CN111840522B - 一种利用重组蛋白治疗儿童感染性腹泻的口服复方制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗婴幼儿因致病性大肠杆菌或(和)轮状病毒感染引起的感染性腹泻的口服复方制剂，包含具有抗菌、抗病毒、免疫调节作用的规模化生产的重组人乳铁蛋白(90～110mg/ml)和重组人溶菌酶(30～36mg/ml)，还包含具有稳定剂、矫味剂以及抑菌作用的蔗糖(17％～23％)。本发明通过腹泻动物模型试验证实，重组人乳铁蛋白溶菌酶口服复方生物制剂对治疗致病性大肠杆菌引起或轮状病毒引起以及两者混合感染引起的感染性腹泻效果明显；经幼年SD大鼠及幼年Beagle犬的安全性评价试验，最大耐受剂量大于或等于3200mg/kg体重。本发明可以替代或减少抗生素和抗病毒化药在婴幼儿人群中使用，提供一种更加安全、有效的治疗感染性腹泻，保护婴幼儿肠道黏膜的方法。

Description

一种利用重组蛋白治疗儿童感染性腹泻的口服复方制剂
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种利用重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶配制而成的口服复方制剂，可用于治疗婴幼儿因致病性大肠杆菌或(和)轮状病毒感染引起的感染性腹泻。
背景技术
感染性腹泻病是全球发病率高和流行广泛的传染病，对人类尤其是儿童的健康危害严重。在我国，根据一些省份的入户调查资料，5岁以下儿童则为2.50～3.38次/人。感染性腹泻通常由胃肠道病毒和细菌感染所致，临床上常伴或不伴呕吐、恶心、发热、腹痛等症状。儿童急性感染性腹泻的病因多为病毒感染，以轮状病毒、诺如病毒最为常见，细菌病原包括大肠埃希菌属、弯曲菌属、沙门菌属以及志贺菌属等(中华医学会儿科学分会消化学组，2016年)。
人溶菌酶(Human Lysozyme，hLYZ)和人乳铁蛋白(Human Lactoferrin，hLF)是母乳中的主要蛋白成分之一，分别占母乳中0.04％和0.3％；在婴儿的免疫系统不健全时，母乳中的溶菌酶和乳铁蛋白对帮助婴儿抵御细菌和病毒的侵蚀，增加婴儿的免疫能力具有重要作用，这是长期进化的结果。人溶菌酶主要针对革兰氏阳性细菌以及部分革兰氏阴性菌，抗菌能力比市场上鸡溶菌酶的活性高出3.5倍，而人乳铁蛋白能抗革兰氏阴性细菌，同时人乳铁蛋白经胃消化后产生一个小分子多肽具有极强的抗病毒能力，二者均具有广谱抗菌、抗病毒和增强免疫力的药理作用，两种成分的组合对由多种细菌感染、轮状病毒感染以及抗生素滥用引起的腹泻有协同治疗作用，在治疗的同时提高机体免疫力，加速腹泻患者疾病恢复。因此，在腹泻的治疗中，WHO的治疗方案中推荐喂养母乳，是因为母乳中含有大量抗病毒的乳铁蛋白和广谱抗菌的溶菌酶。Zavaleta等研究表明，在口服补盐液的基础上添加重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶，与对照组(仅服口服补盐液)相比，试验组婴幼儿腹泻持续时间显著缩短，同时排出固体粪便的比例显著升高，另外在观察期后腹泻的再发生率也较低(Zavaleta等，2007)。专利CN104321075A公开了一种用于预防、改善或治疗腹泻的用途的包含乳铁蛋白的组合物，该组合物可以在断奶期、婴幼儿期和/或儿童期期间施用乳铁蛋白允许减少腹泻发生、其持续时间和严重性，但因浓度太低，只能用于补水等辅助治疗作用。
由于来源限制，市场上没有人溶菌酶产品和人乳铁蛋白产品，主要来源是鸡蛋清溶菌酶和牛乳铁蛋白，鸡溶菌酶的溶菌活性不仅比人溶菌酶的活性低3.5倍，而且是一个已知的过敏原，具有过敏性风险，不适合于婴幼儿使用，只能用于工业用途；市场上的乳铁蛋白来源于牛乳，是国外奶酪的副产品，其抗病毒活性也低于人乳铁蛋白，且牛乳铁蛋白主要依赖进口。同时具有传播疯牛病等人畜共患病毒的高风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全、有效的口服复方生物制剂，可有效治疗因致病性大肠杆菌或(和)轮状病毒感染引起的婴幼儿感染性腹泻，从而可以减少抗生素在我国幼儿中的使用，同时也可缓解我们儿童感染性腹泻无特效药的局面。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种口服复方生物制剂，包括具有抗病毒、抗菌生物活性的重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶，还包括起稳定剂、矫味剂作用的辅料；所述口服复方制剂组分中重组人乳铁蛋白∶重组人溶菌酶的蛋白浓度比例为2.5:1～3.7:1。
进一步地，所述的抗病毒是指抗轮状病毒、抗菌是指抗致病性大肠杆菌。轮状病毒及致病性大肠杆菌均可引起婴幼儿急性腹泻。
进一步地，所述的重组人乳铁蛋白是使用水稻胚乳特异性表达系统生产，具有与天然人乳铁蛋白相同的一级、二级和晶体结构。
进一步地，所述的重组溶菌酶是使用水稻胚乳特异性表达系统生产，具有与天然人溶菌酶相同的一级、二级和晶体结构。
进一步地，所述的起稳定剂和矫味剂作用的辅料是蔗糖。
进一步地，包含以下浓度配比组分：90～110mg/ml的重组人乳铁蛋白、30～36mg/ml的重组人溶菌酶以及17～23％(重量/体积)的蔗糖；所述制剂的pH值为5.2～6.5。
进一步地，所述制剂为液体口服制剂。
进一步地，本发明涉及将所述生物制剂在制备用于预防和治疗婴幼儿因致病性大肠杆菌或/和轮状病毒感染引起的感染性腹泻的药物中的应用。所述制剂治疗大肠杆菌致小鼠腹泻的有效剂量范围以OsrhLF计，为160～900mg/kg；治疗轮状病毒性腹泻的有效剂量以OsrhLF计，为150～450mg/kg。
