MX2014005205A - Medios y metodos para incrementar la viabilidad de bacterias en forma de barra. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al uso de peptona para controlar el volumen y/o la relación longitud a diámetro de células en cultivo, en donde las células son células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra.

Description

MEDIOS Y MÉTODOS PARA INCREMENTAR LA VIABILIDAD DE BACTERIAS EN FORMA DE BARRA Descripción de la invención Esta invención se refiere al uso de peptona para controlar el volumen diagonal o la relación longitud a diámetro de células en cultivo, en donde dichas células son células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra.

En esta descripción, se cita un número de documentos que incluyen solicitudes de patente y manuales de fabricantes. La descripción de estos documentos, aunque no se considera relevante para la patentabilidad de esta invención, se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Más específicamente, todos los documentos de referencia se incorporan por referencia al mismo grado que si cada documento individual estuviera específica e individualmente indicado como incorporado por referencia.

Las bacterias de ácido láctico (LAB) son microorganismos industriales importantes y han sido usados como cultivos de partida para la fabricación de productos lácteos tales como, por ejemplo, queso, yogurt o kéfir desde hace mucho tiempo. En las últimas décadas cantidades cada vez más altas de ALB se aplican como suplementos probióticos en alimentos funcionales y nutrición animal. Entre las LAB usadas el género Lactobacillus (Lb. ) es de gran importancia. Para cultivos de partida así como probióticos, un gran reto para los fabricantes es mantener vitalidad y viabilidad de los organismos. Una alta viabilidad de probióticos es de gran interés, toda vez que la cantidad declarada de microorganismos vivos al final de la vida útil del alimento probiótico o farmacéutico es un criterio de calidad principal. Dada la definición ampliamente aceptable para probióticos de la FAO/WHO (Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Joint FAO/WHO Working Group. Report on Drafting Guidelines for Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canadá (2002)), de que los probióticos son "microorganismos vivos que cuando son administrados en cantidades adecuadas confieren un beneficio de salud al anfitrión", los fabricantes que intentan producir cultivos que sean tan robustos como sea posible para soportar las condiciones durante las diferentes etapas de procesamiento, el almacenamiento y el paso a través del tracto gastrointestinal después del consumo.

El término pleomorfismo proviene del griego pleion = más, morphe = figura y se refiere en bacteriología a formas de crecimiento de células. Se puede definir como variación de tamaño y/o forma y una célula bacteriana.

Este fenómeno es bien examinado en el campo de la patogenicidad de microorganismos en microbiología médica. Véase Justice et al. (2008) (Morphological plasticity as a bacterial survival strategy; Nat Rev Microbiol, 6, 1 62- 168). Por ejemplo, se sabe que la filamentación favorece la entrada y salida transitorias de células epiteliales y de esta manera incrementa la infertilidad de muchas bacterias patógenas tal como en Escherichia coli uropatógena; véase Mulvey et al. (1998) (Induction and evasión of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science, 282, 1494-1497); y Justice et al. (2004) (Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis; Proc Nati Acad Sci E.U.A, 101, 1333-1338). Además, la resistencia a fagocitosis es bien estudiada en hongos pleomórficos (Rooney y Klein (2002); Linking fungal morphogenesis with virulence; Cell Microbiol, 4, 127-137) and bacteria (Chauhan et al. (2006); Mycobacterium tuberculosis cells growing in macrophages are filamentous and deficient in FtsZ rings. J Bacteriol, 188, 1856-1865).

Investigaciones de Jeener y Jeener (1952) (Cytochemical observations on Thermobacterium acidophilus R26 after inhibition of growth by desoxyribonucleosides or uracil; Arch Int Physiol, 60, 194-195) con Lactobacillus (Lb.) acidophilus R-26 revelaron que una concentración de ADN debajo de 0.25 µg/ml en el medio daba como resultado, además de efectos inhibidores de crecimiento, alargamiento de las células. Estas variaciones morfológicas fueron reversibles dentro de 3 horas después de añadir ADN o uracilo al medio. Además, debido a su necesidad única de desoxirribósicos, Lb. acidophilus R-26 se usó como organismo de ensayo para desoxirribósidos por Siedler et al. (1957) (Studies on improvements in the médium for Lactobacillus acidophilus in the assay for deoxyribonucleic acid; J Bacteriol, 73, 670-675). Reich y Soska (1973) (Thymineless death in Lactobacillus acidophilus R-26. II. Factors determining the rate of the reproductive inactivation; Folia Microbiol (Praga), 1 8 , 361 -367) describen muerte celular de Lb. acidophilus R-26 causada por falta de timina así como desoxirribósidos en el medio . Para ambos efectos una pérdida de actividad reproductiva se mantuvo responsable. También para Lb. acidophilus R-26, Soska ( 1 966) (Growth of Lactobacillus acidophilus in the absence of folie acid; J Bacteriol, 91 , 1 840- 1 847) demostró la terminación de síntesis de ADN después de transferir el cultivo en un medio que carecía de timina o desoxirribósidos . No obstante las células crecieron en longitud y el número de célul as se incrementó sólo 2 a 4 veces . Además, Soska ( 1 996) encontró que una reducción de la concentración de fosfato a un cuarentavo se traduj o en células que sólo sean un tercio a la mitad de grandes . Beck et al. ( 1 963 ) (Purification, kinetics, and repression control of bacterial trans-N-deoxyribosylase; J Biol Chem, 238 , 702-709) demostraron dependencia de crecimiento en al menos un desoxirribonucleósido exógeno para cepas de Lactobacillus Lb. leichmannii, Lb. lactis, Lb. acidophilus y Lb. delbrueckii. Condiciones de nutrición limitativas fueron asociadas con la formación de células fil amentosas y actividades incrementadas de trans-N-desoxirribosilasa (EC 2.4.2.6), una enzima que está implicada en la síntesis de ADN y encontrada en bacterias que requieren desoxirribonucleó sido s externos para crecimiento . Esta enzima se encontró sólo en las cuatro cepas pleomórficas mencionadas arriba, en comparación con los otros dos microorgani smos investi gados Lb. casei y Escherichia coli \ 5T, los cuales no formaron variantes filamentosas. Los resultados se confirmaron de Sawula et al. ( 1974) para Lb. acidophilus R-26.

Deibel et al. ( 1 956) (Filament formation by Lactobacillus leichmannii when desoxyribosides replace vitamin B 12 in the growth médium; J Bacteriol, 71 , 255-256) reportaron que células de Lb. leichmannii 313, crecieron en un medio con una concentración de vitamina B 12 de 0.02 ng/ml así como con una concentración de timidina de 0.5 mg/ml, tuvieron una morfología celular tipo filamentoso. A concentraciones de 0.5 ng/ml para vitamina B 12 y 5.0 mg/ml para timidina, las células propagadas formaron barras normales. Los autores discutieron que ambos componentes probablemente juegan un papel importante en división celular. Resultados similares se encontraron por Kusaka y Kitahara ( 1962) (Effect of several vitamins on the cell división and the growth of Lactobacillus delbrueckii; J Vitaminol (Kyoto), 8 , 1 1 5- 120) para Lb. delbrueckii No. l . Ellos observaron alargamiento celular a una concentración de vitamina B 1 2 de 0.3 ng/ml mientras que una concentración tan alta como 1 µg/ml se requirió para división celular. Esta discrepancia se considera que es la razón para un alargamiento celular anormal de Lb. delbrueckii. Dave y Shah ( 1 998) (Ingredient supplementation effects on viability of probiotic bacteria in yogurt. J Dairy Sci, 8 1 , 2804-28 16) describen una investigación sobre los efectos de L-cisteína, suero en polvo, concentrado de proteína de suero, hidrolizado de caseína ácida y triptona en la viabilidad de bacterias probióticas en yogurt.

Webb (1949a) (The Influence of Magnesium on Cell División: The Effect of Magnesium on the Growth and Cell División of Various Bacterial Species in Complex Media; J Gen Microbiol, 3, 410-417) y Webb (1949b) (The influence of magnesium on cell división; the effect of magnesium on the growth of bacteria in simple chemically defined media; J Gen Microbiol, 3, 418-424) investigaron el fenómeno del pleomorfismo causado por deficiencia en magnesio para ciertas especies de Clostridium y Bacillus. En estos estudios, la inhibición de la división celular causada por deficiencia de magnesio presuntamente indujo la filamentación de las bacterias normalmente en forma de barra. Wright y Klaenhammer (1981) (Calcium-Induced Alteration of Cellular Morphology Affecting the Resistance of Lactobacillus acidophilus to Freezing; Appl Environ Microbiol, 41, 807-815) demostraron que la suplementación con calcio del medio de crecimiento indujo estabilidad incrementada de concentrados de Lb. acidophilus NCFM durante congelación. Los autores observaron que caldo MRS complementado con calcio (de Man et al., (1960); A Médium for the Cultivation of Lactobacilli; J. Appl. Bact. 23,130-135) causó una transición morfológica del cultivo de barras filamentosas a baciloides, y relacionó el cambio de morfología inducido por calcio con un incremento en estabilidad. Interesantemente algunos autores demostraron más adelante (Wright y Klaenhammer (1983a); Survival of Lactobacillus bulgaricus During Freezing and Freeze-Drying After Growth in the Presence of Calcium. Journal of Food Science, 48, 773-777) que la adición de calcio en el medio de crecimiento de las dos cepas Lb. bulgaricus 1234-0 y F también indujo estabilidades incrementadas durante congelación y liofilización, pero en estos estudios la suplementación con calcio no tuvo efecto en la morfología celular o crecimiento. Sales de manganeso y magnesio no pudieron ejercer efectos protectores en estas investigaciones. En experimentos adicionales, los mismos autores investigaron la influencia de la concentración de fosfato en crecimiento, producción de ácido y morfología celular de las dos cepas Lb. bulgaricus 1243 -F y 1489 (Wright y Klaenhammer ( 1 984) ; Phosphated Milk Adversely Affects Growth, Cellular Morphology, and Fermentative Ability of Lactobacillus bulgaricus; J. Dairy Sci., 67, 44-5 1 ). Además de una inhibición de la producción de ácido y crecimiento, la morfología celular de ambas cepas cambió cuando se cultivaron en leche que contenía 2 a 3 % de fosfato o medio inhibidor de fagos comercial. Estos medios induj eron una transición a cadenas largas de células conectadas en comparación con barras cortas normales que crecen en leche no suplementada. El deficiente crecimiento observado y la alteración de la morfología celular estuvieron relacionados con la necesidad de cationes divalentes para un crecimiento y ensamble celular adecuados y concuerdan con resultados anteriores de los autores (Wright y Klaenhammer ( 1983b); Influence of Calcium and Manganese on Dechaining of Lactobacillus bulgaricus; Appl Environ Microbiol, 46, 785 -792), en donde se predijo que calcio y manganeso eran necesarios para una actividad de descadenamiento adecuada de las enzimas correspondientes. Resultados similares se observaron por Kojima ( 190a) (A study on the pleomorphism of Lactobacillus bifidus; Kobe Daigaku Igakubu Kiyo, 32, 126- 147) y Kojima et al. ( 1 970b) (Necessity of calcium ion for cell división in Lactobacillus bifidus; J Bacteriol, 1 04, 1 010- 101 3), quienes enfatizan un papel indispensable de iones de calcio para división celular en Lb. bifidus. Los autores formaron la imagen de un septo inducido por calcio por medio de microscopía electrónica.

