에 기인하여 발현된다(예로서, 문헌 [Mc Bride et al., 1995 Bio/Technology 13, 362]; US 5,693, 507).

그러므로, 키메라 유전자는 바람직하게, 상기 기술되어 있는 바와 같이, 상동성 또는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 있고, 임의로는, 3' 비번역 핵산 서열(3'UTR)이 이어지는, AA6 프로모터를 포함한다. 상동성 또는 이종성 핵산 서열은 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열일 수 있거나, 숙주 세포 또는 유기체에서 유전자 또는 유전자 계열을 침묵화시키는데 적합하게 활성인, RNA 분자, 예로서, 센스 및/또는 안티센스 RNA(dsRNA)로 전사되는 서열일 수 있다.

AA6 프로모터-포함 키메라 유전자를 종래 방식으로 단일 식물 세포의 핵 게놈 내로 안정적으로 삽입시킬 수 있고, 그렇게 형질전환된 식물 세포를 종래 방식으로 사용하여 키메라 유전자의 구성적 발현에 기인하여 표현형이 변경된, 형질전환된 식물을 생산할 수 있다.

이와 관련하여, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에서 추가의 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 AA6 프로모터(또는 상기 기술된 바와 같은 변이체 또는 단편)를 포함하는 T-DNA 벡터를 사용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있고, 이후, 형질전환된 식물은 예를 들어, EP 0 116 718, EP 0 270 822, PCT 공보 WO 84/02913 및 공개된 유럽 특허 출원 EP 0 242 246 및 문헌 [Gould et al. 1991, Plant Physiol 95,426-434]에 기재되어 있는 방법을 사용함으로써 형질전환된 식물 세포로부터 재생될 수 있다. 아그로박테리움 매개 식물 형질전환을 위한 T-DNA 벡터의 작제는 당업계에 잘 알려져 있다. T-DNA 벡터는 EP 0 120 561 및 EP 0 120 515에 기재되어 있는 바와 같은 이진 벡터일 수 있거나, EP O 116 718에 기재되어 있는 바와 같이 상동성 재조합에 의해 아그로박테리움 Ti-플라스미드로 통합될 수 있는 통합체 벡터일 수 있다.

바람직한 T-DNA 벡터는 각각 T-DNA 경계 서열 사이, 또는 적어도 우측 경계 서열의 좌측에 위치하는, 전사되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 AA6 프로모터를 포함한다. 경계 서열은 문헌 [Gielen et al. 1984, EMBO J 3,835-845]에 기재되어 있다. 물론, 다른 유형의 벡터를 사용함으로써 방법, 예로서, 직접적 유전자 전달(예를 들어, EP 0 223 247에 기재되어 있는 것, 또는 US 2005/055740 및 WO 2004/092345에 기재되어 있는 바와 같은 입자 또는 유전자총 충격법), 화분 매개 형질전환(예를 들어, EP 0 270 356 및 WO 85/01856에 기재되어 있는 것), 예를 들어, US 4,684, 611에 기재되어 있는 것과 같은 원형질체 형질전환, 식물 바이러스-매개 형질전환, 리포좀-매개 형질전환(예를 들어, US 4,536, 475에 기재되어 있는 것), 및 기타 방법, 예로서, 특정의 옥수수 계를 형질전환시키기 위한 것으로 하기에 기재되어 있는 방법(예로서, US 6,140,553; 문헌 [Fromm et al, 1990, Bio/Technology 8, 833-839]; [Gordon-Kamm et al, 1990, The Plant Cell 2, 603-618]) 및 특정의 벼 계를 형질전환시키기 위한 것으로 하기에 기재되어 있는 방법(문헌 [Shimamoto et al, 1989, Nature 338, 274-276]; [Datta et al 1990, Bio/Technology 8, 736-740]) 및 일반적으로 단자엽을 형질전환시키는 방법(WO 92/09696)을 사용하여 식물 세포를 형질전환시킬 수 있다. 목화 형질전환에 대해서는 WO 00/71733 또한 참조할 수 있고, 벼 형질전환에 대해서는 WO 92/09696, WO 94/00977 및 WO 95/06722에 기재되어 있는 방법 또한 참조할 수 있다. 수수 형질전환에 대해서는 예를 들면, (문헌 [Jeoung JM et al 2002, Hereditas 137: 20-8] 또는 문헌 [Zhao ZY et al. 2000, Plant Mol Biol. 44:789-98])를 참조할 수 있다. 토마토 또는 담배 형질전환에 대해서는 또한 문헌 ([An G. et al., 1986, Plant Physiol. 81: 301-305]; [Horsch R.B. et al, 1988, In: Plant Molecular Biology Manual A5, Dordrecht, Netherlands, Kluwer Academic Publishers, pp 1-9]; [Koornneef M. et al, 1986, In: Nevins DJ. and R.A. Jones, eds. Tomato Biotechnology, New York, NY, USA, Alan R. Liss, Inc. pp 169-178])를 참조할 수 있다. 유사하게, 형질전환된 식물을 선별하고, 형질전환된 세포로부터 재생시키는 것은 당업계에 잘 공지되어 있다. 다른 종, 및 심지어는 단일 종의 다른 변종 또는 품종에 대해서는 고빈도로 형질전환체를 재생시키기 위해 프로토콜을 구체적으로 적합화하여야 하는 것은 분명하다.

핵 게놈의 형질전환 이외에도, 색소체 게놈, 바람직하게, 엽록체 게놈의 형질전환도 본 발명에 포함된다. 색소체 게놈 형질전환의 한가지 잇점은 트랜스진(들)이 확산될 위험이 축소될 수 있다는 점이다. 색소체 게놈 형질전환은 당업계에 공지된 바와 같이 수행될 수 있으며, 예를 들면, 문헌 ([Sidorov VA et al., 1999, Plant J.19:209-216] 또는 [Lutz KA et al 2004, Plant J. 37(6):906-13])을 참조할 수 있다.

