CN106011088A

CN106011088A - cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

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Publication number: CN106011088A
Application number: CN201610622268.8A
Authority: CN
Inventors: 金天明; 弓建芳; 张东超; 李小慧; 高珂珂; 林静; 孟佳丽; 尚翠玲; 李昕
Original assignee: Tianjin Agricultural University
Current assignee: Tianjin Agricultural University
Priority date: 2016-07-28
Filing date: 2016-07-28
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-07-28
Also published as: CN106011088B

Abstract

本发明公开了一种cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，从石斑鱼头肾组织和人乳体细胞总RNA中分别扩增出cLYZ基因和hLTF基因，将获得的目的基因克隆到pDC315穿梭载体中，将含有目的基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒经脂质体共转染HEK293细胞，包装获得高滴度的重组腺病毒；评价cLYZ基因和hLTF基因在腺病毒介导下对奶牛乳房炎主要致病菌的联合抑制作用。

Description

cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

技术领域

本发明涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。

背景技术

奶牛乳房炎又被称为奶牛乳腺炎，是奶牛乳腺受到外界刺激或致病菌感染时所发生的一种炎症反应。其不仅会引起奶牛产乳量的下降，缩短奶牛的更替周期，严重时甚至会造成患病奶牛泌乳能力的完全丧失。因此，奶牛乳房炎的临床防治是一直困扰奶牛养殖业的一大难题。目前该病的防治主要通过提过规范化养殖管理及使用抗生素和化疗药物，但由于不同地区致病菌的差异以及抗生素等的长期不规范使用，在治疗过程中产生的细菌耐药性等问题常常给地方性奶牛乳房炎的治疗带来困难。为了应对上述问题，临床上亟需一种新的研究策略来防治奶牛乳房炎。

目前，随着基因疗法的日益兴起，使用基因药物代替常规抗生素预防和治疗奶牛乳房炎，已成为应对抗生素滥用导致的细菌耐药性增强等一系列问题的研究重点和热点。

与哺乳动物相比较，鱼类的获得性免疫系统较脆弱，固有免疫在抵抗外来病原入侵中发挥着极其重要的作用，石斑鱼的c型溶菌酶(c type Lysozyme,cLYZ)就是其体内重要的非特异性免疫因子之一，不仅能抑制革兰氏阳性菌而且对革兰氏阴性菌也有抑制作用。人乳铁蛋白(Human Lactoferrin,hLTF)是主要存在于乳汁中的一种铁结合性糖蛋白，富含多种氨基酸，具有广谱的抗菌性及免疫作用，抗氧化作用，抗炎症，抗病毒，抗癌症作用等生物学功能。由于hLTF具有强烈地螯合铁离子的作用，而铁元素是几乎所有细菌生长不可缺少的，因此，hLTF就可以阻止细菌利用铁离子而起到抑菌杀菌的作用；其次，hLTF作为蛋白酶，可以降解一些细菌的毒力，从而降低微生物的致病性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。将cLYZ基因的广谱抑菌作用、hLTF基因广泛高效抑菌的特性和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构建出可以表达上述基因的重组腺病毒，最终检验在腺病毒介导下cLYZ和hLTF基因对奶牛乳房炎主要致病菌的联合抑菌作用。为进一步利用重组腺病毒在体内外抑制奶牛乳房炎致病菌的生长及研制奶牛乳房炎治疗和预防疫苗奠定试验基础。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：

1)从石斑鱼头肾组织总RNA和人乳体细胞总RNA中分别扩增出cLYZ基因序列GI:JQ-287658.1和hLTF基因序列GI:AY-875691.1；

所述的cLYZ基因和hLTF基因的扩增包括：以cLYZ-F SEQ ID NO：1和cLYZ-R SEQ ID NO：2为引物，以石斑鱼头肾组织总RNA为模版，扩增cLYZ基因序列；以hLTF-F SEQ ID NO：3和hLTF-R SEQ ID NO：4为引物，以人乳体细胞总RNA为模版，扩增hLTF基因序列；