进一步地，本发明提供了一种制备权利要求8所述的口服复方制剂的方法，包括以下步骤：
(1)称取一定量的蔗糖加入到OsrhLF原液中，充分溶解后分批次加入一定量OsrhLYZ冻干粉，静止澄清后，补加入一定量的注射用水使得最终制剂中OsrhLF的蛋白浓度为90～110mg/ml，OsrhLYZ的蛋白浓度为30～36mg/ml，蔗糖的浓度(w/v)为17～23％；
(2)采用1mol/L HCl调节步骤(1)所得溶液pH为5.2～6.5，即为重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液原液；
(3)将原液通过0.22μm无菌过滤器过滤，分装入瓶并铝盖密封即为口服液成品。
本发明利用规模化生产的重组人乳铁蛋白(Recombinant human lactoferrinfrom Oryza sativa，OsrhLF)和重组人溶菌酶(Recombinant human lysozyme from Oryzasativa，OsrhLYZ)为原料，以母乳中乳铁蛋白和溶菌酶的含量及比例为基本配方依据，通过体外抗病毒、抑菌试验确定配方中乳铁蛋白和溶菌酶的最优配比，同时通过辅料筛选，确定最佳的辅料及使用比例。通过腹泻型模式动物进一步证实重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶所组配方的对致病性大肠杆菌或(和)轮状病毒引起的感染性腹泻具有明显的治疗效果。
由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：(1)人溶菌酶和人乳铁蛋白作为人体母乳中的主要蛋白质，与人体具有天然相容性，长期使用不会产生耐药性，可以替代抗生素和抗病毒药物，也是儿童这一特殊患病群体的理想选择；(2)本制剂以最安全的口服方式，达到有效治疗儿童感染性腹泻的效果；(3)安全性高，经口服最高安全剂量大于或等于3.2g/kg；由于生产方式简单、安全性高，成本低，可填补我国无专门治疗儿童感染性腹泻的安全有效生物药物的空白，可以满足我国儿童感染性腹泻治疗的重大市场需求，减少或取代抗生素在儿童腹泻治疗中的应用，保障我国儿童健康。
附图说明
图1显示不同辅料在不同条件下对制剂中OsrhLF及OsrhLYZ成分变化的影响。
图2显示重组人乳铁蛋白溶菌酶口服制剂配制生产工艺流程图。
图3显示重组人乳铁蛋白&溶菌酶口服液对小鼠总便含水量的量效关系曲线(n＝10)。
图4显示重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对大肠杆菌所致小鼠小肠病理组织形态学的影响(200×)。
图5显示重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液及对照药治疗乳鼠结束后小肠病理变化(200×)；A为正常对照组；B为病毒对照组；C为1800mg/kg妈咪爱组；D为900mg/kg妈咪爱组；E为50mg/kg口服液组；F为150mg/kg口服液组；G为300mg/kg口服液组；H为450mg/kg口服液组；蓝色箭头为细胞胞浆空泡化。
图6显示重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液及其单方对乳鼠治疗结束后小肠病理(HE染色)结果(200×)。A为正常对照组；B为病毒对照组；C为1800mg/kg妈咪爱组；D为900mg/kg妈咪爱组；E为重组人溶菌酶组；F为重组人乳铁蛋白组；G为450mg/kg口服液组。
图7显示重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液治疗乳鼠病毒细菌混合感染的小肠组织病理学(HE染色，200×)。A为正常对照组；B为病毒细菌模型组；C为重组人乳铁蛋白溶菌酶组；D为妈咪爱组900mg/kg；E为妈咪爱组1800mg/kg；蓝色箭头所示为空泡化胞浆，红色箭头所示为菌丝团。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的口服复方制剂进行具体说明。所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
以下实验所用的试剂均为市售产品。
重组人乳铁蛋白(产品货号HYC004M01，纯度＞95％，具有与天然人乳铁蛋白相同的一级、二级和晶体结构)及重组人溶菌酶(产品货号HYC013R01，纯度＞95％，具有与天然人溶菌酶相同的一级、二级和晶体结构)均为武汉禾元生物科技股份有限公司生产的医药级产品。
【实施例1】重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液体外抗病毒效果
目的：采用人轮状病毒A组G3型709株(武汉大学病毒研究所保存)、恒河猴胚肾细胞(MA-104)作为研究对象，分别考察4组供试品(供试品A：60mg/ml OsrhLF，12mg/mlOsrhLYZ；供试品B：60mg/ml OsrhLF，6mg/ml OsrhLYZ；供试品C：60mg/ml OsrhLF；供试品D：9mg/ml OsrhLYZ)的抗轮状病毒效果。
方法：(1)供试品对MA-104细胞的毒性作用。在96孔板中加入0.1mL5×104的MA-104细胞，待细胞长成单层后，分别加入终浓度为10mg/ml、5mg/ml、3mg/ml、2.5mg/ml、1mg/ml(采用DMEM原液稀释)的含4种供试品的维持液(2μg/ml胰蛋白酶的DMEM原液)继续培养。每天于倒置显微镜下观察细胞变化，72h后，MTT法检测细胞存活率(细胞存活率(％)＝(实验组平均A值/对照组平均A值)×100％)。采用统计软件SPSS20.0进行数据分析并计算药物的半数细胞毒性浓度(TC50)；
