CN103179975B - 肠道免疫调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种更优异的肠道免疫调节剂。本发明所涉及的肠道免疫调节剂含有国际保藏编号为FERM BP-11098的副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）K71株的菌体或者菌体成分作为有效成分，用于促进分泌型免疫球蛋白A生成或者用于NK细胞活化。

Description

肠道免疫调节剂
技术领域
本发明涉及肠道免疫调节剂，更具体而言涉及含有特定乳酸菌的菌体或者菌体成分作为有效成分的肠道免疫调节剂。
背景技术
分泌型免疫球蛋白A（SIgA）存在于口腔、鼻孔、呼吸器官、消化道等的粘膜上，是构成粘膜免疫的核心的免疫物质。粘膜通常通过外界空气和食物而暴露在病原体和过敏原之中，而SIgA担负着保护这些粘膜不受其伤害的重要职责。即，SIgA通过与细菌和病毒结合而将其凝集，同时与来自毒素和细菌的酶等结合而使其无毒化，从而保护粘膜。SIgA的分泌量受到脑、内分泌系统和自律神经系统的控制，年幼者和高龄者的分泌量比成人低。
另一方面，自然杀伤（NK）细胞是淋巴细胞的一种，能够发现癌细胞和病毒感染细胞等被识别为非己原有的细胞并将其消灭。NK细胞的数量也是在年幼时和高龄者体内较低，可以认为这是幼儿和高龄者容易发生感染的原因之一。
近年，提高SIgA分泌量或NK细胞活性的食品和食品成分相继被开发，并已有文献报道乳酸菌和双歧杆菌这类特定的菌株具有如此功能（参照专利文献1～8）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开2005-194259号公报
专利文献2：特开2007-308419号公报
专利文献3：特开2008-179630号公报
专利文献4：特开2008-201708号公报
专利文献5：特开2010-057395号公报
专利文献6：特开2010-130954号公报
专利文献7：特开2010-150206号公报
专利文献8：WO2006-087913号小册子
发明内容
发明要解决的技术问题
但是，现有开发的技术停留在仅仅提高SIgA分泌或者NK细胞活性的其中之一，而非提高两者。为此，存在粘膜保护不充分、或者被保护的粘膜轻微感染时无法充分抑制症状加重等问题。
为了达到这种作用，不间断地每日连续摄取具有这种功能的食品或者食品成分非常重要。但是，胶囊或片剂形态的保健品只要未养成习惯，就存在忘记服用的问题。另外，一般食品形态的酸奶和乳酸菌饮料，虽然能够利用上述乳酸菌和双歧杆菌而制造，但是存在由于个人喜好而无法接受的情况，且容易吃腻，因此对于必须每日坚持摄取而言并不是理想的食品形态。
相对于此，由于米是大多数人的主食，因此如果能够提供一种以米为原料、利用发酵等过程而使其富含具有上述作用的乳酸菌的米和速食米饭，则具有能够每日坚持摄取的优点。
鉴于以上实情，本发明的目的在于提供一种更优异的肠道免疫调节剂，具体而言，目的在于提供一种肠道免疫调节剂，兼具促进分泌型免疫球蛋白A生成的作用和NK细胞活化作用，并且还能够以作为主食的米的加工品的形态而提供。
解决技术问题的技术方案
本发明者发现，具有抗过敏作用的乳酸菌副干酪乳杆菌（lactobacillusparacasei）K71株（FERM BP-11098）在浸渍于水中的米的表面旺盛生长，由于生长出的乳酸菌紧密地结合而存在于米的表面，因此即使将发酵产生的乳酸等影响味觉的成分洗净除去后该乳酸菌仍然附着在米上而存在，通过烹饪附着有乳酸菌的洗净米能够制造出一种速食米饭，含有大量该乳酸菌并且与通常的米饭在感官上并无差异且味道良好，该发明已记载在编号为PCT/JP2009/059141的国际专利申请中，其详细内容在WO2009/131208号小册子中已经被国际公开。本发明者发现该乳酸菌副干酪乳杆菌K71具有一种令人惊讶的现象，即兼具促进分泌型免疫球蛋白A生成的作用和NK细胞活化作用，从而完成本发明。具体而言，本发明包括以下内容。
