KR20140093975A

KR20140093975A - 간상 박테리아의 생존력을 증가시키는 수단 및 방법

Info

Publication number: KR20140093975A
Application number: KR1020147015102A
Authority: KR
Inventors: 베른하드 반 렌게리흐; 마르틴 센즈; 울프 스탈; 에델트라우드 마스트-게르라흐
Original assignee: 제네랄밀즈인코포레이팃드
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2014-07-29
Also published as: CN103958664A; JP2015501635A; EP2776555A1; BR112014011198A2; WO2013068585A1; CA2854695A1; AU2012335510A1; US20140370572A1; IL232225A0; MX2014005205A

Abstract

본 발명은 배양중 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포의 부피 및/또는 길이-대-직경 비를 제어하기 위한 펩톤의 용도에 관한 것이다.

Description

간상 박테리아의 생존력을 증가시키는 수단 및 방법 {MEANS AND METHODS OF INCREASING VIABILITY OF ROD-SHAPED BACTERIA}

본 발명은 배양중 간상 프로바이오틱(rod-shaped probiotic) 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포의 부피 및/또는 길이-대-직경 비를 제어하기 위한 펩톤의 용도에 관한 것이다.

본 명세서에서, 특허 출원 및 제조업자 매뉴얼을 비롯한 다수의 문헌이 인용된다. 이들 문헌의 개시내용은, 본 발명의 특허성에 적절한 것으로 간주되지는 않지만, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 좀더 구체적으로, 모든 참고 문헌은 각 개별 문헌이 참조로 포함되는 것임을 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도까지 참조로 포함된다.

락트산 박테리아 (LAB)는 산업상 중요한 미생물이며 오랫동안부터 예를 들어 치즈, 요구르트 또는 케피어(kefir)같은 유제품의 제조를 위한 출발 배양물로서 사용되어 왔다. 지난 수십 년 점점 증가하는 양의 LAB가 기능성 식품 및 동물 영양분에 프로바이오틱 보충물로서 적용되고 있다. 사용되는 LAB 가운데 락토바실루스 (Lb.)속이 매우 중요하다. 출발 배양물 및 프로바이오틱스의 경우, 제조업자에게 있어 주된 난관은 유기체의 생명력 및 생존력을 유지시키는 것이다. 프로바이오틱스의 높은 생존력은 중요한 관심사인데, 그 이유는 프로바이오틱 식품 또는 약제의 보관 수명 말기에서의 살아있는 미생물의 표기량(declared amount)이 주요 품질 기준이기 때문이다. 프로바이오틱스란 "적정량으로 투여시 숙주에 건강상의 이익을 부여하는 살아있는 미생물"이라는 FAO/WHO의 프로바이오틱스에 대한 널리 받아들여지고 있는 정의 (문헌 [(Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Joint FAO/WHO Working Group. Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada (2002)])를 가정하면, 제조업자는 상이한 프로세싱 단계, 저장 및 소비 후 위장관을 지나 통과하는 동안의 주위조건에 견디도록 가능한 한 강건한 배양물을 생산하고자 노력한다.

용어 "다형성(pleomorphism)"은 그리스어 pleion = 보다 많은, morphe = 형상에서 기원하고, 세균학에서는 세포의 성장 형태를 언급한다. "다형성"은 박테리아 세포의 크기 및/또는 형상의 변이로서 정의될 수 있다.

당해 현상은 의학 미생물학중 미생물의 병원성 분야에서 잘 조사되어 있다; 문헌 [Justice et al. (2008) (Morphological plasticity as a bacterial survival strategy; Nat Rev Microbiol, 6, 162-168)] 참조. 예를 들어, 필라멘트화는 상피 세포의 일시적 출입을 하게 해주고 그에 따라 요로병원성 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서처럼 다수의 병원성 박테리아의 감역력을 증진시킨다고 알려져 있다; 문헌 [Mulvey et al. (1998) (Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science, 282, 1494-1497)]; 및 [Justice et al. (2004) (Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis; Proc Natl Acad Sci USA, 101, 1333-1338)] 참조. 추가로, 식세포작용에 대한 저항성이 다형성 진균 (문헌 [(Rooney and Klein (2002); Linking fungal morphogenesis with virulence; Cell Microbiol, 4, 127-137)] 및 박테리아 [문헌 (Chauhan et al . (2006); Mycobacterium tuberculosis cells growing in macrophages are filamentous and deficient in FtsZ rings. J Bacteriol, 188, 1856-1865)]에서 잘 연구되어 있다.

