JP2023145882A - Iap活性化用組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】新たなIAP活性化組成物を提供することを課題とする。【解決手段】Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus delbrueckii、Streptococcus thermophilusによる培養物を有効成分とすることにより、IAP活性化作用を有する飲食品および飼料を提供する【選択図】図3
Description
本発明は、小腸アルカリホスファターゼ(IAP)活性を増強する乳酸菌に関する。
小腸型アルカリホスファターゼ(Intestinal Alkaline Phosphatase; IAP)は、小腸刷子縁上に発現する脱リン酸化酵素である。IAP活性の低下は、糖尿病、慢性腎不全、メタボリックシンドローム、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、壊死性腸炎(NEC)、敗血症、抗生物質関連下痢等、様々な疾患と関与していることが報告されている(非特許文献1、2)。したがって、IAPを活性化することにより、これらの疾患に対する予防・改善効果が期待される。
IAPを活性化させる物質には様々なものが報告されている。例えば、副腎皮質刺激ホルモンや甲状腺ホルモンのようなホルモン、長鎖・中鎖トリアシルグリセロールのような脂質、デンプンやセルロース、オリゴ糖のような炭水化物、その他、アミノ酸、ペプチド、ビタミン、ミネラル等が挙げられる(非特許文献1、2)。これらの成分の一部は、前述の種々の疾患に対して抑制的に働くことが示唆されている(非特許文献1、2)。食品成分にIAP活性化能が報告されていることから、普段の食事の栄養組成を改善することによって、IAP活性を高く維持することができ、様々な疾患を予防できると考えられる。
ところで、乳酸菌およびビフィズス菌は、古来より発酵食品の製造に使用される細菌であるが、近年の研究で様々な健康機能の増進に寄与することが明らかとなりつつある。乳酸菌やビフィズス菌等で発酵した食品によるIAP活性化作用についても報告されており、例えば非特許文献3には、ヨーグルト及びLactobacillus caseiを用いた発酵乳に刷子縁酵素活性化作用があることが記載されている。また、特許文献1は、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus plantarum、Streptococcus faeciumを投与することでブタのIAPを活性化する方法を記載している(請求項6)。しかしながら、これらの文献においては、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus delbrueckii、Streptococcus thermophilusのIAP活性化作用については検討されていない。
Lalles JP. Recent advances in intestinal alkaline phosphatase, inflammation, and nutrition. Nutr Rev.2019 October;77(10):710-724.
Lalles JP. Intestinal alkaline phosphatase: multiple biological roles in maintenance of intestinal homeostasis and modulation by diet. Nutr Rev. 2010 Jun;68(6):323-32.
Thoreux K, Balas D, Bouley C, Senegas-Balas F. Diet supplemented with yoghurt or milk fermented by Lactobacillus casei DN-114 001 stimulates growth and brush-border enzyme activities in mouse small intestine. Digestion. 1998 Jul-Aug;59(4):349-59.
本発明は、新たなIAP活性化用組成物を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究を重ねた結果、IAP活性化作用を増強する乳酸菌を見出し、これらの乳酸菌を用いて培養物を調製することでIAP活性化能の高い組成物が得られることを見出した。
本発明は、具体的には以下のとおりである。ここにいう「組成物」には、製剤、飲食品ならびに飼料等の動物(ヒトを含む)が摂取し得る物が含まれる。
[実施態様1]
ラクトバチルス(Lactobacillus)属またはストレプトコッカス(Streptococcus)属に属する菌体およびその培養物を有効成分とするIAP活性化用組成物。
[実施態様2]
Lactobacillus属またはStreptococcus属に属する菌が、ラクトバチルス ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス デルブリッキー(Lactobacillus delbrueckii)及びストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)から成る群から選択される少なくとも1つであることを特徴とする実施態様1に記載のIAP活性化用組成物。
[実施態様3]
Lactobacillus属またはStreptococcus属に属する菌が、Lactobacillus johnsonii SBT0305(NITE P-03628)、Lactobacillus johnsonii SBT0307(NITE P-02982)、Lactobacillus johnsonii SBT0309(NITE P-03629)、Lactobacillus johnsonii SBT2082(NITE P-03632)、Lactobacillus delbrueckii SBT0803(NITE P-03630)及びStreptococcus thermophilus SBT1016(NITE P-03631)から成る群から選択される少なくとも1つであることを特徴とする実施態様2に記載のIAP活性化用組成物。