（1）一种肠道免疫调节剂，含有国际保藏编号为FERM BP-11098的副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）K71株的菌体或者菌体成分作为有效成分。
（2）上述（1）记载的肠道免疫调节剂，上述菌体是死菌体。
（3）上述（1）或（2）记载的肠道免疫调节剂，其用于促进分泌型免疫球蛋白A的生成。
（4）上述（1）至（3）中任一项记载的肠道免疫调节剂，其用于自然杀伤细胞的活化。
（5）上述（1）至（4）中任一项记载的肠道免疫调节剂，其为口服的肠道免疫调节剂。
（6）上述（1）至（5）中任一项记载的肠道免疫调节剂，包括利用上述K71株的菌体进行发酵的米、该米的粉碎物、或者将上述米或米的粉碎物进行烹饪处理而得到的米饭。
（7）一种医药品，含有上述（1）至（6）中任一项记载的肠道免疫调节剂，用于预防感染。
发明效果
根据本发明，通过促进呼吸道和消化道粘膜上的SIgA产生使其与从体外入侵的病原体结合，从而阻止病原体感染粘膜上皮细胞，并且，即使粘膜上皮细胞被病毒等感染，由于活化的NK细胞进行攻击而阻止周围细胞受到感染，从而能够充分地预防感染。
附图说明
图1是BALB/c雌性小鼠经由口服给药摄取通过本发明实施例的方法制造的组合物5周后，对其粪便中SIgA含量进行比较的图。误差棒（errorbar）表示标准偏差，记号*表示组间的差异具有统计意义（P＜0.05）。
图2是BALB/c雌性小鼠摄取本发明的组合物6周后，按照每一周示出的粪便中SIgA含量变化的图。误差棒表示标准偏差，记号*表示组间的差异具有统计意义（P＜0.05）。
图3是示出BALB/c雌性小鼠摄取本发明的组合物5周后，其脾细胞中所含的NK细胞的细胞杀伤活性的图。横线表示平均值，◇表示各测量点，记号*表示组间的差异具有统计意义（P＜0.01）。
图4是示出SD雄性大鼠经由混饵方式给药摄取通过本发明实施例的方法制造的组合物7天时，其粪便中SIgA含量增加的图。误差棒表示标准偏差。
图5是示出SIgA分泌量较低的健康成年男女摄取本发明的组合物12周时，其唾液中SIgA分泌速度增加的图。误差棒表示标准偏差，记号*表示相对于试验开始前的值的差异具有统计意义（P＜0.05）。
具体实施方式
以下，对本发明实施方式进行说明，但本发明并不局限于此。
本发明所涉及的肠道免疫调节剂，含有国际保藏编号为FERMBP-11098的副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）K71株的菌体或者菌体成分作为有效成分。上述菌体以及菌体成分兼具促进分泌型免疫球蛋白A生成和NK细胞活化的双重作用，因而能够充分预防感染。
本发明中“含有作为有效成分”是指只要对肠道免疫调节能力的损害达不到具有统计意义的程度，则不排除包含其他成分。
根据上述生物保藏编号，K71株是于2009年2月20日在独立行政法人产业技术总合研究所专利生物保藏中心（日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）进行国际保藏。其培养可以在使用通常的培养基（例如MRS培养基或蔬菜果汁等）的通常的培养条件下进行。可以在pH4.0～pH7.0、优选为pH6.0～pH6.5的培养基中开始培养，在35℃～42℃、优选为37℃～40℃的温度下进行培养。静置培养即可充分生长，但为了使培养基成分与菌体均匀分布，优选进行缓慢地搅拌。随着乳酸菌的生长，乳酸在培养基中积累，使培养基的pH值逐渐降低。虽然不必调节培养中培养基的pH也可以某种程度地回收乳酸菌，但优选通过向培养基中添加碳酸钙或通过自动调节而控制培养基的pH。通过将培养中的培养基pH控制在pH4.0～pH7.0、优选为pH6.0～pH6.5，能够得到高密度的乳酸菌。有关K71株的其他生理/生化学性状等记载在WO2009/131208号小册子中，其详细说明不再赘述。
通过液体培养而生长的K71株可以直接或将其干燥后作为肠道免疫调节剂使用，也可以作为使精白米等发酵时的酵母使用。即，本发明的肠道免疫调节剂可以通过利用K71株进行发酵制造而成。另外，由于K71株可以使用浸渍在水中的精白米作为单一培养基并在其中旺盛生长，且具有附着于精白米表面的性质，因此可以从由K71株制成的米的发酵品当中，通过水洗除去经由发酵生成的乳酸等不需要的成分之后，进行烹饪或其他加热、加压等来制造肠道免疫调节剂。
