CN1407108A

CN1407108A - 表达乳铁蛋白的基因工程重组菌株及其应用

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Publication number: CN1407108A
Application number: CN01142001A
Authority: CN
Inventors: 胡放; 王春香
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2001-09-06
Publication date: 2003-04-02

Abstract

本发明阐述用分子生物学技术构建含有乳铁蛋白基因的表达载体，并通过电转化法转入益生菌中，得到稳定表达人内皮细胞抑制素基因的重组益生菌菌株。一种或多种重组菌株经发酵处理后作为口服制剂，通过口服，在体内表达有活性的乳铁蛋白及其多肽片段。所表达的乳铁蛋白及其多肽片段能够治疗和预防病毒引起的传染病，抑制肿瘤细胞的生长，缓解肿瘤病人经放化疗后引起的消化道功能紊乱、促进患者胃肠道内益生菌群的生长和提高机体免疫能力；并可用于食品、保健品。

Description

表达乳铁蛋白的基因工程重组菌株及其应用

本发明涉及一种全新的产品，它能在体内传递有活性的乳铁蛋白多肽，并用于预防和治疗多种疾病。本发明的方法是将乳铁蛋白基因克隆到益生菌，通常是乳酸菌如乳球菌和乳杆菌的表达载体上，用电转化方法获得转乳铁蛋白基因的重组菌株。通过蛋白杂交及生物活性测定，证明得到的重组菌株确实能够产生有生物活性的乳铁蛋白多肽。然后用一种或多种重组益生菌菌株制成不同的制剂如口服液、冻干粉压片、胶囊或喷雾剂，提供给患者，使其在消化道和阴道或其它粘膜处及体表能表达乳铁蛋白，由于所使用的益生菌不仅不生产任何对人体有害的毒素，而且对人体健康还有不同程度的促进作用，益生菌在人体内能够不断地繁殖，因而我们能够利用这种重组的益生菌成为在体内制造这种生物活性蛋白的“工厂”，这也是在体内传递有生物活性的乳铁蛋白的一种全新的方法，从而达到预防和治疗多种疾病的目的。

乳铁蛋白是一种天然的非血红素铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族的一员。上个世纪六十年代首次在牛初乳中发现的。其分布很广，主要存在于母乳中，尤其于初乳中含量最高。它是母乳中含量第二多的蛋白质，占普通母乳蛋白质的10-20％。除乳汁外，其他的消化、呼吸和生殖系统的外分泌液中也含有一定量的乳铁蛋白，如泪液、精液、唾液、滑液等。血液中也能检测到乳铁蛋白的存在。血液中的乳铁蛋白来自于噬中性粒细胞，噬中性粒细胞在炎症处被激活后会合成并释放出乳铁蛋白。

人乳铁蛋白是分子量为78kDa的单体糖蛋白，其在不同的种属中分别含1-4个多聚糖。牛与人的乳铁蛋白分别含689和691个氨基酸，其同源性为69％。两者的三维结构非常相似。每个乳铁蛋白由两个相同的叶组成，分别命名为N-和C-叶。每个叶又可分为两个亚叶，亚叶之间形成一个裂缝。此裂缝通过一个双碳酸根离子与Fe³⁺的协同作用牢固结合Fe³⁺，每分子可结合两个Fe³⁺。乳铁蛋白具有促铁吸收、免疫调节、抑菌、杀菌、抗病毒、阻断氧自由基、调节骨随细胞的生长和促进肠道内益生菌生长等功能。最新研究显示乳铁蛋白还有预防和抑制大肠癌发生和扩散的作用。此外，它还能抑制丙型肝炎病毒的增殖，而且没有副作用。现已发现去糖基化蛋白保留了天然乳铁蛋白的所有生物功能。乳铁蛋白的稳定性是随PH、盐离子浓度和环境其它因素而改变。在酸性条件下，乳铁蛋白非常稳定，对体内一些蛋白酶不敏感。大量试验证明被蛋白酶水解的一些乳铁蛋白多肽仍具有抗菌活性，如lactoferricin H(包含N端1-47氨基酸)，其抑菌和杀菌活性比完整的乳铁蛋白还高。乳铁蛋白的N1端参与与LPS的结合，乳铁蛋白还与溶菌酶，肝素、和DNA结合。