생성된 형질전환된 식물은 트랜스진을 함유하는 형질전환된 식물을 더 많이 생산하기 위하여 종래 식물 육종 방식에 사용될 수 있다. 단일 카피 형질전환체는 예를 들면, 써던 블롯 분석법 또는 PCR 기초 방법 또는 인베이더® 테크놀러지(Invader® Technology) 검정법(Third Wave Technologies, Inc.)을 사용하여 선별될 수 있다. 형질전환된 세포 및 식물은 키메라 유전자의 존재에 의해 형질전환되지 않는 것으로부터 용이하게 식별될 수 있다. 트랜스진 삽입 부위의 측면에 위치하는 식물 DNA 서열 또한 서열 분석될 수 있고, 이로써, "이벤트에 특이성을 갖는" 검출 방법이 일반용으로 개발될 수 있다. 예를 들어, 통합된 서열과 인접(게놈) 서열에 기초한, 정선된 이벤트 검출용 키트(예로서, PCR 검출용 키트)가 기재되어 있는 WO 01/41558을 참조할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 전사되고, 임의로는 번역되는(핵산이 코딩 서열일 경우) 핵산 서열은, 전사되는 서열이 적합한 3' 말단 전사 조절 신호("3' 말단")(즉, 전사체 형성 및 폴리아데닐화 신호)의 상류(즉, 5')에 위치하도록 식물 게놈 내로 삽입될 수 있다. 폴리아데닐화 및 전사체 형성 신호는 노팔린 신타아제 유전자("3'nos")(문헌 [Depicker et al, 1982 J. Molec. Appl. Genetics 1, 561-573]), 옥토핀 신타아제 유전자("3'ocs")(문헌 [Gielen et al, 1984, EMBO J 3, 835-845]) 및 형질전환된 식물 세포에서 3'-비번역 DNA 서열로 작용하는 T-DNA 유전자 7("3' 유전자 7")(문헌 [Velten and Schell, 1985, Nucleic Acids Research 13, 6981- 6998]), 및 기타의 것을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 사용되는 3' 말단 서열은 식물 시스테인 신타아제 유전자의 것, 바람직하게는 또한 AA6 프로모터가 수득될 수 있는 시스테인 신타아제 유전자로부터의 것이다. 본원에서 제공되는 적합한 3' 말단 서열은 서열 번호 3, 또는 그의 단편 또는 변이체이다. 서열 번호 3의 변이체는 서열 번호 3과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상의 핵산 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 서열 번호 3의 단편, 또는 서열 번호 3의 변이체의 단편은 서열 번호 3의, 또는 서열 번호 3의 변이체의 적어도 50, 100, 150, 200, 250, 300개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 이들 3' 말단 서열 또한 그 자체로서 실시태양이며, 이는 임의의 키메라 유전자 및 벡터를 작제하는데, 즉, 상이한 프로모터와 함께 사용될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 발현되는 핵산 서열은 하이브리드 단백질 또는 펩티드 또는 융합 단백질을 비롯한, 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열이다. 코딩 서열은 임의 기원, 즉, 식물, 진균(효모 포함), 동물, 세균, 합성, 바이러스 등의 것일 수 있다. 또한 예로서, 분비 신호 펩티드 또는 색소체 표적 신호와 같은 표적 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 코딩 서열은 프레임내에서 또한 카나마이신 내성을 부여하는 예를 들어, neo(또는 nptII) 유전자(EP 0 242 236)와 같은 선별가능하거나 점수화가 가능한 마커를 코딩하는 유전자에 연결됨으로써 세포는 용이하게 검출될 수 있는 융합 단백질을 발현시킬 수 있게 된다. 임의 유전자의 코딩 부위(cDNA 또는 게놈 DNA)가 사용될 수 있지만, 예시적인 하기 유전자의 코딩 부위가 바람직하게 본 발명에 따른 AA6 프로모터에 작동가능하게 연결된다: 1. 바이러스 핵산 서열(예를 들면, 바이러스 외피 단백질 유전자의 센스 및 안티센스 서열; 또한 하기를 참조할 수 있다)의 역위 반복 서열; 2. 질환 신호 전달 경로 유전자 또는 질환 내성 유전자; 3. 비생물적 스트레스 반응 관련 유전자(예를 들면, 샤인(SHINE) 전사 인자, 또는 CBF/DREB 유전자); 4. 치료제 및/또는 약물학적으로 중요한 산물 또는 산업적으로 가치있는 화합물의 생산을 위한 유전자를 비롯한, 2차 대사물질 생합성 유전자.

예로서, 농경상의 형질에 영향을 주는 유전자, 예로서, 제초제 내성에 대한 유전자(예를 들면, EPSPS 유전자, 바(bar) 또는 PAT 유전자), 수율 또는 질적 형질(예를 들면, 단백질 조성)에 영향을 주는 유전자 등과 같은 다른 유전자도 본 발명의 AA6 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다는 것은 분명하다.

본 발명에 따른 키메라 유전자 또는 벡터는 또한 미생물, 예로서, 세균(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas), 아그로박테리움, 바실러스(Bacillus) 등) 또는 진균 또는 조류 또는 곤충을 형질전환시키는데 사용될 수 있거나, 유전자 또는 벡터는 또한 바이러스를 공학 처리하는데 사용될 수 있다. 적합한 클로닝 비히클에 혼입된 본 발명의 핵산 서열로 세균을 형질전환시키는 것은 종래 방식으로, 바람직하게 문헌 [Maillon et al. (1989, FEMS Microbiol. Letters 60, 205-210.] 및 WO 90/06999에 기재되어 있는 종래의 전기천공 기법을 사용함으로써 수행될 수 있다. 원핵생물 숙주 세포에서 코딩 서열을 발현시키기 위해서는 핵산 서열의 코돈 용법을 적절히 최적화시킬 수 있다(유사하게, 식물 세포에서 코딩 서열을 발현시키기 위해서는 핵산 서열의 코돈 용법을 공지된 바와 같이 최적화시킬 수 있다). 인트론 서열이 제거되어야 하며, 최적의 발현을 위해 공지된 바와 같이 적합화될 수 있다.

단자엽 식물, 예로서, 목초 종, 예를 들면, 옥수수 또는 벼에서 핵산 서열의 발현을 증진시키기 위해서, 인트론, 바람직하게, 단자엽 인트론을 키메라 유전자에 부가할 수 있다. 예를 들어, 옥수수 Adh1 유전자의 인트론을 5' 조절 부위로 삽입시키는 것이 옥수수에서 발현을 증진시키는 것으로 나타났다(문헌 [Callis et. al., 1987, Genes Develop. 1: 1183-1200]). 유사하게, US 5,859, 347에 기재되어 있는 것과 같은 HSP70 인트론을 사용함으로써 발현을 증진시킬 수 있다. 따라서, 하나 이상의 인트론을 임의로 본 발명에 따른 임의의 프로모터 서열 내로, 또는 5'UTR 또는 코딩 서열 내로 삽입시킬 수 있다.

또다른 실시태양에서, AA6 프로모터를 사용하여 유전자 침묵화를 위한 키메라 유전자 및 벡터를 제조할 수 있는데, 그에 따라 프로모터는 표적 유전자(침묵화되는 내재성 유전자 또는 유전자 계열)의 센스 및/또는 안티센스 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다. 추가의 또다른 실시태양에서, 표적 유전자는 또한 침입성 식물 병원체, 예로서, 바이러스의 유전자 또는 유전자 계열일 수 있다. 예를 들어, 바이러스 내성 식물을 제조하기 위해 바이러스 외피 단백질 유전자의 역위 반복 서열을 사용할 수 있다. 바이러스 외피 단백질 유전자는 예를 들어, WO 96/21031에 기재되어 있다. "유전자 침묵화"란 하나 이상의 표적 유전자의 유전자 발현을 하향-조절하거나, 완전히 저해시키는 것을 지칭한다. 유전자 발현을 감소시키거나 소멸시키기 위하여 저해성 RNA를 사용하는 것은 당업계에 잘 확립되어 있고, 이는 여러 리뷰의 주제이기도 하다(예를 들면, 문헌 [Baulcombe, 1996, Plant Cell 8: 1833-1844]; [Stam et al, 1997, Plant Journal 12: 63-82]; [Depicker and Van Montagu, 1997, Curr. Opinion Cell Biol. 9: 373-382]). 식물에서 유전자 침묵화를 달성하기 위하여 이용될 수 있는 기술은 다수 존재하며, 예로서, 표적 유전자 모두 또는 그의 일부분의 안티센스 RNA를 생산하는 키메라 유전자(예를 들면, EP 0 140 308 B1, EP 0 240 208 B1 및 EP 0 223 399 B1을 참조할 수 있다), 또는 센스 RNA를 생산하는 키메라 유전자(공-억제로서도 지칭된다)(EP 0 465 572 B1을 참조할 수 있다)가 있다.