락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus ( Lb .) acidophilus) R-26을 가지고 행한 지너(Jeener) 및 지너 (1952) (문헌 [Cytochemical observations on Thermobacterium acidophilus R26 after inhibition of growth by desoxyribonucleosides or uracil; Arch Int Physiol, 60, 194-195])로부터의 조사에 따르면 배지중 0.25 ㎍/ml 미만의 DNA 농도는 성장 억제 효과 이외에도 세포의 신장을 초래함이 드러났다. 이들 형태학적 변이는 배지에 DNA 또는 우라실 첨가 후 3 h 안에 가역적이었다. 또한, 락토바실루스 아시도필루스 R-26은 데옥시리보시드에 대한 그의 독특한 요구성 때문에 쉬들러(Siedler) 등 (1957) (문헌 [Studies on improvements in the medium for Lactobacillus acidophilus in the assay for deoxyribonucleic acid; J Bacteriol, 73, 670-675])에 의하여 데옥시리보시드에 대한 검정 유기체로서 사용되었다. 라이히(Reich) 및 소스카(Soska) (1973) (문헌 [Thymineless death in Lactobacillus acidophilus R-26. II. Factors determining the rate of the reproductive inactivation; Folia Microbiol (Praha), 18, 361-367])는 배지중 데옥시리보시드뿐 아니라 티민의 부족에 의하여 초래된 락토바실루스 아시도필루스 R-26의 세포사를 기술하고 있다. 양쪽 효과 모두의 경우, 생식 활동의 상실에 책임이 있다. 또한 락토바실루스 아시도필루스 R-26의 경우에, 소스카 (1966) (문헌 [Growth of Lactobacillus acidophilus in the absence of folic acid; J Bacteriol, 91, 1840-1847])는 배양물을 티민 또는 데옥시리보시드가 결여된 배지에 옮긴 후 DNA 합성의 종결을 증명해 보여주었다. 그럼에도 불구하고 세포는 길이가 커졌으며 세포수는 불과 2 내지 4배 증가하였다. 부가적으로, 소스카 (1996)는 포스페이트 농도를 1/14로 감소시키는 것이 1/3 내지 1/2 정도 크기에 불과한 세포를 초래하였음을 발견하였다. 벡(Beck) 등 (1963) (문헌 [Purification, kinetics, and repression control of bacterial trans-N-deoxyribosylase; J Biol Chem, 238, 702-709])은 락토바실루스 균주 락토바실루스 레이크만니이(Lb . leichmannii), 락토바실루스 락티스(Lb . lactis), 락토바실루스 아시도필루스 및 락토바실루스 델브루에키이(Lb . delbrueckii)에 대하여 적어도 1종의 외인성 데옥시리보뉴클레오시드에 대한 성장 의존성을 증명해 보여주었다. 제한 영양 상태는 필라멘트형 세포의 형성, 및 DNA 합성에 관여하고 성장에 외부 데옥시리보뉴클레오시드를 요하는 박테리아에서 발견되는 효소인 트랜스-N-데옥시리보실라제 (EC 2.4.2.6)의 증진된 활성과 연관되어 있었다. 당해 효소는 필라멘트형 변이체를 형성하지 않은 두 종의 다른 조사된 유기체 락토바실루스 카세이(Lb . casei) 및 에스케리키아 콜라이₁₅ _T와 비교하여 전술한 4종의 다형성 균주에서만 발견되었다. 결과는 락토바실루스 아시도필루스 R-26에 대하여 소울라(Sawula) 등 (1974)으로부터 확인되었다.

