JP5266596B2 - 免疫賦活作用を有する乳酸菌，免疫賦活作用を有する製品及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は，ＩｇＡ（免疫グロブリンＡ）誘導活性能を発揮することによって免疫賦活作用を有する乳酸菌，これを添加含有した免疫賦活作用を有する製品及びその製造方法に関する。

この種乳酸菌として，マウスパイエル板細胞培養系を用いてそのＩｇＡ誘導活性能を研究した結果，乳酸菌の一種ラクトバチルス・プランタラム乳酸菌，特にその特許生物寄託センター寄託のＦＥＲＭ ＢＰ−１００６４及び１００６５菌株が，免疫賦活作用，生体防御作用に優れているとして，該乳酸菌，これを添加含有した医薬，飲食物等の製品及び使用方法が提案されている。

特許第３８１８３１９号公報

上記乳酸菌の一種ラクトバチルス属プランタラム乳酸菌は，その相当程度のＩｇＡ産生促進機能により免疫賦活作用を発揮するものとして有用な乳酸菌と認められ，その製品も同様に有用のものと認められるが，IｇＡ産生の促進機能を発揮する乳酸菌は，これに限定されるものではないものとも考えられ，ヒト由来の乳酸菌中に，ＩｇＡ誘導活性能を同様に高度に発揮する免疫賦活作用を有するものが存在する可能性があり，その分離培養と有効な活用が求められる。

本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので，その解決課題とするところは，ＩｇＡ誘導活性能を発揮するヒト由来の免疫賦活作用を有する乳酸菌を新規に提供するにあり，またこれを添加含有した免疫賦活作用を有する製品及びその製造方法を新規に提供するにある。

上記課題に沿って鋭意研究と実験を重ねた結果，ヒト由来の乳酸菌中の，特にラクトバチルス属ガセリ種（以下ラクトバチルス・ガセリという。なおラクトバチルス属に属する他の種についても同様に属と種とを「・」（中丸）を介して一連に表記する。）がＩｇＡ誘導活性能（ＩｇＡ産生誘導活性能乃至ＩｇＡ産生機能といってもよい）を発揮する傾向があること，このとき特にラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（特許生物寄託センター受託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９））が，特に強力なＩｇＡ誘導活性能を呈して免疫賦活作用を有する乳酸菌として特に好適であることを見出して，本発明を行うに至ったもので，即ち請求項１に記載の発明を，ＩｇＡ誘導活性能を有する，ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌による免疫賦活作用を有する乳酸菌であって、該ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を，乳酸菌標準菌株ラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３の５倍程度の IｇＡ誘導活性を有するラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）としてなることを特徴とする免疫賦活作用を有する乳酸菌とし、請求項２に記載の発明を，請求項１に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を，ＩｇＡ誘導活性能を発揮させるために添加含有してなることを特徴とする免疫賦活作用を有する製品とし、請求項３に記載の発明を，上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を添加含有した製品を，発酵乳，乳酸菌飲料，清涼飲料水，ガム，グミ，その他の食品又は顆粒，粉末，錠剤，その他のサプリメント乃至医薬品としてなることを特徴とする請求項２に記載の上記免疫賦活作用を有する製品とし、請求項４に記載の発明を，請求項１に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を，ＩｇＡ誘導活性能を発揮させるために添加含有してなることを特徴とする免疫賦活作用を有する製品の製造方法としたものである。