2)将获得的目的基因分别克隆到pDC315-MCS-EGFP穿梭载体中，与骨架载体pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF和Ad-cLYZ-hLTF。

所述的构建cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的方法及制备的重组腺病毒。

所述的构建cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的方法及制备的重组腺病毒在防治奶牛乳房炎中细菌性疾病生物制品方面的应用。

本发明的有益效果是：将cLYZ的广谱抑菌效应、hLTF的广泛抑菌特性和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构建出包含上述基因的重组腺病毒，检验在腺病毒介导下cLYZ和hLTF基因对奶牛乳房炎小鼠模型主要致病菌的联合抑菌作用。通过检测重组腺病毒在HEK293细胞中的表达蛋白对大肠杆菌(K88)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳链球菌(ATCC 9809)和无乳链球菌等多株乳房炎致病菌的抑菌活性和最小抑菌浓度(MIC)，综合评价了重组腺病毒对奶牛乳房炎小鼠模型主要致病菌的抑菌作用，研究结果显示重组腺病毒在体外表达的目的蛋白可以有效抑制5种试验菌株。本发明最终研制出一种针对乳房炎动物模型细菌性疾病的广谱疫苗。

附图说明

图1是hLTF和Ec-cLYZ基因RT-PCR扩增结果(M:DL 2502bp DNA分子质量标准；1：hLTF基因RT-PCR扩增产物；2：Ec-cLYZ基因RT-PCR扩增产物)。

图2是pMD-cLYZ和pMD-hLTF质粒的双酶切鉴定结果(M：DL 2502bp DNAMarker；1：pMD-hLTF经Nhe I和Sal I的双酶切产物；2：pMD-cLYZ经EcoR I和Nhe I的双酶切产物)。

图3是目的片段与腺病毒穿梭载体的亚克隆结果(M：DL 2502bp DNAMarker；1：pDC315-cLYZ的菌液PCR；2：pDC315-hLTF的菌液PCR；3：pDC315-cLYZ-hLTF的菌液PCR)。

图4是穿梭载体的双酶切鉴定结果(M：DL 2502bp DNA Marker；1：pDC315-cLYZ经EcoR I和Nhe I的双酶切产物；2：pDC315-hLTF经Nhe I和Sal I的双酶切产物；3：pDC315-cLYZ-hLTF经EcoR I和Sal I的双酶切产物)。

图5是荧光检测重组腺病毒在HEK 293细胞中的表达结果(10×)(A：正常HEK 293细胞图；B：重组腺病毒Ad-cLYZ感染HEK 293细胞后24h图；C：重组腺病毒Ad-hLTF感染HEK 293细胞感染后24h荧光图；D：重组腺病毒Ad-cLYZ-hLTF感染HEK 293细胞感染后72h图；E：重组腺病毒Ad-GFP感染HEK 293细胞感染后24h荧光图)。

图6是目的基因在HEK293细胞中mRNA转录的RT-PCR检测(M：DL2502DNA分子质量标准；1：Ad-cLYZ-hLTF转染细胞转录cLYZ基因；2：Ad-cLYZ-hLTF转染细胞转录hLTF基因；3：Ad-cLYZ-hLTF转染细胞转录cLYZ-hLTF基因；4：Ad-cLYZ转染细胞转录cLYZ基因；5：Ad-hLTF转染细胞转录hLTF基因)。

图7是Western blotting检测目的蛋白在HEK293细胞中的表达。

图8是BCA定量方法测定重组腺病毒感染HEK293细胞后蛋白提取物浓度所绘制的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

随着分子生物学、免疫学、病理学及相关学科的发展，基因治疗现已成为疾病防治研究的热点。目前，腺病毒(adenovirus,Ad)载体疗法是基因治疗中最有前景的基因转移方法之一，它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中，载体的构建和操作简单，宿主范围广，感染性强，不整合入宿主染色体，在增殖和非增殖细胞中均可感染和表达多种目的基因。