그러나, 지금까지 가장 성공적인 접근법은, 세포에서 더블 스트랜드 RNA(dsRNA)를 형성하고, 표적 유전자(들)을 침묵화시키는 표적 유전자의 센스 및 안티센스 RNA, 둘 모두의 생산("역위 반복")이었다. dsRNA 생산 및 유전자 침묵화를 위한 방법 및 벡터는 EP 1 068 311, EP 983 370 A1, EP 1 042 462 A1, EP 1 071 762 A1 및 EP 1 080 208 A1에 기재되어 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 벡터는 표적 유전자의 센스 및/또는 안티센스 DNA 단편에 작동가능하게 연결된 AA6 프로모터를 포함할 수 있다. 표적 유전자 서열의 짧은 (센스 및 안티센스) 스트래치, 예로서, 코딩 또는 비-코딩 서열의 약 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 이상의 뉴클레오티드가 충분할 수 있다. 예로서, 적어도 약 100개, 200개, 250개, 300개, 400개, 500개, 1000개, 1500개 이상의 뉴클레오티드와 같이, 보다 긴 서열 또한 빈번하게 사용된다. 바람직하게, 센스 및 안티센스 단편은 스페이서 서열, 예로서, 인트론에 의해 분리되어 있으며, 이는 dsRNA 형성시 루프(또는 헤어핀)를 형성한다. 임의 스트래치의 표적 유전자를 사용하여, 표적 유전자 또는 유전자 계열이 침묵화되는 유전자 침묵화 벡터 및 트랜스제닉 식물을 제조할 수 있다. 헤어핀 작제물을 생성하는 편리한 방법은 일반 벡터, 예로서, 게이트웨이(Gateway)® 기술에 기초한 벡터인 pHANNIBAL 및 pHELLSGATE를 사용하는 것이다(문헌 [Wesley et al. 2004, Methods Mol Biol. 265:117-30]; [Wesley et al. 2003, Methods Mol Biol. 236:273-86] 및 [Helliwell & Waterhouse 2003, Methods 30(4):289-95.](이들 모두 본원에서 참고로 인용된다).

표적 유전자의 보존 핵산 서열을 선택함으로써 숙주 식물에서 과 구성원을 침묵화시킬 수 있다. 표적 유전자가 침입성 병원체의 유전자 또는 유전자 계열인 경우, 병원체의 표적 유전자가 침묵화될 것이며, 식물은 병원에 대하여 내성을 띨 것이다. 표적 유전자 핵산 서열의 센스 및/또는 안티센스 DNA 단편에 작동가능하게 연결된 AA6 프로모터를 포함하며, 표적 유전자 침묵화 표현형을 나타내는 트랜스제닉 식물 또한 본원에 포함되어 있다. 표현형은 유전자 기능에 따라 달라질 것이며, 이는 화학 또는 분자상의 변화, 육안으로 볼 수 있거나, 볼 수 없을 수 있다. 그러므로, 그러한 키메라 유전자 및 벡터는 또한 유전자의 기능을 측정하거나 입증하기 위해서도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 키메라 유전자는 또한 숙주 게놈 내로 안정하게 도입될 수 있거나, 에피좀 유니트로서 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 트랜스제닉 세포 및 유기체

상기 방법에 의해 수득될 수 있는, 트랜스제닉 세포 및 유기체, 특히, 식물, 식물 세포, 조직 또는 기관도 제공한다. 이러한 세포 및 유기체는 그들 세포내 키메라 유전자의 존재를 특징으로 하거나, 게놈내 본 발명에 따른 AA6 프로모터의 존재를 특징으로 한다. 추가로, mRNA 전사체 또는 번역된 단백질은 세포 또는 유기체, 예를 들면, 식물 세포 또는 식물의 표현형을 변경시킬 수 있다.

AA6 프로모터가 구성적이기는 하지만, 게놈내 위치가 프로모터의 활성 및 키메라 유전자의 발현 수준에 영향을 줄 수 있다. 그러므로, 고도의 구성적 수준의 단백질, 또는 센스 및/또는 안티센스 전사체(침묵화 작제물 사용시)를 발현시키는 형질전환체("이벤트" 또는 "형질전환 이벤트")는 예를 들면, 카피수(써던 블롯 분석법), mRNA 전사체 수준(예를 들면, 노던 블롯 분석법 또는 RT-PCR)을 분석함으로써, 또는 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질의 존재 여부 및 상기 단백질의 수준을 분석함으로써(예를 들면, SDS-PAGE에 이어지는 웨스턴 블롯 분석법; ELISA 검정법, 면역세포학적 검정법 등) 선택될 수 있다. 또한 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스 조건하에 발현의 안정성에 대하여 형질전환체를 또한 시험할 수 있고, 하나 이상의 원하는 조건하에서 고도의 구성적 발현을 보유하는 그러한 이벤트는 동정될 수 있고, 추가 용도를 위해 선택될 수 있다.

트랜스제닉 식물은 예로서, 이종 교배, 자가 수분, 역 교배 등과 같은 전통적인 육종 방법에 사용될 수 있다. 형질전환체를 자가 수분함으로써 트랜스진에 대하여 동형접합성인 식물을 생성할 수 있다. 육종 방법은 당업계에 공지되어 있고, 식물 육종에 관한 표준 교과서, 예를 들면, 문헌 ([Allard, R. W., Principles of Plant Breeding (1960) New York, NY, Wiley, pp 485]; [Simmonds, N. W., Principles of Crop Improvement (1979), London, UK, Longman, pp 408]; [Sneep, J. et al, (1979) Tomato Breeding (p. 135-171) in: Breeding of Vegetable Crops, Mark J. Basset, (1986, editor), The Tomato crop: a scientific basis for improvement, by Atherton, J.G. & J. Rudich (editors), Plant Breeding Perspectives (1986)]; [Fehr, Principles of Cultivar Development - Theory and Technique (1987) New York, NY, MacMillan])에 기재되어 있다.

트랜스제닉 세포 또는 유기체는 또한 예를 들어, 재조합 단백질의 대량 생산을 위해 세포 배양물(식물 세포 배양물, 세균 또는 진균 세포 배양물 예로서, 효모 배양물, 인간 또는 포유동물 세포 배양물, 곤충 세포 배양물)에서 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 AA6 프로모터를 포함하는 세포를 포함하는, 세포 배양물을 제공한다.

본 발명에 따른 방법 및 용도

또한, (a) 발현되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 본 발명에 따른 AA6 프로모터 및/또는 AA6 3'UTR을 포함하는 키메라 유전자 또는 벡터를 생성하는 단계;

(b) 식물 또는 식물 세포를 상기 키메라 유전자 또는 벡터로 형질전환시키는 단계; 및

임의로, (c) 트랜스제닉 식물 또는 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

추가로, 비-스트레스 조건하에 강한 구성적 프로모터 활성을 제공하고, 이로써, 프로모터 활성은 식물이 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 노출된 경우에도 본질적으로 변하지 않는(적어도 감소되지 않거나, 유의적으로 감소하지 않는), 트랜스제닉 식물을 동정할 수 있다.