以下に上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌及びそのうちのラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）を選定したＩｇＡ誘導活性能の研究評価について説明すると，本発明者は，出願人会社保有のヒト由来乳酸菌の中から，ラクトバチルス・カゼイ，ラクトバチルス・クリスパタス，ラクトバチルス・ファーメンタム，ラクトバチルス・ガセリ，ラクトバチルス・プランタラム，ラクトバチルス・ラムノサスである乳酸菌株５２菌株及び標準菌株としてラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３菌株を加えて，計５３菌株を選び，これらの菌株についてマウスパイエル板細胞を用いてそのＩｇＡ誘導活性能を研究評価した。その結果，ＩｇＡ誘導活性能を強く呈するもの（菌体無添加時のＩｇＡ値を１とした場合のＩｇＡ量の相対値が３以上のもの）は，ラクトバチルス・カゼイで０／９株，ラクトバチルス・クリスパタスで２／１１株，ラクトバチルス・ファーメンタムで０／１５株，ラクトバチルス・ガセリで３／８株，ラクトバチルス・プランタラムで０／５株，ラクトバチルス・ラムノサスで０／５株であり，とりわけラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）の相対値は他の乳酸菌株の５〜７倍程度、乳酸菌標準菌株ラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３の５倍程度と高く，免疫賦活作用を有する乳酸菌株として好適と認められ，またこれらは，乳発酵性，耐酸・耐胆汁酸性及び腸管接着性においても好適なものと認められた。

選抜した使用菌株：
下記の表１に示すとおりである。使用した乳酸菌株は，ラクトバチルス・カゼイ（９菌株）に番号１〜５及び３８〜４１，ラクトバチルス・ガセリ（８菌株）に番号６〜１３，ラクトバチルス・プランタラム（５菌株）に番号１４〜１８，ラクトバチルス・ラムノサス（４菌株）に番号１９〜２２，ラクトバチルス・ファーメンタム（１５菌株）に番号２３〜３７，ラクトバチルス・クリスパタス（１１菌株）に番号４２〜５２のサンプル番号を付し，またサンプル番号５３は標準菌株としてラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３菌株（ＡＴＣＣ：アメリカンタイプカルチャーコレクション）を加えサンプル菌株とした。

菌体サンプルの調整方法：
上記５３株の乳酸菌株を，それぞれＭＲＳ−ｂｒｏｔｈで４８時間培養した後，８，０００ｘｇ，１０分間の遠心分離で回収し，水で３回洗浄して，１ｍｌの水に懸濁して６５℃で３０分加熱後そのまま凍結乾燥することによって行なった。

マウスパイエル板細胞の調整方法及び培養方法：
マウスパイエル板（ＢＡＬＢ／ｃ，ｆｅｍａｌｅ，８ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ，日本チャールス・リバー株式会社製）を，１ｍｇ／ｍｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｔｙｐｅ I（Ｓｉｇｍａ），１５μｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩ（Ｒｈｏｃｈｅ），１０％，ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｓｉｇｍａ）を含むＰＲＭＩ１６４０に移し，ハサミで切り刻み，スターラーを用いて穏やかに撹拌しながら，３７℃で３０分間インキュベートした。これを３５０ｘｇ，１０分間遠心分離し，上清を廃棄した後５ｍＭ ＥＤＴＡ／５％ＦＢＳを含むＨＢＳＳを加えて懸濁し，３７℃，５分間インキュベートした。細胞懸濁液をセルストレイナー（７０μｍ，ＢＤ ｆａｌｃｏｎ）に通して，１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した後，５×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるように希釈し，９６ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ｎｕｎｃ）で培養した。このマウスパイエル板細胞に，１００μｇ／ｍｌとなるように上記各凍結乾燥した菌体サンプルを添加し，ＣＯ２インキュベーターを用いて７日間培養した。このときポジティブコントロールとしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ；ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ）を２０μｇ／ｍｌになるように添加した。培養後遠心分離によって上清を回収し，ＩｇＡを測定するまで−８０℃で保存した。

ＩｇＡ誘導試験：
培養上清中の総ＩｇＡの定量は，Ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ，inc製）を用いて，ｋｉｔ付属のプロトルコルに従ってＩｇＡを定量した。その結果を，Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（菌体無添加時）のＩｇＡ値を１とした場合のＩｇＡ量の相対値として，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＬＰＳ）の結果とともに下記の表１に示した。

