CN102604949A - 一种乙醇脱氢酶启动子驱动的厌氧组织选择性基因表达方法及应用 - Google Patents
一种乙醇脱氢酶启动子驱动的厌氧组织选择性基因表达方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体涉及利用蛋白质组学筛选厌氧特异性高效表达启动子的方法，以及一种由乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法及应用。该种由乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法主要由厌氧特异性诱导的乙醇脱氢酶启动子作为目的基因启动子、厌氧靶向细菌、低拷贝质粒等组成，使得目的基因能够在体内外低氧或者乏氧的环境中特异性高效表达。利用该种乙醇脱氢酶启动子驱动的厌氧组织选择性基因治疗方法能够更有效地治疗包括肿瘤在内的厌氧组织疾病，也可用于制备抗肿瘤药物。
Description
技术领域
本发明属基因工程生物技术领域，具体涉及一种厌氧特异性启动子的蛋白质组学筛选方法，以及利用该方法筛选获得的厌氧特异性乙醇脱氢酶启动子驱动的治疗基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达方法及应用。
背景技术
肿瘤基因治疗能够在基因水平根本上弥补肿瘤发生发展过程产生的基因表达异常状况、纠正肿瘤的失调状态，因而具有广阔的应用前景。但是肿瘤基因治疗仍存在一些瓶颈环节的难题，例如，在系统给药情况下如何使被转入的治疗基因实现只限制在实体瘤内部或者整个肿瘤环境内高水平、高特异性地表达，而不在其它正常组织表达，从而有效消除或降低目的基因可能带来的副作用？这一技术难题限制了基因治疗在实体瘤治疗中的实际应用。在开发适用于癌症基因治疗的载体的研发过程中，基因治疗载体的安全性和有效性都是极其重要的因素。很多实体瘤，包括大多数乳腺癌和黑色素瘤等原发瘤，都具有特征性的缺氧区或坏死区[Patyar
S等，2010，Journal
of Biomedical Science 17:21；Li X等，2003，Cancer Gene
Therapy 10:105-111]。肿瘤患者体内的组织氧浓度分析结果表明，肿瘤内的氧分压为10-30
mm汞柱，而在正常组织中的氧分压则达24-66 mm汞柱。而实体瘤中的缺氧坏死区的细胞对于放疗和化疗均不敏感，所以经典的放化疗不足以完全杀死肿瘤细胞，从而导致肿瘤病人对放化疗的耐受、也造成肿瘤的复发和转移[Li X等，2003，Cancer Gene
Therapy 10:105-111；Lee CH等，2005，Molecular
Therapy 11:707-716]。
根据这一实际情况，在针对实体瘤的基因治疗研究领域，开发靶向于实体瘤内部缺氧坏死区的基因运载表达体系成为了近年的研究重点。一些厌氧或兼性厌氧细菌如：鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella
typhimurium）, 梭状芽孢杆菌（genera Clostridium）和双歧杆菌（Bifidobacterium），可以在系统性感染后，选择性地在实体瘤内缺氧区定殖生长[Patyar S等，2010，Journal of Biomedical Science 17:21；Li X等，2003，Cancer Gene Therapy 10:105-111]，与此同时它们还能刺激机体产生免疫抗肿瘤效应[Lee CH等，2009，Journal of Immunotherapy 32:376-388；Chen G等，2009，Cancer Science 100:2437-2443；Avogadri F等，2005，Cancer Research 65:3920-3927；Liu T等，2010，Cancer Gene Therapy 17:97-108；Eisenstein TK等，2001，Microbes and Infection 3:1223-1231]。然而，肿瘤内单一的细菌繁殖不足以阻止恶性肿瘤的繁殖。为了增加细菌的抑瘤能力，研究者们开始探究如何利用沙门氏菌携带特异的基因或蛋白到肿瘤组织而不进入其它组织。近年来，科学家们已经利用鼠伤寒沙门氏菌作为基因治疗的肿瘤靶向性载体进行了一系列工作，并且取得了可喜的效果。在这些研究工作中，研究人员对于如何使抗肿瘤的治疗基因进行表达开展了一系列尝试，他们或者尝试了一些原核生物的启动子，比如阿拉伯糖诱导启动子、外膜孔蛋白C（ompC）启动子，或者采用了真核细胞组成型启动子如：β-actin启动子，或者真核细胞中的辐射诱导启动子等，它们都表现出了较显著的抑制肿瘤生长作用[Ganai S等，2009，British Journal
of Cancer 101:1683-1691；Brader P等，2008，Clinical Cancer
Research 14:2295-2302；Weth R等，2001，Cancer Gene
Therapy 8:599-611；Loessner H等，2007，Cellular
Microbiology 9:1529-1537；Nguyen VH等，2010，Cancer Research
70:18-23；Loeffler M等，2007，Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 104:12879-12883；Loeffler
M等，2008，Journal
of the National Cancer Institute 100:1113-1116；Loeffler
M等，2008，Cancer
Gene Therapy 15:787-794；Loeffler M等，2009，Cancer
Immunology Immunotherapy 58:769-775；Lee
CH等，2004，Journal
of Gene Medicine 6:1382-1393；Lee CH等，2005，Cancer Gene
Therapy 12:175-184；King I等，2002，Human Gene
Therapy 13:1225-1233；Li YH等，2001，International
Journal of Cancer 94:438-443]。然而，在上述基因治疗表达体系中依然存在一些问题：例如，研究发现，利用减毒株治疗荷瘤小鼠，细菌不仅在肿瘤内富集，还在其它正常组织定殖[Clairmont
C等，2000，Journal
of Infectious Diseases 181:1996-2002] ，因此，目的基因会在正常组织中进行表达，导致目的基因非肿瘤组织特异性的表达，从而产生体内毒性；又如，重组的沙门氏菌常被用来携带组成型表达的启动子并启动的下游目的基因，这种多器官分布特征很可能会引起一定的负面效应（如：毒性效应）从而影响沙门氏菌携带目的基因治疗的特异性[King
I等，2002，Human
Gene Therapy 13:1225-1233；Low KB等，1999，Nature
Biotechnology 17:37-41]；再如，携带强启动子表达的高水平的异源蛋白可能会引起细菌胞内毒性，最终导致感染过程中大量的质粒丢失[Hautefort
I等，2003，Applied
and Environmental Microbiology 69：7480-7491]。因此还存在另外一些问题，如，基因表达的质粒载体在体内的稳定性较差、容易丢失；目的基因在体内表达水平较低、在绝大多数的以往研究中无法利用常规的蛋白电泳和蛋白质印迹（Western
blot）方法进行目标治疗基因的表达检测[Weth R等，2001，Cancer Gene
Therapy 8:599-611；Li YH等，2001，International
Journal of Cancer 94:438-443；Pawelek
JM等，1997，Cancer
Research 57:4537-4544；Liu SC等，2002，Gene Therapy
9:291-306；Nemunaitis J等，2003，Cancer Gene