상기 식물은 종래 농업 및 육종 방법에서 사용될 수 있다. 특히, 프로모터 활성을 감소시키지 않으면서 식물을 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스 조건에 가하는 환경하에서 식물을 재배할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 고온 또는 저온, 강풍, 고염, 고도한 토양 오염물, 높거나 낮은 수위, 가뭄기를 갖는 지역, 고도한 질환 또는 페스트 압박, 고도한 방사선 등을 갖는 지역에서 프로모터 활성을 감소시키지 않으면서, 또는 적어도 유의적으로 감소시키지 않으면서, 트랜스제닉 식물을 재배하는 방법을 제공한다.

서열

서열 번호 1: "3kb" (2986 bp) AA6 프로모터

서열 번호 2: "5kb" (5000 bp) AA6 프로모터

서열 번호 3 : 토마토 시스테인 신타아제 유전자(AA6 유전자)의 3'UTR

서열 번호 4: 토마토 시스테인 신타아제 cDNA(AA6 cDNA)

서열 번호 5: 서열 번호 4(토마토 시토졸 시스테인 신타아제)에 의해 코딩되는 단백질

서열 번호 6: 일부 모호성을 갖는 "3kb" AA6 프로모터

서열 번호 7: 일부 모호성을 갖는 "5kb" AA6 프로모터

서열 번호 8: 재-서열 분석되고 E. 콜라이 기탁 번호 CBS120175에서와 같은, pKG8135의 "3kb" AA6 프로모터.

서열 번호 9: 재-서열 분석되고 E. 콜라이 기탁 번호 CBS120176에서와 같은, pKG8137의 "5kb" AA6 프로모터.

도 1: pKG1562의 벡터 지도

도 2: pKG1700 의 벡터 지도

도 3: pKG8135, pKG8136 및 pKG8137의 벡터 지도

하기의 비-제한적인 실시예는 본 발명에 따른 AA6 프로모터를 기술한다. 본 실시예에서 달리 언급하지 않는 한, 모든 재조합 DNA 기법은 문헌 ([Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 및 [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY]; 및 [in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA])에 기재되어 있는 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 식물 분자 실험을 위함 표준 물질 및 방법은 BIOS 사이언티픽 퍼블리케이션 리미티드(BIOS Scientific Publications Ltd(영국 소재)) 및 영국 소재의 블랙웰 사이언티픽 퍼블리케이션(Blackwell Scientific Publications)에 의해 공동으로 공개된, R.D.D. 크로이(R.D.D. Croy)에 의해 문헌 [Plant Molecular Biology Labfax (1993)]에 기재되어 있다.

실시예 1 - 물질 및 방법

리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) 변종 머니버그(Moneyberg)에서 cDNA를 사용하는 차별적 디스플레이 분석법을 실시하였다.

스트레스 조건하에서의 발현 시험을 L. 에스쿨렌툼 변종 머니버그에서 실시하였다.

벡터 pKG8136, pKG8137 및 pKG1700을 사용한 형질전환은 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 변종 SR1 및 L. 에스쿨렌툼 변종 RZ 52201에서 실시하였다. 하기 문헌에 기재되어 있는 바와 같이 식물 형질전환을 수행하였다:

토마토 및 담배 형질전환을 위해:

문헌 [An G., B.D. Watson and CC. Chiang. 1986. Transformation of tobacco, tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system. Plant Physiol. 81: 301-305].

담배 형질전환을 위해: 문헌 [Horsch R.B., J. Fry, N. Hoffman, J. Neidermeyer, S. G. Rogers and R.T. Fraley. 1988. Leaf disc transformation. In: Plant Molecular Biology Manual A5. Dordrecht, Netherlands, Kluwer Academic Publishers, pp 1-9].

토마토 형질전환을 위해: [Koornneef M., M. Jongsma, R. Weide, P. Zabel and J. Hille. 1986. Transformation of tomato. In: Nevins DJ. and R.A. Jones, eds. Tomato Biotechnology. New York, NY, USA, Alan R. Liss, Inc. pp 169-178].

5' 및 3' 말단 RACE는 클론테크 라보라토리즈 인코포레이티드(CLONTECH Laboratories Inc.)로부터 입수한 SMART™ RACE cDNA 증폭용 키트(SMART™ RACE cDNA Amplification Kit)를 사용하여 실시하였다.

PCR 산물의 클로닝은 플라스미드 pCR®2.1을 사용하여 인비트로겐 BV.(Invitrogen BV.)로부터 입수한 오리지날 TA 클로닝® 키트(Original TA Cloning® Kit)로 실시하였다.

DNA 서열 분석은 베이스클리어(BaseClear)(네덜란드 레이덴 BH 2302 P.O. 박스 1336 소재)가 실시하였다

형질전환 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 변종 GV2260 내로 혼입시켰다.

프로모터 활성의 정량 분석법은 조직학적 GUS 검정법을 사용하여 수행하였다: 다양한 식물 부분을 대기 산소의 존재하에서 인산염 완충액(5-브로모-4-클로로 -인돌릴 글루쿠로니드, 1 mg/ml, K₂HPO₄, 40 mM, KH₂PO₄, 10 mM, pH 7.4)중 Xgluc 기질과 함께 진탕시키면서 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 에탄올로 반복하여 세척하여 샘플을 탈색시켰다. 비-트랜스제닉 식물은 음성 대조군으로 사용하였다.

프로모터 활성의 정량 분석법은 형광 GUS 검정법을 사용하여 수행하였다:

총 단백질 샘플은 어린 잎 물질로부터 제조하였다; 대략 크기가 동일한 것으로, 풀링된 잎 조각으로부터 샘플을 제조하고, 각 식물의 상이한 부분으로부터 발생 단계를 시험하였다. 새잎 물질은 금속 비드를 사용하여 인산염 완충액(Na₂HPO₄, 77.4 mM, NaH₂PO₄, 22.6 mM)중에서 연마한 후, 원심분리하고 상등액을 수집하였다.

형광 GUS 검정법:

몰레큘라 프로브, 인코포레이티드(Molecular Probes, Inc.)로부터 입수한 나노 오렌지 키트(Nano Orange Kit)를 사용하여 각 상등액으로부터 얻은 분취량의 단백질 농도를 측정하였다. 총 단백질 농도를 정규화시키기 위하여 단백질 샘플을 희석시켰다. 37℃에서 밤새도록 분취량의 단백질 샘플을 기질 4-메틸 움벨리페릴 β-d-글루쿠로니드(MUG)(최종 농도 1 mg/ml)와 함께 인큐베이션시켰다. 분취량의 반응 혼합물을 제거하고, Na₂CO₃ 용액(최종 농도 1.1 M)을 가하여 반응을 종결시킨 후, 355nm에서의 여기에 의해 유발된 460nm에서 방출값을 측정함으로써 시점 0부터 밤새도록 인큐베이션시킨 후까지 형광을 측정하였다.