[実施態様4]
実施態様1~3のいずれか一項に記載のIAP活性化用組成物を含む、IAP活性化用飼料組成物、IAP活性化用医薬組成物、又はIAP活性化用食品組成物。
[実施態様5]
新規乳酸菌Lactobacillus johnsonii SBT0305(NITE P-03628)、Lactobacillus johnsonii SBT0309(NITE P-03629)、Lactobacillus delbrueckii SBT0803(NITE P-03630)、Streptococcus thermophilus SBT1016(NITE P-03631)、及びLactobacillus johnsonii SBT2082(NITE P-03632)。
[実施態様1]
ラクトバチルス(Lactobacillus)属またはストレプトコッカス(Streptococcus)属に属する菌体およびその培養物を有効成分とするIAP活性化用組成物。
[実施態様2]
Lactobacillus属またはStreptococcus属に属する菌が、ラクトバチルス ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス デルブリッキー(Lactobacillus delbrueckii)及びストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)から成る群から選択される少なくとも1つであることを特徴とする実施態様1に記載のIAP活性化用組成物。
[実施態様3]
Lactobacillus属またはStreptococcus属に属する菌が、Lactobacillus johnsonii SBT0305(NITE P-03628)、Lactobacillus johnsonii SBT0307(NITE P-02982)、Lactobacillus johnsonii SBT0309(NITE P-03629)、Lactobacillus johnsonii SBT2082(NITE P-03632)、Lactobacillus delbrueckii SBT0803(NITE P-03630)及びStreptococcus thermophilus SBT1016(NITE P-03631)から成る群から選択される少なくとも1つであることを特徴とする実施態様2に記載のIAP活性化用組成物。
[実施態様4]
実施態様1~3のいずれか一項に記載のIAP活性化用組成物を含む、IAP活性化用飼料組成物、IAP活性化用医薬組成物、又はIAP活性化用食品組成物。
[実施態様5]
新規乳酸菌Lactobacillus johnsonii SBT0305(NITE P-03628)、Lactobacillus johnsonii SBT0309(NITE P-03629)、Lactobacillus delbrueckii SBT0803(NITE P-03630)、Streptococcus thermophilus SBT1016(NITE P-03631)、及びLactobacillus johnsonii SBT2082(NITE P-03632)。
本発明によれば、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus delbrueckii、Streptococcus thermophilusよりなる群から選択される少なくとも一種の乳酸菌およびその培養物を含有するIAP活性化用組成物を提供することができる。
(ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する菌の菌体)
本発明のIAP活性化用組成物では、ラクトバチルス(Lactobacillus)属およびストレプトコッカス(Streptococcus)属に分類される乳酸菌であり、且つIAP活性化能を有するものであればどのようなものでも用いることができる。尚、ここで述べるラクトバチルス属には、旧来ラクトバチルス属として分類されていたリジラクトバチルス(Ligilactobacillus)属、レビラクトバチルス(Levilactobacillus)属、リモシラクトバチルス(Limosilactobacillus)属、レンチラクトバチルス(Lentilactobacillus)属、ラクチカゼイバチルス(Lacticaseibacillus)属、ラクチプランチバチルス(Lactiplantibacillus)属、ラチラクトバチルス(Latilactobacillus)属、ロイゴラクトバチルス(Loigolactobacillus)属、シュレイフェリラクトバチルス(Schleiferilactobacillus)属等を含む。
本発明のIAP活性化用組成物では、ラクトバチルス(Lactobacillus)属およびストレプトコッカス(Streptococcus)属に分類される乳酸菌であり、且つIAP活性化能を有するものであればどのようなものでも用いることができる。尚、ここで述べるラクトバチルス属には、旧来ラクトバチルス属として分類されていたリジラクトバチルス(Ligilactobacillus)属、レビラクトバチルス(Levilactobacillus)属、リモシラクトバチルス(Limosilactobacillus)属、レンチラクトバチルス(Lentilactobacillus)属、ラクチカゼイバチルス(Lacticaseibacillus)属、ラクチプランチバチルス(Lactiplantibacillus)属、ラチラクトバチルス(Latilactobacillus)属、ロイゴラクトバチルス(Loigolactobacillus)属、シュレイフェリラクトバチルス(Schleiferilactobacillus)属等を含む。