(2)体外抗轮状病毒的药效学研究。Ⅰ组(药物对病毒的直接杀伤作用)。即将不同浓度的药物与100TCID50/0.1mL的病毒液等量混合，4℃作用6h，15mg/L胰酶预处理后，再将其感染单层细胞，吸附2h后，弃上清，加入维持液，每天于倒置显微镜下观察细胞变化。记录CPE。待病毒对照组CPE达80％以上且细胞对照组正常时，用MTT法检测细胞存活率，以Probit回归方法计算药物半数有效浓度(IC50)。Ⅱ组(药物对病毒感染的预防作用)。分别加入不同浓度的含不同供试品的维持液预先处理单层细胞24h后，再将用胰酶预处理的100TCID50/0.1mL的病毒每孔加入0.1mL，吸附2h，弃病毒液，加维持液培养，同上法处理，观察、计算IC50。Ⅲ组(药物对病毒穿入细胞后的抑制作用)。先用胰酶预处理的100TCID50/0.1mL的病毒每孔0.1mL感染细胞，吸附2h后，吸弃病毒，加入不同浓度的含不同供试品的维持液，同上法培养和检查。采用治疗指数(Treatment index，TI)作为评价指标，衡量药物对轮状病毒的抑制效力，TI＝TC50/IC50，其中TI>2为有效低毒，1<TI<2为低效有毒，TI<1为无效。病毒抑制率计算公式如下：
结果讨论：(1)4种供试品对MA-104细胞的半数毒性浓度(TC50)分别为5.9mg/ml、5.2mg/ml、4.1mg/ml和4.6mg/ml。其中供试品A和B的安全性较好。结果见表1。
(2)直接杀伤轮状病毒作用方面，供试品A、B均具有量效关系，抗病毒效果明显，供试品C和D没有明显的抗病毒作用，结果见表2；在阻断病毒感染方面，供试品A、B的IC50分别是0.286mg/ml、7.194mg/ml，TI分别为20.63、0.72，而对照供试品C、D作用不明显，没有量效关系，供试品A在阻断病毒感染方面有明显效果，有进一步研究的价值，结果见表3；在病毒增殖抑制方面，供试品A、B、C、D皆未表现出明显的抗病毒作用，结果见表4。
结果讨论：供试品A(60mg/ml OsrhLF，12mg/ml OsrhLYZ)、供试品B(60mg/mlOsrhLF，6mg/ml OsrhLYZ)有明显的抗轮状病毒作用，且供试品A的效果优于供试品B；OsrhLF和OsrhLYZ联合使用的体外抗病毒的效果优于单独使用OsrhLF或OsrhLYZ。
表1 4种供试品不同浓度下的细胞存活率
表2 4种供试品对病毒直接杀伤作用
表3 4种供试品对病毒的阻断作用
表4 4种供试品对病毒增殖的抑制作用
【实施例2】重组人乳铁蛋白溶菌酶复方制剂体外抑菌效果
目的：评估重组人乳铁蛋白溶菌酶复方制剂的体外抑菌效果
方法：采用96孔微量培养法，将不同浓度(以OsrhLF计)的制剂(OsrhLF与OsrhLYZ蛋白含量比为5:1)加入接种浓度1×104cfu/ml肠致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coliEPEC，菌株编号：CICC 106643)的胰酪大豆胨琼脂培养基中，分别检测培养0，1h，2h，4h的细菌数，并与空白组(不含制剂)做比较。
结果讨论：如表5所示，不同浓度的制剂对均对肠致病性大肠埃希氏菌的生长具有一定的抑制作用，且呈现一定的量效关系。当制剂中OsrhLF和OsrhLYZ的含量比为5:1时，其对引起婴幼儿腹泻的肠致病性大肠埃希氏菌的生长具有一定的抑制作用。
表5不同培养时间细菌浓度测定值
【实施例3】重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶浓度配比的筛选
目的：通过体外抗病毒试验确定制剂中OsrhLF和OsrhLYZ的最佳浓度比。
方法：将OsrhLF及OsrhLYZ按照一定的浓度随机组合组成20种配方，分别考察不同配方的抗轮状病毒效果。试验方法参考实施例1。
结果：(1)在直接杀伤病毒方面，配方3mg/ml OsrhLF+0.6mg/ml OsrhLYZ的效果最好，2mg/ml OsrhLF+0.6mg/ml OsrhLYZ的次之。结果见表6；(2)在阻断病毒感染细胞方面，大部分配方的细胞抑制率均在90％以上。结果见表7；(3)在抑制病毒增殖方面，各配方的抑制效果均较低，其中OsrhLF为2mg/ml，OsrhLYZ为0.6mg/ml，效果相对较好，实验结果见表8。
结果讨论：综合3种抗病毒作用的结果筛选和分析，2mg/ml OsrhLF+0.6mg/mlOsrhLYZ为最优配方。
表6 20种配比的制剂对轮状病毒的直接杀伤作用
注：表中配方组成按OsrhLF mg/ml+OsrhLYZ mg/ml表示，下同。
表7 20种配比的制剂对轮状病毒的感染阻断作用
配方组成 OD均值 抑制率(％) 配方组成 OD均值 抑制率(％)
3+1 0.5008 82.4 1+1 0.5293 95.3
3+0.8 0.578 117.3 1+0.8 0.522 92.0
3+0.6 0.5523 105.7 1+0.6 0.5358 98.2
3+0.3 0.572 114.6 1+0.3 0.5205 91.3
3+0.1 0.595 125.0 1+0.1 0.5308 96.0
2+1 0.5598 109.1 0.5+1 0.5225 92.2
2+0.8 0.5273 94.4 0.5+0.8 0.5183 90.3
2+0.6 0.5515 105.3 0.5+0.6 0.4868 76.1
2+0.3 0.533 97.0 0.5+0.3 0.4855 75.5
2+0.1 0.5393 99.8 0.5+0.1 0.4658 66.6