菌体可以是活菌体及/或死菌体，从确实达到所需程度的上述作用的观点出发优选为死菌体。但是，从增进乳酸菌繁殖或代谢的优点以及降低肠道免疫调节剂制造成本的观点出发，优选为活菌体。此外，活菌体是指还存活着的菌体，死菌体是指经过加热、加压、药物处理等杀菌处理后的菌体。另外，菌体成分是指经过酶处理、均质化、超声波处理等破坏细胞之后的破碎物、或者经过分离细胞壁成分后的成分。
本发明的肠道免疫调节剂不限于特定用途，可以用于包含预防感染和增进健康等肠道免疫调节的广泛用途。但是，本发明的肠道免疫调节剂，考虑到其特定的优异作用，适合用于促进分泌型免疫球蛋白A生成（例如预防粘膜上皮细胞被病原体感染）及/或自然杀伤细胞活化（例如，抑制病毒感染范围从粘膜上皮细胞向周围扩大）的用途。
本发明的肠道免疫调节剂以一直以来食用的乳酸菌为有效成分，因此最适合口服给药，可以通过各种剂型（溶液、片剂、颗粒等）给药。另外也不排除肠内注射等直接导入方式。
本发明的肠道免疫调节剂兼具优异的肠道免疫调节能力以及安全性，因此作为医药品成分也有用。因而，本发明还包括一种医药品，其含有上述肠道免疫调节剂，并用于预防感染（例如所谓的感冒）。由于本发明的医药品兼具促进分泌型免疫球蛋白A生成作用和NK细胞活化作用，因此具有优异的感染预防效果。此外，本发明的肠道免疫调节剂还可以加入调料、色素、防腐剂或其他食品中允许的成分而共同制成食品。
实施例
实施例1
将副干酪乳杆菌K71接种至MRS培养基，在37℃下培养20小时。通过离心分离回收乳酸菌体，再用蒸馏水清洗两次之后，加入与干燥菌体重量相等的糊精，在80℃下加热杀菌30分钟。将其冷冻干燥后得到副干酪乳杆菌K71的死菌体粉末（以下简称为“K71粉末”）。
将BALB/c雌性小鼠（5周龄，从查尔斯河公司购入）在22℃通常环境下驯化饲养一周之后分成两组，每组各5只。将K71粉末20mg悬浊在1mL灭菌水中，将该悬浊液50μL给其中一组每日一次口服给药（1mg-K71粉末/小鼠/每日）（K71给药组）。同样给另一组每日一次服用50μL灭菌水（对照组）。在饲养的第五周（第34日夜晚～第35日早上）回收其粪便，以PBS缓冲液适当制成为悬浊液之后，利用ELISA法测量其上清液中所含的IgA量（SIgA）。其结果示于图1。
如图1所示，与对照组相比K71给药组粪便中的SIgA含量增高，具有统计意义（P＜0.05）。
实施例2
与实施例1相同，将K71粉末以1mg/小鼠/每日的方式给BALB/c雌性小鼠（每组6只）反复口服给药，并每周一次测量粪便中SIgA的含量。其结果，如图2所示在整个试验期间，与对照组相比K71给药组的SIgA含量显示较高的值，其差异在第2、第4以及第6周具有统计意义（P＜0.05）。
实施例3
与实施例1相同，每日给BALB/c雌性小鼠（每组6只）服用K71粉末或灭菌水。经过5周饲养之后采取其脾细胞。将脾细胞（1.25×106细胞/ml）和YAC-1细胞（1×105细胞/ml）以12.5:1（脾细胞:YAC-1细胞）的比率混合之后，在含有1%胎牛血清的RPMI-1640培养基（96孔培养板）中、在37℃、5%CO2条件下培养4小时。通过调查随着YAC-1细胞被破坏而放出的乳酸脱氢酶（LDH）的活性，求出采取的脾细胞具有的细胞杀伤活性。具体而言，将脾细胞和YAC-1细胞的共同培养上清液50μL移到新的96孔培养板，使用罗氏公司制造的细胞毒性检测试剂盒（LDH）测量LDH酶活性。
其结果如图3所示，与对照组相比K71给药组脾细胞的细胞杀伤活性显示较高的值，具有统计意义（P＜0.01）。由此可知，摄取K71株的菌体或菌体成分能够促进自然杀伤细胞活化。
实施例4
从日本SRL公司购入6周龄的SD雄性大鼠，在SPF环境下使其自由摄取固体饲料（船桥农场（フナバシファーム）公司制造的FR-2）以及自来水，进行一周预备饲养。之后将其分成两组，每组各三只，向对照组喂食FR-2饲料，而向K71给药组喂食混入5%K71粉末的FR-2饲料，使其自由摄取，在22℃的SPF环境下饲养8天。测量其饲养前后的体重，并回收即将开始饲养之前（预备饲养结束前天夜晚至结束当天早上）以及即将结束饲养之前（饲养第7天夜晚至第8天早上）的粪便。