表１のＩｇＡ定量誘導試験の結果によると，相対値が３以上の強いＩｇＡ誘導活性が認められるのは，サンプル番号１〜５及び３８〜４１のラクトバチルス・カゼイ菌体サンプル９菌株においてゼロ，サンプル番号６〜１３のラクトバチルス・ガセリ菌体サンプル８菌株において３菌株，サンプル番号１４〜１８のラクトバチルス・プランタラム菌体サンプル５菌株においてゼロ，サンプル番号１９〜２２のラクトバチルス・ラムノサス菌体サンプル４菌株においてゼロ，サンプル番号２３〜３７のラクトバチルス・ファーメンタム菌体サンプル１５菌株においてゼロ，サンプル番号４２〜５２のラクトバチルス・クリスパタス菌体サンプル１１菌株において２菌株であり，またサンプル番号５３の標準菌株ラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３菌株については，相対値が１．３とＩｇＡ誘導活性が認められなかった。

即ち，ＩｇＡ誘導活性は，ラクトバチルス・カゼイ，ラクトバチルス・プランタラム，ラクトバチルス・ファーメンタム，ラクトバチルス・ラムノサスにおいては認められず，またラクトバチルス・ガセリ，ラクトバチルス・クリスパタスにおいて認められたが，特にラクトバチルス・ガセリにあっては，菌体サンプルの半数に認められ，該ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌に，ＩｇＡ誘導活性能を発揮する傾向が強いことが判明し，該ラクトバチルス・ガセリに属する乳酸菌に，免疫賦活作用を有する乳酸菌としての蓋然性があるものと評価できる。また特に該ラクトバチルス・ガセリのうち，サンプル番号９のラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）については，ＩｇＡ誘導活性の相対値が６．４と、乳酸菌標準菌株ラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３の５倍程度、他の乳酸菌株の５〜７倍程度高く，またＩｇＡ誘導活性を示す乳酸菌株のうちの最高値を示しており，従ってこのラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株は，極めて高度なＩｇＡ誘導活性を示す乳酸菌株として，優れた免疫賦活作用を発揮するものと高く評価することができる。なおラクトバチルス・クリスパタスにＩｇＡ誘導活性が認められるが，ラクトバチルス・ガセリのように活性が強いとはいえないし，また乳等の発酵に際して発酵適正が劣る傾向があり，従ってその実用は必ずしも好適とはいえない。

以上から，ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌は，免疫賦活作用を発揮する用途に適当であり，またラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）が，特に強力なＩｇＡ誘導活性能を呈するものとして，免疫賦活作用を発揮する用途に好適であり，その乳酸菌，これを用いた製品の供給により，需要者の免疫力を高めて，各種の外来抗原に対して有効に作用することが大きく期待される。

本発明者らが分離培養して命名したラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）について，その培養と生理生化学的性状を以下に示す。
培養条件：
培地 BL寒天培地（日水製薬，日本）+5％馬脱繊維血
培養温度 37℃
培養時間 48時間
培養した菌株にグラム染色を施し，表２の各項目についてその生理生化学的性状を試験した。グラム染色は，フェイバーG「ニッスイ」（日水製薬，日本）を用いて行った。カタラーゼ反応，オキシダーゼ反応，ブドウ糖からの酸／ガス産生，ブドウ糖の酸化／発酵（O／F）については，BARROW（BARROW, (G.I.) and FELTHAM, (R.K.A.): Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. 1993, Cambridge University Press.）らの方法に基づいて行った。その結果を表２に示す。

更に糖資化性についてAPI50CHL（bioMerieux，Lyon，France）を用いて調べた。その結果を表３に示す。

本発明は，このようにラクトバチルス・ガセリ乳酸菌，特に好ましいラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）によって，ＩｇＡ誘導活性能を発揮する上記乳酸菌を提供するとともにこれを添加含有した製品及びこれを添加含有する製品の製造方法を提供するものであり，上記請求項記載の発明を，それぞれ発明の要旨として，上記課題解決の手段とするものである。