Altermann et al. (2004) (Identification and phenotypic characterization of the cell-division protein CdpA; Gene, 342, 1 89- 197) fueron capaces de suprimir el marco de lectura abierto ORF_223 en Lb. acidophilus NCFM, el cual codifica para la proteína separadora de células cdpA. Estos mutantes, en los cuales se inhibió la división celular, generaron largas cadenas de células en las cuales las células individuales eran aproximadamente dos a tres veces más grandes en términos de volumen que las células tipo silvestre. Además, esas células son menos estables contra el estrés por NaCl, osmótico y etanol que el tipo silvestre pero fueron más estables contra tratamientos con extracto de bilis. Rechinger et al. (2000) ("Early" protein synthesis of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in milk revealed by [35 S] methionine labeling and two-dimensional gel electrophoresis; Electrophoresis, 21 , 2660-2669) observaron para Lb. delbrueckii spp. bulgaricus que las bacterias cultivadas en medios complejos tales como MRS o leche descremada reconstituida tuvieron formas de barras normales mientras que el uso de un medio definido químico se traduj o en células filamentosas, indicando la falta de al menos un factor que está presente en el medio complejo . Suzuki et al. ( 1986) (Growth of Lactobacillus bulgaricus in Milk. 1 . Cell Elongation and the Role of Formic Acid in Boiled Milk; J . Dairy Sci . , 69, 3 1 1 -320) demostraron un alargamiento anormal de Lb. bulgaricus B5b cuando se cultivó en leche, la cual fue hervida durante 1 5 min a 100°C. Este procedimiento reduj o el contenido de nutrición en la leche que fue responsable de una represión de la síntesis de ARN global y por consiguiente un progreso de división celular defectuoso. Rhee y Pack ( 1980) (Effect of environmental pH on chain length of lactobacillus bulgaricus; J Bacteriol, 144, 865-868) reportaron la generación de cadena en Lb. bulgaricus NLS-4 a valores de pH alcalinos (por arriba de 7.5) en un cultivo en continuo de estado fij o. Los autores pudieron correlacionar este fenómeno con la inhibición de la síntesis de las enzimas descadenantes a valores de pH incrementados.

Aunque la técnica anterior en varios casos describe correlaciones entre la presencia o ausencia de ciertos agentes por un lado y la ocurrencia de formas pleomórficas por el otro, poco se conoce acerca de cómo la morfología celular puede ser controlada de una manera sistemática con el obj etivo de lograr productos biotecnológicos superiores tales como productos probióticos e iniciadores de fermentación. El problema técnico debaj o de la presente invención puede verse por lo tanto en la provisión de medios y métodos mejorados para cultivar microorganismos.

El problema técnico es resuelto por la materia de las reivindicaciones anexas.

En un primer aspecto, esta invención se refiere al uso de peptona para controlar el volumen y/o la relación longitud a diámetro de células en cultivo, en donde dichas células son células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra.

El término "peptona" tiene el significado establecido en la técnica. Se refiere a una mezcla de péptidos y aminoácidos que pueden obtenerse por degradación a partir de proteínas animales o vegetales como material de partida. La degradación que da origen a péptidos y aminoácidos puede llevarse a cabo por hidrólisis química, por ej emplo, causada por ácidos y/o por digestión enzimática, de preferencia con pepsina. La pepsina se presenta en varias isoformas, pepsina A, pepsina B y pepsina C siendo las prominentes. Los números de la comisión enzimática (EC) correspondientes son 3.4.23. 1 , 3.4.23.2 y 3.4.23.3. Si no se especifica lo contrario, "pepsina" se refiere a pepsina A. La pepsina disponible comercialmente usualmente es pepsina A obtenida del estómago porcino. Como alternativa, la digestión enzimática puede llevarse a cabo con pepsina u otras endopeptidasas. Las peptonas son constituyentes típicos de medios para microorganismos tales como bacterias o levaduras. Las peptonas preferidas se describen abajo.

El término "bacterias en forma de barra" se establece en la técnica y se refiere a bacterias que comparten una morfología común. El término no debe confundirse con un criterio taxonómico. El género Bacillus es una característica representativa de las bacterias en forma de barra. Como se detallará más a continuación, una barra se puede describir en términos genéticos como sigue: un cilindro abierto con una media esfera en cada extremo de tal manera que un compartimiento convexo cerrado sea formado. Algunas veces el término "bacilos" se usa para indicar cualquier bacteria en forma de barra en cuyo caso no se debe confundir con el taxo Bacillus. Las bacterias en forma de barra deben distinguirse de las bacterias esféricas elipsoides. En el lado derecho de la figura 3 , barras de diferentes longitudes pueden ser vistas. Barras más largas algunas veces también son denominadas formas filamentosas, mientras que barras cortas algunas veces también son denominadas formas baciloides.

La estructura en forma de barra estable se origina a partir de la presencia de una pared celular que es más rígida que la membrana celular. La pared celular está principalmente hecha de peptidoglicanos que dan origen a una estructura que es más rígida que la bicapa lípida de la membrana celular. Entre la pared celular sobre el exterior y la membrana celular en el interior, hay un lumen conocido también como espacio periplásmico.

El tamaño de una bacteria en forma de barra puede definirse en términos de su volumen. La instrumentación para determinar volúmenes celulares está a disposición de la persona experta y se describe en los ej emplos. Los términos "volumen" y "volumen celular" se usan indistintamente.

Dada la definición de una barra en términos geométricos como la proporcionada arriba, es aparente que un solo parámetro puede usarse para definir la forma general de una barra determinada. Este parámetro es la relación longitud a diámetro abreviada como "relación L/D". Medios para determinar la longitud a diámetro se describen a continuación. En particular, en una primera etapa el volumen de las células en cuestión es determinado, y en una segunda etapa la relación L/D se calcula a partir del mismo.

En el curso de calcular la relación L/D, una opción es asumir un diámetro celular particular. En caso de las Lactobacillacaea, en particular en caso de Lactobacillus acidophilus, pero no confinada a ésta, un valor de 1 µ?? es un buen estimado del diámetro celular D . En el caso de bacterias en forma de barra, se entiende que el diámetro D se refiere al diámetro de la parte cilindrica de la barra. Los inventores observaron además que, dependiendo del medio de cultivo usado, el volumen de célula promedio varía. Para una buena aproximación, la variación del volumen celular se origina a partir de una variación de la longitud de barra pero no del diámetro de la barra. El volumen celular promedio, como una función de radio r y longitud h de la parte cilindrica de la barra se define como 2 3 sigue: V = V = p r h + 4/3 p r . Suponiendo, como se indicó arriba, que D sea 1 µ?? y el radio r = 0.5 µ??, se concluye que h puede determinarse a partir del volumen celular V. Ya que la longitud total de la barra L = h + 2r (dos medias esferas en los extremos de la parte cilindrica de la barra), y que el diámetro D = 2r = 1 µ??, se concluye que la relación L/D puede determinarse y usarse como un parámetro que caracterice la morfología de las bacterias en forma de barra de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con la invención, las bacterias en forma de barra se definen además como siendo ya sea bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra. Como se mencionó en la presente arriba, los probióticos son microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio de salud en el anfitrión. Los taxos preferidos que caen dentro de dicha definición se detallan aquí abajo . Como es aparente a partir de la definición de probióticos, es importante que las bacterias probióticas, cuando sean suministradas al anfitrión y cuando lleguen a su destino, estén vivas.

El término "bacterias de fermentación" en forma de barra se refiere a cualquier bacteria en forma de barra capaz de fermentación. El término "fermentación" según se usa aquí tiene el significado usual como el establecido en la técnica y se refiere al proceso bioquímico de oxidación de compuestos orgánicos, extrayendo así energía tal como en forma de ATP. En el curso de oxidación como parte de procesos de fermentación, se usa en un receptor de electrones endógeno . El segundo aspecto distingue la fermentación de la respiración. De preferencia, dichas bacterias de fermentación en forma de barra son bacterias en forma de barra como se usan en procesos de producción biotecnológicos. Estos procesos de producción biotecnológicos incluyen la producción de bebidas, alimentos para el consumo humano o animal, suplementos dietarios, productos alimenticios y medicinales funcionales. Los taxos preferidos que caen dentro de las definiciones anteriores se proporcionan abajo.

La presente invención completamente es aplicable además a bacterias en forma de barra usadas como agentes de biocontrol, en particular como bioplaguicidas y bioconservadores. El término "agente de biocontrol" se refiere a microorganismos - a diferencia de químicos - que se pueden usar para controlar otros microorganismos. Los bacilales son conocidos como agentes de biocontrol. Ej emplos de bioplaguicidas incluyen Bacillus thuringiensis ssp. aizawai. Ejemplos de bioconservadores incluyen Lactobacillus plantarum .