将回收的粪便以适当的生理盐水悬浊之后进行均质化（stomachere）处理，测量上清液的活菌数（CFDA荧光染色法）、大肠菌群的数量（使用日水制药（ニッスイ）的XM-G琼脂培养基的菌落计数法）、以及SIgA浓度（ELISA法）。其结果示于表1及图4。
表1
如表1所示可知，对照组和K71给药组之间的体重以及体重增加量并无差别。K71给药组的回收粪便重量虽然稍重，但是饲养前后重量差并无太大变化。两组的粪便活菌数在饲养前后也并无太大变动。
另一方面，对饲养前后粪便中的大肠菌群进行比较的结果显示，K71给药组的全部个体的大肠菌群数均减少。另外，如图4所示，K71给药组的SIgA含量与实施例1以及实施例2的结果相同，与对照组相比显示较高的值。由此可知，摄取K71株的菌体或菌体成分能够促进消化道粘膜中IgA的分泌，其结果能够减少粪便中的大肠菌群数。
实施例5
根据赫尔辛基宣言以及免疫学研究相关的道德准则进行人体试验。对24名30岁～57岁健康成人男女按照常规进行唾液SIgA分泌速度测量作为摄取前检查。SIgA分泌速度为47.87±20.07μg/min。选择24名中SIgA分泌速度较低的11名（男性5名、女性6名）作为试验者。向试验者提供试验食品（一包内含有K71粉末200mg的粉末食品），使其一天一包混合冷水或温水等服用。每隔4周来院进行一次问诊以及测量唾液中SIgA的分泌速度。试验中有两人中途退出（男女各一人），因此只对9名试验者进行分析。其结果，如图5所示可知，摄取开始后第4周、第8周、第12周SIgA的分泌速度比摄取前的值增加，且该增加值具有统计意义。整个摄取期间并未发现因摄取试验食品而造成的有害现象。

Claims (6)

1.一种国际保藏编号为FERM BP-11098的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)K71株的菌体在肠道免疫调节剂的制造中的用途，其中，所述肠道免疫调节剂用于促进分泌型免疫球蛋白A的生成，从而预防感染。
2.根据权利要求1所述的国际保藏编号为FERM BP-11098的副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)K71株的菌体在肠道免疫调节剂的制造中的用途，其特征在于，
所述菌体是死菌体。
3.根据权利要求1或2所述的国际保藏编号为FERM BP-11098的副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)K71株的菌体在肠道免疫调节剂的制造中的用途，其特征在于，
所述肠道免疫调节剂还用于自然杀伤细胞的活化。
4.根据权利要求1或2所述的国际保藏编号为FERM BP-11098的副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)K71株的菌体在肠道免疫调节剂的制造中的用途，其特征在于，
所述肠道免疫调节剂是口服的肠道免疫调节剂。
5.根据权利要求1所述的国际保藏编号为FERM BP-11098的副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)K71株的菌体在肠道免疫调节剂的制造中的用途，其特征在于，
所述肠道免疫调节剂包括利用所述K71株的菌体进行发酵而得的米、该米的粉碎物、或者将所述米或米的粉碎物进行烹饪处理而得到的米饭。
6.一种国际保藏编号为FERM BP-11098的副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)K71株的菌体在医药品的制造中的用途，其特征在于，
所述医药品含有权利要求1至5中任一项所述的肠道免疫调节剂，用于促进分泌型免疫球蛋白A的生成，从而预防感染。
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