데이블(Deibel) 등 (1956) (문헌 [Filament formation by Lactobacillus leichmannii when desoxyribosides replace vitamin B12 in the growth medium; J Bacteriol, 71, 255-256])은 0.5 mg/ml의 티미딘 농도와 함께 또한 0.02 ng/ml의 비타민 B₁₂ 농도를 갖는 배지에서 성장한 락토바실루스 레이크만니이 313의 세포가 필라멘트형 세포 형태를 보유하였음을 보고하였다. 비타민 B₁₂에 대하여 0.5 ng/ml및티미딘에 대하여 5.0 mg/ml의 농도에서, 증식 세포는 정상적인 간상체(rod)를 형성하였다. 저자들은 양쪽 성분 모두 십중팔구 세포 분열에서 중요한 역할을 한다고 논의하였다. 유사한 결과가 락토바실루스 델브루에키이 No.1에 대하여 구사카(Kusaka) 및 기타하라(Kitahara) (1962) (문헌 [Effect of several vitamins on the cell division and the growth of Lactobacillus delbrueckii; J Vitaminol (Kyoto), 8, 115-120])에 의하여 발견되었다. 그들은 0.3 ng/ml의 비타민 B₁₂ 농도에서 세포 신장을 관찰하였으며 반면에 세포 분열에는 1 ㎍/ml만큼 높은 농도가 요구되었다. 이러한 불일치가 락토바실루스 델브루에키이의 비정상적인 세포 신장에 대한 이유인 것으로 생각된다. 데이브(Dave) 및 샤(Shah) (1998) (문헌 [(Ingredient supplementation effects on viability of probiotic bacteria in yogurt. J Dairy Sci, 81, 2804-2816])는 요구르트중 프로바이오틱 박테리아의 생존력에 대한 L-시스테인, 유장 분말, 유장 단백질 농축물, 산 카세인 가수분해물 및 트립톤의 효과에 대한 조사를 기술하고 있다.

웹(Webb) (1949a) (문헌 [The Influence of Magnesium on Cell Division: The Effect of Magnesium on the Growth and Cell Division of Various Bacterial Species in Complex Media; J Gen Microbiol, 3, 410-417]) 및 웹 (1949b) (문헌 [The influence of magnesium on cell division; the effect of magnesium on the growth of bacteria in simple chemically defined media; J Gen Microbiol, 3, 418-424])은 클로스트리디움 및 바실루스의 특정 종에 대하여 마그네슘 결핍에 의하여 초래된 다형성의 현상을 조사하였다. 이들 연구에서, 마그네슘 결핍에 의하여 초래된 세포 분열의 억제는 정상적 간상 박테리아의 필라멘트화를 유도하는 것으로 추정되었다. 라이트(Wright) 및 클랜해머(Klaenhammer) (1981) (문헌 [Calcium-Induced Alteration of Cellular Morphology Affecting the Resistance of Lactobacillus acidophilus to Freezing; Appl Environ Microbiol, 41, 807-815])는 성장 배지의 칼슘 보충이 동결중 락토바실루스 아시도필루스 NCFM 농축물의 증진된 안정성을 유도하였음을 입증해 보여주었다. 저자들은 칼슘-보충 MRS 브로쓰 (문헌 [de Man et al., (1960); A Medium for the Cultivation of Lactobacilli; J. Appl. Bact. 23, 130-135])가 필라멘트형 → 바실로이드(bacilloid) 간상체로 배양물의 형태학적 전이를 초래하였음을 관찰하였고, 칼슘-유발 형태 변화를 안정성 증가와 관련시켜서 설명하였다. 흥미롭게도 동일 저자들은 추후에 (문헌 [(Wright and Klaenhammer (1983a); Survival of Lactobacillus bulgaricus During Freezing and Freeze-Drying After Growth in the Presence of Calcium. Journal of Food Science, 48, 773-777]) 두 균주 락토바실루스 불가리쿠스(Lb . bulgaricus) 1234-O 및 F의 성장 배지에 칼슘의 첨가 역시도 동결 및 동결건조중 증진된 안정성을 유도하였음을 입증해 보여주었지만, 이들 연구에서 칼슘 보충은 세포 형태 또는 성장에 대한 효과가 없었다. 망가니즈 및 마그네슘 염은 이들 조사에서 보호 효과 발휘에는 실패하였다. 추가 실험에서, 동일 저자들은 포스페이트 농도가 두 균주 락토바실루스 불가리쿠스 1243-F 및 1489의 성장, 산 생산 및 세포 형태에 미치는 영향을 조사하였다 (문헌 [(Wright and Klaenhammer (1984); Phosphated Milk Adversely Affects Growth, Cellular Morphology, and Fermentative Ability of Lactobacillus bulgaricus; J. Dairy Sci., 67, 44-51]). 산 생산 및 성장의 억제 외에도, 2 내지 3% 포스페이트를 함유하는 우유 또는 시판 파지 억제 배지에서 배양시에 양쪽 균주의 세포 형태가 변하였다. 이들 배지는 비-보충 우유에서 성장하는 정상적인 짧은 간상체와 비교하여 연결된 세포의 긴 사슬로의 이행을 유발하였다. 관찰된 불량한 성장 및 세포 형태의 변경은 적당한 성장 및 세포 조립을 위한 2가 양이온에 대한 요구성과 관계가 있었으며, 칼슘 및 망가니즈가 상응하는 효소의 적절한 사슬제거(dechaining) 활성에 필요한 것으로 예측되었던 저자들 (문헌 [Wright and Klaenhammer (1983b); Influence of Calcium and Manganese on Dechaining of Lactobacillus bulgaricus; Appl Environ Microbiol, 46, 785-792])로부터의 초기 결과와 일치한다. 락토바실루스 비피더스에서의 세포 분열에 대한 칼슘 이온의 불가결한 역할을 강조하는, 고지마(Kojima) (1970a) (문헌 [A study on the pleomorphism of Lactobacillus bifidus; Kobe Daigaku Igakubu Kiyo, 32, 126-147]) 및 고지마 등 (1970b) (Necessity of calcium ion for cell division in Lactobacillus bifidus; J Bacteriol, 104, 1010-1013])에 의하여 유사한 결과가 관찰되었다. 저자들은 전자현미경법을 통해 칼슘-유발 격막 형성을 영상화하였다.