鱼类是脊椎动物亚门中最原始最低级的类群，虽具有特异性和非特异性免疫系统，但与哺乳动物相比，其特异性免疫系统不发达。因此，鱼类非特异性免疫系统主要担负着清除和降解入侵机体的病原微生物和有害物质的角色，在机体抵抗外界病原菌时发挥极其重要的作用。溶菌酶是固有免疫反应中的重要参与者，主要通过破坏革兰氏阳性菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂。大量研究结果表明，石斑鱼c型溶菌酶(Epinepheluscoioides c type Lysozyme，Ec-cLYZ)是其生物体内重要的非特异性免疫因子之一，在抵抗外来病原入过程中侵中发挥着重要作用。石斑鱼c型溶菌酶是一种很稳定的蛋白质，主要存在于肝脏、头肾、胃和免疫组织，具有较强的抗热性，同时肩负着消化和防御两大功能。当机体受到细菌、重金属等外界刺激时，c型溶菌酶在体内各组织中的表达量会发生变化，因此，可以通过提高c型溶菌酶活性来降低重金属和细菌等对石斑鱼造成的伤害。此外，c型溶菌酶还具有广泛的抗菌活性和抗病毒作用，可以抑制虹彩病毒衣壳蛋白的合成，以及激活宿主的免疫系统，具有抗肿瘤作用。

人乳铁蛋白(Human Lactoferrin，hLTF)是一种分子质量为78kDa的糖蛋白，hLTF以两种形式存在：一种是不含铁的人乳铁蛋白，它主要具有杀菌和抑菌作用；另一种是铁饱和的人乳铁蛋白，它主要作为人体的铁源。乳铁蛋白能通过阻止细菌利用铁离子的途径而起到抑菌作用(Ellison R T et al.1991)。由于乳铁蛋白具有强烈地螯合铁离子的作用，而铁元素是几乎所有细菌生长不可缺少的，故导致细菌停止生长或死亡。研究发现，母乳中乳铁蛋白通过与大肠杆菌争夺铁离子而对抗大肠杆菌感染；其次，乳铁蛋白作为蛋白酶，可以降解一些细菌的毒力，从而降低微生物的致病性。此外，乳铁蛋白还具有抗肿瘤，抗病毒，调节免疫等作用。

因此，选择上述两个基因构建重组腺病毒，利用腺病毒载体的高效表达活性，实现目的蛋白对多种细菌的协同抑菌作用。

本发明构建Ec-cLYZ和hLTF基因重组腺病毒的方法，包括以下步骤：

1)石斑鱼c型溶菌酶基因和人乳铁蛋白基因的克隆；

2)Ec-cLYZ和hLTF基因重组腺病毒穿梭质粒的构建；

3)Ec-cLYZ和hLTF基因重组腺病毒质粒的包装与鉴定；

4)重组腺病毒介导杀伤奶牛乳房炎主要致病菌的体外抑菌效果评价。

具体包括步骤如下：

2)将获得的目的基因分别克隆到pDC315-MCS-EGFP穿梭载体中，含目的基因的穿梭载体与骨架载体pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF和Ad-cLYZ-hLTF。

所述的构建cLYZ和hLTF基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒。

所述的构建cLYZ和hLTF基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒在防治奶牛乳房炎中细菌性疾病生物制品方面的应用。

也就是说：从石斑鱼头肾组织和人乳体细胞总RNA中分别扩增出cLYZ基因和hLTF基因；将获得的目的基因克隆到pDC315-MCS-EGFP穿梭载体后，将穿梭质粒与骨架载体pBHGlox(delta)E1,3Cre经脂质体共转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒；应用RT-PCR、Western blotting对重组腺病毒在HEK293细胞中表达情况进行鉴定；通过荧光显微技术检测病毒感染HEK293细胞后的形态变化；利用腺病毒纯化试剂盒纯化病毒并测定其滴度；将获得的高滴度重组腺病毒体外转染HEK293细胞，通过组织活性蛋白提取试剂盒提取细胞内表达蛋白并通过BCA法测定蛋白浓度。分别通过纸片法和试管二倍稀释培养法测定待测菌株对蛋白提取液的敏感性及最小抑菌浓度(MIC)。最后根据测定的MIC检测在该浓度下双蛋白对待测菌株的抑菌活性并与常用抗生素进行比较，评价在腺病毒载体介导下的cLYZ和hLTF对奶牛乳房炎主要致病菌的体外抑菌效果。