Un grupo más de células obj etivo que pertenecen a las bacterias de fermentación son células de bacterias en forma de barra como las comprendidas en iniciadores de fermentación, algunas veces también llamadas "cultivos iniciadores". Como se conoce en la técnica, los iniciadores de fermentación son preparaciones que asisten en el comienzo del proceso de fermentación en la preparación de varios alimentos y bebidas fermentados. Bacterias y/o levaduras están comprendidas en iniciadores de fermentación típicos. Las bacterias preferidas como las comprendidas en dichos iniciadores de fermentación se definen en términos de los taxos indicados aquí abajo.

El término "cultivo", cuando se usa como parte del término "cultivo de partida" que tiene un significado especial que ya se refiere a una composición que comprende una o más especies de microorganismos que son adecuados para iniciar la fermentación. De otra manera, y hablando generalmente, el término "cultivo" tiene un significado como el establecido en la técnica y se refiere por un lado a un método para multiplicar organismos microbianos al dej arlos reproducir en medios de cultivo predeterminados bajo condiciones de laboratorio y/o producción controlados, como por el otro lado a la composición de materia en donde se presenta actualmente el cultivo, dicha composición de materia comprendiendo medio de cultivo y microorganismos. El término "cultivo" según se usa en la presente se refiere al cultivo en cualquier escala, contenido o mantenido en cualquier recipiente o portador, y cualquier estado de materia. Por ej emplo, el cultivo puede ser cultivo líquido. "Cultivo" también se puede extender a la presencia, de preferencia a la propagación de microorganismos en composiciones obtenidas por fermentación, tales composiciones incluyendo bebidas, alimentos, suplementos dietarios y productos medicinales. En una modalidad preferida, el término "cultivo" se refiere a la etapa de cultivar en un medio de cultivo al cual se ha añadido peptona o el cual comprende peptona.

Como se indicó arriba, las peptonas son constituyentes típicos de medio de cultivo. Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que la elección de peptona es un medio de influenciar el volumen celular un parámetro morfológico específico en microorganismos específicos, el parámetro morfológico siendo la relación longitud a diámetro, y los microorganismos siendo las bacterias en forma de barra específicas mencionadas arriba. Esta "influencia" es estadísticamente significativa y se conoce también como "control" en la presente. La longitud de las barras y volumen celular se ha encontrado que dependen significativamente de la elección de la peptona comprendida en el medio de cultivo . Al reducir el volumen y/o relación L/D, altos recuentos o concentraciones de células se logran; véase, por ej emplo, los datos mostrados en la figura 1 . Además, como se describirá más abajo, reducir el volumen y/o rel ación longitud a diámetro es un medio de hacer que las bacterias en forma de barra como las definidas aquí sean más viables y resistentes a condiciones de estrés mecánico, químico o térmico que pudieran presentarse en los procesos de producción biotecnológica.

En una modalidad preferida, dicho control es reducir y dicha peptona es peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptido de origen porcino . El término "peptona de ganado de engorda" se refiere a peptona que se origina de ganado de engorda. La peptona de ganado de engorda puede obtenerse al hidrolizar o digerir proteína o tejido que contenga proteína, en particular carne de ganado de engorda. El término "ganado de engorda" se refiere a animales que son sacrificados tales como cerdo y ganado vacuno (incluyendo Bos primigenius Taurus) . La peptona de leche incluyendo peptona de caseína no se debe subsumir baj o "peptona de ganado de engorda" . El término "origen porcino" se refiere a cualquier tej ido obtenido de una fuente grasa del género Sus, de preferencia la especie Sus scrofa, muy preferibl emente Sus scrofa domestica .

Los presentes inventores encontraron sorprendentemente que, al seleccionar una peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, la morfología celular de las bacterias en forma de barra de acuerdo con la presente invención puede modificarse de tal manera que células bacterianas de volumen más pequeño y/o barras más cortas (relaciones L/D más pequeñas) se obtengan así como concentraciones celulares más altas. De preferencia, dicha peptona es un digerido péptido de tej ido porcino . Un digerido péptido es una preparación obtenida a partir del material de partida después de la adición de la enzima peptina. Con respecto a dicho material de partida, se da preferencia a tej idos, en particular carne, de ganado de engorda, en particular de origen porcino, más específicamente a tej ido estomacal de origen porcino . Al mismo tiempo, el uso de otras fuentes de proteínas o tejidos que comprenden proteínas de origen porcino es contemplado .

Aunque las peptonas se consideran principalmente como fuentes de aminoácidos y péptidos, es al mismo tiempo cierto que comprenden otros constituyentes toda vez que los tejidos completos se usan típicamente en su preparación. Con respecto a estos otros constituyentes, se dan preferencia a peptonas con una alta concentración de bloques de construcción de ácido nucleico tales como nucleótidos, nucleósidos y nucleobases así como los derivados. Como un indicador de estas altas concentraciones, la concentración de timidina y/o hipoxantina puede ser usada. Timidina e hipoxantina como tales están de preferencia presentes a altas concentraciones también. Altas concentraciones de hipoxantina son concentraciones por arriba de 50, 100, 1 50 ó 200 µg/g. Altas concentraciones de timidina son concentraciones de más de 20, 40, 60 ó 70 iglg. S e contempla usar peptonas que cumplan cualquiera de estos criterios (altas concentraciones de bloques de construcción de ácido nucleico, timidina y/o hipoxantina), peptonas que no necesariamente están confinadas a peptona de ganado de engorda o peptona de origen porcino.

En el curso de la presente invención, los inventores prepararon en parte sus propios medios usando peptonas de diferente origen y/o de diferentes fabricantes. Una peptona específica de origen porcino que actúo de una manera particularmente sorprendente es Bacto™ Proteosa Peptona No. 3 , disponible de Becton Dickinson, la cual se ha conocido previamente como Difco™ Proteosa Peptona No. 3. A pesar del cambio de nombre, el método de fabricación de dicha peptona no ha sido cambiado. Información adicional sobre Bacto™ Proteosa Peptona No. 3 puede encontrarse, por ej emplo, en la tercera edición del manual técnico de BD Bionutrients™ (octubre 2006); véase en particular las tablas en las páginas 9, 42 y 43 del mismo. B acto™ Proteosa Peptona No. 3 es una peptona particularmente preferida de origen porcino para todos los aspectos de esta invención. B acto™ Proteosa Peptona No. 3 es algunas veces brevemente denominada Proteosa Peptona No. 3 o Peptone No. 3 en la presente.

En una modalidad preferida más, el volumen promedio de dichas células en la presencia de la peptona es debajo de 3 µ??3, de preferencia entre 2 y 3 µ??3, más preferiblemente entre 1 .4 y 2 µ??3, y muy preferiblemente entre 1 . 1 y 1 .4 µ??3, volúmenes de células que se prefieren más incluyendo 1 .0, 1 .2, 1 .3 y 1 .5 µ??3 y la relación longitud a diámetro promedio está debajo de 5 , de preferencia debajo de 4 o debaj o de 3 o debaj o de 2.5, muy preferiblemente debajo de 2.2 o debajo de 2.1 o debajo de 2.0, y más preferiblemente debajo de 1 .8. La figura 1 muestra el volumen celular promedio ("volumen celular medio") así como el recuento celular por mi para una variedad de diferentes condiciones de cultivo. La figura 3 muestra distribuciones de volumen celular determinado para cultivo en diferentes medios.

En una modalidad preferida, la relación longitud a diámetro promedio es al menos 1 . 1 , 1 .2, 1 .3 , 1 .4 ó 1 .5. En cualquier caso, un valor por arriba de 1 .0 está implicado por el término "en forma de barra" término que requiere que una estructura cilindrica esté presente; véase arriba.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptido de origen porcino, para incrementar viabilidad, estabilidad, vida útil, replicación de ADN, formación de septo y/o división celular de células, en donde dichas células son células de bacterias prebióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra.

Esta modalidad se refiere a un descubrimiento sorprendente adicional de los presentes inventores, en particular que medios específicos que permiten controlar el volumen celular o la relación longitud a diámetro, llámese la peptona de acuerdo con la invención, proporcionan además incremento de la calidad de un cultivo de células así como de composiciones o preparaciones que comprenden dichas células u obtenidos de las mismas. Parámetros de calidad de acuerdo con la presente invención son viabilidad, vitalidad, estabilidad, vida útil, replicación de ADN, formación de septo y división celular.

El término "viabilidad" de células indica su estado como vivas. Ese estado puede expresarse por supervivencia, crecimiento y multiplicación de células y en muchos aspectos es verificable por una capacidad de cultivo positiva. El término "vitalidad" de células indica su estado de tener una actividad metabólica designada. El término "estabilidad" según se usa en la presente se refiere a la capacidad de mantener viabilidad durante cierto periodo de tiempo o después de procesamiento, el procesamiento incluye extrusión, liofilización, congelación, secado y almacenamiento.

La "vida útil" es un parámetro frecuentemente usado para caracterizar productos comercialmente disponibles. En el presente caso, el término se usa para designar el periodo de tiempo hasta el cual un cultivo probiótico o una preparación obtenida del mismo es capaz de conferir el beneficio de salud mencionado arriba al anfitrión, o, en la medida en que se haga referencia a bacterias de fermentación, a la capacidad de éstas últimas para llevar a cabo el proceso de fermentación deseado. Los últimos tres parámetros de calidad (replicación de ADN, formación de septo y división celular) pueden verse como indicadores microscópicos o bioquímicos de viabilidad. El término "septo" se refiere al límite que se forma entre células en división durante el euros de la división celular. Uno o más de los parámetros de calidad mencionados arriba pueden mejorarse cuando se use la peptona específica de acuerdo con la presente invención.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para seleccionar un medio de cultivo de células, medio que incrementa la viabilidad de células o estabilidad o vida útil de una preparación que comprende células cultivadas en dicho medio, en donde las células son células de bacterias Gram-positivas en forma de barra, de preferencia bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra, dicho método comprende determinar el volumen promedio y/o la relación longitud a diámetro promedio de las células en cultivo, en donde bajos volúmenes promedio o baj as relaciones longitud a diámetro promedio son indicadoras de un medio adecuado, los valores promedio preferidos y las relaciones longitud a diámetro promedio siendo como las definidas en la presente arrib a.