由于乳铁蛋白的重要生理功能，自其发现的近四十年来，吸引了众多科学家的兴趣，目前已对其结构特征和生理功能有相当的了解，对其进行商业化开发的时机已经成熟。由于乳铁蛋白具有以上的生理功能，所以其在国外得到广泛的应用。多年来乳铁蛋白主要用作乳制品添加剂和婴幼儿食品添加剂，模仿母乳，提高抗病菌能力。在乳制品中乳铁蛋白与益生菌混用，作为运动员营养的一部分。生产片剂或速溶饲料，用作宠物食品，抗病毒。作为功能食品，增加铁的可溶性和帮助对铁的吸收，用于儿童和孕妇的补铁制品。添加到化妆品中，用于抗氧化，抗衰老，甚至用于口腔保护剂和口香糖，改善口腔卫口等。市售多种奶粉、鲜奶，多不含乳铁蛋白，这是因为其产品制造过程中，加热、杀菌等程序，破坏了乳铁蛋白。目前商业化的乳铁蛋白来源主要有两种：1)从牛奶中直接提取，用作保健品、饮料、婴儿食品、口腔护理以及化妆品等。2)基因工程表达的重组人乳铁蛋白。表达系统有用曲霉菌表达和转基因牛，表达后经提纯为蛋白质纯品，用作临床药物的开发。

目前临床实验表明，大剂量的乳铁蛋白才有较好的预防和治疗效果，由于以上两种方法产量低，生产成本高，不能满足人们对乳铁蛋白的需求。因而，需要发展一种更有效和更经济的方法生产乳铁蛋白。我们发明的用表达乳铁蛋白多肽的基因工程重组益生菌菌株在体内传递乳铁蛋白的方法，具有生产工艺简单、成本低、疗效好的巨大优势，将取代其它几种方法。

本发明提供了获得表达乳铁蛋白多肽的重组益生菌的方法，并提供了生产这种重组益生菌菌株的方法和其在动物和人体内的应用。本发明也提供了新的益生菌表达载体的构建，特别是乳酸菌中乳球菌和乳杆菌质粒的构建，它使乳铁蛋白多肽能够表达，并具有一定的生物学活性。

本发明方法包括以下步骤：

1.本发明构建了带有乳铁蛋白基因的各种不同的益生菌表达载体。

益生菌主要包括原核革兰氏阳性细菌和真核酵母菌，而原核革兰氏阳性细菌主要是指一些有利于人和畜牧身体健康的乳酸菌，如双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌和链球菌。基因工程乳酸菌的研究起步较晚，由于乳酸菌自身遗传特性比较复杂性，其技术难点主要集中在质粒的构建和蛋白的表达。真核蛋白表达的难度大，与大肠杆菌相比，表达量极低。不同质粒、不同启动子及不同信号肽都对外源蛋白的表达影响很大。

本发明采用几种乳酸菌能识别的强启动子及信号肽等元件，构建了多种诱导和非诱导型胞内和胞外表达的乳酸菌表达质粒，这些质粒可游离地存在于乳酸菌中。

另外，将这些质粒中包括乳铁蛋白基因在内的表达元件部分通过酶切、连接等方法克隆到乳酸菌整合质粒，如pG+host、pJIM2481或Tn916、Tn917、Tn919等转座子上，从而整合到乳酸菌染色体中，构建了可持续、稳定表达乳铁蛋白基因的重组乳酸菌菌株。

酵母表达体系最大的优点在于它属于真核生物表达系统，能够进行蛋白质修饰作用，而且酵母为单细胞生物，生长速度快，便于进行分子生物学操作。

在酵母中表达外源基因和分泌外源蛋白必须具备下列条件：酵母识别的强启动子，信号肽序列，转录终止信号，翻译终止密码子，合适的表达框架等。本发明采用带有酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因启动子和转录终止信号的表达载体，在启动子后插入酵母天然信号肽——MFα1信号肽编码序列和乳铁蛋白基因序列，从而构建了可在酵母菌中分泌表达重组乳铁蛋白或多肽片段的表达质粒。