本发明的创新之处在于，首次结合将石斑鱼c型溶菌酶的广谱抗菌效果、人乳铁蛋白的抑菌杀菌作用以及腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性相结合，成功构建共表达上述基因的重组腺病毒，为且构建的重组腺病毒可以在HEK293细胞中高效表达，目的蛋白对试验菌株表现出良好的抑菌活性，为临床细菌性疾病的生物防治奠定了理论和试验基础。

下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：

1材料与方法

1.1 cLYZ基因和hLTF基因的扩增

收集石斑鱼小块头肾组织，加入1mL Trizol试剂，按照产品说明书操作，提取总RNA。根据GenBank中的石斑鱼cLYZ基因序列(JQ287658.1)，设计一对RT-PCR扩增引物，按Takara公司PrimeScript^TM One Step RT-PCR kit说明书采用一步法进行cLYZ基因序列的扩增，将扩增产物克隆至pMD19-T载体上，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-cLYZ，于-20℃保存备用。

采用常规离心法，通过不同的离心力和离心时间分离并收集乳汁中的体细胞，加入1mL Trizol试剂，按照产品说明书操作，提取总RNA。根据GenBank中的hLTF基因序列(AY875691.1)，设计一对RT-PCR扩增引物，按Takara公司PrimeScript^TM One Step RT-PCR kit说明书采用一步法进行hLTF基因序列的扩增，将扩增产物克隆至pMD19-T载体上，将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-hLTF，于-20℃保存备用。

RT-PCR扩增(反应体系见表1)和T-A克隆(反应体系见表2)，引物序列见下表3。

表1 RT-PCR反应体系

注：反应程序：50℃，1h，94℃，5min；{94℃，30s；58℃，30s；72℃，45s}35个循环，72℃延伸10min。4℃保存备用。

表2 T-A克隆连接体系

表3扩增目的片段的引物

1.2亚克隆穿梭腺病毒载体的构建

回收纯化产物Ec-cLYZ基因片段，将其与穿梭载体pDC315-MCS-EGFP分别用EcoR I、Nhe I进行双酶切。将双酶切获得的目的基因cLYZ与pDC315-MCS-EGFP相连，16℃连接过夜。连接反应体系为10×T₄DNA LigaseBuffer 2.0μL，载体片段4.0μL，目的片段10.0μL，T4DNA Ligase 0.5μL。经氨苄霉素抗性筛选，菌液PCR、酶切及测序鉴定，构建pDC315-cLYZ重组穿梭质粒。

回收纯化产物hLYZ基因片段，将其与载体pDC315-MCS-EGFP分别用NheI、Sal I进行双酶切。将双酶切获得的目的基因与pDC315-MCS-EGFP相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建pDC315-hLTF重组穿梭质粒。

回收纯化产物phLTF基因片段及载体pDC315-cLYZ分别用Nhe I、Sal I进行双酶切。将双酶切获得的目的基因与pDC315-cLYZ相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建pDC315-cLYZ-hLTF重组穿梭质粒。

1.3重组腺病毒穿梭质粒的鉴定

对克隆的穿梭载体进行菌液PCR验证、双酶切鉴定以及测序鉴定，成功构建的穿梭载体命名为pDC315-cLYZ、pDC315-hLTF和pDC315-cLYZ-hLTF。

1.4重组腺病毒的包装

重组腺病毒质粒的质粒提取按照Tiangen质粒大提试剂盒说明书进行。穿梭质粒2μg和腺病毒骨架质粒4μg，由12.0μL脂质体LipoFiter^TM介导，转染HEK293细胞，包装后获得重组腺病毒。利用RT-PCR检测目的基因mRNA转录，Western blotting检测目的蛋白的表达，通过荧光显微镜检测重组腺病毒的细胞转染情况，对重组腺病毒转染HEK293细胞的情况进行鉴定；采用纯化试剂盒纯化所扩增的病毒，参照TCID₅₀法进行病毒滴度测定。