올터맨(Altermann) 등 (2004) (문헌 [Identification and phenotypic characterization of the cell-division protein CdpA; Gene, 342, 189-197])은 락토바실루스 아시도필루스 NCFM에서 세포 분리 단백질 cdpA을 코딩하는 개방 판독 프레임 ORF_223을 녹아웃시킬 수 있었다. 세포 분열이 억제된 이들 돌연변이체는 단일 세포가 부피면에서 야생형 세포보다 약 2 내지 3배 더 큰 긴 세포 사슬을 생성하였다. 또한, 그들 세포는 NaCl-, 삼투- 및 에탄올-스트레스에 대하여 야생형보다 덜 안정하지만 옥스갈 처리에 대하여는 보다 안정하였다. 레칭거(Rechinger) 등 (2000) (문헌 ["Early" protein synthesis of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus in milk revealed by [35S] methionine labeling and two-dimensional gel electrophoresis; Electrophoresis, 21, 2660-2669])은 락토바실루스 델브루에키이 spp. 불가리쿠스에 대하여 MRS 또는 환원 탈지유같은 복합 배지에서 성장한 박테리아는 정상적인 간상체 형상을 띤 반면에 화학적으로 정의된 배지의 사용은 필라멘트형 세포를 초래하였음을 관찰하였는데, 이는 복합 배지에 존재하는 적어도 1종의 인자가 결여되었음을 나타내는 것이다. 스즈키(Suzuki) 등 (1986) (문헌 [Growth of Lactobacillus bulgaricus in Milk. 1. Cell Elongation and the Role of Formic Acid in Boiled Milk; J. Dairy Sci., 69, 311-320])은 100℃에서 15 min 동안 끓인 우유에서 성장시 락토바실루스 불가리쿠스 B5b의 비정상적인 신장을 입증해 보여주었다. 당해 절차는 우유내 영양소 함량을 감소시켰고 이는 벌크 RNA 합성의 억제 및 그러므로 결손 세포 분열 진행의 원인이 되었다. 리(Rhee) 및 백(Pack) (1980) (문헌 [Effect of environmental pH on chain length of lactobacillus bulgaricus; J Bacteriol, 144, 865-868])은 정상 상태(steady-state) 연속 배양시 알칼리성 pH 값 (7.5 초과)에서 락토바실루스 불가리쿠스 NLS-4에서의 사슬 생성을 보고하였다. 저자들은 이 현상을 높아진 pH 값에서의 사슬제거 효소(들)의 합성 억제와 상관지을 수 있었다.

몇몇 사례에서의 종래기술이 한편으로는 특정 작용제의 존부간 상관관계 및 다른 한편으로는 다형성 형태의 발생을 기술하고 있지만, 프로바이오틱 제품 또는 발효 출발물질과 같은 보다 우수한 생물공학 제품의 달성을 목표로 하여 체계적인 방식으로 어떻게 세포 형태를 제어할 수 있는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 그러므로 본 발명의 기저에 있는 기술적 과제는 미생물을 배양하는 개선된 수단 및 방법의 제공에서 만나볼 수 있다.

당해 기술적 과제는 첨부 특허청구범위의 주제에 의하여 해결된다.