具体的には、リジラクトバチルス アシディピスシス(Ligilactobacillus acidipiscis)、ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス アミロボラス(Lactobacillus amylovorus)、レビラクトバチルス ブレビス(Levilactobacillus brevis)、ラクトバチルス クリスパタス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ デルブルッキー(Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii)、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ ラクティス(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis)、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ ジャコブセニー(Lactobacillus delbrueckii subsp. jakobsenii)、リモシラクトバチルス ファーメンタム(Limosilactobacillus fermentum)、ラクトバチルス ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス パラガセリ(Lactobacillus paragasseri)、ラクトバチルス ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、レンチラクトバチルス ケフィリ(Lentilactobacillus kefiri)、リモシラクトバチルス ムコサエ(Limosilactobacillus mucosae)、リモシラクトバチルス オリス(Limosilactobacillus oris)、レンチラクトバチルス パラブチネリ(Lentilactobacillus parabuchneri)、ラクチカゼイバチルス パラカゼイ(Lacticaseibacillus paracasei)、ラクチプランチバチルス プランタラム(Lactiplantibacillus plantarum)、リモシラクトバチルス ロイテリ(Limosilactobacillus reuteri)、ラクチカゼイバチルス ラムノーサス(Lacticaseibacillus rhamnosus)、ラチラクトバチルス サケイ(Latilactobacillus sakei)、リジラクトバチルス サリバリウス(Ligilactobacillus salivarius)、リモシラクトバチルス バジナリス(Limosilactobacillus vaginalis)、ロイゴラクトバチルス コリニフォルミス(Loigolactobacillus coryniformis)、ラチラクトバチルス クルバタス(Latilactobacillus curvatus)、シュレイフェリラクトバチルス ハルビネンシス(Schleiferilactobacillus harbinensis)、ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、ストレプトコッカス オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス パラウベリス(Streptococcus parauberis)、ストレプトコッカス サリバリウス(Streptococcus salivarius)等を例示できるが、これらに限定されるものではない。
本発明に使用するラクトバチルス属の菌は、ラクトバチルス デルブルッキー、ラクトバチルス ジョンソニーであることが好ましく、Lactobacillus johnsonii SBT0305(NITE P-03628)、Lactobacillus johnsonii SBT0307(NITE P-02982)、Lactobacillus johnsonii SBT0309(NITE P-03629)、Lactobacillus johnsonii SBT2082(NITE P-03632)、Lactobacillus delbrueckii SBT0803(NITE P-03630)であることが特に好ましい。本発明に使用するストレプトコッカス属の菌は、ストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)であることが好ましく、Streptococcus thermophilus SBT1016(NITE P-03631)であることが特に好ましい。
上記の菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(日本、千葉県、木更津市)から入手することができる。
(ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する菌の培養物の調製)
本発明のIAP活性化用組成物において使用する、ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する菌は、各菌の培養の常法に従って培養し、所望の量を調製すればよい。調製の一例を以下に示す。ラクトバチルス属に属する乳酸菌はMRS培地(Difco)を用いて、ストレプトコッカス属に属する乳酸菌は1%グルコース含有M17培地(Difco)を用いてそれぞれ培養し、10%還元脱脂乳(SM、雪印メグミルク)、0.5%ミーストパウダーN(アサヒグループ食品)、1%グルコース(Wako)、0.1%アスコルビン酸ナトリウム(Wako)0.04% L-システイン塩酸塩を含む培地(SM培地)で3代継代培養することで培養物を得る。得られた培養物をそのまま用いてもよいし、濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供したものを用いることもできる。