1.5重组腺病毒介导目的蛋白的体外抑菌试验

为评价cLYZ和hLYZ双基因表达蛋白的重组腺病毒在动物细菌性疾病基因防治中的作用，本研究选择了包括金黄色葡萄球菌等在内的五种菌株为研究对象，分别为大肠杆菌(K88)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳链球菌(ATCC 9809)和无乳链球菌。将构建成功的高滴度重组腺病毒感染HEK293细胞，通过组织活性蛋白提取试剂盒提取细胞内表达蛋白，观察目的蛋白对待测菌株的体外抑菌活性。

试验中利用纸片法检测待测菌株对目的蛋白的敏感性，通过组织活性蛋白提取试剂盒获得在HEK293中表达的目的蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白提取液的浓度。将直径为6mm的无菌圆滤纸片浸泡在细胞蛋白提取液中，过夜后自然风干。将风干的滤纸片按照正三角形贴于制备的含有待测菌株的琼脂平板上，37℃恒温恒湿培养16～18h后通过游标卡尺测量抑菌圈直径并记录数据。根据抑菌圈的直径来初步判定待测菌株对目的蛋白的敏感性：抑菌圈直径大于15mm为高度敏感；直径在10～15mm为中度敏感；直径小于10mm为低度敏感；无抑菌圈则表示待测菌株不敏感。

利用试管二倍稀释培养法测定目的蛋白对待测菌株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，将倍比稀释的蛋白提取液与无菌液体培养基转移至无菌试管中，各试管中加入100μL等浓度的待测菌液后37℃恒温恒湿培养24h，不添加蛋白提取液的无菌液体培养基作为空白对照。培养结束后分别检测各菌液在620nm处的吸光值，与对照组吸光值一致的菌液认定为无菌生长，用“--”表示；吸光值大于对照组且目测有菌体生长的认定为有细菌生长，用“+”表示；液体培养基中没有菌体生长的最低蛋白浓度即为其最低抑菌浓度。

为更好的评价目的蛋白的体外抑菌效果，采用纸片法测定MIC目的蛋白对待测菌株的体外抑菌试验，并与常用抗生素进行比较。目的蛋白药敏纸片和含有待测菌株的琼脂平板的制备方法如上所述。37℃恒温恒湿培养24h后通过游标卡尺测量抑菌环的直径，记录数值并进行比较。

2结果与分析

2.1石斑鱼c型溶菌酶基因和人乳铁蛋白基因的克隆与序列分析

利用特异性引物，分别以石斑鱼头肾组织和人乳体细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方法，分别扩增出471bp的Ec-cLYZ基因片段和2172bp的hLTF基因片段，条带大小与位置均与预期相符(见图1)。

分别对pMD-cLYZ和pMD-hLTF进行双酶切鉴定，分别得到471bp、2900bp和2172bp、2900bp的基因片段，表明目的基因成功连至pMD19-T载体(见图2)。

测序结果与GeneBank中的数据进行Blast分析，表明Ec-cLYZ和hLTF基因序列同源性均为99％以上。

2.2亚克隆穿梭腺病毒载体的构建

分别对pMD-cLYZ、pMD-hLTF和腺病毒穿梭质粒pDC315-MCS-EGFP进行双酶切，胶回收目的片段，以T4DNA连接酶连接，得到亚克隆质粒pDC315-cLYZ和pDC315-hLTF。对pMD-hLTF和pDC315-cLYZ进行双酶切，胶回收目的片段，以T4DNA连接酶连接，得到亚克隆质粒pDC315-cLYZ-hLTF。对以上亚克隆质粒进行菌液PCR鉴定，分别得到471bp、2172bp和2643bp的目的片段，表明穿梭载体的亚克隆成功(见图3)。