Therapy 10:737-744]。
如何解决上述肿瘤靶向性细菌介导的基因治疗中的关键难题，实现目的基因在肿瘤靶向性细菌中肿瘤组织选择性的、高水平表达，同时也在体内具有良好的质粒稳定性，从而保证肿瘤靶向性细菌介导的目的基因治疗不仅具有良好、持续的治疗效果，同时降低治疗的毒副作用，这是肿瘤靶向性目的基因治疗的亟待突破之处。
发明内容
针对厌氧靶向性细菌介导的基因治疗中存在的上述关键难题，本发明的目的旨在发明一种利用蛋白质组学技术筛选厌氧选择性表达的启动子的方法，利用该方法筛选的乙醇脱氢酶启动子和厌氧靶向性细菌进行基因治疗的过程中实现治疗基因在厌氧组织中选择性地、高水平表达，同时又使得目的基因在体内具有良好的质粒稳定性的方法，从而保证厌氧靶向性细菌介导的目的基因治疗不仅具有良好、持续的治疗效果，同时降低治疗的毒副作用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是利用蛋白质组学技术筛选厌氧选择性表达的基因及其启动子，从而获得在厌氧环境中选择性表达的启动子作为目的基因的启动子，使得目的基因能够在低氧或者乏氧的环境中表达。
进一步地，利用上述利用蛋白质组学技术筛选厌氧选择性表达的细菌基因及其启动子的筛选方法从沙门氏菌中经蛋白质组学筛选所获得的乙醇脱氢酶启动子padhE，该padhE启动子在原核细菌中高度保守。其序列与各种沙门氏菌肠道亚种（鼠伤寒沙门氏菌4/74、T000240、SL1344、14028S、D23580、LT2，沙门氏菌肠道亚种-海德堡沙门氏菌SL476等）相比，其DNA序列同源性高达100%。与沙门氏菌肠道各亚种（肠炎沙门氏菌P125109、都柏林沙门氏菌CT_02021853、鸡沙门氏菌.287/91、纽波特沙门氏菌SL254、副伤寒沙门氏菌SPB7等）中，其DNA序列同源性高达99%。与沙门氏菌肠道各亚种（阿格纳沙门氏菌SL483、施瓦曾格隆得沙门氏菌CVM19633、猪霍乱沙门氏菌SC-B67、丙型副伤寒沙门氏菌 RKS4594、伤寒沙门氏菌Ty2、韦太夫雷登沙门氏菌2007-60-3289-1、甲型副伤寒沙门氏菌AKU_12601、甲型副伤寒沙门氏菌ATCC
9150等）相比，其DNA序列同源性高达98%。与伤寒沙门氏菌肠道亚种（伤寒沙门氏菌）CT18株相比，其DNA序列同源性高达98%；与沙门氏菌肠道各亚种（亚利桑那沙门氏菌
62:z4,z23:--）93%同源；与变栖克雷伯氏菌
At-22和肺炎克雷伯菌亚属（肺炎菌NTUH-K2044、342、肺炎菌 MGF 78578）相比，其DNA序列同源性高达88%；与克氏柠檬酸杆菌 ATCC BAA-895株相比，其DNA序列同源性高达81%；与啮齿类柠檬酸杆菌 ICC168株相比，其DNA序列同源性高达80%；与痢疾志贺氏菌 Sd197相比，其DNA序列同源性高达79%；与大肠杆菌各亚种（SMS-3-5、536、083: H1株、UM146、IHE3034、026:H11株、LF82、、S88、、APEC 01、UTI89、KO11、W株、BL21(DE3)、ETEC H10407、ABU
83972、0111: H-株、0103:
H2株、大肠杆菌B株REL606、BL21-Gold(DE3)pLysS AG'、UMN026、ED1a、、IAI39、IAI1、55989、SE11、ATCC 8739、E24377A、HS、CFT073、042、DH1(ME8569)、DH1、0157: H7株、BW2952、0127: H6 E2348/69、0157:
H7株EC4115、K12亚株DH10B、K12亚株W3110、K12亚株MG1655、0157:H7株凯萨0157:H7 EDL933、0155:H7株CB9615、SE15）相比，其DNA序列同源性高达77%；与费格森埃希菌ATCC35469相比，其DNA序列同源性高达77%；与痢疾杆菌（2002017、2a株、2a株2457T）相比，其DNA序列同源性高达77%；与索氏志贺氏菌Ss046、鲍地氏志贺氏杆菌 CDC3083-94、弗氏志贺菌5株8401、鲍地氏志贺氏杆菌 Sb227等相比，其DNA序列同源性高达77%；与大肠杆菌 0157相比，其DNA序列同源性高达76%；与阴沟乳杆菌SCF1相比，其DNA序列同源性高达75%。因此，padhE启动子在细菌中高度保守，原核细菌的padhE启动子均能够作为厌氧靶向性细菌介导的目的基因厌氧特异性表达的启动子。
进一步地，上述padhE启动子的核心序列必须至少包括adhE基因上游1200bp区域之内的序列，才能实现该启动子在低氧或者乏氧的环境下选择性表达。在该序列中，adhE基因上游500bp或者1000bp区域的序列均能够实现报告基因的高水平表达，但是都不具有厌氧特异性表达的特性；在此基础上，adhE基因上游1000bp- 1200bp的DNA序列能够使启动子表现出显著的厌氧诱导表达的特性。大于adhE基因上游1200bp区域的序列由于包括了adhE基因上游1200bp的DNA序列，因此当然具有低氧或者乏氧选择性表达的性质，启动子1200bp区域已经包含有部分上游的ychE基因序列，ychE基因也具有辅助padhE启动子的功能。
一种上述padhE启动子驱动的目标基因分泌表达质粒的克隆方法，利用该方法将padhE启动子驱动的治疗基因克隆在含有原核复制子的质粒中，能够在低氧或者乏氧的环境下实现目的基因在厌氧靶向性细菌中的表达。
进一步地，通过PCR反应扩增由SPA分泌信号肽和目标基因的融合基因片段，再通过重叠PCR反应方法将上述基因片段与adhE启动子片段进行拼接，连接产物经过限制性内切酶酶切后，和酶切后的大肠杆菌质粒进行连接，并转化TOP10感受态，进行克隆培养和筛选，获得含有adhE启动子的目标基因的分泌表达质粒，能够在低氧或者乏氧的环境下实现目的基因在厌氧靶向性细菌中的表达。
一种上述padhE启动子驱动的目的基因在厌氧靶向性细菌中稳定存在的表达质粒的克隆方法，将padhE启动子及其控制下的目的基因克隆在低拷贝质粒中，能够实现padhE启动子及其控制下的目的基因在体内环境中能在厌氧靶向性细菌中稳定存在。上述低拷贝质粒能够在肿瘤中大量存在,而且都可以稳定地在肿瘤组织内特异的表达、其表达水平不随时间变化。
进一步地，通过PCR反应扩增由SPA分泌信号肽和目标基因的融合基因片段，再通过重叠PCR反应方法将上述基因片段与adhE启动子片段进行拼接，连接产物经过限制性内切酶酶切后，和酶切后的大肠杆菌pBR322质粒进行连接，并转化TOP10感受态，进行克隆培养和筛选，获得含有adhE启动子的目标基因的分泌表达质粒，上述表达质粒转化在减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，通过口饲给药、静脉给药或者腹腔给药肿瘤动物模型后，上述低拷贝质粒能够在含有减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的肿瘤组织中大量存在,而且稳定地在肿瘤组织内特异地表达、其表达水平不随时间变化。
一种含有padh启动子驱动的治疗基因的表达菌株制备方法，将上述克隆有padh启动子驱动的目的基因的质粒载体转化在厌氧靶向性细菌中。
一种通过定位整合于染色体而稳定表达目标基因的沙门氏菌菌株的构建方法，通过PCR反应扩增目标基因，然后重叠PCR反应将其和padhE-目标基因片段进行拼接；同时用PCR引物MSB-1和引物MSB-2从沙门氏菌基因组扩增得到MSB基因片段，然后再通过重叠PCR反应将其和padhE-目标基因片段进行拼接，然后再克隆在pDS132载体中，转化TOP10感受态，进行克隆培养和筛选，此克隆为含有padhE-目标基因自杀质粒。将含有padhE-目标基因自杀质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，利用抗性筛选padhE-目标基因同源重组整合进入细菌特异的染色体位点MSB基因的菌株。
进一步地，一种通过定位整合于染色体而稳定表达GFP的沙门氏菌菌株的构建方法，利用引物GFP-1