2.本发明构建了能稳定表达具有生物学活性的乳铁蛋白多肽的益生菌菌株。

上述含有乳铁蛋白基因或基因片段的相应表达载体，通过电转化的方法，分别转入酵母菌、双歧杆菌、乳杆菌、乳球菌、链球菌、肠球菌、明串珠菌、利斯特氏菌、和芽胞杆菌中，游离存在或整合到染色体上，得到能稳定表达具有生物学活性的乳铁蛋白多肽的重组益生菌菌株。

重组菌株经发酵诱导后，提纯所表达的乳铁蛋白，用标准品作对照，用已建立好的乳铁蛋白生物活性的检测方法证明重组益生菌分泌出的乳铁蛋白本身具有生物活性。

3.提供了利用上述重组益生菌在动物或人体内生产和传递乳铁蛋白多肽的方法及应用。

重组菌株分别用适宜培养基培养，得到的发酵液可制备成各种剂型，如口服液喷雾剂、胶囊、或片剂，施用于消化道、阴道或其它粘膜处，用于治疗或预防病毒或细菌引起的传染病，抑制肿瘤细胞生长、缓解肿瘤病人经放化疗后引起的消化道功能紊乱、促进患者胃肠道内益菌群如双歧杆菌的生长和提高机体免疫能力。

本发明具有以下优点：

1.采用益生菌自身表达载体，可以稳定高效表达外源基因。

2.所用的益生菌本身对人和畜牧是安全的，不产生内外毒素，同时对人和畜牧的身体健康还有促进作用，如某些益生菌能够维持人体肠道内固有菌群的平衡，对肠道致病菌有拮抗和抑制作用，对调整肠道菌群失调和治疗急慢性腹泻有良好的效果，同时能降低血内毒素水平，提高人体免疫力。

3.直接使用能够表达人乳铁蛋白基因的重组益生菌，不需经过蛋白纯化，此产品生产工艺简单，成本低。

4.重组益生菌可以在人和动物体内不断繁殖，在一定时期内持续表达并提供给机体乳铁蛋白，具有很好的特异性和有效性。

以下通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明。这些实施例和附图说明本发明优选的实施方案，因此不被认为限制其范围。此发明应包括其它等效的实施方案。

图1表示乳酸菌表达载体pLA311的构建过程。其中，PnisA为启动子，SPusp为信号肽序列。

图2表示乳酸菌表达载体pLA313的构建过程。其中，PslpA为启动子，SPslpA为信号肽序列。

图3表示乳酸菌表达载体pLA315的构建过程。其中，P59为启动子，SPusp为信号肽序列。

图4表示乳酸菌表达载体pLA317的构建过程。其中，P32为启动子，SPusp为信号肽序列。

实施例1：乳酸菌表达载体pLA311和pLA319的构建

质粒pLA141来源于乳酸菌质粒pGK，有colE1和pWV01复制子，可以在大肠杆菌和乳酸菌中复制，带有乳球菌NisA启动子和乳球菌Usp45信号肽，在Nisin诱导下可启动其后外源基因的表达，表达的重组蛋白在信号肽的牵引下分泌至胞外。

根据已发表的人乳铁蛋白cDNA序列，设计合成两段引物

上游：agcgatgcatcaggccgtaggagaaggagtgtt

下游：agcgactagtttacttcctgaggaattcacaggcttc

在两段引物中分别引入NsiI位点和SpeI位点，以人乳铁蛋白cDNA为模板，PCR扩增人乳铁蛋白基因。

反应条件为94℃变性5分钟，以下循环94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共30个循环。

将PCR产物用限制性内切酶NsiI和SpeI消化，将得到的人乳铁蛋白基因连接到pLA141质粒的NsiI-SpeI位点，电转化乳酸乳球菌NZ9000，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明人乳铁蛋白基因已插入pLA141，序列正确，重组质粒命名为pLA311。

具体过程见图1

将重组质粒pLA311用限制性内切酶BamHI和NsiI消化，切除质粒上的usp45信号肽序列，再加入klenow片段补平酶切后的粘性末端，质粒白连后转化乳酸乳球菌NZ9000，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明序列正确，得到的重组质粒命名为pLA319