제1 측면에서, 본 발명은 배양중 세포의 부피 및/또는 길이-대-직경 비를 제어하기 위한 펩톤의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 세포는 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포이다.

용어 "펩톤"은 당업계에서 확립된 바와 같은 의미를 지닌다. 펩톤은 출발 물질로서 동물성 또는 식물성 단백질로부터의 분해에 의하여 수득될 수 있는 펩티드와 아미노산의 혼합물을 언급한다. 펩티드와 아미노산을 생성하는 분해는 예를 들어 산에 의하여 및/또는 효소 소화에 의하여, 바람직하게는 펩신으로의 효소 소화에 의하여 초래된 화학적 가수분해에 의하여 달성될 수 있다. 펩신은 몇몇 이소형으로 발생하며, 펩신 A, 펩신 B 및 펩신 C가 두드러진 것들이다. 상응하는 효소위원회 (EC) 번호는 3.4.23.1, 3.4.23.2 및 3.4.23.3이다. 특별히 규정하지 않는 한, "펩신"은 펩신 A를 언급한다. 시판 펩신은 보통 돼지 위에서 수득한 펩신 A이다. 이와 달리, 효소 소화는 트립신 또는 그 밖의 엔도펩티다제(들)로 달성될 수 있다. 펩톤은 박테리아 또는 효모와 같은 미생물용 배지의 전형적인 구성성분이다. 바람직한 펩톤은 이하에서 기재한다.

용어 "간상 박테리아"는 당업계에 확립되어 있고 공통적인 형태를 공유하는 박테리아를 언급한다. 그 용어는 분류학적 기준과 혼동하지 않아야 한다. 바실루스속은 간상 박테리아의 특징적인 대표이다. 하기에서 좀더 상세히 설명하게되는 바와 같이, 간상체는 다음과 같이 기하학 용어로 기술될 수 있다: 폐쇄된 볼록한 구획이 형성되도록 어느 한쪽 말단에 반구를 갖는 개방 원통. 종종 용어 "바실루스(bacilli)"는 분류군 바실루스속(Bacillus)과 혼동되지 않아야 하는 경우에 임의의 간상 박테리아를 표시하기 위하여 사용된다. 간상 박테리아는 구형 또는 타원형 박테리아와 구별하고자 한다. 도 3의 우측에서 다양한 길이의 간상체를 볼 수 있다. 보다 긴 간상체는 종종 필라멘트 형태로도 언급하며, 반면에 짧은 간상체는 종종 바실로이드 형태로도 언급한다.

안정한 간상 구조는 세포막보다 단단한 세포벽의 존재에서 연유한다. 세포벽은 세포막의 지질 이중층보다 단단한 구조를 생성하는 펩티도글리칸으로 주로 이루어진다. 외측의 세포벽과 내측의 세포막 사이에는 주변세포질 공간으로도 불리는 관강이 존재한다.

간상 박테리아의 크기는 그의 부피로 정의될 수 있다. 세포 부피를 측정하기 위한 기구사용은 당업자의 재량에 있으며 실시예에 기재되어 있다. 용어 "부피" 및 "세포 부피"는 상호교환가능하게 사용된다.

앞서 제공한 바와 같은 기하학 용어로 간상체의 정의가 주어지면, 단일 파라미터를 이용하여 주어진 간상체의 전체적인 형상을 정의할 수 있음이 자명하다. 당해 파라미터는 "L/D 비"로 약칭되는 길이-대-직경 비이다. 길이-대-직경 비 측정 수단은 하기에서 설명될 것이다. 특히, 제1 단계에서는 문제의 세포 부피를 측정하고, 제2 단계에서는 그로부터 L/D 비를 계산한다.

L/D 비를 계산하는 과정에서, 하나의 옵션은 특정 세포 직경을 가정하는 것이다. 락토바실루스과의 경우에, 특히 락토바실루스 아시도필루스의 경우에, (그러나 그에 국한되지 않는다), 1 ㎛의 값은 세포 직경 D의 양호한 견적이다. 간상 박테리아의 경우에, 직경 D는 간상체의 원통형 부분의 직경을 언급하는 것으로 이해한다. 본 발명자들은 사용되는 배양 배지에 따라 평균 세포 부피가 다양하다는 것을 추가로 관찰하였다. 합당한 추정에 따르면, 세포 부피의 변이는 간상체 직경의 변이가 아니라 간상체 길이의 변이에서 연유한다. 간상체의 원통형 부분의 반경 r 및 길이 h의 함수로서 평균 세포 부피는 다음과 같이 정의된다: V = πr² + ⁴/₃ πr³.전술한 바와 같이 D는 1 ㎛이고 반경 r = 0.5 ㎛라고 가정하면, 그에 따라 h는 세포 부피 V로부터 측정될 수 있다. 간상체의 총 길이 L = h + 2r (간상체의 원통형 부분의 말단에서의 두 반구) 및 직경 D = 2r = 1 ㎛이므로, 그에 따라 L/D 비가 측정되어 본 발명에 따른 간상 박테리아의 형태를 특성해석하는 파라미터로서 이용될 수 있다.