本発明のIAP活性化用組成物において使用する、ラクトバチルス属またはストレプトコッカス属に属する菌は、各菌の培養の常法に従って培養し、所望の量を調製すればよい。調製の一例を以下に示す。ラクトバチルス属に属する乳酸菌はMRS培地(Difco)を用いて、ストレプトコッカス属に属する乳酸菌は1%グルコース含有M17培地(Difco)を用いてそれぞれ培養し、10%還元脱脂乳(SM、雪印メグミルク)、0.5%ミーストパウダーN(アサヒグループ食品)、1%グルコース(Wako)、0.1%アスコルビン酸ナトリウム(Wako)0.04% L-システイン塩酸塩を含む培地(SM培地)で3代継代培養することで培養物を得る。得られた培養物をそのまま用いてもよいし、濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供したものを用いることもできる。
(利用方法)
上記したとおり、本発明の組成物は濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した培養物も有効成分とすることができることから、製剤、飲食品、飼料の原料として広く用いることができる。製剤、飲食品、又は飼料を培地として菌を培養して、当該培地、培養物、懸濁物、又はその他の培養物含有物をそのまま製剤、飲食品、又は飼料として用いてもよく、または、他の培地で培養した培養物を製剤、飲食品、又は飼料に添加してもよい。
上記したとおり、本発明の組成物は濃縮、乾燥、凍結乾燥処理に供した培養物も有効成分とすることができることから、製剤、飲食品、飼料の原料として広く用いることができる。製剤、飲食品、又は飼料を培地として菌を培養して、当該培地、培養物、懸濁物、又はその他の培養物含有物をそのまま製剤、飲食品、又は飼料として用いてもよく、または、他の培地で培養した培養物を製剤、飲食品、又は飼料に添加してもよい。
培養物などの形態としては、合成培地であるMRS培地(Difco)、還元脱脂乳培地など一般的に乳酸菌の培養に用いられる培地を用いた培養物だけでなく、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料などの乳製品などを例示することができるが特に限定されるものではない。
本発明のIAP活性化用組成物の製剤化に際しては製剤上許可されている賦型剤、安定剤、矯味剤などを適宜混合して濃縮、凍結乾燥することができる。これらの乾燥物、濃縮物、ペースト状物も含有される。また、培養物のIAP活性化作用を妨げない範囲で、賦型剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、懸濁剤、コーティング剤、その他の任意の薬剤を混合して製剤化することもできる。剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤などが可能であり、これらを経口的に投与することが望ましい。
本発明のIAP活性化用組成物はどのような飲食品に配合しても良く、飲食品の製造工程中に原料に添加しても良い。飲食品の例としては、チーズ、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、バター、マーガリンなどの乳製品、乳飲料、果汁飲料、清涼飲料などの飲料、ゼリー、キャンディー、プリン、マヨネーズなどの卵加工品、バターケーキなどの菓子・パン類、さらには、各種粉乳の他、乳幼児食品、栄養組成物などを挙げることができるが特に限定されるものではない。
本発明のIAP活性化用組成物は、飼料に配合することができる。前記飲食品と同様にどのような飼料に配合しても良く、飼料の製造工程中に原料に添加しても良い。
本発明の組成物の投与対象は特に限定されず、ヒトに対して投与することができるが、投与対象はヒト以外の動物(例えば、イヌ、ネコ、ウマ又はウサギ等)であることもできる。投与対象がヒトである場合は、20歳未満の未成年、成人、又は65歳以上の高齢者などに投与することができる。本発明の組成物は、健康な対象に投与することで腸内環境を改善することが出来る。
(IAP活性の評価方法)
実施例に記載の方法、すなわち、ヒト大腸癌由来細胞株Caco-2を用いた方法で評価が可能である。具体的には、以下の通りである。
(1)Caco-2細胞は、コラーゲンコート(新田ゼラチン)した48-well plate上で培養する。培地は10% FBS(Gibco)、1% NEAA(ナカライテスク)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を含むhigh glucose DMEM(ナカライテスク)を使用する。培養は37°C、5%CO2条件下で行う。
(2)コラーゲンコートした48-well plateにCaco-2細胞を0.5×105 cells/wellで播種し、コンフルエントになった日を培養0日とし、2-3日ごとに培地交換して2週間培養する。
(3)2週間後、2 mM酪酸ナトリウムあるいは各種濃度のサンプルを溶解した培地に培地交換し、2-3日ごとに培地交換しながら7日間培養する。
(4)サンプル添加後7日間培養した細胞を生理食塩水で3回洗浄し、1% Triton-X、1 mM PMSF、10 mM TBS(pH 7.3)を200 μl/wellで添加して細胞を溶解させる。細胞溶解液を全量1.5 mlチューブに回収し、氷上にて超音波破砕する(on time 15 sec, Amp 30%)。4,800×g、5 min、4°Cで遠心し、上清を回収する。回収した上清を粗酵素抽出物とし、試験に供するまで-80°Cで保存する。