和GFP-2从pEGFP质粒中扩增得到GFP基因片段，然后利用重叠PCR反应将其和padhE片段进行拼接，然后用引物MSB-1和引物MSB-2从沙门氏菌基因组扩增获得MSB片段，此为同源重组片段。然后利用引物MSB-1和引物GFP-2进行扩增，最后将PCR产物用Hind III和Sal I酶切，然后与Hind III和Sal I酶切后的pDS132载体进行连接，并转化TOP10感受态，进行克隆培养和筛选，此克隆为含有启动子adhE的GFP自杀质粒。将含有padhE-目标基因自杀质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，利用抗性筛选padhE-目标基因同源重组整合进入细菌特异的染色体位点MSB基因的菌株。
GFP-1引物为：5’-
TGCTGCAAATGCTATGGTGAGCAAGGCGA-3’；
GFP-2引物为：5’-
ATACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’；
MSB-1引物为：5’-GCGTCTAGAGTGAGCAGATCGTCCATTG-3’；
MSB-2引物为：5’-GAGCTGCAGCGTTACATGCACTTGCGTA-3’。
一种低毒性的含有padh启动子驱动的治疗基因的表达菌株递送到体内的方法，将含有padh启动子驱动的目的基因的表达菌株通过口服途径，能够将含有padh启动子驱动的目的基因的表达菌株递送到体内，能够实现其在厌氧组织中的靶向性聚集，同时毒副作用明显低于其它常规方法。
一种含有padh启动子驱动的目的基因的厌氧靶向细菌在体内在厌氧组织中的靶向性递送和厌氧组织选择性表达的方法，将上述含有padh启动子驱动的目的基因的厌氧靶向细菌通过腹腔注射、静脉注射或者口服的方法传送到体内，能够高水平地在厌氧组织中表达目的基因、而在其它正常组织中不表达目的基因。
利用上述的一种padh启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧靶向性和选择性抗厌氧组织疾病治疗药物中的应用。
利用上述的一种padh启动子驱动的目的基因在厌氧肿瘤组织靶向递送和选择性的稳定表达的方法在制备厌氧肿瘤靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物中应用。
进一步地，利用减毒沙门氏菌VNP20009携带padh启动子驱动Endostatin基因（VNPpadhEEnd）在荷 Lewis肺癌小鼠肿瘤模型上进行肿瘤治疗，与对照组相比较，减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd和减毒沙门氏菌VNP明显降低了肿瘤的生长速度。在细菌接种后12到18天，减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组肿瘤体积明显小于减毒沙门氏菌VNP。进一步分析肿瘤体积倍增时间，对照组为3.46天，减毒沙门氏菌VNP组为4.44天，减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组为5.21天。与空白对照组（11.43天）相比较，减毒沙门氏菌VNP组和减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组肿瘤生长延迟明显增加，两者分别为8.45天和11.43天。在黑色素肿瘤治疗中，与减毒沙门氏菌VNP组和空白对照组相比较，减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd显著抑制了黑色素瘤的生长。减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组的肿瘤体积倍增时间为6.96天，明显长于减毒沙门氏菌VNP组（5.86 天）和空白对照组（2.96 天）。同时肿瘤生长延迟时间也在减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组明显增加，平均为17.07天；而在减毒沙门氏菌VNP组和空白对照组分别平均为12.90天和7.56天。在肺癌肿瘤模型中，减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd 组小鼠的中位生存期为49.0天，明显高于对照组（18.0天）和减毒沙门氏菌VNP组（25.92天）。Kaplan-Meier生存分析显示减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd处理能明显提高小鼠的生存率。减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组和减毒沙门氏菌VNP组的30天生存率分别为86 % 和71 %。在黑色素肿瘤模型中，减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组中位生存期为28.5天，空白对照组为11.5天，减毒沙门氏菌VNP组为19.5天。与对照组相比较，减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组的中位生存期明显提高。减毒沙门氏菌VNPpadhEEnd组和减毒沙门氏菌VNP组的30天生存率分别为25%和0%。
与已有的厌氧特异性启动子及厌氧靶向性细菌为传输系统的厌氧组织特异性基因治疗相比较，本发明的有益效果在于：
（1）本发明利用蛋白质组学筛选方法从沙门氏菌VNP20009中筛选出的厌氧特异性表达的adhE基因，其在有氧状态下不表达，在厌氧环境中表达水平上升120多倍，padhE是一个高水平、厌氧特异性表达的启动子。体内实验也表明：该padhE启动子能够在动物体内高水平、肿瘤组织特异性地表达luciferase、GFP、Endostatin等目标基因。
（2）本发明不但借助于厌氧靶向性细菌实现了目的基因在厌氧组织（包括肿瘤组织）的靶向性输送，而且利用原核的padhE启动子使得目的基因只在低氧或者乏氧的肿瘤组织核心区表达，从而有效避免了目的基因在一些正常组织中的表达，进一步降低了因为目的基因表达带来的潜在体内毒性。本发明实现了目的基因在厌氧组织中特异性的递送再加上目的基因在厌氧组织中选择性的表达，这种目的基因在厌氧组织中选择性的表达利用了厌氧的肿瘤组织核心区域所具有的低氧或者乏氧特征，不需要人为的、额外的诱导。
（3）本发明发现低拷贝数的质粒能够使携带的目的基因在体内更稳定地存在，从而展现出更好的治疗效果。
（4）在绝大多数的以往有关肿瘤靶向性细菌介导的基因治疗研究报道中，虽然都报道具有肿瘤治疗效果，但是目的基因在体内外的表达水平较低、无法利用常规的蛋白电泳和蛋白质印迹方法进行目的基因的表达检测。在本发明的一种乙醇脱氢酶启动子驱动的厌氧组织选择性基因治疗方法，目的基因获得了高水平的表达，其表达无论在体内、还是体外都能够用常规的蛋白电泳和蛋白质印迹方法直接检测。因此，本发明不仅解决了目的基因在厌氧组织中特异性的递送和目的基因在厌氧组织（包括肿瘤组织）中选择性表达的难题，而且解决了目的基因在体内外、及在肿瘤组织中高表达的问题，从而有力地保证了厌氧组织（包括肿瘤组织）靶向递送和选择性稳定表达的基因治疗方法制备的抗厌氧组织疾病（包括肿瘤）药物良好的治疗效果。
因此，本发明建立了一种利用蛋白质组学筛选厌氧特异性高效表达启动子的方法，及其利用该方法筛选获得的乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法及其应用。
附图说明
附图缩写说明：
VNP: 减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009；adhE
: 乙醇脱氢酶基因；VNPpLuc: VNP携带luciferase基因质粒（不含启动子）；VNPpadhEEnd:
VNP携带pEndostatin质粒；VNPpBR: VNP携带pBR322空载质粒； mutVNP-GFP: GFP整合入基因组的沙门氏菌VNP；GFP: 绿色荧光蛋白。
图1. VNP在厌氧和有氧培养时蛋白表达差异的二维电泳分析。
1A. 二维电泳分析VNP在厌氧和有氧培养时的蛋白表达差异。1、厌氧诱导表达；2、有氧培养。
1B. 质谱鉴定出的adhE蛋白的基因的启动子结构示意图。