VC 0.3183 NC 0.5397
表8 20种配比的制剂对轮状病毒进入细胞的增殖抑制作用
【实施例4】辅料的筛选
目的：考察常见矫味剂对制剂的稳定性的影响。
方法：根据制剂的特点，在配方(83.3mg/ml OsrhLF，8.3mg/ml OsrhLYZ)的基础上添加不同浓度的蔗糖、甜菊糖、阿斯巴甜、果葡糖浆，通过外观(目测)及含量变化(液相色谱)考察不同配方在不同温度下(2～8℃，25℃，40℃)的稳定性。
结果讨论：高浓度的蔗糖(10％～20％)及10％果葡糖浆对高温下制剂的稳定性有明显的改善作用。外观观察结果见表9，OsrhLF及OsrhLYZ含量检测结果见图1。
结论：鉴于蔗糖的安全性最高及在口服糖浆类药品中使用最广，因此选择的蔗糖作为矫味剂(同时还具有稳定剂的作用)。另外考虑到高浓度蔗糖具有甜度高及一定的抑菌作用，最终选择20％蔗糖作为制剂的辅料。
表9高温下制剂的外观检查结果
【实施例5】重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液配方的确定
通过实施例2证明3.5mg/ml OsrhLF+0.7mg/ml OsrhLYZ的配方(即蛋白含量比OsrhLF：OsrhLYZ＝5：1)具有抑制肠致病性大肠杆菌增殖的作用；通过实施例3证明2mg/mlOsrhLF+0.6mg/ml OsrhLYZ(即OsrhLF:OsrhLYZ＝3.3：1)的抗轮状病毒效果相对最好。综合考虑，最终确定制剂配方中OsrhLF和OsrhLYZ的配比(蛋白浓度)为3:1。另外结合实施例4，选择辅料蔗糖的浓度20％(w/v)。因此，最终制剂配方如下：100mg/ml OsrhLF，33mg/mlOsrhLYZ，20％(w/v)蔗糖。
【实施例6】重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液的配制
重组人乳铁蛋白溶解酶口服液的的生产过程包括OsrhLF及OsrhLYZ与辅料按照实施例5的配方进行混合，pH调节，0.22μm过滤，无菌灌装，轧盖，目视检查，贴标签和成品包装。其生产工艺流程图如图2所示。简单的说，按照批处方，称取一定量的蔗糖加入到OsrhLF中，充分溶解后分批次加入一定量OsrhLYZ冻干粉，静止澄清后，补加入一定量的注射用水使得最终制剂中OsrhLF的蛋白浓度为90～110mg/ml，OsrhLYZ的蛋白浓度为30～36mg/ml，蔗糖的浓度(w/v)为17～23％，采用1mol/L HCl调节pH至5.2～6.5，所得溶液称为重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液原液。然后将原液通过0.22μm无菌过滤器过滤，即为半成品。将半成品无菌分装至预先干热灭菌灭菌的20ml棕色钠钙玻璃管制口服液体瓶中，然后盖上预先蒸汽灭菌灭菌的口服液瓶用铝盖，并用预先密封蒸汽灭菌灭菌的铝封口机轧盖密封，即为成品。
【实施例7】重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对大肠杆菌致小鼠腹泻的影响
目的：比较重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液、重组人乳铁蛋白、重组人溶菌酶对肠致病性大肠杆菌致小鼠腹泻模型的影响。观察重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液的量效关系，并探讨其作用机制，为重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液治疗小儿细菌感染性腹泻提供实验依据。
方法：(1)比较重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液、单用重组人乳铁蛋白、单用重组人溶菌酶对大肠杆菌致小鼠腹泻模型的影响。
利用肠致病性大肠杆菌复制小鼠腹泻模型，模型复制成功后随机分为模型组、头孢克肟组(26mg/kg)、重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组(160mg/kg、285mg/kg；均以OsrhLF计)、重组人乳铁蛋白组(160mg/kg、285mg/kg)、重组人溶菌酶组(53mg/kg、94mg/kg)，另设空白对照组，每组各10只。药后观察每隔1小时间段的总便数、稀便数(稀便的判断以滤纸上有无污迹来判断)及测量稀便直径，并计算稀便率、稀便级和腹泻指数(造模后小鼠排出的稀便在滤纸上污迹直径对稀便进行分级：1级，污迹直径＜1cm；2级，污迹直径1～＜2cm；3级，污迹直径2～＜3cm；腹泻指数＝稀便率×稀便级)。记录给药后0～9h的粪便湿重及干重，并计算粪便含水量(粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100％)。药后3h每只小鼠灌胃营养性半固体黑糊0.3mL，观察首次排黑便的时间。
(2)观察重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对大肠杆菌致小鼠腹泻模型的疗效及量效关系。
利用肠致病性大肠杆菌复制小鼠腹泻模型，模型复制成功后随机分为模型组、头孢克肟组(26mg/kg)、重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组(90mg/kg、160mg/kg、285mg/kg、506mg/kg、900mg/kg、1600mg/kg)，另设空白对照组，每组各10只。药后观察每隔1小时间段的总便数、稀便数及测量稀便直径，并计算稀便率、稀便级和稀便率。记录给药后0-9h的粪便湿重及干重，并计算粪便含水量。药后3h每只小鼠灌胃营养性半固体黑糊0.3mL，观察首次排黑便的时间。药后9h处死小鼠，取十二指肠、空肠和回肠，一部分用于固定进行HE染色；另一部分制成肠黏膜匀浆液，检测乳糖酶、蔗糖酶和麦芽糖酶的活性。