(5)粗酵素抽出物のIAP活性を、PierceTM PNPP Substrate Kit(37620,Thermo Fisher Scientific)にて測定する。1% Triton-X、1 mM PMSF、10 mM TBS(pH 7.3)で検量線用に段階希釈したBacterial alkaline phosphatase(BAP,Takara)、または10倍希釈したサンプルを、96-well plateに10 μl/wellで添加する。PNPP substrate solutionを90 μl/wellで添加し、プレートシェイカーにて撹拌した後、暗所にて室温で30分間静置する。静置後、2N NaOHを50 μl/wellで添加して反応を停止し、Varioskan Flash(Thermo Fisher Scientific)にて405 nm吸光度を測定する。BAPの測定結果から作出した検量線を用いて、IAP活性(U/ml)を算出する。
(6)粗酵素抽出物のタンパク質濃度を、PierceTM BCA Protein Assay Kit(23225,Thermo Fisher Scientific)にて測定する。IAP活性(U/ml)をタンパク質濃度(mg/ml)にて補正し、補正値をIAP活性(U/mg protein)とする。
実施例に記載の方法、すなわち、ヒト大腸癌由来細胞株Caco-2を用いた方法で評価が可能である。具体的には、以下の通りである。
(1)Caco-2細胞は、コラーゲンコート(新田ゼラチン)した48-well plate上で培養する。培地は10% FBS(Gibco)、1% NEAA(ナカライテスク)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を含むhigh glucose DMEM(ナカライテスク)を使用する。培養は37°C、5%CO2条件下で行う。
(2)コラーゲンコートした48-well plateにCaco-2細胞を0.5×105 cells/wellで播種し、コンフルエントになった日を培養0日とし、2-3日ごとに培地交換して2週間培養する。
(3)2週間後、2 mM酪酸ナトリウムあるいは各種濃度のサンプルを溶解した培地に培地交換し、2-3日ごとに培地交換しながら7日間培養する。
(4)サンプル添加後7日間培養した細胞を生理食塩水で3回洗浄し、1% Triton-X、1 mM PMSF、10 mM TBS(pH 7.3)を200 μl/wellで添加して細胞を溶解させる。細胞溶解液を全量1.5 mlチューブに回収し、氷上にて超音波破砕する(on time 15 sec, Amp 30%)。4,800×g、5 min、4°Cで遠心し、上清を回収する。回収した上清を粗酵素抽出物とし、試験に供するまで-80°Cで保存する。
(5)粗酵素抽出物のIAP活性を、PierceTM PNPP Substrate Kit(37620,Thermo Fisher Scientific)にて測定する。1% Triton-X、1 mM PMSF、10 mM TBS(pH 7.3)で検量線用に段階希釈したBacterial alkaline phosphatase(BAP,Takara)、または10倍希釈したサンプルを、96-well plateに10 μl/wellで添加する。PNPP substrate solutionを90 μl/wellで添加し、プレートシェイカーにて撹拌した後、暗所にて室温で30分間静置する。静置後、2N NaOHを50 μl/wellで添加して反応を停止し、Varioskan Flash(Thermo Fisher Scientific)にて405 nm吸光度を測定する。BAPの測定結果から作出した検量線を用いて、IAP活性(U/ml)を算出する。
(6)粗酵素抽出物のタンパク質濃度を、PierceTM BCA Protein Assay Kit(23225,Thermo Fisher Scientific)にて測定する。IAP活性(U/ml)をタンパク質濃度(mg/ml)にて補正し、補正値をIAP活性(U/mg protein)とする。
(利用方法)
本発明の製造方法により得られる飲食品としては、例えば、発酵乳食品、発酵豆乳食品、漬物、納豆、酒類等が挙げられる。
本発明の製造方法により得られる飲食品としては、例えば、発酵乳食品、発酵豆乳食品、漬物、納豆、酒類等が挙げられる。
乳類を含有する原材料にIAP活性増強菌を複数種接種して発酵する際にも、用いる菌の増殖や酵素反応等に好適な条件を設定すればよい。条件は、一般に10~42℃で数時間、または1~3日発酵すればよい。このようにして得られた食品はIAP活性化用組成物を含有する発酵乳食品である。
乳類を含有する原材料を用いることにより、良好に発酵し、発酵時間を短くすることができ、得られる発酵乳食品の風味及び香り等は非常に良好なものとなる。このような発酵乳食品の例としては、チーズ、ヨーグルトや豆乳等が挙げられる。
本発明の方法により得られる医薬品としては、例えば、得られるIAP活性化用組成物をそのまま用いてもよいし、また乾燥した粉末を有効成分としてもよい。乾燥方法に特に制限はないが、成分の変質を抑制できる凍結乾燥法が好ましい。これらの粉末は乳糖等の適当な賦形剤と混合し、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤又はシロップ剤等として製剤化することができる。
さらに、本発明の方法により得られる飼料としては、例えば、得られるIAP活性化用組成物をどのような飼料に配合しても良く、その製造工程中に原料に添加しても良い。
また、本発明の方法により得られる飲食品は、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品、又は美容用食品として使用することも可能である。
以下、本発明を試験例、比較例、実施例をもとにさらに詳細に説明するが、本発明は係る実施例等に限定されて解釈されるものではない。なお、特に説明のない限り、%の表示は質量%を示す。
(実施例品1)
