TWI568368B - Lactobacillus paracasei K71 - Google Patents

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Description

Lactobacillus paracasei K71之菌體之用途
本發明關於一腸道免疫調整劑，更詳細地關於一含有特定乳酸菌之菌體或該菌體成分作為有效成分之腸道免疫調整劑。
分泌型免疫球蛋白A(SIg A)存在於口腔、鼻孔、呼吸器官、消化道等黏膜，是黏膜免疫中相當重要的免疫物質。黏膜經常與暴露在空氣與食物中的病原菌與過敏物質接觸，SIg A擔負著黏膜保護之重要責任。亦即，SIg A藉由與細菌或病毒連結並聚集，將毒素或來自細菌的酵素等結合後將其無毒化，進而保護黏膜。SIg A的分泌量係受到腦、內分泌系統或自律神經之控制，年幼或年長者的含量相較於成年人低。
另一方面，自然殺手(NK)細胞(Natural killer cell)為淋巴球的一種，會認識癌細胞或病毒感染細胞等非我細胞並將其消滅。NK細胞的數量同樣在年幼或年長者的含量較低，這也是為什麼兒童與高齡者容易發生感染症的原因之一。
近年來，提高SIg A分泌量或N K細胞活性的食品或食品成分相繼被開發，機能強於乳酸菌或比菲德氏菌之特定菌株之相關報告可參照專利文獻1~8。
【專利文獻】
【專利文獻1】特開2005-194259號公報
【專利文獻2】特開2007-308419號公報
【專利文獻3】特開2008-179630號公報
【專利文獻4】特開2008-201708號公報
【專利文獻5】特開2010-057395號公報
【專利文獻6】特開2010-130954號公報
【專利文獻7】特開2010-150206號公報
【專利文獻8】WO2006-087913號公報
然而，以往開發的僅止於提升SIg A分泌或NK細胞活性之其中一項，無法同時提升兩者。因此無法充分保護黏膜，或是黏膜如遭輕微感染時無法完全抑制其症狀加重等問題。
要達到上述作用，持續每日服用含有該機能之食品或食品成分是非常重要的。然而，膠囊或錠劑型態的機能性食品，若非養成習慣，常有忘記服用等問題。另外，一般食品型態的優格或乳酸菌飲料，雖然可使用上述乳酸菌或比菲德氏菌製造，但可能因個人喜好產生不能接受或容易吃膩等情形，對於每天必須攝取的養分來說並不是理想的食品型態。
相對於此，米為多數人的主食，若能以米作為原料，利用發酵過程使米或速食飯中富含前述乳酸菌，便有能夠每日攝取的優點。
有鑑於上述情形，本發明之目的係在於提供一較佳之腸道免疫調整劑，具體而言，其同時具有促進分泌型免疫蛋白球A生成之作用以及NK細胞活性化作用，並且可以利用米加工品形式提供的一種腸道免疫調整劑。
本發明者群製作出一種具有抗過敏作用的乳酸菌Lactobacillus paracasei K71菌株(FERM BP-11098)，其可在浸水的米的表面旺盛生長，且生長出來的乳酸菌可緊密結合於米的表面。將發酵所產生會影響風味的乳酸等成分洗淨除去後，該乳酸菌仍舊附著在米的表面，將附著有乳酸菌的洗淨米炊飯後，仍含有多量的該乳酸菌，且與一般米飯在味覺上並無差異。前述發明係記載於PCT/JP2009/059141號國際專利申請，其詳細內容公開在WO2009/131208號公報。本發明者群發現一令人驚訝的現象，係該Lactobacillus paracasei K71乳酸菌同時具有促進分泌型免疫蛋白球A生成之作用以及NK細胞活性化作用，本發明因而完成。本發明具體提供以下內容。
(1)　一腸道免疫調整劑，包含國際寄存編號FERM BP-110985、台灣寄存編號BCRC 910529之Lactobacillus paracasei K71之菌體或該菌體成分為有效成分。