结果讨论：
1.重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组(160mg/kg、285mg/kg)、重组人乳铁蛋白组(160mg/kg、285mg/kg)、重组人溶菌酶组(53mg/kg、94mg/kg)均能降低模型小鼠的总便粒、稀便粒(表10)、稀便率(表10)和总便含水量(表11)，延长首次排黑便时间(表11)，除重组人乳铁蛋白组160mg/kg和重组人溶菌酶组53mg/kg组外，其余各组与模型组比较均有显著性差异。其中重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组的总便粒、稀便粒、稀便率和总便含水量均低于单用重组人乳铁蛋白组及重组人溶菌酶组；首次排黑便时间则高于单用重组人乳铁蛋白组及重组人溶菌酶组。
表10重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液、重组人乳铁蛋白、重组人溶菌酶对小鼠总便粒和稀便粒的影响(n＝10)
注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与285mg/kg重组人乳铁蛋白溶菌酶组组比较：▲P<0.05(下同)。
表11重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液、重组人乳铁蛋白、重组人溶菌酶对小鼠总便含水量和首次排黑便时间及对大肠杆菌所致小鼠腹泻综合评分(n＝10)
注：与重组人乳铁蛋白溶菌酶组160mg/kg比较：#P<0.05，##P<0.01(下同)。
2.重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液能降低模型小鼠的总便粒、稀便粒、稀便率(表12)和总便含水量(表13)，延长首次排黑便时间(表13)及升高小肠双糖酶活性(表14-16)，除重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组90mg/kg外，其余各组与模型组比较均有显著性差异。而当重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液剂量达到900mg/kg时再增加剂量，小鼠的稀便粒、稀便率和总便含水量不再继续下降，首次排黑便时间、十二指肠粘膜双糖酶活性以及空肠粘膜麦芽糖酶活性不再继续增加，而小鼠的总便粒虽有下降，空肠粘膜乳糖酶和蔗糖酶活性、回肠粘膜蔗糖酶和麦芽糖酶活性虽有增加，但差异无显著性。病理结果显示模型组个别小鼠的十二指肠及回肠出现粘膜层轻度充血，纤维轻度增生，轻度炎细胞浸润，及粘膜轻度至中度变性脱落，但其病理评分与空白组比较无显著性差异(表18-20)；给予重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液后，其组织结构亦无明显改变(图4)。
表12不同剂量重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组对小鼠总便粒和稀便粒以及稀便率的影响(n＝10)
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01(下同)。
表13不同剂量重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对小鼠总便含水量等的影响(n＝10)
表14重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对小鼠十二指肠粘膜双糖酶活性的影响(n＝10)/>
注：与空白组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01(下同)。
表15重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对小鼠空肠粘膜双糖酶活性的影响(n＝10)
表16重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对小鼠回肠粘膜双糖酶活性的影响(n＝10)/>
表17重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对大肠杆菌所致小鼠腹泻综合评分的影响(n＝10)
表18重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对大肠杆菌所致小鼠十二指肠病理评分的影响(n＝10)/>
表19重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对大肠杆菌所致小鼠空肠病理评分的影响(x±s，n＝10)
表20重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对大肠杆菌所致小鼠回肠病理评分的影响(n＝10)
结果讨论：(1)重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对大肠杆菌致小鼠腹泻的疗效要显著优于单用重组人乳铁蛋白和单用重组人溶菌酶。(2)重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液可治疗大肠杆菌致小鼠腹泻，其起效剂量为160mg/kg，最大效应剂量为900mg/kg，半最大效应剂量(EC50)为314.5mg/kg，起效时间为给药后1h。(3)重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液可通过增加小肠黏膜的双糖酶活性，抑制大肠杆菌引起的腹泻。