图2. 乙醇脱氢酶启动子厌氧条件启动GFP表达或促进Endostatin的分泌表达分析。
2A. 构建GFP稳定表达菌株策略。adhE-GFP片段通过同源重组方法整合入VNP的染色体中。msbB1：msbB同源臂1；PadhE：adhE启动子；GFP：绿色荧光蛋白；msbB2:msbB同源臂2。
2B. 荧光显微镜分析mutVNP-GFP的厌氧诱导表达特性和流式荧光定量。荧光密度值为不同细菌样品组的平均值（平均标准偏差，n=3，†P<0.001）：1、有氧培养；2、厌氧培养。
2C. 内皮抑素Endostatin分泌表达载体构建示意图。PadhE：adhE启动子；SpA：金黄色葡萄球菌A蛋白分泌信号；Endostatin：内皮抑素基因。
2D. 利用抗人的特异性Endostatin抗体western blot的方法来检测VNP携带padhEEnd质粒时胞外和胞内的Endostatin蛋白表达情况分析。1：厌氧培养；2：有氧培养；3：细胞外培养上清；4：细胞的裂解上清。
图3. 鼠伤寒沙门氏菌VNP20009在B16F10黑色素瘤中选择性地聚集并靶向肿瘤组织表达目的基因。
3A. 沙门氏菌VNP携带luciferase质粒并诱导表达分析。分别在不同给药后时间，对组织进行匀浆处理并检测luciferase的值（平均标准偏差，n=3，†P<0.001肿瘤组织和肝脏、脾脏比较极显著）。1、肿瘤；2、肝脏；3、脾脏。
3B. 荧光素酶报告基因检测adhE启动子在C57BL/6小鼠肿瘤中的诱导情况。（平均标准偏差，n=3，†P<0.001）。1、肿瘤；2、肝脏；3、脾脏。
3C. 沙门氏菌携带的padhEEnd质粒在肿瘤内的稳定性分析。总细菌数量利用无氨苄抗性的LB平板进行计数（空框所示），含有质粒的细菌利用有氨苄抗性的LB平板计数（填充图所示）。每个点表示一只小鼠。1、有氨苄抗性；2、无氨苄抗性。
3D. 荧光共聚焦显微镜证实沙门氏菌mutVNP-GFP只在肿瘤的厌氧坏死区富集，ahdE启动子可以在这一区域诱导表达。V: 新生肿瘤细胞，N：肿瘤坏死区。1、沙门氏菌mutVNP-GFP感染肿瘤组织的共聚焦荧光图。以上每个试验均重复三次。
图4. 沙门氏菌VNPpadhEEnd在小鼠Lewis肺癌和B16F10黑色素瘤皮下模型上的抗肿瘤验证。
4A. 不同给药后Lewis肺癌生长的平均体积变化情况，n=7，n表示每组动物数量。*P<0.05。1、对照组；2、沙门氏菌VNP单独给药组；3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。
4B. 不同给药后Lewis肺癌的肿瘤翻倍时间和肿瘤生长延滞时间的分析。n=7。†p<0.001：沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组与沙门氏菌VNP组相比有极显著差异。1、空白对照。2、沙门氏菌VNP单独处理组。3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。
4C. 不同给药后B16F10黑色素瘤生长的平均体积变化情况，n=8，n表示每组动物数量。*P<0.05。1、对照组；2、沙门氏菌VNP单独给药组；3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。
4D. 不同给药后B16F10黑色素瘤的肿瘤翻倍时间分析。n=8。†p<0.001：沙门氏菌VNPpadhEEnd组与沙门氏菌VNP处理组相比有极显著差异。1、空白对照。2、沙门氏菌VNP单独处理组。3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。
4E. 不同给药后B16F10黑色素瘤的肿瘤生长延滞时间的分析。n=8。†p<0.001,
沙门氏菌VNPpadhEEnd组与沙门氏菌VNP处理组相比有极显著差异。1、空白对照。2、沙门氏菌VNP单独处理组。3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。
图5. 沙门氏菌介导的padhEEnd靶向基因治疗显著地延长携带Lewis肺癌和黑色素瘤小鼠的生存时间。
5A. 沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组与对照组相比显著延长Lewis肺癌小鼠的生存时间。平均标准偏差，n=7，†P<0.001：通过Kaplan-Meier生存分析表示沙门氏菌VNPpadhEEnd组与对照组组相比，有极显著差异。1、对照组；2、沙门氏菌VNP单独处理组；3、沙门氏菌VNPpadhEEnd处理组。
5B. 沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组与对照组相比显著延长B16F10黑色素瘤小鼠的生存时间。平均标准偏差，n=8，†P<0.01：通过Kaplan-Meier生存分析表示沙门氏菌VNPpadhEEnd组与对照组组相比，有极显著差异。1、对照组；2、沙门氏菌VNP单独给药组；3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。
图6. 沙门氏菌VNPpadhEEnd在体内、体外显著抑制新生血管的生成。
6A. CAM（鸡胚尿囊膜实验）分析。不同细菌分别处理于8周龄大小的鸡胚。处理后48小时后分别对尿囊膜给药区进行观察分析。1、PBS空白对照组处理；2、沙门氏菌VNP上清液组，剂量为200微克蛋白/个鸡胚；3、沙门氏菌VNPpadhEEnd上清液组，剂量为100微克蛋白/个鸡胚；4、沙门氏菌VNPpadhEEnd上清液组，剂量为200微克蛋白/个鸡胚。
6B. 沙门氏菌VNPpadhEEnd处理后肿瘤内VEGF的含量分析。1、空白对照组。2、沙门氏菌VNP单独给药组。3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。n=3，每组三只小鼠，*P<0.05表示沙门氏菌VNPpadhEEnd组较VNP单独给药组显著抑制肿瘤内VEGF含量, **P<0.01表示沙门氏菌VNPpadhEEnd组较空白对照组较显著抑制肿瘤内VEGF含量。
6C. 切片分析给药处理后肿瘤微血管CD31分析染色情况（400倍放大）。1、空白对照组；2、沙门氏菌VNP单独给药组；3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。
6D. 肿瘤内CD31染色定量分析。n=3每组三只小鼠，*P<0.05表示沙门氏菌VNPpadhEEnd组较沙门氏菌VNP单独给药组显著抑制肿瘤内CD31表征的微血管生成, **P<0.01表示沙门氏菌VNPpadhEEnd组较空白对照组较显著抑制肿瘤内CD31表征的微血管生成。1、空白对照组；2、沙门氏菌VNP单独给药组；3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组。
图7. 沙门氏菌VNPpadhEEnd给药诱导黑色素瘤细胞坏死促进细菌的定殖能力并促进黑色素瘤细胞凋亡。
7A. 沙门氏菌VNPpadhEEnd给药后肿瘤组织切片的坏死和凋亡分析。肿瘤坏死分析通过组织的HE染色分析（100倍放大）。新生肿瘤细胞如图蓝色箭头所示。TUNEL分析用来检测肿瘤细胞凋亡情况（200倍放大）。TUNEL阳性细胞如绿色箭头所示。1、空白对照；2、沙门氏菌VNP单独给药组；3、沙门氏菌VNPpadhEEnd给药组；4、HE染色分析；5、TUNEL分析。
7B. 肿瘤内坏死和凋亡的定量分析。肿瘤坏死定量由软件Image
J完成。每只小鼠肿瘤准备4张不同切面的切片进行分析，每组4只小鼠。TUNEL阳性细胞分别在3个阳性密度最大的区域进行计数分析。†P<0.01表示沙门氏菌VNPpadhEEnd组较沙门氏菌VNP组极显著地诱导肿瘤坏死。*P<0.05表示沙门氏菌VNPpadhEEnd组较沙门氏菌VNP处理组显著地诱导肿瘤凋亡。
7C. 不同给药后12天肿瘤内细菌滴度分析。每组4只小鼠，n=4，†P<0.05， 沙门氏菌VNPpadhEEndostatin组较沙门氏菌VNPpBR组显著促进细菌定殖。
具体实施方式
实施例：
表
1.