El término "Gram-positivas" está bien establecido en la técnica. S e refiere a la capacidad de ciertas bacterias, en particular bacterias Gram-positivas, para conservar tinción violeta de cri stal después de la decoloración con etanol . Esta capacidad no se presenta en bacterias Gram-negativas. La capacidad de l as bacterias Gram-positivas para conservar la tinción violeta cristal se atribuye a la presencia de una pared celular gruesa rica en peptidoglucano s. Bacillales, Lactobacillales y Bifidobacteriales son todas bacterias Gram-positivas .

Este aspecto de la invención se refiere a un método de análisis que permite la identificación de medios de cultivo de células adecuados. Aunque los aspecto s anteriores se refieren a bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra, y además están confinados a peptonas como agentes de control, el método para seleccionar un medio de cultivo de células de acuerdo con la invención no está confinado a un agente específico tal como una peptona. Como una consecuencia, es aplicable a bacterias Gram-positivas en forma de barra en general . Este aspecto particular de la invención se origina a partir del sorprendente descubrimiento de que reducir el volumen celular promedio y/o la relación longitud a diámetro promedio en un cultivo de bacterias Gram-po sitivas en forma de barra es un medio para incrementar viabilidad, estabilidad y/o vida útil .

En una modalidad preferida, la fuente de aminoácidos y/o péptidos en dicho medio es mediada en el curso del método para seleccionar un medio de cultivo de células. En particular, se contempla comparar digeridos enzimáticos tales como digeridos pépticos de fuentes de proteínas y animales, en particular carne de animales incluyendo carne de ganado de engorda.

La presente invención, en un aspecto más, se refiere a un método para establecer un volumen promedio y/o relación longitud a diámetro promedio de células en cultivo, en donde las células son células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra, volumen promedio que está debajo de 3 µp?3, de preferencia entre 2 y 3 µ??3, más preferiblemente entre 1 .4 y 2 µp?3, y muy preferiblemente entre 1 . 1 y 1 .4 µ??3, y relación longitud a diámetro promedio que está debajo de 5, de preferencia debajo de 4 o debaj o de 3 o debaj o de 2.5 , muy preferiblemente debajo de 2.2 o debajo de 2.1 o debajo de 2.0, y más preferiblemente debajo de 1 .8 , y método que comprende cultivar las células en presencia de peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptico de origen porcino.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para cultivar las células en presencia de peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptido de origen porcino durante cierto periodo de tiempo. El tiempo de cultivo preferible procede hasta que se alcance una concentración máxima de células viables y un mínimo de células . La etapa preferida del cultivo es la ll amada fase de crecimiento estacionaria, en donde esa fase se alcanza entre 10 y 48 horas, preferiblemente entre 1 2 y 24 h, más preferiblemente entre 1 4 y 22 h y muy preferiblemente entre 1 6 y 20 h.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para incrementar la viabilidad, estabilidad, vida útil, replicación de ADN, formación de septo y/o división celular de células, en donde las células son células de bacterias probióticas en forma de barra o bacteri as de fermentación en forma de barra, en donde el método comprende cultivar las células en presencia de peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptico de origen porcino .

En una modalidad preferida de los usos y métodos descritos aquí, l a bacteria probiótica o bacteria de fermentación se seleccionan de Lactobacillales en forma de barra y Bifidobacteriales en forma de barra, de preferencia Lactobacillaceae en forma de barra y Bifidobacteriaceae en forma de barra, muy preferibl emente Lactobacillus y Bifidobacterium . Taxos preferido s adicionales son Bacillales en forma de barra, de preferencia Bacillaceae en forma de barra, un género preferido siendo Bacillus; y Clostridiales en forma de barra, de preferencia Clostridium .

Preferiblemente, el Lactobacillus se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus salivarius.

En una modalidad que se prefiere más, (a) Lactobacillus acidophilus es Lactobacillus acidophilus o Lactobacillus acidophilus NCFM; (b) Lactobacillus casei es Lactobacillus casei subsp. rhamnosus (ATCC 7469); (c) Lactobacillus delbrueckii es Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis o Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus; (d) Lactobacillus johnsonii es Lactobacillus johnsonii La l ; (e) Lactobacillus rhamnosus es Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53 1 03 ); o (f) Lactobacillus salivarius es Lactobacillus salivarius subsp. salivarius.

Especies preferidas adicionales y cepas del género Lactobacillus ("L.") y Bifidobacterium ("B .") son L. acidophilus R0052 (Lallemand), L. casei shirota (Yakult), L. casei immunitas (DN 1 14001 ) (Danone), L. paracasei CRL43 1 (Chr. Hansen), L. paracasei ST 1 1 (Nestle), L. paracasei LP33 (GenMont Biotech), L. paracasei F 1 9 (Medipharm), L. plantarum 299V (Probi AB/Lallemand), L. gasseri (Merck/Seven Seas), L. reuteri SD21 1 2 (Biogaia), L. rhamnosus LGG (Valió), L. rhamnosus GR- 1 (Urex Biotech), L. rhamnosus 271 (Probi AB), L. salivarius UCC 1 1 8 (Universidad de Cork), L. helveticus CPN4 (Calpis, Japan), L. helveticus (LKB 16H) (Valió), Lactococcus lactis L I A (Essum AB), B. lactis (DN 1 73 01 0) (Danone), B. lactis Bb- 12 (Chr. Hansen), B. longum BB-536 (Morinaga), B. longum Rosell 1 52 (Lallemand), B. longum SBT-2928 (Snow Brand Milk Prod., Japón), cepa de B. breve (Yakult), B. lactis HN019 (Howaru, Danisco).

Se prefieren particularmente Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus rhamnosus GG y Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis.

En una modalidad preferida más, la peptona está comprendida en medio de cultivo tal como medio MRS, de preferencia BD Difco™ caldo de lactobacilos MRS, o medio GEM. El medio MRS se conoce en la técnica y ha sido descrito en la publicación por Man et al. (1960) (de Man, J.D., Rogosa M. and Sharpe M. E. (1960). A Médium for the Cultivation of Lactobacilli. J. Appl. Bact. 23, 130-135). Varios medios MRS han sido probados por los inventores y son medios MRS que difieren unos de otros con respecto a la peptona comprendida. Un medio MRS que se prefiere, designado en la presente "MRSD" es un medio MRS que comprende Proteosa Peptona No. 3 que contribuye al rendimiento particularmente bueno de medio MRSD. Los constituyentes del medio MRSD se proporcionan en el ejemplo 1 en la presente abajo. En una modalidad preferida alternativa, GEM (medio comestible general) como el descrito en Saarela et al. (2004) (Stationary-phase acid and heat treatments for improvement of the viability of probiotic lactobacilli and bifidobacteria; J Appl Microbiol, 96, 1205-1214) es usado. Típicamente, GEM contiene peptona de soya; véase ejemplo 1. Los demás constituyentes de GEM también se proporcionan en el ejemplo 1. De acuerdo con la invención, la peptona de soya puede ser reemplazada con cualquier otra peptona, en donde se da preferencia a peptona de origen porcino, en particular Proteosa Peptona No. 1 3.

Hablando generalmente, se prefieren concentraciones de dicha peptona en el intervalo de 5 a 50, 1 0 a 40, 12 a 30 ó 1 5 a 25 g/1.

En una modalidad que se prefiere más, (a) el medio MRS comprende 5 a 20 g/1, preferiblemente aproximadamente 1 0 g/1 de la peptona; o (b) el medio GEM comprende 10 a 50 g/1, preferiblemente 20 a 40 g/1, más preferiblemente aproximadamente 30 g/1 de dicha peptona. Como se indicó arriba, una peptona que se prefiere particularmente es Bacto™ Proteosa Peptona No.3.

En la medida en que se emplee medio GEM, se prefiere que dicho medio GEM comprende además Tween 80, de preferencia a una concentración de 0.5 a 2 g/1, muy preferiblemente alrededor de 1 g/1.

En modalidades preferidas adicionales de los usos y métodos de la presente invención (a) viabilidad es viabilidad en cultivo o en una preparación; (b) estabilidad es estabilidad en una preparación; (c) vida útil es vida útil en una preparación; (d) replicación de ADN es replicación de ADN en cultivo; (e) formación de septo es formación de septo en cultivo; y (f) división celular es división celular en cultivo.

En una modalidad preferida, la preparación se selecciona de preparaciones en las que las células son encapsuladas o incrustadas en una matriz protectora, tal como extruidos o esferas, liofilizados; preparaciones congeladas y preparaciones secas.

Se conoce en la técnica que la viabilidad de las bacterias en forma de barra como las definidas en la presente arriba, en particular bacterias probióticas en forma de barra, puede incrementarse más al encapsularlas o incrustarlas en una matriz protectora. Un proceso preferido para encapsular o incrustar es extrusión. Una matriz protectora preferida es una masa. Constituyentes adicionales o alternativos de la matriz protectora pueden ser leche descremada o LyoA; véase también ej emplo 2. "LyoA" Se usa en la presente para designar una solución acuosa de gelatina ( 1 .5% (p/p)), glicerol ( 1 % (p/p)), maltodextrina, preferiblemente Glucidex l 2® (5% (p/p)) y lactosa monohidratada (5% (p/p)).

El proceso de extrusión, que da origen a extruidos, se conoce en la técnica. Hablando generalmente, un gel o una composición viscosa o tipo masa es exprimida a través de un orificio. La fabricación de pasta es un ej emplo de extrusión. De acuerdo con la presente invención, se da preferencia a extrusión con condiciones leves, también denominada "extrusión en frío". En la medida en que sea necesario, se aplica enfriamiento durante el proceso de extrusión, dicho enfriamiento sirviendo para mantener la temperatura en un intervalo de alrededor de 20°C a aproximadamente 1 5 °C. Si las bacterias en forma de barra de acuerdo con la invención se combinan con una masa, y la masa es extruida, las células bacterianas serán inmovilizadas dentro de la red, en particular la red de gluten de la masa. Este proceso de inmovilización se conoce también como encapsulación o incrustación en la presente.