실시예 2 - 프로모터 단리를 위한 유전자 선별

cDNA-AFLP®(문헌 [Volkmuth W., et al., 2003, Genome-Wide cDNA-AFLP® Analysis of the Arabidopsis Transcriptome, OMICS, 7, 2]; [Vos, P. and Stanssens P., 2002, AFLP-based transcript profiling, Current Protocols in Molecular Biology, unit 25B.5., Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G. Smith, J.A., Struhl, K., John Wiley and Sons, New York]; 및 [Vos et al., 1995, AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research 23: 4407-4414])을 사용하여 다양한 발생 단계(어린 잎, 오랜 잎, 줄기, 뿌리, 시험관내 잎, 시험관내 줄기, 시험관내 뿌리, 유합 조직, 미성숙 및 성숙 녹색 열매, 채색기(Breaker stage) 열매, 적색 열매, 꽃, 전체 묘목)에서의 토마토 식물 물질로부터 단리된 cDNA 상에서 차별적 분석법을 실시하였다. Taq1 프라이머에 대한 2개의 선택 뉴클레오티드 및 Mse1 프라이머에 대한 3개의 선택 뉴클레오티드를 사용한, 가능한 모든 Taq1/Mse1 프라이머 조합물을 사용하여 발현 프로파일을 작성하였다. 이어서 유전자 단편 발현 프로파일은 키진 N.V.(Keygene N.V.) 사유의 소프트웨어(Improve™)를 사용하여 작성하고 데이타베이스에 저장하였다. 12개의 Taq1/Mse1 프라이머 조합물에 상응하는 13개의 후보 전사체가 모든 샘플링된 조직에서 강한 강한 구성적 발현을 나타내는 것으로 선별되었다.

이어서, 생물적 및 비생물적 스트레스하의 다양한 조직에서 cDNA-AFLP®에 의해 후보 유전자의 발현을 측정하였다. 13주된 토마토 식물(머니버그)을 하기와 같이 분리된 스트레스 조건을 사용하여 14일 동안 재배하였다:

수확하기 2일 전의 오이 모자이크 바이러스(CMV: Cucumber Mosaic Virus)로 감염, 고온(낮 37℃ 및 밤 25℃), 저온(낮 1O℃ 및 밤 5℃), 가뭄 스트레스(식물 사멸을 피할 정도의 최소량의 수분, 동시에 낮 37℃ 및 밤 25℃) 및 손상(족집게로 으깨어진 잎).

하기 물질을 수확하였다: 어린 잎, 오랜 잎, 줄기, 뿌리, 및 꽃눈. 이들 물질로부터의 cDNA를 생산하고, 13개의 선택된 후보 전사체를 증폭시키는데 필요한 동일한 프라이머 조합물과 함께(및 또한 선택적 뉴클레오티드를 별로 갖지 않는 프라이머 조합물을 사용하여) cDNA-AFLP®을 사용하여 차별적 분석법을 실시하였다(프라이머 서열에 대해서는 하기를 참조할 수있다). 상기 스트레스 조건 모두에 대하여 계속하여 강한 구성적 발현을 제공하는 7개의 전사체를 선별하였다.

시스테인 신타아제 유전자 (AA6) 단편을 증폭시키는 (+2/+2) AFLP 프라이머의 프라이머 서열은 하기와 같다:

후보 cDNA AFLP 단편을 겔로부터 절단하고, 정제하고, 클로닝하고, 서열 분석하였다. 이어서, 서열 정보를 사용하여 RACE PCR에 관한 프라이머를 디자인하였다.

7개의 후보 유전자의 신장된 유전자 단편을 생산하기 위하여 5' 및 3', 양측 말단 SMART-RACE-PCR(Clontech)을 실시하고, pCR2.1(Invitrogen)로 클로닝한 후 서열 분석을 실시하였다(네덜란드 레이덴 BH 2302 P.O. 박스 1336에 소재하는 BaseClear). 공개 데이타베이스로부터의 상동성 EST와 함께 신장된 유전자 단편을 조립하였다. 이로써 5개의 후보 유전자에 대한 전장의 cDNA 서열을 수득하였다.

10개의 상이한 제한 효소로 분해된 토마토 게놈 DNA과, 프로브로서 cDNA의 5' 말단 단편을 사용하는 써던 블롯팅을 이용함으로써 5개의 유전자에 대한 카피수 평가를 실시하였다. 동일 프로브가 또한 현 머니버그 BAC 라이브러리(Keygene N.V.)에 혼성화되었다.

전장 cDNAs중 하나(IS158-53으로 지정; 서열 번호 4)는 토마토 시토졸 시스테인 신타아제 유전자 (UP│Q9FS27 (Q9FS27)에 상동성인 토마토│TC 162833)에 대하여 매우 고도한 상동성을 나타내었다. TC 162833 및 서열 번호 4, 둘 모두 동일한 아미노산 서열(서열 번호 5)을 코딩하지만, 두 뉴클레오티드의 핵산 수준에서는 차이가 난다. 서열 번호 4의 207번 위치의 뉴클레오티드는 'C'인 반면 TC162833에서는 'T'이고, 동시에 서열 번호 4의 372번 위치의 뉴클레오티드는 'A'인 반면 TC162833에서는 'G'이다.

서열 번호 4는 생물적 및 비생물적 스트레스 조건하에서도 구성적으로 발현되었고, 토마토 게놈의 카피수는 적었고(대략 2개의 카피), 이는 키진 N.V. 토마토 BAC 라이브러리의 BAC 9에 잘 혼성화되었으며, 이로써, 그의 프로모터 단리에 대한 착수하였다.

그의 전장의 cDNA가 토마토 시스테인 신타아제 유전자(서열 번호 4)와 상동성인 유전자의 프로모터를 하기와 같이 선택하였다.

실시예 3 - AA6 프로모터 서열 단리

주형으로서 BAC 9로부터의 게놈 DNA를 사용하는 링커 PCR을 실시하기 위하여 시스테인 신타아제로 지정된 토마토 유전자의 유도된 서열 상에 디자인된 프라이머(프라이머 서열에 대해서는 하기를 참조할 수 있다)를 사용하였다. 3'UTR 서열(서열 번호 3)은 주형으로서 머니버그 토마토의 게놈 DNA를 사용하는 장기 PCR에 의해 수득하였다.

시스테인 신타아제 서열 상에 디자인된 프라이머는 하기와 같다:

프로모터의 경우 5'-GTTCGATGAGGACACTCTCGC-3 및

네스티드 프라이머의 경우 5'-CAATTAAAGTTGCTAAGCGTCCTGA-3'

종결자의 경우 5'-TCAGTTACATCCTTGGCAATTCC-3' 및

네스티드 프라이머의 경우 5'-CAGAGAACATGACTGTGGAGCC-3'

실시예 4 - 형질전환 벡터 작제

하나는 5000bp(서열 번호 2)이고, 또하나는 2986bp(서열 번호 1)인, 시스테인 신타아제 5' 상류 부위의 AA6 프로모터 DNA 단편 2개를 gusA 코딩 부위와 함께, 내재성 시스테인 신타아제 종결 인자(서열 번호 3) 또는 nos 종결 인자를 포함하는 플라스미드 pKG1562(벡터 백본, 노팔린 신타아제 프로모터에 의해 구동되는 nptII 함유)로 결찰시켰다.

작제물은,

시스테인 신타아제 5' 상류 부위의 2986bp(서열 번호 1): gusA: 3'nos를 함유하는 pKG8135(도 3 참조),

시스테인 신타아제 5' 상류 부위의 5000bp(서열 번호 2): gusA: 3'nos를 함 유하는 pKG8136(도 3 참조),

시스테인 신타아제 5' 상류 부위의 5000bp(서열 번호 2): gusA: 3'시스테인 신타아제(서열 번호 3)를 함유하는 pKG8137(도 3 참조)로 지정하였다.