基因克隆和重组质粒构建所用引物。
1．表达载体的构建:
构建用所有的酶均购自于日本TAKARA公司，pBR322质粒购于日本的TaKaRa公司，由于其良好的体内稳定性在本文中被采用。人源的Endostatin和沙门氏菌的adhE基因序列均来自于美国NCBI数据库。
Luciferase相关载体的构建：
（1）pLuc的构建：
利用引物Luc-3 (5’-TCTAAGCTTATGGAAGACGCCAAAAAC-3’)， Luc-4(5’-T ATGTCGACTTACACGGCGATC-3’)，从pGL3-basic质粒（Promega公司, 美国）上扩增luciferase基因，并用内切酶Hind III和Sal I进行酶切，然后与Hind III和Sal I酶切后的pBR322载体进行连接，并转化TOP10感受态，进行克隆培养和筛选，此克隆为无启动子的luciferase对照质粒。
（2）padhELuc的构建：
利用引物LUC-1 (5’-TGCTGCAAATGCTATGGAAGACGCCAAAAAC-3’),
LUC-2 (5’-GACGTCGACTTACAATTTGGACTTTCCGCCCTT-3’)，从pGL3-basic质粒（Promega公司, 美国）上扩增luciferase基因，并利用引物AP-1
(5’- GTATCTAGAGTTGAATCACGGTTAGCT-3’)，AP-2-secretion
(5’-GTTTTTCTTTTT CAAAATGCTCTCCTGATAATG-3’) 从沙门氏菌VNP20009基因组上扩增adhE基因，然后利用重叠PCR反应将luciferase片段和adhE启动子片段进行拼接。最后将产物用Hind III和Sal I酶切，然后与Hind III和Sal I酶切后的pBR322载体进行连接，并转化TOP10感受态，进行克隆培养和筛选，此克隆为含有启动子adhE的luciferase表达质粒。
（3）pDSMSB-GFP自杀载体的构建：
利用引物GFP-1 (5’-TGCTGCAAATGCTATggTgAgCAAGGGCgA-3’)，GFP-2 (5’-ATACTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’)从pEGFP质粒（Clontech公司，美国）中扩增得到GFP基因片段（用上述引物扩增adhE启动子片段，利用重叠PCR反应将其和adhE片段进行拼接，然后用引物MSB-1(5’-GCGTCTAGAGTG AGCAGATCGTCCATTG-3’)和引物MSB-2 (5’-GAGCTGCAGCGTTACATGCAC TTGCGTA-3’)从沙门氏菌基因组扩增得到MSB片段，此为同源重组片段，然后利用引物MSB-1和引物GFP-2最后将产物用Hind III和Sal I酶切，然后与Hind III和Sal I酶切后的pDS132载体进行连接，并转化TOP10感受态，进行克隆培养和筛选，此克隆为含有启动子adhE的GFP自杀质粒。
（4）Endostatin分泌表达质粒的构建：
人源的内皮抑素(Endostatin)基因是利用引物ENDO-1(5’-TGCTGCAAATGC
TCATAGCCACCGCGA-3’)和ENDO-2(5’-GAGGTCGACCTACTTGGAGGCAGT
CATG-3’)从pET28a-Endostatin质粒（本实验室保存）中扩增得到，SPA分泌信号时有引物SPA-1(5’-TTGAAAAAGAAAAACATTTATTCAATTC-3’)和引物SPA-2 (5’-GCATTTGCAGCAGGTGTTAC-3’)扩增得到，再由引物SPA-1和引物ENDO-2将SPA分泌信号和Endostatin片段进行拼接得到SPA-Endostatin片段，再利用引物AP-1和ENDO-2通过重叠PCR反应方法将上述片段与adhE启动子片段进行拼接，连接产物经过限制性内切酶Hind
III和 Sal I酶切后，和酶切后的pBR322载体进行连接，并转化TOP10感受态，进行克隆培养和筛选，此克隆为含有adhE启动子的Endostatin分泌表达质粒。
2．重组沙门氏菌的转染：
制备沙门氏菌电转感受态细胞：沙门氏菌VNP20009于液态LB培养基中在37°C生长至对数生长期中期。4°C，6000 rpm离心收集菌体，分别用预先至于冰上的灭菌超纯水和10%的甘油洗涤菌体二遍。最后用10%的甘油稀释至菌浓度约为1010 cfu/40 µl 10%甘油。
沙门氏菌电转化：再将目的基因的质粒与预先制备好的电转化感受态细胞混合后，与冰上放置不足5 min，将其转入2 mm电转杯，充分去除电转杯外的水分，然后使用基因脉冲仪（Bio-Rad）进行电转化，电转化的条件为1.6 KV，25 μF，400 Ω。电转完成后立即用900 μl的LB溶液将已电转化的细菌充分吸出，与37°C的摇床孵育1小时，孵育完成后，4°C离心，并将沉淀涂于有抗性的LB平板上，于37°C培养箱中培养过夜。
3．重组沙门氏菌携带载体pBR322的体内稳定性分析：
重组沙门氏菌携带常用的原核基因载体pBR322（低拷贝）在感染荷瘤B6小鼠后肿瘤中载体质粒的丢失情况，即两种载体的体内稳定性。在给药后适当时间处死荷瘤小鼠，取出肿瘤组织，用组织匀浆器加入无菌PBS进行匀浆（组织重量g:PBS体积ml=1:1），匀浆后吸出，用无菌的PBS进行梯度稀释，最后将合适的稀释液涂布于无抗性和含有氨苄抗性的LB平板，于37°C培养箱进行培养过夜。分别在有氨苄青霉素抗性（含有质粒的重组沙门氏菌才能生长）和无氨苄青霉素抗性的平板对肿瘤内分离的重组沙门氏菌的质粒丢失进行分析，对长出的菌落进行菌落计数。
4．二维电泳和质谱分析（MALDI-TOF）。
分别在有氧和厌氧条件下生长的10ML 沙门氏菌培养到每毫升109个细胞的密度，然后4度离心收获菌体。菌体用预冷的PBS洗3遍，2000g离心5分钟。然后将菌体重悬在细胞裂解液（7M 尿素， 2M 硫脲， 40Mm DTT， 2% IPG 缓冲液）中，液氮反复冻融3次。裂解液超声去除核酸，然后4度超速离心（40000g）60分钟。离心上清用Bradford方法测定蛋白浓度。以上所有步骤均在冰上操作。每个样品上样量为120微克总蛋白，首先在pH值3-10的线性胶条上进行等点聚焦，然后再进行第二向的SDS-PAGE胶分离。分离后的蛋白点用银染显色。双蒸水洗2遍后，每块胶进行扫描（300dpi），图像用Adobe Photoshop软件编辑，然后用Image
Master Platinum（GE Healthcare）软件进行分析。变化大于2倍的点认为是有意义的。差异表达的蛋白点被切割下来并进行胰酶消化。
MALDI样品根据仪器所提供的方法准备。质谱数据在Ultraflex II MALDI-TOF-TOF质谱仪上用FlexControl 3.0 软件获得。MALDI-TOF
光谱以阳离子反射模式记录700-4000 Da 的质量范围，离子加速电压为25kv。获得的质谱数据用FlexAnalysis 3.0
软件进行处理。峰检测运算法则：SNAP；S/N 极限：3；质量因子极限：50。胰酶自消化离子峰（trypsin_[108-115],
MH+842.509, trypsin_[58-77], MH+2211.104）被用作内部参照。基质和/或自酶解的胰酶片段或者预知的污染离子（角蛋白）均被排除。最终产生的肽指纹谱在NCBInr 20101105（101942个序列）数据库里用Mascot (v2.3.02)软件自动模式进行比对。搜寻比对的参数如下：有意义的蛋白MOWSE得分设定为P<0.05，最低质量精度为120 ppm，胰酶为消化酶，允许1个误差酶切位点，设置cysteine carbamidomethylation 为固定修饰，methionine oxidation为可变修饰。
5．通过染色体整合厌氧特异性稳定表达GFP的沙门氏菌VNP菌株的构建。
adhE-GFP片段通过自杀载体克隆中的MSB与沙门氏菌VNP上的MSB区发生特异性的重组，并在抗性压力下整合入VNP的染色体里。并通过PCR的方法进行进一步的验证。最终得到染色体上整合了厌氧特异性稳定表达GFP的沙门氏菌VNP菌株（mutVNP-GFP）。