De preferencia, glicerol y/o grasa de coco o aceite de coco se añaden a una composición que será extruida. Esto proporciona una mej ora adicional de la viabilidad y/o estabilidad de bacterias en forma de barra de acuerdo con la presente invención como las comprendidas en la composición que será extruida durante el proceso de extrusión y/o obtenida por el procesamiento corriente abajo del extruido obtenido. En consecuenci a, en un aspecto más, la presente invención se refiere a un proceso para extruir una composición que comprende bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra, en donde, antes de la etapa de extrusión, glicerol y/o grasa de coco o aceite de coco se añaden a la composición que comprende las bacterias. También se proporciona el uso de glicerol y/o grasa de coco o aceite de coco para incrementar viabilidad, estabilidad y/o vida útil de bacterias en forma de barra de acuerdo con la presente invención en un extruido, glicerol y/o grasa de coco o aceite de coco estando presentes en el extruido durante el proceso de extrusión.

Se pueden producir esferas por ej emplo al mezclar las bacterias en forma ya sea húmeda o seca con un material aglutinante protector, tal como por ej emplo harinas, almidones, materiales celulósicos o similares, y una cantidad suficiente de líquido para obtener particulados en forma de moronas que puedan comprimirse en gránulos y/o procesarse más, por ej emplo, en un esferonizador, dando como resultado particulados que tengan formas esféricas y que contengan las bacterias de la invención.

Los liofilizados son composiciones obtenidas por liofilización. Los medios y métodos para liofilización se conocen en la técnica y están a disposición de la persona experta; véase también los ej emplos anexos.

El término "preparaciones congeladas" se refiere a preparaciones que comprenden bacterias en forma de barra como las definidas aquí arriba y almacenadas a temperaturas debajo de 0°C, de preferencia en el intervalo de - 10 a -30°C, más preferiblemente alrededor de - 1 8 a -20°C .

De preferencia, el extruido es una masa y/o comprende harina y agua.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para preparar una preparación extruida, liofilizada o congelada, la preparación extruida, liofilizada o congelada comprende células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra, dicho método comprende (aa) el método de establecer un volumen promedio y/o relación longitud a diámetro promedio como se definió arriba o (ab) el método de incrementar viabilidad, estabilidad, vida útil, replicación de ADN, formación de septo y/o división de células como el definido arriba, y (b) una etapa de extruir, liofilizar y/o congelar, respectivamente.

En un aspecto más, la presente invención proporciona una composición que comprende o que consiste bacterias probióticas en forma de barra y/o bacterias de fermentación en forma de barra con un volumen promedio debajo de 3 µp?3, de preferencia entre 2 y 3 µp?3, más ¦a preferiblemente entre 1 .4 y 2 µ?? y todavía más preferiblemente entre 1 . 1 y 1 .4 µ?? y/o una relación longitud a diámetro promedio debajo de 5, preferiblemente debajo de 4 o debajo de 3 o debajo de 2.5 , más preferiblemente debajo de 2.2 o debajo de 2. 1 o debajo de 2.0, y más preferiblemente debajo de 1 .8.

En una modalidad preferida, la composición se selecciona de medio de cultivo, bebida, alimento para consumo humano o animal, pienso, suplemento dietario, agente de biocontrol, producto medicinal, extruido, liofilizado, preparación congelada y preparación seca.

Los medios de cultivo preferidos son aquellos descritos en la presente arriba, en particular medios MRS y GEM, en donde dicha composición de acuerdo con la presente invención, en la medida en que se refiera a medios de cultivo, comprende o consiste en medio tal como medio MRS o GEM y bacterias en forma de barra como las definidas aquí arriba.

Ej emplos de bebidas y alimentos así como suplementos dietarios incluyen yogurts, queso, leche cuaj ada y productos obtenidos de la misma y probióticos. Ejemplos adicionales son productos a base de cereal tal como cereales listos para comer incluyendo hojuelas de maíz; barras tales como barras de chocolate y muesli. Se contempla particularmente la adición de extruidos como los descritos aquí a tales preparaciones.

Agentes de biocontrol así como modalidades preferidas de los mismos (bioplaguicidas, bioconservadores) son descritos arriba.

Se proporciona además una composición que comprende o que consiste en bacterias probióticas en forma de barra y/o bacterias de fermentación en forma de barra, composición que puede obtenerse o se obtiene mediante (i) el método de establecer un volumen promedio y/o relación longitud a diámetro promedio como el definido arriba; (ii) el método de incrementar viabilidad, estabilidad, vida útil, replicación de ADN, formación de septo y/o división de células como el definido arriba; o (iii) el método de preparar un extruido, liofilizado o preparación congelada como el definido arriba.

En modalidades preferidas de los métodos o composiciones de la presente invención, las bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra que se prefieren son como las definidas más arriba.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para preparar un medio de cultivo de células, el método comprende tratar peptonas de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptico de origen porcino en presencia de un azúcar reductor tal como glucosa, fructosa galactosa, maltosa y lactosa a temperaturas de 1 02°C y 1 30°C durante al menos 1 5 minutos.

Hablando generalmente, entre más tarda la temperatura, más corto el tiempo de tratamiento necesario a una temperatura dada. En particular, el tratamiento con calor puede llevarse a cabo bajo condiciones de absorción estándares ( 121 °C, 20 min) o por cocción ( 1 00°C) del medio, en donde el tiempo de incubación es de preferencia más de l h, más de 4h, más de 6h u 8h. Una indicación de un tratamiento con calor suficiente a temperaturas debajo de 120°C puede ser la medición fotométrica de la absorbancia a una longitud de onda de 420 nm en comparación de la absorbancia con condiciones de autoclave estándares ( 120°C, 20 mn), en donde dicho valor de absorbancia está de preferencia por arriba de 1 , muy preferiblemente arriba de 2 y más preferiblemente arriba de 2.9.

El inventor encontró sorprendentemente que tratar peptona y un azúcar reductor juntos por calentamiento es particularmente benéfico en términos de cultivo de acuerdo con la presente invención; véase también ej emplo 6.

Sin desear ser limitados por una teoría específica, se considera que este descubrimiento puede correlacionarse directa o indirectamente con la generación de reactivos benéficos durante tratamiento con calor, tal como la generación de productos de reacción de Maillard.

La reacción de Maillard se clasifica como pardeamiento no enzimático, una reacción química entre un aminoácido, péptido o proteína y un azúcar reductor que se condensan y progresan para crear una red altamente compleja de productos de reacción parcialmente desconocidos que se conocen colectivamente como productos de reacción de Maillard. La reacción de Maillard es influenciada por muchos factores tales como temperatura, tiempo, pH, actividad de agua y fuente y concentración de reactivos (por ej emplo, Wij ewickreme, A. N. and Kitts, D. D. ( 1 997) Influence of Reaction Conditions on the Oxidative Behavior of Model Maillard Reaction Products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 4571 -4576). La actividad antioxidante de los productos de reacción de Maillard derivados de un sistema de azúcar-proteína calentado está bien estudiado (por ej emplo, Jing, H. y Kitts, D . D . (2002) Chemical and biochemical properties of casein-sugar Maillard reaction products. Food Chem Toxicol, 40, 1007- 1 01 5 ; Yeboah, F. K., Alli, I. and Yaylayan, V. A. ( 1999) Reactivities of D-glucose and D-fructose during glycation of bovine serum albumin. J Agrie Food Chem, 47, 3 164-3 1 72), y tienen una influencia potencial en el comportamiento de crecimiento.

Los productos de reacción de Maillard podrían mejorar la calidad del medio de cultivo por la generación de una actividad de ruptura de ADN (Hiramoto, K. , Kido, K. y Kikugawa, K. ( 1994) DNA Breaking by Maillard Products of Glucose-Amino Acid Mixtures Formed in an Aqueous System. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42, 689-694). Esta actividad de ruptura de ADN podría actuar en componentes del medio y mejorar el suministro de las bacterias con productos de corte de ADN, nucleótidos y derivados de los mismos, los cuales se generan durante el calentamiento del medio y/o después del calentamiento, durante crecimiento en dicho medio. Rogers et al. (Rogers, D., King, T. E. y Cheldelin, V. H. ( 1953 ) Growth stimulation of Lactobacillus gayoni by N-D-glucosylglycine. Proc Soc Exp Biol Med, 82, 140- 144) encontraron que la omisión de glucosa o caseína hidrolizada con ácido en el medio de crecimiento durante la esterilización con calor redujo la estimulación de crecimiento de Lactobacillus gayoni, un efecto que es similar al encontrado aquí (véase también ej emplo y) . Sin embargo, en la contribución de Rogers et al . , sólo la conducta de crecimiento, registrada como densidad óptica (OD a 600 nm) en el caldo de cultivo, se describió y no se sugiere ninguna relación de ninguna otra propiedad de célula (por ej emplo, morfología o estabilidad celular).

Las figuras muestran: Figura 1 : Concentración de células y volumen de células de Lb. acidophilus NCFM cultivado en medios de diferentes fabricantes o composiciones durante 16 horas. El número de experimentos independientes se indica entre corchetes. Las determinaciones por duplicado se indican como valor medio ± máximo y mínimo. Para determinaciones múltiples, los valores se indican como valor medio ± S .D. El sorprendente rendimiento de medios que comprenden Bacto™ Proteosa Peptona No. 3 ("GEM Bacto Peptona No . 3 " y "MRSD") es evidente. Los datos se indican en formato alemán de números decimales.

Figura 2: Valores D linearizados (D = tiempo de reducción decimal) de preparaciones de Lb. acidophilus NCFM liofilizadas como una función de la temperatura de almacenamiento. Caldo de cultivo se propagó en GEM que contenía peptona de soya y MRSD. Cada valor es la media de al menos tres tiempos de almacenamiento a la temperatura correspondiente.

Figura 3 : Distribución de volumen de células de imágenes de contraste de fases de Lb. acidophilus NCFM cultivada durante 16 horas en GEM que contiene peptona de soya (A), GME que contiene Proteosa Peptona No . 3 (B) y MRSD (C) . La concentración de células (CC) y el volumen celular medio (CV) se indican para cada cultivo. Dimensión de barra: 1 00 µ??. Volúmenes celulares promedio significativamente más pequeños (CV) así como relaciones L/D más pequeñas se observan con medios GEM que comprenden Proteosa Peptona No. 3 y MRSD.