【实施例8】不同剂量重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对治疗轮状病毒性腹泻的影响
目的：观察不同浓度重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对鼠轮状病毒性腹泻的治疗作用。
方法：ICR乳鼠随机按窝分为空白组、模型组、妈咪爱组(1800mg/kg)、重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组(450mg/kg、300mg/kg、150mg/kg、50mg/kg)共7组，用人轮状病毒A组G3型709株感染ICR乳鼠，制备腹泻模型，感染病毒后24h给予药物治疗，疗程5天。通过观察乳鼠体质量变化、腹泻程度(腹泻程度按颜色、质地、量进行1-4分评分，正常便为1分，松软便为2分，黄绿稀松便为3分，水样便为4分，无便视为无腹泻，分值>2分视为腹泻，评分由同一人完成)、腹泻率(腹泻率(％)＝(腹泻分值>2分粪便数)/粪便总数×100％)、粪便病毒阳性率和组织病理学，评价重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对鼠轮状病毒性腹泻的治疗效果。
结果讨论：治疗前，各组乳鼠体质量均数之间差异无统计学意义，治疗后，重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液450mg/kg浓度组乳鼠体质量比病毒对照组显著性增加(p<0.05)，但其他各剂量组间无差异。口服液450mg/kg，300mg/kg，150mg/kg组均可不同程度改善乳鼠腹泻程度，呈现量效关系。除50mg/kg剂量组外，各剂量组重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液均能够很好的控制乳鼠的腹泻情况，并存在量效关系。与模型组比，450mg/kg及300m/kg口服液组在治疗结束后的粪便病毒阳性检出率有显著性差异(p<0.05)，而阳性药物妈咪爱对照组则仍具有50％以上的粪便病毒阳性检出率，与模型组无显著性差异。组织病理学检查证实药物治疗可以减轻乳鼠小肠病变程度，并呈现量效关系。
表21各剂量组治疗期间乳鼠体质量变化情况(g，mean±SEM)
注：与病毒模型组相比，*表示p<0.05；与450mg/kg口服液组相比，#表示p<0.05；与正常对照相比，&表示p<0.05。与1800mg/kg妈咪爱相比，％表示P<0.05；与900mg/kg妈咪爱相比，$表示P<0.05；
表22.重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对乳鼠治疗过程中腹泻程度的影响(mean±SEM)
注：与模型组相比，*表示P<0.05；与450mg/kg口服液相比，#表示P<0.05；与1800mg/kg妈咪爱相比，&表示P<0.05；与900mg/kg妈咪爱相比，$表示P<0.05；
表23重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液各剂量组对乳鼠腹泻率及粪便病毒抗原阳性率影响
注：与模型组相比，*表示P<0.05；与450mg/kg口服液相比，#表示p<0.05；与1800mg/kg妈咪爱相比，&表示P<0.05；与900mg/kg妈咪爱相比，$表示P<0.05；
结果：重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对鼠轮状病毒性腹泻有治疗作用，且呈现剂量效应。
【实施例9】重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液与单用重组人乳铁蛋白或重组人溶菌酶对轮状病毒致腹泻乳鼠的影响
目的：比较并验证重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液治疗乳鼠腹泻效果是否优于单用重组人乳铁蛋白或单用重组人溶菌酶对轮状病毒致腹泻乳鼠的治疗作用。
方法：ICR乳鼠随机按窝分为空白组、模型组、阳性对照妈咪爱组(1800mg/kg、900mg/kg)、重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组450mg/kg、重组人乳铁蛋白450mg/kg，重组人溶菌酶150mg/kg共6组，用人轮状病毒A组G3型709株感染ICR乳鼠，制备腹泻模型，感染病毒后24h给予药物治疗，疗程5天，结束24h后处死所有乳鼠。通过观察乳鼠体质量变化、腹泻程度、腹泻率、粪便病毒阳性率和组织病理学，评价重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对鼠轮状病毒性腹泻的治疗效果。