대조군 작제물은 하기와 같이 CaMV35S 프로모터([Franck et al., 상기 동일]): gusA: 3'nos를 함유하는 pKG1700(도 2 참조)을 사용하였다.

사용된 형질전환 벡터의 벡터 지도에 관한 상세한 설명은 도 1-3을 참조할 수 있다.

플라스미드 pKG8135, pKG8136, pKG8137 및 pKG1700을 아그로박테리움 투메파시엔스 내로 혼입시켰다. 담배(변종 SR1) 및 토마토(변종 RZ 52201)를 형질전환시키고, 카나마이신 선별하에 재생시키고, 파종시키기 위하여 1차 재생체(T₀)를 재배하였다.

실시예 5 - 형질전환체의 발현 분석

이들 벡터에서 gusA의 발현은 AA6 프로모터, 또는 CaMV35S 프로모터에 의해 발현되기 때문에 식물에서 생산되는 β-D-글루코시다제(GUS) 수준이 프로모터의 효능을 지시한다. GUS 존재에 관한 조직학적 염색 검정법은 기질로서 5-브로모-4-클로로-인돌릴 글루쿠로니드(XGluc)를 사용하여 실시하였다.

묘목기부터 개화 식물기까지의 수개의 발생 단계에서의 담배 및 토마토 T1 식물, 둘 모두(1차 형질전환체의 자가 수분 이후에 수득)의 잎 조직 상에서 염색 실험을 실시하였다. 추가로, 꽃눈, 꽃송이, 꽃줄기(담배), 꽃자루, 정단생장점 눈, 잎, 잎자루, 주 줄기, 뿌리, 종자 및 열매(토마토)를 비롯한 성숙한 담채 및 토마토계로부터의 다양한 물질 상에서, 및 발아 종자 및 묘목 상에서 GUS에 관한 조직학적 염색 실험을 실시하였다.

AA6 프로모터 또는 CaMV35S 프로모터의 긴 단편(서열 번호 2) 또는 짧은 단편(서열 번호 1)에 의해 gusA가 구동되었을 때, 담배 및 토마토, 둘 모두의 시험된 모든 조직에서 GUS 발현이 검출되었다.

시각적(색상 염색) 비교를 통해 AA6 프로모터 단편 뿐만 아니라, CaMV35S 프로모터가 담배 및 토마토, 둘 모두에서 작동한 것으로 나타났다.

기질로서 4-메틸 움벨리페릴 β-d-글루쿠로니드(MUG)를 사용하는 형광 검정법으로 GUS 발현의 정량적 분석법을 실시하였다. 담배 및 토마토, 둘 모두의 어린 잎에서 5000bp 단편 AA6 프로모터(pKG8137)에 의해 구동된 GUS 발현을 CaMV35S 프로모터(pKG1700)에 의해 구동된 GUS 발현과 비교하였다.

HindIII 제한 효소로 분해된 담배 및 토마토 식물과 프로브로서 사용된 nptII 단편을 이용한 써던 블롯팅을 사용하여 단일 카피 식물을 선별하는데, 이 공정은 제한 효소로서 XbaI를 사용하여 반복하였다. 각 T-DNA 삽입체는 nptII 및 gusA 각각 1개의 카피를 함유하기 때문에 nptII 카피수가 gusA 카피수를 반영한다. 또한, 공지된 토마토 또는 담배 내부 대조군과 비교하여 nptII 유전자의 존재 및 상대적인 정량을 검출하는 인베이더® 검정법(Third Wave Technologies, Inc.)을 사용함으로써 카피수를 확인하였는데; 상기 검정법을 T1 세대에 대해 적용함으로써 반접합성 개체 및 동형접합성 개체 사이를 식별할 수 있다.

반접합성 및 동형접합성 단일 카피 형질전환체 및 담배 및 토마토 식물의 0개의 카피 대조군으로부터 총 단백질 추출물을 제조하였다. 나노오렌지(NanoOrange)™ 키트(Molecular Probes)를 사용하여 단백질 함량을 측정한 후, 추출 완충액으로 희석시켜 샘플내 단백질 농도를 정규화하였다.

MUG 기질을 첨가한 후, 초기 형광을 측정하였다(여기 필터, 355nm 및 발광 필터, 460nm). 이어서, 샘플을 인큐베이션시키고, 절단된 메틸 움벨리페론(MU)에 기인한 형광을 측정하였다. 인큐베이션 1시간 당 증가된 형광량을 계산하였다. 비-트랜스제닉 담배 또는 토마토 총 단백질 추출물(시험 샘플의 총 단백질 함량과 동일) 배경하의 GUS 효소(Sigma-Aldrich Chemie B.V.) 활성을 나타내는 검정 곡선을 작성하였다. 트랜스제닉 시험 샘플에 존재하는 GUS 효소 농도(총 식물 단백질 추출물 1mg당 mU)도 샘플로부터의 형광 데이타 및 검정 곡선을 사용하여 계산하였다.

동형접합성 단일 카피 식물에서, AA6 프로모터(pKG8137) 및 CaMV35S 프로모터에 의해 구동된 GUS 발현 수준이 담배에서는 유의적으로 상이하지 않은 반면, 토마토에서는 AA6 프로모터에 기인한 GUS의 발현이 CaMV35S 프로모터에 기인한 것보다 최고 79%까지 더 높았다는 것이 이중 실험의 통계학적 분석법을 통해 나타났다(하기 표에 데이타 세트를 나타냄).

담배에서의 GUS 발현

[표 1]

반접합성 담배 식물에 대한 계당 평균 GUS 활성(총 식물 단백질 추출물 1 mg당 mU로 표시)과, 그의 표준 편차 및 평균의 표준 오차(SEM: standard error of means).

[표 2]

동형접합성 담배 식물에 대한 계당 평균 GUS 활성(총 식물 단백질 추출물 1 mg당 mU로 표시)과, 그의 표준 편차 및 평균의 표준 오차(SEM)

알 수 있는 바와 같이, AA6 프로모터(5kb 프로모터)의 평균 프로모터 활성은 트랜스제닉 담배 잎(트랜스진에 대하여 반접합성인 식물 및 동형접합성인 식물, 둘 모두에서)에서 35S 프로모터의 것과 본질적으로 동일하다.

토마토에서의 GUS 발현

[표 3]

반접합성 토마토 식물에 대한 계당 평균 GUS 활성(총 식물 단백질 추출물 1 mg당 mU로 표시)과, 그의 표준 편차 및 평균의 표준 오차(SEM).

[표 4]

동형접합성 토마토 식물에 대한 계당 평균 GUS 활성(총 식물 단백질 추출물 1 mg당 mU로 표시)과, 그의 표준 편차 및 평균의 표준 오차(SEM).

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 동형접합성 토마토 식물의 평균 프로모터 활성은 토마토에서 트랜스제닉 토마토 잎(트랜스진에 대하여 반접합성인 식물 및 동형접합성인 식물, 둘 모두에서)에서 35S 프로모터의 것과 비교할 때 유의적으로 더 높다(35S 활성을 기준으로 하였을 때, 데이타 세트 1에서는 35S보다 약 52%가 더 높고, 데이타 세트 2에서는 35S보다 약 79%가 더 높다).