Figura 4 : Pérdida de viabilidad de preparaciones de Lb. acidophilus NCFM liofilizadas después de almacenamiento a 37°C . El contenido de humedad residual medio para todas las muestras después de la liofilización fue 3.3 % ± 0.2%. El desplazamiento de peso promediado fue para las muestras almacenadas a una humedad relativa de 1 1 .3 % (A) + 0.9 ± 0.3% (p/p) y para muestras almacenadas de una manera seca y hermética a gas (B) + 0.3 ± 0. 1 % (p/p).

Figura 5: Muerte bacteriana de Lb. acidophilus NCFM durante procesos de extrusión repetidos. Las determinaciones se hicieron por triplicado y se indica como valor medio ± S.D .

Figura 6 : Concentración celular total y volumen celular medio de Lb. acidophilus cultivado durante 1 8 horas en diferentes medios MRS(D) calentados. Además, el grado de pardeamiento de los medios aplicados se indica como extinción (o absorbancia) a 420 nm. Se ilustra que un tratamiento con calor incluso de 20 min a 121 °C u 8 horas a 1 00°C es necesario para alcanzar el efecto estimulador completo (pequeños volúmenes celulares y alta concentración celular). Este efecto estimulador se correlaciona con el pardeamiento resultante del medio, causados probablemente por productos de reacción de Maillard.

Figu ra 7: Concentración celular total y volumen celular medio de Lb. acidophilus cultivado durante 1 8 horas en medios MRS(D), en donde los componentes seleccionados fueron sometidos a autoclave por separado del medio global y suplementados posteriormente. Además, las capacidades antioxidantes y el pardeamiento de los medios aplicados son indicados. Parece de los datos que el medio completo tiene que ser tratado con calor en presencia de glucosa y Peptona No . 3 para alcanzar el efecto estimulador completo (pequeños volúmenes celulares y alta concentración celular). Los datos se indican en el formato alemán de números decimales.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no deben considerarse como siendo limitadores.

Materiales y métodos para los siguientes ejemplos : Cepas y medios Lactobacillus acidophilus NCFM se obtuvo de Danisco A/S en Copenhagen, Dinamarca. Para almacenamiento a largo plazo, las bacterias se mantuvieron como grupos de glicerol (33 % v/v) a -70°C. Medio MRS prefabricado de acuerdo con Man et al. ( 1960) (Difco™, Becton Dickenson GmbH, Heidelberg, Germany), denominado aquí MRSD, se usó para cultivo. El MRSD contenía por litro 10 g de Proteosa Peptona No.3 , 1 0 g de extracto de res, 5 g de extracto de levadura, 20 g de dextrosa, 1 g de polisorbato 80, 2 g de citrato de amonio, 5 g de acetato de sodio, 0. 1 g de sulfato de magnesio, 0.05 g de sulfato de manganeso y 2 g de fosfato dipotásico. Para experimentos individuales medios MRS prefabricados de otros fabricantes, pero con las mismas concentraciones de los ingredientes, fueron usados. Estos son indicados como MRSR (Cari Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Al emania), MRSA (Applichem GmbH, Darmstadt, Alemania) y MRS S (Scharlau Chemie S .A. , Sentmenat, España). MRSS Se investigó con 0.2% de glucosa o 0.2% de lactosa como fuente de carbono.

Además, un medio comestible general (GEM), que fue desarrollado en el VTT (Technical Research Centre of Finland) [Saarela et al. (2004)] fue usado. El GEM contenía por litro 30 g de peptona de soya (Serva Elektrophorese GmbH, Heidelberg, Alemania), 7 g de extracto de levadura (Serva), 20 g de dextrosa (Cari Roth), 0.4 g fosfato dipotásico (Cari Roth), 1 g de fosfato diácido de potasio (Cari Roth), 1 g sulfato de magnesio (Merck) y 1 g polisorbato 80 (Cari Roth). En algunos experimentos, la peptona de soya en el GEM fue reemplazada por peptonas diversas : Proteo sa Peptona No .3 (Difco™ o equivalentemente B acto™, Becton Dickenson), peptona de soya (Fluka Chemie GmbH, Ob eraching, Alemania), Soytone (Difco™, B ecton Dickenson), Triptona (Bacto™, B ecton Dickinson), Casitona (Merck KGaA, D armstadt, Alemania) . Todos los medios fueron esterilizados en botellas de 1 litro a 1 2 1 °C durante 20 minutos como composición completa.

Los medios y condiciones de cultivo como los definidos arriba han sido usados para Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei subsp . rhamnosus, Lactobacillus delbrückii subsp. lactis, Lactobacillus delbrückii subsp. bulgaricus, Lactobacillus johnsonii La l , Lactobacillus rhamnosus GG y Lactobacillus salivarius subsp . salivarius.

Condiciones de cultivo P ara la preparación de precultivos, 50 mi de MRSD se ino cularon con 2 mi de un cultivo de abastecimiento de glicerol e incub ados durante 6 horas a 37° C . Las fermentaciones de lotes principales fueron inoculadas con 1 % (v/v) de precultivo e incubadas durante 1 6 horas hasta la fase de crecimiento estacionaria en cultivos normales a menos que se indicara lo contrario . Todas las fermentaciones se hicieron a 37° C .

Preparación de muestras para liofilización Para la preparación de liofilizados, muestras fueron cosechadas, separadas por medio de centrifugación (8 min, 5,000 x g) y el sobrenadante se reemplazó por el mismo volumen de la matriz crio- y lioprotectora LyoA, que contenía (p/p) 1 .5% de gelatina, 1 % de glicerol, 5% de maltodextrina (Glucidex 12®) y 5 % lactose monohidratada [Wesenfeld (2005) (Vitalitát und Stabilitát von probiotischen Mikroorganismen nach der Gefriertrocknung (Lyophilisation); Dissertation an der Fakultát für Prozesswissenschaften der Technischen Universitát Berlín)] . Estas mezclas se hicieron alícuotas en proporciones de 1 mi en frascos de vidrio de 5 mi, y se congelaron a -70°C al menos durane 20 horas y se liofilizaron (Gamma A, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, Alemania) durante 28 horas hasta una presión mínima de 0.22 mbares con el siguiente perfil de temperaturas de anaquel : 22 h -20°C, 3 h + 10°C, 3 h +30°C.

Preparación de muestras para experimentos de encapsulamiento El encapsulamiento de bacterias se logró mediante la incorporación de un caldo de cultivo nativo en una matriz de harina de trigo duro. Para preparación de la masa, un cultivo de crecimiento de 16 horas se enfrió en agua helada debajo de 10°C, se mezcló con harina de trigo crudo en una relación de 1 a 3 (g/g) y se amasó manualmente con una mezcladora manual. De esta manera la harina fue suministrada gradualmente al recipiente, asegurándose de que se reduj era la masa moronosa homogénea.

La masa resultante se transfirió en el tanque mezclador de un extrusor de pasta de tornillo individual (PN 1 00, Haussler GmbH, Heiligkreuzthal, Alemania) y se extruyó a través de troqueles revestidos con teflón de 76 x 0.8 mm con un área de abertura de troquel total de 38.2 mm2 a un flujo de masa constante de 1 12.5 g/min. Se usó un dispositivo de corte de pasta para granulado, dando como resultado gránulos de aproximadamente 4-5 mm de largo. Todas las muestras se tomaron al menos por triplicado .

Determinación de recuento celular total y distribución de volumen celular El recuento celular y distribución de volumen celular se determinaron con el Beckman Multisizer™ 3 Coulter Counter® (Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Alemania). Datos de pulso se convirtieron en características de tamaño por el software Multisizer™ 3 versión 3.53. Además, las morfologías celulares fueron controladas por microscopía (Axioskop 40 FL, Cari Zeiss GmbH, Alemania).

Determinación de la supervivencia de células Unidades formadoras de colonias (cfu) fueron determinadas por el método de recuento en placa en MRS-agar (Applichem). Las placas fueron incubadas aeróbicamente a 37°C durante 48 -72 horas. Muestras liofilizadas fueron rehidratadas en 0.85% de solución de NaCl antes de la dilución en serie. Gránulos con bacterias encapsuladas fueron rehidratados 1 : 10 (p/p) en solución de NaCl al 0.85% precalentada (37°C). Tubos de muestra fueron sujetados en un adaptador de tubo y mezclados automáticamente durante 30 minutos a 37°C a frecuencia máxima (Vortex-Genie 2, Scientific Industries Inc. ). La solución con la masa disuelta se usó para diluciones decimales y se colocó en placas como se mencionó arriba. La pérdida de viabilidad durante almacenamiento se indicó normalmente como logaritmo de la cfu por gramo después de almacenamiento (N) dividido entre el número inicial de cfu por gramo al inicio del almacenamiento (No) . El mismo cálculo se aplicó para las muestras antes (No) y después (N) del encapsulamiento por proceso de extrusión.

Almacenamiento de preparaciones de bacterias Las tasas de supervivencia de las preparaciones de bacterias después del almacenamiento se evaluaron usando el método de prueba de vida útil acelerado (ASLT) [Achour et al. (2001 ) (Application of the accelerated shelf life testing method ASLT to study the survival rates of freeze-dried Lactococcus starter cultures; Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 76, 624-628); ing et al. ( 1998) (Accelerated storage testing of freeze-dried and controlled low-temperature vacuum dehydrated Lactobacillus acidophilus; J Gen Appl Microbiol, 44, 160- 165)], prediciendo que la relación de Arrhenius es adecuada para la caracterización de la conducta de vida útil. Por lo tanto, preparaciones liofilizadas así como granos encapsulados en masa se almacenaron en la oscuridad en frascos de vidrio seco cerrados por tapas herméticas a gases o en una atmósfera con una humedad relativa definida. En el segundo caso frascos abiertos fueron almacenados en un desecador y llenado con solución de cloruro de litio saturada (Merck), dando como resultado una humedad relativa de 1 1 .3 % [Greenspan ( 1977) (Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions; J Res Nati Bur Stand A., 81 , 89-96)] .