GFP表达的定量检测：将沙门氏菌mutVNP-GFP分别在厌氧和有氧下培养至OD600=0.4。离心收集1 ml的沉淀，重悬于0.5 ml的冰冷的PBS中离心并吸取上清，最后将沉淀溶解于4微升的去离子水，并滴加与干净的载破片上并在荧光显微镜下进行观察，同时剩余的细菌超声裂解，并用0.22 µm孔径的滤膜进行过滤除菌，并用流式细胞仪在吸收峰为485 nm是对GFP的表达进行检测分析。
6．组织中luciferase表达分析。
分别加入1:1的冰冷的PBS将肿瘤、脾脏和肝脏用匀浆器进行碾磨处理。匀浆液用裂解液进行裂解（50 mM Tris-HCl，pH 8.3，4 mM DTT，20 % (v/v) glycerol，2 % (v/v)
Triton X-100，2 mg ml-1 lysozyme) 处理，在25°C孵育10 min。4°C，12000 rpm离心10 min，吸取上清进行检测，使用荧光素酶活性检测试剂盒（Promega）测量这些样品中的荧光素酶活性。方法如下：将10 µl样品中与10 µl荧光素酶反应底物（LAR）混合后立刻计时，10 s后使用Lumat LB9507 luminometer（Berthold公司）测量相对luciferase酶反应荧光值（RLU）的大小。
7．Western bloting分析和ELISA分析
（1）厌氧培养基的配制：将新鲜配制的LB溶液于沸水浴中煮沸约15分钟以去除培养基中大部分的溶氧，然后再使用氮气配合煮沸的方法插入LB溶液中驱除残存的氧气，再加入50 µl 0.05% 硫化钠和0.05%半胱氨酸以维持厌氧培养瓶（购于英国伦敦Oxid公司）内的还原性环境，之后迅速用厌氧橡胶塞塞住厌氧培养瓶，并用金属压盖器进行密封，并进行高温高压灭菌处理，从而得到低氧无菌的LB培养基。
（2）Western bloting分析：有氧或厌氧条件时，利用western blot的方法分析人源endostatin在VNP中的分泌表达情况。细菌表达沉淀重悬于100
mM的Tris/HCL（pH7.4）并在冰上超声处理，超声时间为30 s。细菌表达的上清利用TCA方法进行沉淀浓缩。最后所得样品均按照标准western blot方法进行检测。兔抗人的endostatin抗体购于美国Santa
Cruz公司。
（3）ELISA分析：前述的多余肿瘤组织用抽提液（50 mM HEPES，pH7.4, 100 mM NaCl, 50 mM NaF, 2 mM EDTA, 1% Triton-100
and 100 µg/mL PMSF）按照1：8进行抽提处理，并冰上放置1小时。利用Brandford方法对组织的蛋白浓度进行检测。肿瘤内VEGF含量利用中国博士德公司的ELISA试剂盒进行检测。
8．鸡胚尿囊膜（CAM）分析实验
利用0.22µm孔径的滤膜对细菌表达裂解上清进行过滤除菌。并进行蛋白浓度的检测，调节至终浓度20
mg/ml。利用10 µm/ml的polymyxin
B对样品中LPS进行灭活处理。所有的操作均要在无菌的环境中完成。购买无菌的6周龄的鸡胚，并置于37°C、90%湿度环境中。孵育两天后，在鸡胚长轴端开一小口，并将Whatman滤纸至于尿囊膜上，之后再滤膜上进行加药处理。培养48小时后，对滤纸进行固定并连同尿囊膜一并取出并拍照。
9．肿瘤的种植和抗肿瘤效果的评价：
将黑色素瘤B16F10细胞和Lewis肺癌细胞溶于PBS溶液中，细胞计数，终浓度为5 ×105 cell/0.1 ml 或者106
cell/0.1 ml PBS。在C57BL/6小鼠腋下右侧肋骨处皮下注射0.1 ml溶解好的肿瘤细胞。
沙门氏菌的给药方案：肿瘤建模后第7天，待肿瘤可见，大小约为0.3
cm3左右，将培养好的沙门氏菌或携带质粒的细菌离心并用无菌PBS洗涤后，以每只小鼠105 cfu细菌的剂量腹腔注射。
评价抗肿瘤效果参考文献方法，肿瘤的体积按照以下公式计算：肿瘤体积=长度×宽度2×0.52，同时监测小鼠的生存率。同时，也结合两个指标：肿瘤体积翻倍时间和肿瘤生长延滞时间来评价抗肿瘤效果。肿瘤体积翻倍时间是指肿瘤体积增加到原来的一倍时所需要的时间；肿瘤生长延滞指肿瘤体积生长至1000
mm3所需要的时间。动物实验是在南京大学动物房按照学校管理制度进行的。
10．组织切片分析
（1）HE染色分析：将肿瘤组织取出并用4%的甲醛溶液进行固定，过夜后进行石蜡包埋，并切片，脱蜡，按照标准的HE染色方法进行染色分析。
（2）肿瘤组织切片的CD31分子染色分析：CD31是表征血管内皮细胞新生血管的一种标记分子。将Endostatin基因治疗和其对照的肿瘤取出，用4%的甲醛溶液进行固定，过夜后进行石蜡包埋，并切片，脱蜡，并用高温高压柠檬酸钠抗原修复液进行抗原修复，然后用羊抗鼠的CD31抗体（购于美国Santa cruz公司）1:200进行一抗4度孵育过夜，其后取出用PBST洗三遍，每次5 min。二抗1:200孵育1小时，后用PBST洗三遍，用DAB显色，肉眼可见时与蒸馏水中终止，并用清水冲洗，最后用苏木精进行复染细胞核，烘干切片，用干性树胶进行封片。显微镜下观察。CD31的定量分析是参考文献[Jia LJ等，2007，International Journal of Cancer 121:666-674]的分析方法。
（3）肿瘤组织切片的TUNEL分析：将处理过后的小鼠肿瘤制备5 µm的冰冻切片并用TUNEL试剂盒（购于博士德公司）进行组织细胞凋亡染色分析。具体实验方法见试剂盒说明书。
本发明利用蛋白质组学技术筛选厌氧选择性表达的细菌基因及其启动子，从而获得在厌氧环境中选择性表达的启动子作为目的基因的启动子，使得目的基因能够在低氧或者乏氧的环境中表达。利用上述利用蛋白质组学技术筛选厌氧选择性表达的细菌基因及其启动子的筛选方法从沙门氏菌中经蛋白质组学筛选所获得的厌氧特异性表达的乙醇脱氢酶adhE，其在有氧状态下不表达，在厌氧环境中其表达水平上升120多倍（图1A）。
该padhE启动子在原核细菌中高度保守。其序列与各种沙门氏菌肠道亚种（鼠伤寒沙门氏菌4/74、T000240、SL1344、14028S、D23580、LT2，沙门氏菌肠道亚种-海德堡沙门氏菌SL476等）相比，其DNA序列同源性高达100%。与沙门氏菌肠道各亚种（肠炎沙门氏菌P125109、都柏林沙门氏菌CT_02021853、鸡沙门氏菌.287/91、纽波特沙门氏菌SL254、副伤寒沙门氏菌SPB7等）中，其DNA序列同源性高达99%。与沙门氏菌肠道各亚种（阿格纳沙门氏菌SL483、施瓦曾格隆得沙门氏菌CVM19633、猪霍乱沙门氏菌SC-B67、丙型副伤寒沙门氏菌 RKS4594、伤寒沙门氏菌Ty2、韦太夫雷登沙门氏菌2007-60-3289-1、甲型副伤寒沙门氏菌AKU_12601、甲型副伤寒沙门氏菌ATCC
9150等）相比，其DNA序列同源性高达98%。与伤寒沙门氏菌肠道亚种（伤寒沙门氏菌）CT18株相比，其DNA序列同源性高达98%；与沙门氏菌肠道各亚种（亚利桑那沙门氏菌
62:z4,z23:--）93%同源；与变栖克雷伯氏菌
At-22和肺炎克雷伯菌亚属（肺炎菌NTUH-K2044、342、肺炎菌 MGF 78578）相比，其DNA序列同源性高达88%；与克氏柠檬酸杆菌 ATCC BAA-895株相比，其DNA序列同源性高达81%；与啮齿类柠檬酸杆菌 ICC168株相比，其DNA序列同源性高达80%；与痢疾志贺氏菌 Sd197相比，其DNA序列同源性高达79%；与大肠杆菌各亚种（SMS-3-5、536、083: H1株、UM146、IHE3034、026:H11株、LF82、、S88、、APEC 01、UTI89、KO11、W株、BL21(DE3)、ETEC H10407、ABU
83972、0111: H-株、0103:
H2株、大肠杆菌B株REL606、BL21-Gold(DE3)pLysS AG'、UMN026、ED1a、、IAI39、IAI1、55989、SE11、ATCC 8739、E24377A、HS、CFT073、042、DH1(ME8569)、DH1、0157: H7株、BW2952、0127: H6 E2348/69、0157:
H7株EC4115、K12亚株DH10B、K12亚株W3110、K12亚株MG1655、0157:H7株凯萨0157:H7 EDL933、0155:H7株CB9615、SE15）相比，其DNA序列同源性高达77%；与费格森埃希菌ATCC35469相比，其DNA序列同源性高达77%；与痢疾杆菌（2002017、2a株、2a株2457T）相比，其DNA序列同源性高达77%；与索氏志贺氏菌Ss046、鲍地氏志贺氏杆菌 CDC3083-94、弗氏志贺菌5株8401、鲍地氏志贺氏杆菌 Sb227等相比，其DNA序列同源性高达77%；与大肠杆菌 0157相比，其DNA序列同源性高达76%；与阴沟乳杆菌SCF1相比，其DNA序列同源性高达75%。因此，padhE启动子在细菌中高度保守，原核细菌的padhE启动子均能够作为厌氧靶向性细菌介导的目的基因厌氧特异性表达的启动子。
该padhE启动子的核心序列包括adhE基因上游1200bp区域之内的序列（图1B），才能实现该启动子在低氧或者乏氧的环境下选择性表达。在该序列中，adhE基因上游500bp或者1000bp区域的序列均能够实现报告基因的高水平表达，但是都不具有厌氧特异性表达的特性；在此基础上，adhE基因上游1000bp- 1200bp的DNA序列能够使启动子表现出显著的厌氧诱导表达的特性。大于adhE基因上游1200bp区域的序列由于包括了adhE基因上游1200bp的DNA序列，因此当然具有低氧或者乏氧选择性表达的性质，启动子1200bp区域已经包含有部分上游的ychE基因序列，ychE基因也具有辅助padhE启动子的功能（图1B）。
为了证明本发明筛选获得的乙醇脱氢酶启动子能够驱动目标基因实现在厌氧组织选择性地表达，本专利分别采用了不同来源的不同基因，包括来源于人的内皮抑素Endostatin（十八型胶原蛋白的C末端），来源于水母的绿色荧光蛋白GFP，来源于昆虫的荧光素酶基因Luciferase等，构建了含有padhE启动子的不同表达载体。这些含有不同基因的不同表达载体都能够在厌氧靶向性细菌中在体外的厌氧或低氧环境中高水平表达（图2A、2B、2C、2D），而且能够在体内厌氧的肿瘤组织中选择性地表达（图3A、3B、3C、3D），在其它组织中不表达（图2B、3B）。在体外实验中，缺氧环境可以特异地、稳定地诱导沙门氏菌携带的padhE启动子的表达（图2B、2E），体内Luciferase、Endostatin等基因的表达分析也表明细菌携带的目的基因确实有较高的厌氧组织靶向性递送和厌氧的肿瘤组织选择性表达的特点（图3B、3D）。padhE启动的外源基因在体内外的表达水平都可以非常容易地用各种检测手段进行检测，例如，通过表达产物Luciferase酶活性检测（图3B），利用表达产物GFP的荧光特性进行观察（图2B），利用western blot方法进行检测（图2D）等。这些用不同方法检测到的adhE启动的不同外源基因，尽管表达产物的性质各不相同，但是其共同点则相同，即所有的检测方法都能够检测到明显的、大量的表达产物的存在。而以往几乎所有的肿瘤靶向性细菌介导的基因治疗无论在体外、还是在体内，都很难检测到外源基因表达产物。
为了准确的反映adhE 基因的启动子活性，本发明将单拷贝的adhE-GFP基因通过同源重组整合到沙门氏菌染色体上，使其在乏氧条件下表达GFP蛋白。结果表明：沙门氏菌只有在贫氧的条件下才高表达GFP荧光蛋白。这一结果证实adhE启动子只有在乏氧条件下发挥生物活性，而在正常有氧条件下则不表达（图2A、2B）。在发明中，我们将SpA分泌信号肽插入了endostatin基因的上游，Western
blotting结果显示在厌氧条件下20 kD的endostatin蛋白被有效地表达，同时被沙门氏菌分泌到胞外；在有氧条件下则观察不到蛋白的表达（图2D）。
将携带padhELuc或pLuc质粒的沙门氏菌VNP20009腹腔注射荷B16F10皮下瘤的小鼠，分别在注射后3天分析肿瘤，脾脏和肝脏的菌落数，结果显示携带padhELuc或pLuc质粒的VNP在肿瘤中大量增殖，是其它器官的1000倍以上（图3A）。在注射后3天和6天分析了肿瘤、肝脏和脾脏中luciferase的活性，在厌氧的肿瘤中能明显检测到luciferase活性，而在有氧的脾脏和肝脏则检测不到（图3B）。更重要的是，由于adhE启动子厌氧的肿瘤组织特异性表达的特点，因而VNPpadhELuc在肿瘤组织高表达的同时却没有显著地产生任何肝脏和脾脏毒性（肝脏和脾脏是正常组织中VNP20009最为富集的器官），这表明细菌携带的adhE启动子基因治疗系统在体内是安全的。
在腹腔注射后5天和15天分析荷瘤小鼠体内细菌的生长状况，携带低拷贝质粒的padhELuc或pLuc表达载体的沙门氏菌VNP20009生长良好，与不携带质粒的沙门氏菌相比较，肿瘤中细菌的数量相同，以上结果显示细菌携带低拷贝的padhELuc质粒并不影响细菌的生长和增殖，而且低拷贝的padhELuc质粒在沙门氏菌中的稳定性超过15天（图3C）。相形之下，高拷贝的pUC质粒来源的表达载体则显著影响沙门氏菌VNP20009的生长和稳定性，影响沙门氏菌VNP20009在肿瘤组织中的数量。荧光显微镜分析证实携带mutVNP-GFP的沙门氏菌聚集在肿瘤乏氧区（图3D）。上述实验结果证实沙门氏菌VNP20009在含adhE启动子驱动的目标基因的情况下仍然靶向于肿瘤乏氧区。
在本专利中，我们还仔细比较了不同拷贝数的质粒对细菌在体内稳定的影响，结果发现含有较低拷贝数的pBR322质粒的细菌在厌氧的肿瘤组织中的滴度远远高于含有高拷贝数的pUC18质粒的细菌，两者在厌氧的肿瘤组织中的滴度相差近1000倍。因此，在较低拷贝数的pBR322质粒更适合于作为肿瘤基因治疗的载体，含有pBR322质粒载体的菌株能够在体内厌氧的肿瘤组织中更稳定地、以高滴度存在，而高拷贝数的pUC18质粒则可能导致细菌有更大的代谢负担，从而导致细菌不能稳定存在。
本发明采用了一种低拷贝的pBR322质粒作为表达载体，这种载体在体内表现出了很高的稳定性，实验证实在肿瘤组织中没有出现显著的质粒丢失现象，本发明的数据还表明该种表达质粒及padhE启动子产生的基因治疗并不影响细菌自身的肿瘤靶向性，也不影响细菌在肿瘤和其他器官内的分布（图3A、3C、3D）。这种关于较低拷贝数的pBR322质粒更适合于作为肿瘤基因治疗的载体的发现是本发明的首创，而本领域的其他研究者和发明人都是使用高拷贝数的pUC18质粒作为表达载体。本专利绝大多数的表达载体都是构建在pBR322质粒之上，因此本发明能够获得高效、稳定的外源基因的表达，尤其是在体内的高效、稳定表达。
由于沙门氏菌VNP20009能优先聚集于肿瘤贫氧区，同时adhE启动子能在肿瘤乏氧区选择性表达，因此我们分析了沙门氏菌VNPpadhEEnd在荷瘤小鼠中对肿瘤生长的影响。将沙门氏菌VNPpadhEEnd 和沙门氏菌VNP分别接种于荷Lewis肺癌(LLC)的小鼠。实验结果证实，与对照组相比较，沙门氏菌VNPpadhEEnd和沙门氏菌VNP明显降低了肿瘤的生长速度(P<0.01)。在细菌接种后12到18天，沙门氏菌VNPpadhEEnd组肿瘤体积明显小于沙门氏菌VNP(P<0.05)
(图4A)。进一步分析肿瘤体积倍增时间，结果表明：对照组为3.46 天(CI, 3.23-2.68天)，沙门氏菌VNP组为4.44天(CI, 4.27-4.61天)，沙门氏菌VNPpadhEEnd组为5.21天(CI, 4.99-5.42天) (图4C、表2) 。与空白对照组（11.43 天）相比较，沙门氏菌VNP组和沙门氏菌VNPpadhEEnd组肿瘤生长延迟明显增加，两者分别为8.45天和11.43天(P<0.001) (图4B、表2)。在黑色素肿瘤治疗中，与沙门氏菌VNP组和空白对照组相比较，沙门氏菌VNPpadhEEnd显著抑制了黑色素瘤的生长(图4C)。沙门氏菌VNPpadhEEnd组的肿瘤体积倍增时间（6.96天; CI, 6.86-7.07天）明显长于沙门氏菌VNP组（5.86天; CI, 5.70-5.98天）和空白对照组（2.96天; CI, 2.85-3.08天）(P<0.001) (图4D、表2)。同时肿瘤生长延迟时间在沙门氏菌VNPpadhEEnd组也明显增加，平均为17.07天；而在沙门氏菌VNP组和空白对照组分别平均为12.90天和7.56天。与沙门氏菌VNP组和空白对照组相比，沙门氏菌VNPpadhEEnd组有显著统计学意义(P<0.001) (图4D、表2)。