实施例2：乳酸菌表达载体pLA313和pLA321的构建

质粒pLA178来源于乳酸菌质粒pGK，有colE1和pWV01复制子，可以在大肠杆菌和乳酸菌中复制，带有乳球菌slpA启动子和slpA信号肽，可高效启动外源基因的表达。将PCR得到的人乳铁蛋白基因用限制性内切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段连接到pLA178质粒启动子和信号肽后的的NsiI-SpeI位点，构建出可在乳酸菌中持续高效表达乳铁蛋白基因的重组表达载体，电转化乳酸乳球菌MG1363，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明人乳铁蛋白基因已插入pLA178，序列正确，重组质粒命名为pLA313。pLA313在乳酸菌中表达的乳铁蛋白可分泌至胞外。

具体过程见图2

将重组质粒pLA313用限制性内切酶BamHI和NsiI消化，切除质粒上的slpA信号肽序列，再加入klenow片段补平酶切后的粘性末端，质粒自连后转化乳酸乳球菌MG1363，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明序列正确，得到的重组质粒命名为pLA321

实施例3：乳酸菌表达载体pLA315和pLA323的构建

质粒pLA136来源于乳酸菌质粒pIL252，有colE1和p AMβ1复制子，在大肠杆菌和乳酸菌中都能复制，带有乳球菌P59启动子和乳球菌Usp45信号肽，将PCR得到的人乳铁蛋白基因用限制性内切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段接入启动子和信号肽后的NsiI-SpeI位点，构建带有乳铁蛋白基因的重组表达载体，电转化乳酸乳球菌MG1363，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明人乳铁蛋白基因已插入pLA136，序列正确，重组质粒命名为pLA315。。该载体在乳酸菌中可持续表达乳铁蛋白，生成的乳铁蛋白能够分泌到胞外。

具体过程见图3

将重组质粒用限制性内切酶BamHI和NsiI消化，切除质粒上的Usp45信号肽序列，再加入klenow片段补平酶切后的粘性末端，质粒自连后转化乳酸乳球菌MG1363，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明序列正确，得到的重组质粒命名为pLA323

实施例4：乳酸菌表达载体pLA317和pLA325的构建

质粒pLA176来源于乳酸菌质粒pGK，有colE1和pWV01复制子，可以在大肠杆菌和乳酸菌中复制，带有乳球菌P32启动子和乳球菌Usp45信号肽，可启动外源基因的表达。将PCR得到的人乳铁蛋白基因用限制性内切酶NsiI和SpeI消化，得到的片段接入该质粒启动子和信号肽后的NsiI-SpeI位点，构建带有乳铁蛋白基因的重组表达载体，电转化乳酸乳球菌MG1363，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明人乳铁蛋白基因已插入pLA176，序列正确，重组质粒命名为pLA317。该载体在乳酸菌中可持续表达乳铁蛋白基因，生成的乳铁蛋白能够分泌到胞外。

具体过程见图4

将重组质粒用限制性内切酶BamHI和NsiI消化，切除质粒上的Usp45信号肽序列，再加入klenow片段补平酶切后的粘性末端，质粒自连后转化乳酸乳球菌MG1363，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明序列正确，得到的重组质粒命名为pLA325

实施例5：重组表达载体pLA312和pLA320的构建

根据已发表的人乳铁蛋白cDNA序列，设计合成两段引物

上游：agcgatgcatcaggccgtaggagaaggagtgtt

下游：agcgaggttcttagatacactggatgggggagtctct

在两段引物中分别引入NsiI位点和EcoRI位点，以人乳铁蛋白cDNA为模板，PCR扩增人乳铁蛋白基因编码前47个氨基酸的基因片段。

反应条件为94℃变性5分钟，以下循环94℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环。

将PCR产物用限制性内切酶NsiI和EcoRI消化，将得到的基因片段连接到pLA141质粒的NsiI-EcoRI位点，电转化乳酸乳球菌NZ9000，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明人乳铁蛋白基因片段已插入pLA141，序列正确，重组质粒命名为pLA312。

将重组质粒用限制性内切酶BamHI和NsiI消化，切除质粒上的信号肽序列，再加入klenow片段补平酶切后的粘性末端，质粒自连后转化乳酸乳球菌NZ9000，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明序列正确，得到的重组质粒命名为pLA320。