结果讨论：治疗前，各组之间体质量差异均无显著性差异，治疗后，与病毒对照组比，重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液450mg/kg组、重组人溶菌酶组及重组人乳铁蛋白组3组体质量增长明显，均有显著性差异。重组人溶菌酶乳铁蛋白口服液、重组人溶菌酶、重组人乳铁蛋白组均能改善乳鼠的腹泻程度，但重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液则能缩短乳鼠平均腹泻天数，优于单方重组人溶菌酶和重组人乳铁蛋白。与模型组相比，仅重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组在治疗结束后的粪便病毒抗原阳性检出率有显著性差异，说明重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶单用时，对轮状病毒的抑制的作用有限，二者联用具有抑制病毒作用。组织病理学检查也证实重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对肠道组织的损伤最小，明显优于阳性对照药物和单纯的溶菌酶和乳铁蛋白。
表24治疗期间乳鼠体质量变化情况(g，mean±SEM)
注：与病毒组相比，*表示p<0.05；与重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组相比，#表示p<0.05；与正常对照组相比，&表示p<0.05；与1800mg/kg妈咪爱相比，％表示P<0.05；与900mg/kg妈咪爱相比，$表示P<0.05；
表25重组人乳铁蛋白溶菌酶及其单方对乳鼠治疗过程中腹泻程度的影响
注：与模型组相比，*表示p<0.05；与450mg/kg口服液相比，#表示p<0.05；与1800mg/kg妈咪爱相比，&表示p<0.05；与900mg/kg妈咪爱相比，$表示p<0.05.
表26重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液及其单方对乳鼠腹泻率及粪便病毒抗原阳性率影响
注：与模型组比较，*P<0.05；与450mg/kg口服液组比较，#P<0.05；与1800mg/kg妈咪爱组相比，&表示p<0.05；与900mg/kg妈咪爱组相比，$表示p<0.05；
结果讨论：重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对轮状病毒性腹泻的治疗效果要优于单用重组人乳铁蛋白或单用重组人溶菌酶。
【实施例10】重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对致病性大肠杆菌及轮状病毒混合感染引起乳鼠腹泻的治疗效果评估
目的：评价重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对致病性大肠杆菌及轮状病毒混合感染引起乳鼠腹泻的治疗效果。
方法：ICR乳鼠随机按窝分为空白组、病毒细菌感染模型组、妈咪爱组(高剂量1800mg/kg)、妈咪爱组(低剂量900mg/kg)重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组高剂量450mg/kg组，共5组。乳鼠禁食2h后感染轮状病毒液，感染病毒23h后再感染致病性大肠杆菌。各组感染病毒后24h后24h给予药物治疗，疗程5天。结束24h后第7d处死所有乳鼠。通过观察乳鼠体质量变化、腹泻程度、腹泻率、粪便病毒阳性率和组织病理学，评价重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对致病性大肠杆菌及轮状病毒混合感染引起乳鼠腹泻的治疗效果。
结果讨论：治疗前，各组之间体质量差异均无显著性差异，治疗后，与模型对照组相比，重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液高剂量组(450mg/kg)、高、低剂量妈咪爱组(1800mg/kg和900mg/kg)三组鼠体质量增长较明显，均有显著性差异。重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液较高、低剂量的阳性对照药物妈咪爱能有效地缩短腹泻天数。治疗结束后，实验组、模型组乳鼠在病毒细菌的混合感染下均有死亡，但治疗组明显低于模型组，与模型组相比，各给药组乳鼠腹泻率均有显著性降低。组织病理学检查也证实模型组乳鼠肠道内可观察到明显菌丝团，而重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组及妈咪爱组则未观察到菌丝生长。
表27重组人乳铁蛋白溶菌酶在治疗期间乳鼠体质量变化情况(g，mean±SEM)
注：与病毒组相比，*表示p<0.05；与重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液组相比，#表示p<0.05；与1800mg/kg妈咪爱组相比，&表示p<0.05；与900mg/kg妈咪爱组相比，$表示p<0.05。
表28.重组人乳铁蛋白溶菌酶对乳鼠治疗过程中腹泻程度的影响(mean±SEM)
注：与模型组相比，*表示p<0.05；与450mg/kg口服液相比，#表示p<0.05；与1800mg/kg妈咪爱组相比，&表示p<0.05；与900mg/kg妈咪爱组相比，$表示p<0.05；
表29重组人乳铁蛋白溶菌酶在治疗前后对乳鼠腹泻率及粪便病毒阳性率影响
注：与模型组比较，*P<0.05；与450mg/kg口服液组比较，#P<0.05；与1800mg/kg妈咪爱组相比，&表示p<0.05；与900mg/kg妈咪爱组相比，$表示p<0.05；
结果讨论：重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液对乳鼠混合感染轮状病毒及细菌也显示治疗作用，而且对病毒细菌混合感染的治疗作用优于阳性对照药物妈咪爱。
【实施例11】重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液单次灌胃给予幼年SD大鼠的毒性试验