下記(1)の各供試菌を、MRS培地(Difco)、1%グルコース含有GAMブイヨン(日水)、M17培地(Difco)または1%グルコース含有M17培地(Difco)にそれぞれ植菌し、30-37℃にて16-24時間静置培養を行った。各種菌株の培養物を、10%還元脱脂乳(SM、雪印メグミルク)、0.5%ミーストパウダーN(アサヒグループ食品)、1%グルコース(Wako)、0.1%アスコルビン酸ナトリウム(Wako)0.04% L-システイン塩酸塩を含む培地(SM培地)で3代継代培養した。調製した各種菌株の脱脂乳培養物は、pHを測定した後、凍結乾燥して粉末状に調製し、試験に供するまで-80°Cで保管した。
下記(1)の各供試菌を、MRS培地(Difco)、1%グルコース含有GAMブイヨン(日水)、M17培地(Difco)または1%グルコース含有M17培地(Difco)にそれぞれ植菌し、30-37℃にて16-24時間静置培養を行った。各種菌株の培養物を、10%還元脱脂乳(SM、雪印メグミルク)、0.5%ミーストパウダーN(アサヒグループ食品)、1%グルコース(Wako)、0.1%アスコルビン酸ナトリウム(Wako)0.04% L-システイン塩酸塩を含む培地(SM培地)で3代継代培養した。調製した各種菌株の脱脂乳培養物は、pHを測定した後、凍結乾燥して粉末状に調製し、試験に供するまで-80°Cで保管した。
(実施例品2)
下記(2)の各供試菌を、MRS培地(Difco)、1%グルコース含有GAMブイヨン(日水)、M17培地(Difco)、1%グルコース含有M17培地(Difco)にそれぞれ植菌し、30-37℃にて16-24時間静置培養を行った。各種菌株の培養物を、10%還元脱脂乳(SM、雪印メグミルク)、0.5%ミーストパウダーN(アサヒグループ食品)、1%グルコース(Wako)、0.1%アスコルビン酸ナトリウム(Wako)0.04% L-システイン塩酸塩を含む培地(SM培地)で3代継代培養した。調製した各種菌株の脱脂乳培養物は、pHを測定した後、凍結乾燥して粉末状に調製し、試験に供するまで-80°Cで保管した。
下記(2)の各供試菌を、MRS培地(Difco)、1%グルコース含有GAMブイヨン(日水)、M17培地(Difco)、1%グルコース含有M17培地(Difco)にそれぞれ植菌し、30-37℃にて16-24時間静置培養を行った。各種菌株の培養物を、10%還元脱脂乳(SM、雪印メグミルク)、0.5%ミーストパウダーN(アサヒグループ食品)、1%グルコース(Wako)、0.1%アスコルビン酸ナトリウム(Wako)0.04% L-システイン塩酸塩を含む培地(SM培地)で3代継代培養した。調製した各種菌株の脱脂乳培養物は、pHを測定した後、凍結乾燥して粉末状に調製し、試験に供するまで-80°Cで保管した。
上記(1)(2)の菌株は、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター(日本、千葉県、木更津市)から入手することができる。
[試験例1]IAP活性化能の高い乳酸菌・ビフィズス菌の選抜試験
IAP活性化能高い乳酸菌を選抜するため、下記の評価を行った。コラーゲンコートした48-well plateにCaco-2細胞を0.5×105 cells/wellで播種し、コンフルエントになった日を培養0日とし、2-3日ごとに培地交換して2週間培養した。
IAP活性化能高い乳酸菌を選抜するため、下記の評価を行った。コラーゲンコートした48-well plateにCaco-2細胞を0.5×105 cells/wellで播種し、コンフルエントになった日を培養0日とし、2-3日ごとに培地交換して2週間培養した。
2週間後、2 mM酪酸ナトリウムあるいは1-10 mg/mlの(実施例品1)を溶解した培地に培地交換し、2-3日ごとに培地交換しながら7日間培養した。
サンプル添加後7日間培養した細胞を生理食塩水で3回洗浄し、1% Triton-X、1 mM PMSF、10 mM TBS(pH 7.3)を200 μl/wellで添加して細胞を溶解させた。細胞溶解液を全量1.5 mlチューブに回収し、氷上にて超音波破砕した(on time 15 sec, Amp 30%)。4,800×g、5 min、4°Cで遠心し、上清を回収した。回収した上清を粗酵素抽出物とし、試験に供するまで-80°Cで保存した。
粗酵素抽出物のIAP活性を、PierceTM PNPP Substrate Kit(37620,Thermo Fisher Scientific)にて測定した。1% Triton-X、1 mM PMSF、10 mM TBS(pH 7.3)で検量線用に段階希釈したBacterial alkaline phosphatase(BAP,Takara)、または10倍希釈したサンプルを、96-well plateに10 μl/wellで添加した。PNPP substrate solutionを90 μl/wellで添加し、プレートシェイカーにて撹拌した後、暗所にて室温で30分間静置する。静置後、2N NaOHを50 μl/wellで添加して反応を停止し、Varioskan Flash(Thermo Fisher Scientific)にて405 nm吸光度を測定した。BAPの測定結果から作出した検量線を用いて、IAP活性(U/ml)を算出した。
粗酵素抽出物のタンパク質濃度を、PierceTM BCA Protein Assay Kit(23225,Thermo Fisher Scientific)にて測定した。IAP活性(U/ml)をタンパク質濃度(mg/ml)にて補正し、補正値をIAP活性(U/mg protein)とした。
同じ濃度のSM添加群との群間比較はDunnett‘s testにて実施した。有意水準はP=0.05とした(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。
各種乳酸菌・ビフィズス菌培養物を1 mg/mlで添加したCaco-2細胞のIAP活性を図1に示した。試験を4回に分けて実施し(Expt.1~4)、各回の上位3位までの培養物をIAP活性化能の高い培養物として選抜した。