실시예 6 - 기타 식물 종에서의 프로모터 활성

기타 식물에서 AA6 및 CaMV35S 프로모터에 의해 구동되는 GUS 발현을 비교 시험하고 확인하였다. 현 시점에서 AA6 프로모터에 의해 구동된 트랜스진 발현에 관하여 시험된 종에 관한 목록에는 (상기 나타난 담배 및 토마토 이외의) 상추, 멜론, 및 브라시카가 포함되며, 이들 각각의 구성적 발현을 나타내었다.

실시예 7 - "3 kb " 및 "5 kb " AA6 프로모터의 재-서열 분석

서열을 체크하고 모호성을 해명하기 위하여 벡터 pKG8135 및 pKG8137(도 3)에 존재하는 핵산 서열에 관하여 다시 서열을 분석하였다. 모호한 위치는 서열 번호 6("3kb"프로모터) 및 서열 번호 7("5kb"프로모터)의 서열 목록 상에 표시되어 있으며, 여기서, 모호한 위치의 가능성이 가장 높은 뉴클레오티드도 동정된다(또한, 하기 표 참조)

모호한 뉴클레오티드 때문에 최소의 서열 차이가 존재하는데: 서열 번호 1은 서열 번호 8 및 6, 각각에 대하여 99.6% 및 99.7%의 서열 동일성을 갖는다("니들만' 사용, 갭 개방 = 10.0, 갭 확장 = 0.5; DNAFull 매트릭스). 서열 번호 2는 서열 번호 9 및 7, 각각에 대하여 99.6% 및 99.8%의 서열 동일성을 갖는다("니들만' 사 용, 갭 개방 = 10.0, 갭 확장 = 0.5; DNAFull 매트릭스).

모호성 및 모호성 해명:

SEQUENCE LISTING <110> KeyGene NV <120> Constitutive plant promoter <130> P6005193PCT1 <150> PCT/NL2005/050083 <151> 2005-12-16 <160> 9 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2986 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 1 tggttttcta attctctcat ctcttttctc tgttcttgta tcttatccct ttctgattat 60 cttcttttgt gttaatctct ccttagttaa tatattatta ctttttgcat gtattccaat 120 agtaacttat attcaacaat aattatatac aatagtgttt gtattagaat cgagtttatt 180 tcataaagtc tcgaaagtaa tacattactt tttttagaat aaaaaaaaaa cttgggaata 240 tggaagttca atctacgcaa aaacctattt tatgatgtca aatgaattca atgtttttac 300 tcatattgca atataaaaag aacagggcta gtgatttttt ttccttcaaa tgattgctag 360 ttaattaatg gacttgttct ttcttttgtt tcatattctt gcctttttta agaccttcca 420 aatcatcaac acaaaaacac cttagacatt attgcatccg acttaattta tatgacataa 480 aatataaagt ttttttttta aaataaaaat aaagagtttt aaattttata agaaagaaat 540 atgtatattt aagttcatac taattataaa aacatgattt attaaaaata aatataaaaa 600 atatatcata taaattaaaa cgaatgaaat atagtatatt aggatgagaa ttcaaaggac 660 tagaatttcc aaagaaatwt gwwgtttttt atgttttatt agttgacttg ttctatgccg 720 gtcttgctcg ttcaccatat atagaccaac acttaaagta aatagtggta atttgatttg 780 acctttcaaa accttcaagg gccaattaga cagaaacttt atattataaa agtaataatg 840 aatagtagta ataaactaat tattaccaag aaatgatgaa taattgttta tatatatata 900 tagtgcaata ataattcata accggccgat cctatatatt tattataaaa tatagaagtt 960 atccaataat ttcatgtctt ttattaaaaa aattcattca ataatttatg ttttttcttt 1020 tacaaagttt aataatagaa cttatttaat taaaactaat gttactatta tgatgaaata 1080 gtcgagatct cttcattttt cataagagat tcaggattca agctgattat gtgagtgaaa 1140 tcctaaaaaa tgaaatttgt aatacgtaaa taatacgaat atcaaatacg aaacaaaaag 1200 aaaattaatg ttattatgat tttgaatttt aattatggta ttttaactac tgaagttgtc 1260 tcattgaatg tatattataa ttaagcatat acaattccag aaaatatata ttattatcta 1320 ggtgttcttt taatataata tttgagtttt atgataaaat ttgattaact tttaaaggaa 1380 aatcttttta aaagtggtca cattagattg agataaatca gaaaggacac gtcacaatct 1440 aaatatgatt tttttaactt catctataaa tatctttcaa attatataca atgcttacgt 1500 gaataaatgc tggcactaat gaattaatat ttgtttttaa aataaaatgt tgaaattgmd 1560 tttagaagtg aacacatgag tcgaagtgtt agaaatagtt actaataaat aatcaatgta 1620 tttgatataa aaagtgttat taagttgttg ttttgttaga ataactcaaa cattttcatt 1680 ttatttaatt aaaaattata aatttaaact atatgtataa acaaaatgag caataataaa 1740 tatagaatga agcaaacatt atgaatttta ttttgaaaaa aaatgatgtg aattataaaa 1800 atattatata atatttgatc aaacaaattg tttactataa gctaaagaaa tcttgatttt 1860 aacttataaa tactttactt atcaaatacg taaaaaaatt aaaaattacc tataaatcaa 1920 tttaatctaa cactttagtc aaacacatta taaatatgaa cttgttgtgc cacgattata 1980 cacatatatt tttttttatt tattgatata tcctcaaaaa taatgtatct cttaaaatat 2040 tagtatttat taagatacgg gttcatgaaa tattctttta acttcaaatt tttatttgac 2100 tttgaaaaca gacccctaaa aagtttaaaa ataacaaaaa ggcaacaaaa aagtttgaaa 2160 caagaactaa aaaagttaga tgcccaaatc tgcacgataa ggtaagtcaa acaacgacaa 2220 aatttagtaa attattgatt gtagaaaatg aagcaaatga aggtggctat ccttatataa 2280 agctatattc agtactctcc tcaacacagt cacagtagat ttcatttctt tgtctttgtc 2340 aaatcctagg taatttttct ctgcccctta atattttttt ttgctcttga ttgcctttta 2400 tggaaaattg gttctctgtt catttgacaa gattgctgtt ttgttttttc ttcagtctga 2460 ttagattttt gctctagatt cgtgggtttt acttgtaaag gtattaggga gtgagtgaga 2520 tgggaaaatt tcratttttt tttaaaaaaa aattatggga taaaaagtga ttccgagaaa 2580 tggggttttg ttttttgaga ttgtatgaac tggggatgat ggattcttgg tggtgattga 2640 ataaaaatgg gatctttaat tattagggat aagattaaag atgctcatgt tcttctttga 2700 atttgtttgt atgcaaagtt ttgagctttt gggtgttttc cccctaattt agctggcaaa 2760 tagttgtaat tggtggaagt tggaaaagga aaagaattaa gaagaaattg atgttcattt 2820 cagtttcttt ttatattttg taaggaacgg aatcaccggt gtcgagtgga atagatttag 2880 agggttctca aatagttaaa tgagtagctg gtttgatgaa atttgttttg attgtataag 2940 atttcactta gttttgctat aaatcatcgc agaatcaacc tgatac 2986 <210> 2 <211> 5000 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 2 catataaccc tgaaaattat tttaccattc tttgatcttc tttttcattt tatttgacca 60 atttataagt attattttaa aagtttaatt ttttttcaaa tttcacgatg aattatggcc 120 aaatttctcc tagttgtgtt ttgaccataa ataaaaatag aagttgttct ttactttttt 180 gtgagtaatt tgaagtgatt tttttcctaa gtttttgaaa ttcaacttta atttttttyt 240 gtttttttgt gacaaggaaa tctgtcttgc tatcttttgg gtgcatacac ggtaaaattc 300 ctgctcatat gcaataactc actctaactt taagttgaac ttaacaattt tacgattaaa 360 gtgttttcta aactcaactt catgaaaaaa ttaaaagtta ttgaggaaat tttaaaaata 420 actaacactg aataatataa ttaaactcct tagctaatgt ttctctaatt acgattcata 480 gctactatta gaaggagaga agtgagcgac aatatgagag gaggagaaat acgagcgaga 540 tctgagagag atacaatcaa tttgtgtatc tgattgatac ttgtattatt gttgtaattc 600 ataataaatt gtatttaatt atatttatct attgccttgt atattgtatt tatgtgttac 660 catgtatatt tgtgctacca ttttgtattt gtatcattga ctgctatcgt tgtacgtgta 720 ttgtagaaag agagagagga gaggaatagt gagaagattg ctataawycc aaattataat 780 tacgaatagt aattctttta aattataatt atgtatagtt aagacatatt ttgtacgttt 840 atctacattt gccccaaaat tattctcctg tggactctca aagcaggaac caaatagtga 900 tggattgggc tcctagttct gaacgaattt tgttattggg cttaaagtta aggttggttg 960 gtcaggtttt tgggtttgca tatctatggg gtagtaaggt ttattctttt ctcgagattc 1020 gatatttata tttgagcttt attaaatttg gattcacacc aaaaagtttt atattgaggg 1080 gggggggggg taaagtgctt cctaataaag gcaaaaacga ttccctactt agaagattca 1140 aactcaaaaa actcgggatg aagtatttac aattctatca cgttgttgat tagttagctt 1200 tatcattgta tgaggtatac ttgtgggata gaatgttaag acaatttatg aatttctttt 1260 ttgaatctag aatgtggttt gatgaacaat ggacttaaaa gaagttaatg gaaaatgaga 1320 aatcaaattt caataaaaat gaagttttta gtgattcttt tcatctatcg ataggtaaaa 1380 gatatatcat ttggtctaat tcaatcccaa aagttagttt aaagggaaaa gcgggttata 1440 aagagtacat tcgtctcatt aaccaccaat gtgaactttt attattcttc aacacccatc 1500 ttattcctag tttttttagc atttggtgtg tgaacaattt tttatttcgg aggtccraca 1560 tcgggtgaga agagttctac tctgatatca tgtgaaatta ggttttgagc taaacttaca 1620 ccaaaaagct agcttaaaag atgaaggatt gtacaagcct tataaggaat tcacccgtct 1680 tattaagcat caatataaaa cttttgtcat tcttaaacaa tataacttcg ataaaaccat 1740 ycaaataaat atagtataca catgtacaaa gatgtatcta ctcaatgaaa tatatgagcg 1800 caaatgagat actatgacta ccatcatcgt aaataaaaaa 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ttaaagtaaa aaaaaaaacc gttcaagtat cttttagtgc 180 ttttgtaatt ctactgtttc tacaacattt gaaatttata gagctgttgc ttcttgttca 240 tgaaggtttt tgcttcttgt tccataattt tacgctacgt tgctcggact cttccaaaat 300 gtccactaat gcgtgttgga ttcttcaaaa atagtgtaac tttgaag 347 <210> 4 <211> 975 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 4 atggcggggg aaaagactgg aattgccaag gatgtaactg aattgatagg taacactcct 60 ttggtatacc tgaataatgt tgtggatggg tgtgttgcac gtgttgctgc caagctggaa 120 agcatggagc catgctctag tgttaaggat aggattggtt atagtatgat tacagatgct 180 gaggagaagg gcttaatcaa acctggcgag agtgtcctca tcgaacctac aagtggaaac 240 accggtgtag gattggcatt catggctgct gctaaaggct acaaactcat cattacgatg 300 ccttcttcaa tgagtcttga gagaagaatt attctgcgtg ctttcggtgc tgagttggtg 360 cttactgacc cagcaaaagg gatgaaaggt gcaatttcga aggccgaaga gataaggggc 420 aaaacaccta actcctatat tcttcagcaa tttgaaaacc ctgctaaccc aaagatacac 480 tatgaaacca ctggtcctga gatctggaaa ggctcaaacg ggaaagtgga tgctctagtc 540 tctggaattg gaacaggagg cacaataaca ggttcaggca agtatttgag 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Claims (12)