本发明还进一步分析了沙门氏菌介导的endostatin 靶向治疗黑色素瘤和肺癌对小鼠生存时间的影响。在肺癌肿瘤模型中，沙门氏菌VNPpadhEEnd组小鼠的中位生存期为49.0天，明显高于对照组（18.0天）和VNP组（25.92天）(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析显示沙门氏菌VNPpadhEEnd治疗能明显提高小鼠的生存率(P<0.001)。沙门氏菌VNPpadhEEnd组和沙门氏菌VNP组的30天生存率分别为86 %和71 %。在黑色素肿瘤模型中，沙门氏菌VNPpadhEEnd组的中位生存期为28.5天，空白对照组为11.5天，沙门氏菌VNP组为19.5天。与对照组相比较，沙门氏菌VNPpadhEEnd组的中位生存期明显提高(P<0.01)。沙门氏菌VNPpadhEEnd组和沙门氏菌VNP组的30天生存率分别为25%和0%（图5A、5B）。
沙门氏菌VNPpadhEEnd在体内和体外都能抑制血管生成。为了验证沙门氏菌VNPpadhEEnd表达的endostatin是否能够在体内抑制血管生成，本发明对发育8天的鸡胚进行了CAM检测。结果如图6A，与对照组和沙门氏菌VPN组相比，沙门氏菌VNPpadhEEnd
治疗后，在滤盘周围产生一个无血管区，这表明沙门氏菌VNP20009确实可以抑制体内的血管生成。我们进一步猜测沙门氏菌VNP20009是否也可以抑制肿瘤血管生成，通过ELISA检测了VEGF的表达后发现：与对照组和单独使用沙门氏菌VNP20009组相比，沙门氏菌VNPpadhEEnd组明显地抑制了VEGF的表达（图6B）。免疫组化研究发现，与对照组相比，沙门氏菌VNPpadhEEnd显著地降低了CD31的表达（图6C、6D）。这表明：沙门氏菌VNPpadhEEnd可能抑制通过抑制血管生成而肿瘤的生长，从而提高黑色素瘤荷瘤小鼠的存活率。
本发明进一步检测沙门氏菌VNPpadhEEnd的治疗作用是否与肿瘤坏死或细胞凋亡相关。结果表明：沙门氏菌VNPpadhEEnd治疗的荷瘤小鼠比对照和沙门氏菌VNP20009治疗小鼠显示出更严重的肿瘤组织坏死。沙门氏菌VNP20009单独治疗或未经治疗的小鼠肿瘤组织同时具有活的肿瘤细胞与散布的组织坏死，而沙门氏菌VNP padhEEnd则诱导大面积、连续的肿瘤组织坏死。TUNEL染色结果显示：沙门氏菌VNPpadhEEnd治疗组比其它组的肿瘤组织相比较有更多正在凋亡的肿瘤细胞。这些结果说明：沙门氏菌VNPpadhEEnd通过诱导细胞凋亡抑制B16F10肿瘤细胞（图7A、7B）。进一步分析还发现：VNPpadhEEnd的瘤内定殖，发现缺氧和坏死环境吸引更多的VNPpadhEEnd瘤内增殖或定居（图7C）。肿瘤血管生成抑制会造成肿瘤内更多的厌氧坏境，而这正是细菌在肿瘤内繁殖和复制所喜爱的，因而可以放大沙门氏菌的抗肿瘤效果，这解释了本发明应用Endostatin进行肿瘤血管生成抑制剂治疗还可以放大细菌在肿瘤内的聚集，这与我们以前的报道相符合[Jia LJ等，2007，International
Journal of Cancer 121:666-674]。
表
2
不同给药组动物肿瘤生长曲线和
Kaplan
- Meier
生存分析、中位生存时间。
数据所列均是其95%置信空间范围内（括号内所示）的平均值。a生长抑制曲线为肿瘤体积（V, cm3）和生长时间（d，天）的变化关系，r为相关系数。b肿瘤翻倍时间是有生长曲线的指数函数计算得出。c肿瘤生长延时时间指肿瘤生长到1000mm3所需要的时间（平均标准偏差， † P<0.0001,沙门氏菌VNPpadhEEnd极显著于VNP, **P<0.01）。半位生存是通过软件MedCalc计算得出，括号内为95%置信空间范围。
在本发明的研究过程中，我们尝试了多种厌氧靶向性细菌介导的基因治疗细菌的给药途径，包括腹腔注射、静脉注射和口服的方法[Jia
LJ等，2007，International
Journal of Cancer 121:666-674；Jia LJ等，2007，Cancer Science
98:1107-1112，2007；Chen
G等，2009，Cancer
Science 100:2437-2443]。正如我们以前研究所观察到的：以上给药方法能够将含有padhE启动子驱动的目的基因的表达菌株递送到体内并产生较好的抗肿瘤治疗效果，但是相形之下，将含有padhE启动子驱动的目的基因的表达菌株通过口服途径将含有padhE启动子驱动的目的基因的表达菌株递送到体内，既能够实现其在厌氧的肿瘤组织中的靶向性聚集，同时毒副作用明显低于其它常规方法。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种厌氧特异性的高效表达启动子的筛选方法，其特征是利用蛋白质组学方法分析细菌在有氧和厌氧条件下表达蛋白质的差异，获得厌氧条件下特异性表达的蛋白质，克隆其基因，获得厌氧特异性表达的启动子。
2.根据权利要求1所述的一种厌氧特异性的高效表达启动子的筛选方法，其特征是利用该方法筛选获得的一种乙醇脱氢酶启动子，能够在厌氧环境中特异性高水平表达所驱动的基因，其启动子活性区域位于基因上游500bp区域内、其厌氧特异性表达调控区域位于基因上游1000-1200 bp区域。
3.根据权利要求2所述的一种乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，其特征是由厌氧靶向性细菌介导的厌氧诱导的乙醇脱氢酶启动子作为目的基因启动子的基因治疗，使得目的基因能够在体内外低氧或者乏氧的环境中特异性表达。
4.根据权利要求3所述的一种乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，其特征是乙醇脱氢酶启动子驱动的治疗基因的克隆方法：将乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因克隆在含有原核复制子的质粒中；乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧靶向性细菌中稳定存在的克隆方法：将乙醇脱氢酶启动子及其控制下的目的基因克隆在较低拷贝质粒中，实现乙醇脱氢酶启动子及其控制下的目的基因在体内环境中在厌氧靶向性细菌中的稳定存在和稳定表达。
5.根据权利要求3所述的一种乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，其特征是含有乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因表达菌株的制备方法：将克隆有乙醇脱氢酶启动子驱动的治疗基因的质粒载体转化在厌氧靶向性细菌中；将克隆有乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因整合在厌氧靶向性细菌的染色体上。
6.根据权利要求3所述的一种乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法，其特征是含有乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因的表达菌株递送到体内的方法：将含有乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因的表达菌株通过腹腔注射、静脉注射及口服的方法传送到体内，实现其在在厌氧组织中高效表达目的基因、在其它正常组织中不表达目的基因。
7.根据权利要求1所述的一种厌氧特异性的高效表达启动子的筛选方法在筛选厌氧特异性表达的启动子中的应用。
8.根据权利要求2所述的一种乙醇脱氢酶启动子在实现目的基因厌氧特异性表达中的应用。
9.根据权利要求3所述的一种乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法在制备厌氧组织靶向性和选择性的抗厌氧组织疾病治疗药物中的应用。
10.根据权利要求3所述的一种乙醇脱氢酶启动子驱动的目的基因在厌氧组织靶向递送和选择性稳定表达的方法在制备肿瘤靶向性和选择性抗肿瘤治疗药物中的应用。
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