Expt.1~4の上位3位までの各種乳酸菌・ビフィズス菌培養物を1または10 mg/mlで添加したCaco-2細胞のIAP活性を図2に示した。10 mg/mlの添加条件において、SM添加群と比較して、Expt.1ではLactobacillus delbrueckii SBT0803培養物、Expt.2ではLactobacillus johnsonii SBT0307培養物、Expt.3ではStreptococcus thermophilus SBT1016培養物添加群がそれぞれ有意にIAP活性を亢進させた。Expt.4ではBifidobacterium mongoliense培養物が、SM添加群と比較して有意にIAP活性を亢進させたが、前述のLactobacillus delbrueckii SBT0803培養物、Lactobacillus johnsonii SBT0307培養物、Streptococcus thermophilus SBT1016培養物と比較すると活性は低かった。すなわち、Lactobacillus delbrueckii SBT0803、Lactobacillus johnsonii SBT0307、Streptococcus thermophilus SBT1016は脱脂乳のIAP活性化能を増強する菌であることが示された。
[試験例2]IAP活性化能の高い菌種探索試験
試験例1において、Lactobacillus delbrueckii SBT0803、Lactobacillus johnsonii SBT0307、Streptococcus thermophilus SBT1016に認められた効果が、菌株特異的な効果なのか、あるいは菌種に共通した効果なのかを検証するべく、下記の評価を行った。
試験例1において、Lactobacillus delbrueckii SBT0803、Lactobacillus johnsonii SBT0307、Streptococcus thermophilus SBT1016に認められた効果が、菌株特異的な効果なのか、あるいは菌種に共通した効果なのかを検証するべく、下記の評価を行った。
コラーゲンコートした48-well plateにCaco-2細胞を0.5×105 cells/wellで播種し、コンフルエントになった日を培養0日とし、2-3日ごとに培地交換して2週間培養した。
2週間後、2 mM酪酸ナトリウムあるいは5 mg/mlの(実施例品2)を溶解した培地に培地交換し、2-3日ごとに培地交換しながら7日間培養した。
サンプル添加後7日間培養した細胞を生理食塩水で3回洗浄し、1% Triton-X、1 mM PMSF、10 mM TBS(pH 7.3)を200 μl/wellで添加して細胞を溶解させる。細胞溶解液を全量1.5 mlチューブに回収し、氷上にて超音波破砕する(on time 15 sec, Amp 30%)。4,800×g、5 min、4°Cで遠心し、上清を回収した。回収した上清を粗酵素抽出物とし、試験に供するまで-80°Cで保存した。
粗酵素抽出物のIAP活性を、PierceTM PNPP Substrate Kit(37620,Thermo Fisher Scientific)にて測定した。1% Triton-X、1 mM PMSF、10 mM TBS(pH 7.3)で検量線用に段階希釈したBacterial alkaline phosphatase(BAP,Takara)、または10倍希釈したサンプルを、96-well plateに10 μl/wellで添加した。PNPP substrate solutionを90 μl/wellで添加し、プレートシェイカーにて撹拌した後、暗所にて室温で30分間静置する。静置後、2N NaOHを50 μl/wellで添加して反応を停止し、Varioskan Flash(Thermo Fisher Scientific)にて405 nm吸光度を測定した。BAPの測定結果から作出した検量線を用いて、IAP活性(U/ml)を算出した。
粗酵素抽出物のタンパク質濃度を、PierceTM BCA Protein Assay Kit(23225,Thermo Fisher Scientific)にて測定した。IAP活性(U/ml)をタンパク質濃度(mg/ml)にて補正し、補正値をIAP活性(U/mg protein)とした。
同じ濃度のSM添加群との群間比較はDunnett‘s testにて実施した。有意水準はP=0.05とした(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。
Lactobacillus delbrueckii 2菌株、Lactobacillus johnsonii 11菌株、Streptococcus thermophilus 22菌株による培養物を5 mg/mlで添加したCaco-2細胞のIAP活性を図3に示した。その結果、Streptococcus thermophilusは22菌株中10菌株の培養物が、Lactobacillus delbrueckiiとLactobacillus johnsoniiは試験に供したすべての菌株の培養物が、SM添加群と比較して有意にIAP活性を亢進させた。すなわち、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus johnsonii 、Streptococcus thermophilusの脱脂乳培養物はIAP活性化能を有することが示された。
本発明によれば、ラクトバチルス(Lactobacillus)属またはストレプトコッカス(Streptococcus)属に属する菌の培養物を有効成分とするIAP活性化用組成物を提供することができる。
[寄託生物材料への言及]
(1)Lactobacillus johnsonii SBT0305
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03628
(2)Lactobacillus johnsonii SBT0309
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03629