分别对亚克隆质粒pDC315-cLYZ、pDC315-hLTF和pDC315-cLYZ-LYZ进行双酶切鉴定，分别得到471bp、2172bp和2643bp的目的片段，表明重组穿梭载体构建成功(见图4)。

2.3 cLYZ、hLTF和双基因重组腺病毒的构建

将构建好的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒经脂质体包裹后，转染HEK293细胞，置于37℃5％CO₂培养箱内培养，每日于倒置显微镜下观察细胞变化，约第7d，经Ad-cLYZ、Ad-hLTF、Ad-cLYZ-hLTF和Ad-GFP转染的HEK293细胞出现肿胀、圆缩等典型病毒感染病变(CPE)。在荧光显微镜下可见重组腺病毒感染细胞出现绿色荧光，而未感染组细胞未见变化(见图5)。RT-PCR产物的电泳结果显示，471bp、2172bp和2643bp处分别出现特异性扩增条带(见图7)。Western blotting结果显示，含有目的基因的重组腺病毒感染细胞后均检测到相应的目的蛋白条带：其中cLYZ为16.0kDa，hLYZ为78.0kDa，Ad-GFP无相应蛋白表达，与预期结果相符(见图7)。

收集纯化后的重组腺病毒病毒，以50％组织培养感染剂量法(TCID₅₀)测定重组腺病毒的病毒滴度，按照KarBer法计算出重组腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF、Ad-cLYZ-hLTF和Ad-GFP的滴度分别为：10^9.54TCID50/mL、10^9.25TCID50/mL、10^9.87TCID50/mL和10^9.16TCID50/mL，符合下一步试验所需滴度要求。

2.4重组腺病毒介导目的蛋白对待测菌株的体外抑菌效果

为评价所构建构建重组腺病毒在动物细菌性疾病基因防治中的作用，本研究选择了包括金黄色葡萄球菌等在内的五种菌株为研究对象，分别为大肠杆菌(K88)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳链球菌(ATCC 9809)和无乳链球菌。

用10MOI的重组腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF和Ad-cLYZ-hLTF分别感染HEK293细胞，48h后收取细胞，通过组织活性蛋白提取试剂盒提取细胞内表达蛋白，通过BCA蛋白定量试剂盒绘制标准曲线(图8)，并测得蛋白浓度分别为2.481mg/mL、2.675mg/mL和3.228mg/mL。将上述蛋白溶液调整至统一浓度后浸泡直径为6mm的无菌圆滤纸片，过夜后风干置于含有待测菌株的琼脂平板上培养16～18h。游标卡尺测量抑菌圈结果显示3种重组腺病毒感染HEK293细胞后表达的目的蛋白均对5种试验菌株具有抑制作用，且双基因蛋白有更强的抑菌作用，而对照组没有抑菌作用(见表4)。

通过试管二倍稀释培养法测定Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物对各待测菌株的最低抑菌浓度，生理盐水作为空白对照，结果显示无乳链球菌、停乳链球菌(ATCC 9809)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)和大肠杆菌(K88)的MIC分别为37.5μg/mL、75μg/mL、37.5μg/mL、37.5μg/mL和150μg/mL(见表5)。

表4是待测菌株对各重组腺病毒感染HEK293细胞后蛋白提取物的敏感性测定结果

表5是重组腺病毒Ad-cLYZ-hLTF感染HEK293细胞后蛋白提取物对各待测菌株最小抑菌浓度的测定结果

为进一步评价腺病毒介导表达的外源蛋白对待测菌株的抑制作用以及临床应用价值，本研究通过纸片法检测了最低抑菌浓度的Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物对各待测菌株的抑菌效果，纸片的制备和效果检测方法如上所述。同时，和常用抗生素对各待测菌株的抑菌效果进行比较。结果显示，与17种常用抗生素相比，外源蛋白对待测菌株都具有良好的抑制作用，抑菌效果与常用抗生素持平，甚至更优。

表6是MIC重组腺病毒Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物对大肠杆菌(K88)的抑菌效果评价

表7是MIC重组腺病毒Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物对停乳链球菌(ATCC9809)的抑菌效果评价