1. 게놈내 통합된 키메라 유전자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포 또는 식물 조직 또는 기관으로서,

   상기 키메라 유전자는 상동성 또는 이종성 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 구성적 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는

   (a) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 핵산 서열;

   (b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 기능성 단편;

   (c) 서열 번호 1 또는 2와 70% 이상의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열;

   (d) (c)의 핵산 서열의 기능성 단편

   의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포 또는 식물 조직 또는 기관.
2. 제1항에 있어서, 식물, 세포, 조직 또는 기관이 하나 이상의 생물적 및/또는 비생물적 스트레스에 노출된 경우, 프로모터 활성이 유의적으로 감소되지 않는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포 또는 식물 조직 또는 기관.
3. (a) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 핵산 서열;

   (b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 단편;

   (c) 서열 번호 1 또는 2와 70% 이상의 서열 동일성을 포함하는 핵산 서열;

   (d) (c)의 핵산 서열의 단편

   으로부터 선택되는 서열을 포함하고, 식물 세포 내로 도입된 경우 프로모터 활성을 갖는 단리된 핵산 서열.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, (b)의 단편이 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 200개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 단편.
5. 상동성 또는 이종성 핵산 서열 및 임의로 3'UTR 서열에 작동가능하게 연결된, 제3항 또는 제4항에 따른 핵산 서열을 포함하는 키메라 유전자.
6. 제5항에 있어서, 상기 3'UTR 서열이 서열 번호 3, 또는 서열 번호 3의 단편, 또는 서열 번호 3과 70% 이상의 핵산 동일성을 포함하는 핵산 서열인 키메라 유전자.
7. 제3항 또는 제4항에 따른 핵산 서열, 또는 제5항 또는 제6항에 따른 키메라 유전자를 포함하는 벡터.
8. 제5항 또는 제6항에 따른 키메라 유전자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포.
9. 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포 또는 식물 조직 또는 기관에서 센스 및/또는 안티센스 핵산 서열의 구성적 발현을 위한 시토졸 식물 시스테인 신타아제 유전자의 프로모터의 용도.
10. 제9항에 있어서, 시토졸 식물 시스테인 신타아제 유전자가 서열 번호 5의 단백질을 코딩하는 것인 용도.
11. (a) 제5항 또는 제6항에 따른 키메라 유전자, 또는 제7항에 따른 벡터를 생성하는 단계;

    (b) 상기 키메라 유전자 또는 벡터로 식물 또는 식물 세포를 형질전환시키는 단계; 및

    임의로, (c) 트랜스제닉 식물을 재생시키는 단계

    를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 제조하는 방법.
12. 서열 번호 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.

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