(3)Lactobacillus delbrueckii SBT0803
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03630
(4)Streptococcus thermophilus SBT1016
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03631
(5)Lactobacillus johnsonii SBT2082
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03632
(1)Lactobacillus johnsonii SBT0305
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03628
(2)Lactobacillus johnsonii SBT0309
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03629
(3)Lactobacillus delbrueckii SBT0803
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03630
(4)Streptococcus thermophilus SBT1016
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03631
(5)Lactobacillus johnsonii SBT2082
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8(郵便番号292-0818)
ロ イの寄託機関が生物材料を受領した日付
令和4年3月23日(受領日)
ハ イの寄託機関が寄託について付した受領番号
NITE AP-03632
Claims (5)
- ラクトバチルス(Lactobacillus)属またはストレプトコッカス(Streptococcus)属に属する菌体およびその培養物を有効成分とするIAP活性化用組成物。
- Lactobacillus属またはStreptococcus属に属する菌が、ラクトバチルス ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス デルブリッキー(Lactobacillus delbrueckii)及びストレプトコッカス サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)から成る群から選択される少なくとも1つであることを特徴とする請求項1に記載のIAP活性化用組成物。
- Lactobacillus属またはStreptococcus属に属する菌が、Lactobacillus johnsonii SBT0305(NITE P-03628)、Lactobacillus johnsonii SBT0307(NITE P-02982)、Lactobacillus johnsonii SBT0309(NITE P-03629)、Lactobacillus johnsonii SBT2082(NITE P-03632)、Lactobacillus delbrueckii SBT0803(NITE P-03630)及びStreptococcus thermophilus SBT1016(NITE P-03631)から成る群から選択される少なくとも1つであることを特徴とする請求項2に記載のIAP活性化用組成物。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載のIAP活性化用組成物を含む、IAP活性化用飼料組成物、IAP活性化用医薬組成物、又はIAP活性化用食品組成物。
- 新規乳酸菌Lactobacillus johnsonii SBT0305(NITE P-03628)、Lactobacillus johnsonii SBT0309(NITE P-03629)、Lactobacillus delbrueckii SBT0803(NITE P-03630)、Streptococcus thermophilus SBT1016(NITE P-03631)、及びLactobacillus johnsonii SBT2082(NITE P-03632)。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022052771A JP2023145882A (ja) | 2022-03-29 | 2022-03-29 | Iap活性化用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022052771A JP2023145882A (ja) | 2022-03-29 | 2022-03-29 | Iap活性化用組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023145882A true JP2023145882A (ja) | 2023-10-12 |
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ID=88286387
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022052771A Pending JP2023145882A (ja) | 2022-03-29 | 2022-03-29 | Iap活性化用組成物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2023145882A (ja) |
-
2022
- 2022-03-29 JP JP2022052771A patent/JP2023145882A/ja active Pending
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