(2)　前述(1)所記載之腸道免疫調整劑，該菌體為死菌體。
(3)　前述(1)或(2)所記載之腸道免疫調整劑，可用於促進分泌型免疫球蛋白A。
(4)　前述(1)至(3)之任一項所記載之腸道免疫調整劑，可用於促進NK細胞之活性化。
(5)　前述(1)至(4)之任一項所記載之腸道免疫調整劑，可以經口投予。
(6)　前述(1)至(5)之任一項所記載之腸道免疫調整劑，包含使用前述K71菌株之菌體進行發酵的米、或該米之粉碎物、或前述米或米之粉碎物經炊飯處理後所得到的米飯。
(7)　一用於預防感染症之醫藥品，其含有前述(1)至(6)之任一項所記載之腸道免疫調整劑。
藉由本發明，可促進氣管或消化道黏膜中SIg A的產生，與從體外入侵的病原體做結合，阻止病原體感染黏膜上皮細胞，或者即便黏膜上皮細胞被病毒所感染，活化的NK細胞可以進行攻擊以阻止周圍的細胞遭感染，達到充分預防感染症之功效。
以下利用本發明之實施態樣進行說明，但該實施態樣不宜用於限定本發明。
本發明之腸道免疫調整劑，包含國際寄存編號FERM BP-110985、台灣寄存編號BCRC 910529之Lactobacillus paracasei K71之菌體或該菌體成分作為有效成分。前述菌體或菌體成分兼具可促進分泌型免疫球蛋白A的產生，以及促進NK細胞之活性化雙重作用，因而可充分預防感染症。
本發明中所謂「作為有效成分」係指對於腸道免疫調整能力的負面影響在不具統計意義之範圍內，亦可包含其他成分。
K71菌株係於2009年2月20日進行國際寄存於獨立行政法人產業技術總合研究所特許生物寄託中心(日本國茨城縣筑波東1丁目1番地1中央第6)，取得寄存編號FERM BP-110985，以及於2011年11月8日進行寄存於台灣財團法人食品工業發展研究所，取得寄存編號BCRC 910529。其培養可以一般培養液(例如MRS培養液或蔬果汁)，依一般培養條件進行。酸鹼值在pH4.0~7.0之間，較佳於pH6.0~6.5之培養液中開始培養，溫度為35℃~42℃，較佳為37℃~40℃。靜置培養即可充分生長，然而為使培養液成分與菌體均勻分散，較佳為緩慢攪拌培養。隨著乳酸菌的生長，乳酸將在培養液中累積，使pH值降低。雖然不需要調節培養液之pH值即可回收特定程度之乳酸菌，較佳係在培養液中添加碳酸鈣，或藉由自動調節方式控制培養液之pH值。培養中的培養液之pH值控制在pH4.0~7.0之間，較佳在pH6.0~6.5之間，可以得到高密度的乳酸菌。關於K71菌株的其他生理、生化學特性等，可以參照WO2009/131208號公報之記載，詳細說明恕在此省略。
藉由液體培養生成之K71菌株，可以直接使用或將其乾燥後作為腸道免疫調整劑，亦可作為精白米發酵時的起始劑(starter)。亦即，本發明之腸道免疫調整劑可以使用K71菌株進行發酵製造。另外，K71菌株可用泡水的白米當作單一培養基，於其中旺盛生長，且具有附著於該精白米表面之特性，因此藉由K71菌株做成之米發酵品中，將發酵生成的乳酸等不需要的成分以水洗去除後，可利用炊飯或其他加熱、加壓方式進行製造。
菌體可為生菌體及/或死菌體，如欲確實達到上述作用，較佳為死菌體。然而若欲增進乳酸菌繁殖或代謝，或站在減低腸道免疫調整劑的製造成本觀點來看，較佳為生菌體。再者，生菌體係指活菌體，死菌體係指經過加熱、加壓或藥物處理等經過殺菌處理後的菌體。另，菌體成分係指經過酵素處理、均質化、超音波處理等破壞細胞之後的破碎物、或經過去細胞壁處理後之成分。
本發明之腸道免疫調整劑不限於特定用途，可用於包含預防感染症或增進健康等調整腸道免疫之廣泛用途。本發明之腸道免疫調整劑，其優越之特點在於具有促進分泌型免疫蛋白球A生成(例如，黏膜上皮細胞的病原體感染預防)及/或自然殺手(NK)細胞活性化作用(例如，可抑制黏膜上皮細胞的病毒感染進一步擴大到周圍細胞)，因此很適合用於上述用途。