Valores D y z Para comparar la conducta de almacenamiento de diferentes bacterias propagadas, los valores DT (subíndice, T mayúscula) y z fueron calculados. DT es el valor D (tiempo requerido para obtener una variación logarítmica en población) para una temperatura de almacenamiento dada T [°C] después de un tiempo de almacenamiento n dado t [h] e indicado en horas . El valor z es la escala de temperatura requerida para obtener una variación de 1 0 veces en valores D indicada en grados Celsius.

Ejemplo 1 Influencia del medio de crecimiento en la morfología celular de bacterias en forma de barra Lb. acidophilus NCFM se cultivó en diferentes medios MRS prefabricados y en GEM durante 16 horas. El tiempo indicado se seleccionó para garantizar que las poblaciones alcanzaran la fase de crecimiento estacionaria y por lo tanto fenómenos como grados diferentes de generación de cadena, causados por diversas velocidades de crecimiento y división celular en la fase de crecimiento exponencial, son descartados .

Lo s resultado s se ilustran en la figura 1 , con lo cual los datos son graficados en secuencia de recuentos celulares cada vez más altos . El análisis de recuento de partículas y células reveló que diferentes medios llevan a variaciones significativas para forma y tamaño de célula y recuento celular total de Lb. acidophilus NCFM, alcanzando de 2.8 * 107 (MRSR) a 1 .0* 1 09 (MRSD) células por mi con volúmenes de células medios correspondientes de 2.61 a 1 .38 µp?3 , respectivamente (figura 1 ) . En general, el volumen celular medio se incrementa con un recuento celular cada vez más baj o .

Para investigar el impacto de la peptona en el comportamiento de crecimiento y morfología celular, Lb, acidophilus NCFM se propagó en GEM en donde la peptona de soya estándar se reemplazó por otras cinco peptonas seleccionadas, incluyendo otras dos peptonas de soya, dos peptonas de caseína y la Proteo sa P eptona No. 3 (véase arriba y figura 1 ) . En el GEM modificado la variación alcanzó de 6.9 * 1 08 células por mi para la Soytone probada de Difco™ a 8. 1 * 1 08 células por mi para la Proteosa Peptona No . 3 . Los resultados demuestran el alto impacto del que contiene peptona en recuento celular y tamaño celular. Además, es obvio que la utilización de medios, los cuales incluyen Proteosa Peptona No . 3 lleva a los recuentos celulares más alto s así como a las áreas de células medias más pequeñas .

Otras cepas y especies . Observaciones similares (sorprendente desempeño de Proteosa P eptona No . 3 , en particul ar de medio MRSD) han sido observadas para Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei subsp . rhamnosus, Lactobacillus rhamnosus GG y Lactobacillus delbrückii subsp . lactis, demostrando así que Proteosa P eptona No . 3 tiene efectos benéficos a través de una variedad de especies y cepas .

Ejemplo 2 Aplicación de una prueb a de almacenamiento acelerado para dos poblaciones morfoló gicas diversas P ara establecer una prueba de vida útil acelerada (ASLT), preparaciones liofilizadas de Lb. acidophilus NCFM se almacenaron a diferentes temperaturas (4, 20, 26, 37, 45 y 60°C) y se analizaron frecuentemente durante un periodo de tiempo de 2 días (60°C) a 520 días (4°C) . Esta serie de pruebas se llevaron a cabo para crecimiento de bacteria en GEM que comprendía peptona de soya y MRSD. El graficado de los valores Log D promedio contra las temperaturas de almacenamiento correspondientes (figura 2) llevó a coeficientes de regresión más altos que 0.99 (tabla 1 ) . Las preparaciones de células propagadas en MRSD son más estables que aquellas cultivadas en GEM . Por ej emplo, el almacenamiento a 4°C da como resultado una diferencia en el valor lgo D4°c de 1 .06, que es igual a una vida útil incrementada once veces en preparaciones hechas de cultivos de MRSD que de cultivos GEM.

Tabla 1 Modelo lineal de la conducta de almacenamiento de prep araciones liofilizadas de Lb. acidophilus NCFM propagada en diferentes medios Medio de Ecuación Coeficiente de Valor z [°C] fermentación regresión (R2) GEM Log DT = 3.471 - 0.992 1 5.9 0.049 T MRSD Log DT = 4.539- 0.997 20.4 0.063 T Además, preparaciones de cultivos de GEM tuvieron un valor z (recíproco de la pendiente de la pendiente de ecuación de regresión en la figura 2) de 15.9°C, que es 4.5 °C más baj o que aquél de las preparaciones de MRSD (tabla 2) . Esta diferencia implica que las preparaciones de los cultivos en MRSD son almacenables a una temperatura que es 4.5 °C más alta que las preparaciones de cultivos GEM que mantienen la misma vida útil .

Ej emplo 3 Influencia de la peptona en la conducta de estabilidad durante liofilización y almacenamiento Para investigar en particular la influencia de la peptona en estabilidad celular después del procesamiento, cultivos de Lb. acidophilus NCFM se propagaron durante 16 horas en el GEM que contenía peptona de soya (composición original), GEM que contenía Proteosa Peptona No. 3 en su lugar, y MRSD. Las características de los cultivos se muestran en la figura 3.

Después de la cosecha, se prepararon las muestras, se liofilizaron en proporciones de 1 mi y se almacenaron a diferentes condiciones atmosféricas a 37°C (figura 4). Las supervivencias de células después de la liofilización fueron para preparaciones propagadas en MRSD, GEM (Proteosa Peptona No. 3 ) y GEM (peptona de soya) 1 04%, 77% y 34%, respectivamente. La utilización de la Proteosa Peptona No. 3 en GEM se traduj o en un incremento de estabilidad durante el procedimiento de liofilización en comparación con GME que comprendía peptona de soya en su lugar. Esta tendencia en estabilidad también fue detectable durante el almacenamiento de las preparaciones como se ve en la figura 4 y tabla 2. Los coeficientes de regresión (R2) para las pérdidas de viabilidad graficadas en la figura 4 fueron entre 0.87 y 0.99, indicando una reducción consistente en la viabilidad bacteriana durante el almacenamiento (tabla 2) . A ambas condiciones de almacenamiento la preparación con bacterias cultivada en GEM con la Proteosa Peptona No. 3 en lugar de la peptona de soya fueron distintamente más estables con un incremento de los valores D37°c de alrededor de 40% (85 a 1 15 h y 168 a 232 h; tabla 2). Los tamaños celulares medios de las poblaciones cultivadas en GEM con peptona No. 3 y MRSD fueron aproximadamente similares (figura 3 ).

Las estabilidades de los cultivos MRSD fueron todavía más altas que para los cultivos hechos en GEM con la misma peptona. De esta manera el reemplazo de la peptona de soya con la Proteosa Peptona No. 3 en GEM dio como resultado de nuevo un incremento de la estabilidad bacteriana durante el almacenamiento de estado seco, pero este incremento de estabilidad, elucidado por los valores D37°c, no alcanzó los valores de los cultivos MRSD. Especialmente las preparaciones almacenadas bajo condiciones de condiciones de intercambio de agua mínima dieron como resultado el valor D promediado más alto de 1,048 h (figura 4B, tabla 2).

Tabla 2 Resultados de la prueba de almacenamiento acelerado para preparaciones de Lb. A cidophilus NCFM liofilizadas. Las bacterias se cultivaron durante 16 horas en los tres medios indicados y se almacenaron a 37°C como se indica. RH: humedad relativa, RM : contenido de humedad residual Medio Atmósfera de Pendiente de R RM promedio Valor D37°c almacenamiento tasa de después de promedio mortalidad liofilización [LOG(N/N0)/día [gwater/ gmuestra) M ) GEM (peptona de A RH 11.3% Y = -0.2918x 0.994 3.36% 85 soya) GEM (peptona de B Gas-tight closed Y = -0.1614x 0.978 3.48% 168 soya) GEM (peptona No. A RH 11.3% Y = -0.1982x 0.980 3.10% 115 3) GEM (peptona No. B Gas-tight closed Y = -0.1227x 0.878 3.37% 232 3) RS (peptona No. A RH 11.3% Y = -0.1583x 0.977 3.11% 161 3) MRS (peptona No. B Gas-tight closed Y = -0.0420X 0.868 3.14% 1048 3) El desplazamiento de peso promediado de las muestras almacenadas a una humedad relativa de 1 1 .3 % y una manera hermética a gases con tapas a presión fue +0.9 ± 0.3 % (p/p) y +0.3 ± 0.1 % (p/p), respectivamente. Se puede estimar que estos desplazamientos de peso son causados únicamente por absorción de agua de la matriz de muestra durante el equilibrio de vapor con la atmósfera circundante. La absorción de agua más alta en las muestras almacenadas a una humedad relativa de 1 1 .3 % dio como resultado actividades de agua incrementadas en las preparaciones y provocando un incremento en las reacciones de degradación con respecto a los límites bacterianos (figuras 4 A y B, tabla 2). Los resultados presentados indican la alta influencia de agua en respuesta a humedad relativa en la atmósfera existente para la viabilidad bacteriana durante el almacenamiento.

Ejemplo 4 Influencia de la peptona en la conducta de estabilidad durante liofilización con diferentes fórmulas protectoras En el curso de la liofilización, matrices de protección pueden ser empleadas . Una opción es la adición de 1 0% de leche descremada. Otra matriz de protección designada LyoA ha sido descrita en Wessenfeld (2005). Los efectos de 1 0% de leche descremada y LyoA en conjunto ya sea con medio MRSD o medio GEM que comprende peptona de soya han sido evaluados. Para todos los experimentos, las bacterias han sido cultivadas durante 8 horas, centrifugadas y el sobrenadante reemplazado con la matriz de protección respectiva. Los resultados experimentales se muestran en la tabla 3 abajo.

Tabla 3 nfluencia del medio de crecimiento y la matriz protectora en la tasa de supervivencia de Lb. acidophilus durante liofilizacion. Todas las muestras se cultivaron durante 8 horas, se congelaron a -70°C y se liofilizaron durante 24 Medio de Matriz Después de tasa ± SD, MD No. de crecimiento protectora de supervivencia Experimento después de independiente congelación MRSD 10% de leche 76.6% ± 16.8% 2 descremada MRSD LyoA 88.9% ± 8.3% 3 GEM LyoA 58.3% ± 15.1% 3 GEM 10% de leche 36.8% ± 27.5% 3 descremada Los resultados en la tabla 3 ilustran la estabilidad incrementada de Lb. acidophilus cuando se cultiva en un medio que contiene la Proteosa Peptona No. 3 porcina. Además el efecto del medio (y por lo tanto las características de la población celular, véanse figuras 1 y 3 ), la alta influencia de la matriz protectora es demostrada.