实施例6：重组表达载体pLA314和pLA322的构建

将PCR得到的人乳铁蛋白前47个氨基酸的基因片段用限制性内切酶NsiI和EcoRI消化，得到的片段连接到pLA178质粒的NsiI-EcoRI位点，电转化乳酸乳球菌MG1363，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明基因片段已插入pLA178，序列正确，重组质粒命名为pLA314。

将重组质粒用限制性内切酶BamHI和NsiI消化，切除质粒上的信号肽序列，再加入klenow片段补平酶切后的粘性末端，质粒自连后转化乳酸乳球菌MG1363，筛选氯霉素抗性的转化子，提取质粒，经酶切鉴定，PCR扩增及测序，证明序列正确，得到的重组质粒命名为pLA322。

实施例7：采用电转化法，将上述几种重组质粒分别转入乳球菌中。

将重组表达载体pLA313、pLA314、pLA315、pLA317、pLA321、pLA322、pLA323、pLA325分别与乳酸乳球菌MG1363感受态细胞在电转杯中混匀，电击，涂到含氯霉素的培养基上，筛选转入重组质粒的菌株。

乳酸乳球菌NZ9000是将Nisin抗性基因转入MG1363染色体中得到的工程菌，可在Nisin存在的条件下正常生长，将带有PnisA启动子的重组质粒转入NZ9000中，可加入Nisin诱导质粒表达外源基因。将重组表达载体pLA311、pLA312、pLA319、pLA320与乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞在电转杯中混匀，电击，涂到含氯霉素的培养基上，筛选转入重组质粒的菌株。

实施例8：采用电转化法，将上述几种重组质粒分别转入乳杆菌中。

将重组表达载体pLA313、pLA314、pLA315、pLA317、pLA321、pLA322、pLA323、pLA325分别与干酪乳杆菌感受态细胞在电转杯中混匀，电击，涂到含氯霉素的MRS培养基上，在厌氧箱中培养，筛选转入重组质粒的菌株。

干酪乳杆菌NY1000是将Nisin抗性基因转入干酪乳杆菌染色体中得到的工程菌，可在Nisin存在的条件下正常生长，将带有PnisA启动子的重组质粒转入NY1000中，可加入Nisin诱导质粒表达外源基因。将重组表达载体pLA311、pLA312、pLA319、pLA320与干酪乳杆菌NY1000感受态细胞在电转杯中混匀，电击，涂到含氯霉素的培养基上，在厌氧箱中培养，筛选转入重组质粒的菌株。

实施例9：重组菌株表达乳铁蛋白

将得到的重组乳球菌、乳杆菌分别在含有对应抗生素的GM17和MRS培养基中静置培养过夜，对带有NisA启动子的重组菌株，待其达到生长对数期O.D.值为0.5左右时，加入诱导剂Nisin，诱导2-3个小时，收获菌体。对非诱导的重组菌株，待其生长到达平台期时收获。收获的菌株经常规处理后，进行Western杂交验证蛋白表达：首先进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜，与兔抗人乳铁蛋白抗体杂交。

结果证明，在转入分泌型重组质粒pLA311、pLA313、pLA315、pLA317、pLA312、pLA314的菌株培养液上清中有重组乳铁蛋白，蛋白大小与从Sigma购买的人乳铁蛋白标准品大小相同。在转入非分泌型重组质粒pLA319、pLA321、pLA323、pLA325、pLA320、pLA322的菌株细胞内有重组乳铁蛋白，蛋白大小与从Sigma购买的人乳铁蛋白标准品大小相同。

实施例10：重组益生菌菌株表达的乳铁蛋白多肽的生物活性测定

采用从Sigma购买的人乳铁蛋白作为标准品，通过体外分析测定标准品及重组乳铁蛋白对大肠杆菌及弗氏志贺菌的抗微生物作用。

将大肠杆菌和弗氏志贺菌在适宜培养基上培养至对数生长期，分别加入不同浓度的标准品及重组乳铁蛋白，37℃震荡培养，在各个时间段等份取出，连续稀释并铺板培养过夜用于计数。结果发现重组乳铁蛋白和标准品的抗微生物作用基本相同。