目的：观察重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液单次灌胃给予幼年SD大鼠后所产生的急性毒性反应情况，为临床研究提供动物试验资料。
方法：试验使用104只幼年SD大鼠(14～15日龄，相当于1.5岁～5岁离乳后幼儿)，采用Provantis系统按性别区段随机分为6组，包括毒理研究组和卫星组。毒理研究组分别为阴性对照组和供试品低、中、高剂量组，每组16只动物，雌雄各半；阴性对照组给予10mL/kg的灭菌注射用水，供试品组给予不同剂量的重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液(乳铁蛋白与溶菌酶含量比为3:1)，低、中、高剂量组的给药剂量分别为320mg/kg、960mg/kg和3200mg/kg(均以乳铁蛋白计)，所有动物单次灌胃给药，给药容量分别为1、3和10mL/kg；动物在给药后笼旁观察约4小时，以后每天进行两次临床观察，连续观察14天。试验期间，定期进行体重和食量的测定。观察期结束后(D15)，将动物实施安乐死，进行大体解剖观察。卫星组动物分别为阴性对照组(灭菌注射用水)和高剂量组(3200mg/kg)，动物数分别为8只和32只，雌雄各半，给药后对卫星组动物取血并转交委托方保存和处理。
结果讨论：(1)试验期间，所有动物均未见死亡或濒死；(2)供试品各剂量组动物临床观察和摄食情况均未见异常。(3)与同期阴性对照组相比，供试品各剂量组各时间点体重未见明确与给药相关的异常改变。(4)各组动物大体解剖观察未见明显异常改变。在本试验条件下，重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液以320、960、3200mg/kg剂量单次灌胃给予幼年SD大鼠，动物未见死亡和濒死情况，未见明显毒性反应，最大耐受剂量(MTD)大于或等于3200mg/kg。
【实施例12】重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液单次灌胃给予幼年Beagle犬的毒性试验
目的：评价重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液单次灌胃给予幼年Beagle犬后可能出现的急性毒性反应情况，为后续毒性试验设计和临床前研究提供参考资料。
方法：试验选用8只幼年Beagle犬(5～6周龄，相当于1.5岁～5岁离乳后幼儿)，雌雄各半，随机分为4组，分别为阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组2只，雌雄各半；阴性对照组给予10mL/kg的灭菌注射用水；供试品组给予不同剂量的重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液，低、中、高剂量组的给药剂量分别为320mg/kg、960mg/kg和3200mg/kg(均以乳铁蛋白计)，所有动物单次灌胃给药，给药容量分别为1、3和10mL/kg。给药后4小时内观察动物的急性毒性反应，试验期间进行了一般和详细临床观察、体重、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血液生化等指标的检测。观察期结束后，将所有动物安乐死，进行了大体解剖检查。
结果讨论：试验期间，所有动物均未见死亡或濒死；供试品各剂量组动物临床观察未见异常反应；与同期对照组及自身药前值相比，供试品各剂量组动物的体重(表30)、体温(表31)、心电图(表32)、血细胞计数、凝血功能以及血液生化等各项指标均未见明显异常改变。观察期结束后(D15)，所有动物均按计划实施安乐死，各组动物大体解剖观察均未见明显与供试品相关的改变。在本试验条件下，重组人乳铁蛋白溶菌酶口服液按照320、960、3200mg/kg的剂量单次灌胃给予Beagle犬，动物未见明显全身毒性反应，最大耐受剂量(MTD)大于或等于3200mg/kg。
表30体重数据-部分动物
表31体温数据-D1药后2～4小时
表32心电图数据(心率)
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均应落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种口服复方制剂，其特征在于所述口服复方制剂包含以下浓度配比组分：90～110mg/ml的重组人乳铁蛋白、30～36mg/ml的重组人溶菌酶以及17～23％重量/体积的蔗糖；所述制剂的pH值为5.2～6.5；其中所述的重组人乳铁蛋白为水稻胚乳特异性表达系统生产、具有与天然人乳铁蛋白相同的一级、二级和晶体结构，所述的重组溶菌酶为水稻胚乳特异性表达系统生产、具有与天然人溶菌酶相同的一级、二级和晶体结构。
2.根据权利要求1所述的口服复方制剂，其特征在于所述口服复方制剂用于抗轮状病毒和抗致病性大肠杆菌。
3.根据权利要求1-2任一项所述的口服复方制剂，其特征在于所述复方口服复方制剂为液体口服制剂。
4.权利要求1所述的口服复方制剂在制备用于预防和治疗婴幼儿因致病性大肠杆菌或/和轮状病毒感染引起的感染性腹泻的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述制剂治疗大肠杆菌致小鼠腹泻的有效剂量范围以重组人乳铁蛋白含量/体重计，为160～900mg/kg；治疗轮状病毒性腹泻的有效剂量范围以重组人乳铁蛋白含量/体重计，为150～450mg/kg。
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