表8是MIC重组腺病毒Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物对无乳链球菌的抑菌效果评价

表9是MIC重组腺病毒Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物对表皮葡萄球菌(ATCC12228)的抑菌效果评价

表10是MIC重组腺病毒Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)的抑菌效果评价

3结论

3.1分别从石斑鱼头肾组织和人乳体细胞中扩增得到cLYZ基因和hLYZ基因，并分别成功连接到pMD19-T载体上，通过PCR检测、酶切鉴定和序列检测，证实扩增所得目的片段与已发表序列的同源性达到99％。

3.2将目的基因片段cLYZ和hLYZ分别亚克隆至穿梭载体pDC315-MCS-EGFP中，得到穿梭载体pDC315-cLYZ和pDC315-hLTF。将目的基因hLTF亚克隆至pDC315-cLYZ得到重组穿梭载体pDC315-cLYZ-LYZ。将以上重组穿梭载体与骨架载体共转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF、Ad-cLYZ-hLTF和对照腺病毒Ad-GFP；经RT-PCR证实重组腺病毒质粒成功导入HEK293细胞中；经Western blotting可检测到目的蛋白的表达，表明构建成功的重组腺病毒具有良好的感染性；上述重组腺病毒经纯化后，应用TCID50法检测其病毒滴度，分别为10^9.54TCID50/mL、10^9.25TCID50/mL、10^9.87TCID50/mL和10^9.16TCID50/mL，表明腺病毒介导外源基因感染有效，收获的较高滴度和感染性的重组腺病毒符合下一步试验的要求。

3.3重组腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF和Ad-cLYZ-hLTF分别感染HEK293细胞后提取细胞内活性蛋白经BCA定量测定蛋白提取物浓度分别为2.481mg/mL、2.675mg/mL和3.228mg/mL。通过纸片法分别检测待测菌株对各蛋白提取物的敏感性，结果显示3种重组腺病毒感染HEK293细胞后表达的目的蛋白均对5种试验菌株具有抑制作用，且双基因蛋白有更强的抑菌作用，而对照组没有抑菌作用。

3.4通过试管二倍稀释培养法测定Ad-cLYZ-hLTF蛋白提取物对各待测菌株的最低抑菌浓度，生理盐水作为空白对照，结果显示无乳链球菌、停乳链球菌(ATCC 9809)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC12228)和大肠杆菌(K88)的MIC分别为37.5μg/mL、75μg/mL、37.5μg/mL、37.5μg/mL和150μg/mL。为进一步评价腺病毒介导表达的外源蛋白对待测菌株的抑制作用以及临床应用价值，纸片法分别测定MIC蛋白提取物对各待测菌株的抑制效果，并与17种常用抗生素进行比较。结果显示与17种常用抗生素相比，外源蛋白对除大肠杆菌之外的待测菌株都具有良好的抑制作用，抑菌效果与常用抗生素持平，甚至更优。

本发明的创新之处在于，首次将cLYZ广谱抑菌作用、hLYZ广泛抑菌的特性和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，成功构建出共表达上述基因的重组腺病毒。通过检测重组腺病毒在体外HEK293细胞中的扩增、转录和外源基因的表达，以及细胞内活性蛋白提取物对金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳链球菌(ATCC 9809)、无乳链球菌和大肠杆菌(K88)等5种菌株的MIC和抑菌活性等，综合评价了重组腺病毒对奶牛乳房炎主要致病菌的抑制作用，阐明了重组腺病毒在体外细胞中的表达规律及介导外源蛋白杀伤细菌的生物学效应，证明了构建的重组腺病毒介导外源蛋白抑制细菌的作用及基因治疗动物细菌性疾病的临床应用前景。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡对本发明所揭示的创意所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims

1.一种cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)将获得的目的基因分别克隆到pDC315-MCS-EGFP穿梭载体中，与骨架载体pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad-cLYZ-hLTF。

2.如权利要求1所述的cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。

3.如权利要求1所述cLYZ和hLTF双抑菌基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在防治奶牛乳房炎中细菌性疾病生物制品方面的应用。