Ejemplo 4 Comportamiento de células con diferentes morfologías durante procesamiento de extrusión La inmovilización de Lb. acidophilus NCFM en una matriz de masa fue una etapa de procesamiento adicional para aplicación industrial . La influencia del proceso de extrusión en bacterias con diferentes tamaños fue investigada. Después de la incorporación intermitente de las bacterias en la masa, una muerte de origen prematuro de 23.4% y 65.0% (referida a la dilución inclusiva de caldo de cultivo causada por adición de harina) fue detectable para células cortas (cultivadas a 16 horas en MRSD) y alargadas (cultivadas a 1 6 h en GEM que comprendía peptona de soya), respectivamente. Para considerar el efecto de las fuerzas mecánicas durante el proceso de extrusión, los gránulos producidos se regresaron al tanque de suministro de la extrusora y se extruyeron de nuevo. Este procedimiento se repitió tres veces. Después de procesos de extrusión repetidos, para el caldo MRSD y GEM incorporados, la muerte promedio por etapa de extrusión fue 33.7% y 62.4%, respectivamente (figura 5). Los coeficientes de correlación de 0.89 (cultivo GEM encapsulado) y 0.98 (cultivo MRSD encapsulado) indican una muerte bacteriana consistente durante cada proceso de extrusión.

Ejemplo 5 Lb. acidophilus se cultivó en MRS(D) (MRS comparable con Type Difco : todos los componentes se pesan normalmente; los compuestos complej os peptona, extracto de carne y extracto de levadura son Type Difco) a 37°C durante 1 8 horas.

Después de la solubilización de los componentes MRS(D) el medio se trató con calor a 100°C durante 1 , 2, 3 , 4, 5 , 6, 7, 8 h en tubos de reacción cerrados. Como referencia medio MRS(D) se sometió a autoclave como se especificó por el fabricante del medio bajo condiciones estándares ( 121 °C, 20 min).

Todos los tubos de cultivo se pesaron vacíos y con el medio antes y después de tratamiento con calor para el cálculo de la pérdida de peso (evaporación). Como resultado, no fue detectable ningún desplazamiento de peso influyente.

El grado de pardeamiento en el medio causado por productos de reacción de Maillard se registró por la absorbancia a 420 nm (E420 nm) en un fotómetro espectral [Morales et al. , 2001 (Free radical scavenging capacity of Maillard reaction producís as related to color and flourescence. Food Chemistry, 72, 1 19- 125)] .

Como se ve en la figura 6, existe una relación lineal del tipo de cocción del medio MRS(D) y la concentración de células logrables así como con el volumen celular promedio característico . De acuerdo con estos dos parámetros, un medio MRS(D) que es cocido durante 8 h tiene la misma calidad que un medio que fue sometido a autoclave usando métodos estándares.

Ejemplo 6 Lb. acidophilus NCFM se cultivó en cuatro medios MRS(D) modificados (MRS comparable con Type Difco. Todos los componentes se pesan normalmente; los compuestos complej os peptona, extracto de carne y extracto de levadura son Type Difco). Para cada medio un componente se omitió durante la esterilización con vapor. Este componente se disolvió posteriormente en el medio global cocido a la concentración original : Medio 1 ) Glucosa fue suplementada después de someter a autoclave el medio global.

Medio 2) Peptona No. 3 fue suplementada después de someter a autoclave del medio global.

Medio 3 ) Extracto de carne se suplemento después de someter a autoclave el medio global.

Medio 4) Extracto de levadura se suplemento después de someter a autoclave el medio global.

Como referencia, un medio MRS(D) que fue cocido durante 8 h es usado. Los medios se caracterizaron además por la medición de la capacidad antioxidante (PHOTOCHEM® system, Analytik Jena AG, Alemania) y medición de la absorbancia a 420 nm. Los resultados de la capacidad antioxidante se presentan en unidades de concentración equivalentes de ácido ascórbico para sustancias solubles en agua. Como se ve en la figura 7, la omisión de glucosa a partir de MRS(D) durante el proceso de esterilización con calor tiene un efecto significativo en el crecimiento celular. La esterilización sin glucosa se traduce en medio con crecimiento deficiente y formas celulares desfavorables de Lb. acidophilus. La omisión de extracto de carne o levadura llevó al efecto estimulador completo del medio de crecimiento igual al medio en donde todos los componentes juntos fueron tratados con calor. Sin ser limitados a una teoría específica, se considera que los derivados nucleótidos están disponibles en un grado más alto en presencia de productos de reacción de Maillard.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1 . Uso de peptona para controlar el volumen y/o la relación longitud a diámetro de células en cultivo, en donde dichas células son células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el control es reducir la peptona es peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptido de origen porcino.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el volumen promedio de dichas células en presencia de la peptona es debajo de 3 µp?3, de preferencia entre 2 y 3 µ??3, más preferiblemente entre 1 .4 y 2 µp? , y muy preferiblemente 1 .1 y 1 .4 µ?? y la relación longitud a diámetro promedio está debajo de 5 , preferiblemente debaj o de 4 o debaj o de 3 o debaj o de 2.5, más preferiblemente debaj o de 2.2 o debajo de 2.1 o debajo de 2.0, y muy preferiblemente debajo de 1 .8.

4. Uso de peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptico de origen porcino, para incrementar viabilidad, estabilidad, vida útil, replicación de ADN, formación de septo y/o división celular de células, en donde las células son células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra.

5. Un método para seleccionar un medio de cultivo cuando incrementa la viabilidad de células o la estabilidad o la vida útil de una preparación que comprende células cultivadas en dicho medio, en donde las células son células de bacterias Gram-positivas en forma de barra, de preferencia bacterias probióticas en forma de barra o bacteria de fermentación en forma de barra, el método se caracteriza porque comprende determinar el volumen promedio y/o la relación longitud a diámetro promedio de las células en cultivo, en donde bajos volúmenes promedio o bajas relaciones longitud a diámetro promedio son indicadoras de un medio adecuado, los volúmenes promedio y relaciones longitud a diámetro promedio que se prefieren siendo como los definidos en la reivindicación 3.

6. Un método para establecer un volumen promedio y/o relación longitud a diámetro promedio de las células en cultivo, en donde las células son células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra, volumen promedio que está debajo de 3 µp?3, de preferencia entre 2 y 3 µ??3, más preferiblemente entre l .4 y 2 µ??3, y aún más preferiblemente entre 1 . 1 y 1 .4 µ??3 y relación longitud a diámetro promedio que está debajo de 5, preferiblemente debajo de 4 o debaj o de 3 o debaj o de 2.5 , más preferiblemente deb aj o de 2.2 o debajo de 2. 1 o debaj o de 2.0, y aún más preferiblemente debaj o de 1 .8 , y el método se caracteriza porque comprende cultivar las células en presencia de peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptido de origen porcino .

7. Un método para incrementar viabilidad, estabilidad, vida útil, replicación de ADN, formación de septo y/o división celular de células, en donde las células son célul as de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra, el método se caracteriza porque comprende cultivar las células en presencia de peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptico de origen porcino .

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las bacteri as probióticas o bacterias de fermentación se seleccionan de Lactobacillales en forma de barra, Bifidobacteriales en forma de barra, Bacillales en forma de barra y Clostridiales en forma de barra, de preferencia Lactobacillaceae en forma de barra, Bifidobacteriaceae en forma de b arra y Bacillaceae en forma de barra, más preferiblemente Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus y Clostridium .

9. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, o el método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque: (a) viabilidad es viabilidad en cultivo o en una preparación; (b) estabilidad es estabilidad en una preparación; (c) vida útil es vida útil en una preparación; (d) replicación de ADN es replicación de ADN en cultivo; (e) formación de septo es formación de septo de cultivo; y (f) división celular es división celular en cultivo.

10. El uso o método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la preparación se selecciona de preparaciones en las que las células son encapsuladas o incrustadas en una matriz protectora, tales como extruidos o esferas; liofilizados; preparaciones congeladas y preparaciones secas.

1 1 . Un método para preparar una preparación extruida, liofilizada o congelada, la preparación extruida, liofilizada o congelada comprende células de bacterias probióticas en forma de barra o bacterias de fermentación en forma de barra, el método se caracteriza porque comprende el método como el definido en la reivindicación 6 ó 7 y una etapa de extrusión, liofilización y/o congelación, respectivamente.

12. Una composición caracterizada porque comprende o consiste en bacterias probióticas en forma de barra y/o bacterias de fermentación en forma de barra con un volumen promedio debajo de 3 µp?3, 3 3 preferiblemente entre 2 y 3 µ?? , más preferiblemente entre 1 .4 y 2 µ?? , y aún más preferiblemente entre 1 . 1 y 1 .4 µ??3, y/o una relación longitud a diámetro promedio debajo de 5 , preferiblemente debajo de 4 o debajo de 3 o debaj o de 2.5, más preferiblemente debajo de 2.2 o debajo de 2.1 o debajo de 2.0, y aún más preferiblemente debajo de 1 .8.

1 3. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la composición se selecciona de medio de cultivo, bebida, alimento para consumo humano o animal, pienso, suplemento dietario, agente de biocontrol, producto medicinal, extruido, liofilizado, preparación congelada y preparación seca.

14. Una composición caracterizada porque comprende o consiste en bacterias probióticas en forma de barra y/o bacterias de fermentación en forma de barra, composición que se puede obtener o se obtiene por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 1 1 . 1 5. Un método para preparar un medio de cultivo de células, el medio se caracteriza porque comprende tratar peptona de ganado de engorda, de preferencia peptona de origen porcino, muy preferiblemente un digerido péptico de origen porcino en presencia de un azúcar reductor tal como glucosa, fructosa, galactosa, maltosa y lactosa a temperaturas entre 100°C y 1 30°C durante al menos 15 minutos.