实施例11：重组菌株的应用。

重组乳球菌、乳杆菌分别用GM17和MRS培养基静置培养，口服液、或将菌体冻干制成胶囊和片剂。得到的发酵液可直接制备成口服液、喷雾剂、或加入保护剂制成冻干粉，然后制成胶囊或片剂，施用于消化道、阴道或其它粘膜处，用于治疗或预防病毒或细菌引起的传染病，抑制肿瘤细胞生长、缓解肿瘤病人经放化疗后引起的消化道功能紊乱、促进患者胃肠道内益菌群如双歧杆菌的生长和提高机体免疫能力。

Claims

1.一种新的表达乳铁蛋白多肽的基因工程重组益生菌菌株，其特征为带有乳铁蛋白基因的表达元件整合到其染色体上或存在于游离质粒中。

2.权利要求1中所述的乳铁蛋白来自人、牛或猪的乳铁蛋白，包括天然的全长的乳铁蛋白、乳铁蛋白多肽片段。

3.权利要求1中所述的益生菌为原核革兰氏阳性细菌和真核酵母菌。

4.权利要求3中所述的原核革兰氏阳性细菌为乳酸菌，包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、利斯特氏菌属(Listeria)、或芽胞杆菌属(Bacillus)。

5.权利要求4中所述的双歧杆菌为青春双歧杆菌(B.adolescentis)或长双歧杆菌(B.longum)。

6.权利要求4中所述的乳杆菌为干酪乳杆菌(L.casei)或米酒乳杆菌(L.sake)或植物乳杆菌(L.plantarum)。

7.权利要求4中所述的乳球菌为乳酸乳球菌(L.lactis)。

8.权利要求4中所述的链球菌为格氏链球菌(S.gordoni)。

9.权利要求4中所述的肠球菌为粪肠球菌(E.faecalis)。

10.权利要求4中所述的利斯特氏菌为无害利斯特氏菌(L.innocua)。

11.权利要求4中所述的芽胞杆菌为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或蜡样芽孢杆菌(B.cereus)。

12.权利要求4中所述的真核酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)。

13.一种用于转化益生菌的质粒，其特征在于含有下列从5’到3’连接的调控因子：启动子、编码乳铁蛋白基因序列、转录终止子。

14.权利要求13中所述启动子，是适用于相应重组益生菌菌株的启动子，包括选自乳球菌NisA基因、短乳杆菌SlpA基因、乳球菌P59、乳球菌P32启动子、乳球菌P23启动子或酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因启动子。

15.权利要求13中所述转录终止子，是适用于相应重组益生菌菌株的转录终止子，包括选自人乳头瘤病毒E7基因、乳球菌Usp45基因、短乳杆菌SlpA基因或酵母磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate Kinase，PGK)基因转录终止信号。

16.权利要求13中所述的质粒，可进一步包含分泌信号肽。

17.权利要求16中所述分泌信号肽，是适用于相应重组益生菌菌株的分泌信号肽，包括选自短乳杆菌SlpA基因、乳球菌Usp45基因或酵母MFα1信号肽编码序列。

18.权利要求13中所述的质粒，可进一步包含适用于相应重组益生菌菌株的复制起始子，包括选自乳酸菌pWV01、pAMβ1复制子或大肠杆菌colE1复制子。

19.含有权利要求13所述的重组质粒的益生菌菌株，包括：重组乳酸乳球菌CGMCC-0622、CGMCC-0623。

20.一种新的传递乳铁蛋白多肽的方法，其特征是利用可接受药用载体在消化道、女性生殖道、或其它粘膜处及体表施用权利要求1或权利要求19所述的表达乳铁蛋白多肽的重组益生菌菌株。

21.权利要求1中所述重组益生菌菌株经发酵后，一种或多种菌株混合制成口服液、喷雾剂、胶囊、或片剂，用于治疗或预防病毒或细菌引起的传染病，抑制肿瘤细胞生长、缓解肿瘤病人经放化疗后引起的消化道功能紊乱、促进患者胃肠道内益生菌群的生长和提高机体免疫能力；并可用于食品、保健品。