本發明之腸道免疫調整劑利用可食用的乳酸菌作為有效成分，因此最適合經口投予，亦可藉由各種劑型(溶液、錠劑、顆粒等)投予。另外也不排除腸內注射等直接導入方式投予。
本發明之腸道免疫調整劑同時兼具優越的腸道免疫調整能力及安全性，亦可作為醫藥品成分。因此本發明也包括一用於預防感染症(例如感冒)之醫藥品，其包含前述本發明之腸道免疫調整劑。本發明之醫藥品兼具促進分泌型免疫蛋白球A生成，以及NK細胞活性化作用，因此具有優越的感染症預防效果。此外，本發明之腸道免疫調整劑，亦可加入調味料、著色劑、保存劑或其他食品中可容許添加的成分。
【實施例】 <實施例1>
將Lactobacillus paracasei K71接種至MRS培養基，於37℃培養20小時。離心回收乳酸菌體，以蒸餾水清洗兩次後，加入與乾燥菌重量等量之糊精於80℃中加熱殺菌30分鐘。將其冷凍乾燥後即可得到K71菌株的死菌體粉末(以下略稱為「K71粉末」)。
將BALB/c雌小鼠(5週大，購自查爾斯理弗(Charles River)公司)於22℃標準飼養環境下進行馴化飼育一星期後分成兩組，每組各5隻。將K71粉末20毫克(mg)加入1毫升(ml)的滅菌水形成懸浮液，將此懸浮液讓其中一組小鼠每天一次經口投予，每次50微升(μL)(K71投予組)。另外一組每日一次經口投予滅菌水50微升(μL)(對照組)。飼養五週後(第34天夜晚~第35天早上)回收其糞便，以PBS緩衝液適當溶解後，利用ELISA法測量其上清液所含的IgA量(SIg A)，其結果如第一圖所示。
如第一圖所示，相較於對照組，K71投予組糞便中SIgA的增加量具有統計上意義(P＜0.05)。
＜實施例2＞
同於實施例1，將K71粉末反覆經口投予BALB/c雌小鼠(一組6隻)，投予量為1毫克/隻/日。每週測量一次糞便中的SIg A含量。其結果如第二圖所示，實驗期間K71投予組之SIg A含量相對於對照組來的高，其差異在第2、4以及6週具有統計上之意義(P＜0.05)。
＜實施例3＞
同於實施例1，將BALB/c雌小鼠(每組6隻)每日經口投予K71粉末或滅菌水。經過五週飼養後採取脾細胞。將脾細胞(1.25×106細胞/毫升)與YAC-1細胞(1×105細胞/毫升)以12.5:1(脾細胞：YAC-1細胞)之比例混合，加入含有1%胎牛血清之RPMI-1640培養液(96孔培養皿)，於37℃、5%CO2環境下培養四小時。破壞YAC-1並測量其釋放出的乳酸脫氫酵素(LDH)之活性，以求得脾細胞之細胞傷害活性。具體而言，係將脾細胞與YAC-1細胞之共同培養上清液50微升(μL)移到新的96孔培養皿，使用羅氏公司販售的細胞毒性檢測套組(Cytotoxicity Dectection Kit，LDH)測量LDH酵素活性。
其結果如第三圖所示，相較於對照組，K71投予組的脾細胞中的細胞傷害活性之提高具有統計意義(P＜0.01)。顯示藉由攝取K71菌株之菌體或菌體成分可以促進自然殺手細胞的活性化。
＜實施例4＞
自日本SRL公司購入6週大的雄性SD大鼠，於SPF環境下使其自由攝取固體飼料(船橋農場股份有限公司(Funabashi Farm)FR-2)以及自來水。進行預備飼養一週後，將其分為兩組，每組各三隻，對照組提供FR-2飼料，K71投予組在FR-2飼料中混入5%K71粉末，使其自由攝取。於22℃、SPF環境下飼養8天。於飼養前後測量其體重，並在飼養開始前(預備飼養結束前天晚上~結束當天早上之間)，以及飼養結束後(飼養第7天晚上~第8天早上)回收其糞便。
將回收的糞便以適當生理食鹽水懸浮之後進行均質(stomachere)處理，測量上清液的生菌數(CFDA螢光染色法)、大腸菌數目(使用日水製藥XM-G寒天培養基之菌落計數法)、以及SIg A濃度(ELISA法)。其結果如表1及第四圖所示。