本発明は，以上のとおりに構成したから，請求項１に記載の発明は，ＩｇＡ誘導活性能を発揮する免疫賦活作用を有する乳酸菌を提供することができ，請求項２及び３に記載の発明は、特に優れたＩｇＡ誘導活性能を発揮する免疫賦活作用を有する製品を提供することができ，また請求項４に記載の発明は、ＩｇＡ誘導活性能を発揮する免疫賦活作用を有する製品の製造方法を提供することができる。

以下更にラクトバチルス・ガセリ乳酸菌，これを用いた製品及びその製造方法を説明すれば，ラクトバチルス・ガセリは，IｇＡ誘導活性を示す上記３種の乳酸菌株，即ちサンプル番号６のＡ０８−０５Ｅ（相対値３．４），同７のＡ０８−０５Ｇ（同３．２），同９のＡ１０−０２Ｃ（同６．４）菌株を好ましく使用することができ，このうち特にＡ１０−０２Ｃ菌株のＩｇＡ誘導活性能が高いので，該ラクトバチルス・ガセリのうちでは，該Ａ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）を使用するのが特に好ましい。

これら乳酸菌は，該菌株として，これを凍結乾燥した乳酸菌粉末として，市場に供給することができるとともに発酵乳，乳酸菌飲料，清涼飲料水，ガム，グミ，その他の食品又は顆粒，粉末，錠剤，その他のサプリメント乃至医薬品として，同様に市場に供給することができる。即ち，例えばヨーグルト等発酵食品のスターターとして添加発酵して，該菌株を含有する発酵食品とする他，一般に用いられる各種の飲料，食品，食品素材，食品添加物，医薬品，サプリメント等に添加することによって，ＩｇＡ誘導活性能を発揮する製品とすることができる。また該製品には，上記乳酸菌又はその乳酸菌粉末を，組成原料の製造段階を含めて，その製造工程の適宜段階に添加することによって，これを製造方法として，これを製造することができる。また，例えばオリゴ糖を同時に添加することによって，これら製品は，プロバイオティクス用途とともにプレバイオティクス用途のものとすることができ，また各種ビタミン類やその他の人体に有益な成分を添加することができ，更に家畜類の飼料としても同様に使用することができる。

これら製品は，常法に従って該製品の組成を行なうとともに常法に従ってその製造を行なうことができ，該乳酸菌によるＩｇＡ誘導活性能の発揮に，特段の条件や製造方法の限定を行なう必要はない。

これらラクトバチルス・ガセリの乳酸菌またその上記Ａ１０−０２Ｃ菌株に，人体に害を及ぼす可能性はないものと認められるから，乳児用の飲料，食品等の製品に，上記と同様に使用することができる上，特殊用途の医薬品にも特段の制限なく使用することができる。またその添加量についても制限がないが，一般には極く微量を添加することで，ＩｇＡ誘導活性能を発揮することが可能である。

本説明は以上のとおりとしたが，本発明の実施に当って，上記乳酸菌株，製品，製造方法の，各具体的形態は，上記発明の要旨に反しない限り，様々な形態のものとすることができる。

Claims (4)

1. ＩｇＡ誘導活性能を有する，ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌による免疫賦活作用を有する乳酸菌であって、該ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を，乳酸菌標準菌株ラクトバチルス・ラムノサスＡＴＣＣ５３１０３の５倍程度の IｇＡ誘導活性を有するラクトバチルス・ガセリＡ１０−０２Ｃ菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−２１３９９）としてなることを特徴とする免疫賦活作用を有する乳酸菌。
2. 請求項１に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を，ＩｇＡ誘導活性能を発揮させるために添加含有してなることを特徴とする免疫賦活作用を有する製品。
3. 上記ラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を添加含有した製品を，発酵乳，乳酸菌飲料，清涼飲料水，ガム，グミ，その他の食品又は顆粒，粉末，錠剤，その他のサプリメント乃至医薬品としてなることを特徴とする請求項２に記載の上記免疫賦活作用を有する製品。
4. 請求項１に記載のラクトバチルス・ガセリ乳酸菌を，ＩｇＡ誘導活性能を発揮させるために添加含有してなることを特徴とする免疫賦活作用を有する製品の製造方法。