如表1所示，對照組與K71投予組之間的體重與體重增加量並無差異。K71投予組的回收糞便重量雖然稍重，但飼養前後並無太大變化。兩組的糞便生菌數於飼養前後亦無太大變動。
另一方面，比較飼養前後糞便中的大腸菌之結果，K71投予組的全部個體之大腸菌數均有減少。另外，如第四圖所示，K71投予組的SIg A量均較對照組來的高，與實施例1與2的結果相同。由此可見，K71菌體或菌體成分之攝取可以促進消化道黏膜的Ig A分泌，其結果亦可能使糞便中的大腸菌數目減少。
＜實施例5＞
依據赫爾辛基宣言以及免疫學研究相關之倫理規範實施人體實驗。實驗對象為30歲~57歲之健康成人男女24位，攝取前依照標準方式測定其唾液SIgA分泌速度為47.87±20.07微克/分(μg/min)。在24位當中選擇SIg A分泌速度較低的11位(男性5位、女性6位)當作實驗者。提供其實驗食品(1包內含200毫克(mg)K71粉末之粉末食品)，使其混合冷水或溫水服用，一天一包。每隔四星期進行問診以及測量唾液中的SIg A分泌速度。試驗中因為有兩位中途退出(男女各一位)，因此只對九位實驗者進行結果分析。結果如第五圖所示，服用開始後第4週、第8週、第12週的SIgA分泌速度較服用前增加，且該增加值具有統計意義。實驗期間並未發現因服用本發明實驗食品而造成之有害現象。
第一圖顯示本發明實施例之方法製得的組合物經口投予BALB/c雌小鼠5週，比較其糞便中的SIg A含量。Error bar代表標準偏差，記號＊代表群組間的差異具有統計意義(P＜0.05)。
第二圖顯示本發明之組合物投予BALB/c雌小鼠6週，比較各週糞便中SIg A含量變化。Error bar代表標準偏差，記號＊代表群組間的差異具有統計意義(P＜0.05)。
第三圖顯示本發明之組合物投予BALB/c雌小鼠5週，比較脾細胞中的NK細胞的細胞傷害活性。橫線代表平均值，記號◇代表各測定點，記號＊代表群組間的差異具有統計意義(P＜0.01)。
第四圖顯示本發明實施例之方法製得的組合物，藉由混餌方式投予SD雄大鼠7日，其糞便中的SIg A含量增加。Error bar代表標準偏差。
第五圖顯示讓SIg A分泌量相對較低的健康成人男女攝取本發明之組合物12週，其唾液中的SIg A分泌速度增加。Error bar代表標準偏差，記號＊代表與試驗開始前的值的差異具有統計意義(P＜0.05)。

Claims (7)

  1. 一種台灣寄存編號BCRC 910529之Lactobacillus paracasei K71之菌體之用途，其係用於製備腸道免疫調整劑。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該菌體為死菌體。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該腸道免疫調整劑可用於促進分泌型免疫球蛋白A。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該腸道免疫調整劑可用於促進NK細胞之活性化。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該腸道免疫調整劑為經口投予。
  6. 如申請專利範圍第1項之用途，包含使用前述K71菌株之菌體進行發酵的米、該米之粉碎物、或前述米或米之粉碎物經炊飯處理後所得到的米飯。
  7. 一種如申請專利範圍第1至6項之任一項之用途，其係將該腸道免疫調整劑用於製備用於預防感染症之醫藥品。
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