본 발명에 따라, 간상 박테리아는 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아 어느 한쪽인 것으로 추가 정의된다. 본원에서 전술한 바와 같이, 프로바이오틱스는 적정량으로 투여시 숙주에 건강상의 이익을 부여하는 살아있는 미생물이다. 상기 정의하에 들어오는 바람직한 분류군은 본원에 이하에서 상세히 설명한다. 프로바이오틱스의 정의로부터 자명한 바와 같이, 프로바이오틱 박테리아는 숙주에 전달시 및 그들이 그들의 목적지에 도착시 살아있는 것이 중요하다.

용어 "간상 발효 박테리아"는 발효를 수행할 수 있는 임의 간상 박테리아를 언급한다. 본원에서 사용되는 용어 "발효"는 당업계에 확립된 바와 같은 통상의 의미를 지니며 유기 화합물 산화의 생화학적 과정을 언급하는 것이며 그에 따라 예컨대 ATP의 형태로 에너지를 추출하게 된다. 발효 과정의 일부로서 산화의 진행중에 내인성 전자 수용체가 이용된다. 후자의 측면은 발효를 호흡과 구별시켜준다. 바람직하게는, 상기 간상 발효 박테리아는 그들이 생물공학적 생산과정에 사용됨에 따라 간상 박테리아이다. 그러한 생물공학적 생산과정은 음료, 인간 또는 동물 소비용 식품, 식이 보충제, 기능성 식품 및 의약품의 생산을 포함한다. 상기 정의하에 들어오는 바람직한 분류군을 이하에 제공한다.

전체적으로 본 발명은 생물방제제로서, 특히 생물살충제 및 생물보존제로서 사용되는 간상 박테리아에 또한 적용가능하다. 용어 "생물방제제"는 타 미생물의 방제에 사용될 수 있는 미생물 - 화학약품과 대비하여 - 을 언급한다. 바실루스목(Bacillales)이 생물방제제로서 유용하다. 생물살충제의 예는 바실루스 투린기엔시스 서브스피시즈 아이자와이(Bacillus thuringiensis ssp. aizawai)를 포함한다. 생물보존제의 예는 락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 포함한다.

발효 박테리아에 속하는 표적 세포의 추가군은 종종 "출발 배양물"로도 언급되는 발효 출발물질에 포함되는 바와 같은 간상 박테리아의 세포이다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 발효 출발물질은 각종 식품 및 발효 음료의 제조시에 발효 과정의 개시를 돕는 제제이다. 박테리아 및/또는 효모는 전형적인 발효 출발물질에 포함된다. 상기 발효 출발물질에 포함되는 바와 같은 바람직한 박테리아는 본원에 이하에서 분류군의 견지에서 정의된다.

용어 "출발 배양물"의 일부로서 사용될 때 용어 "배양물"은 발효를 개시하기에 적합한 미생물 1종 이상을 포함하는 조성물을 언급한다는 점에서 특별한 의미를 지닌다. 이와는 다르게 및 일반적으로 말하면, 용어 "배양"은 당업계에 확립된 바와 같은 의미를 지니며, 한편으로는 통제된 실험실 및/또는 생산 조건하에서 소정의 배양 배지에서 번식하게 함으로써 미생물을 증식시키는 방법을 언급하고, 다른 한편으로는 배양이 실제로 일어나는 물질의 조성물을 언급하며, 상기 물질의 조성물은 배양 배지와 미생물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "배양물"은 임의 용기 또는 담체에 함유되거나 보유된 임의 규모로의 및 물질의 임의 상태로의 배양물을 언급한다. 예를 들어, 배양물은 액체 배양물일 수 있다. "배양물"은 또한 발효에 의하여 수득된 조성물중 미생물의 존재, 바람직하게는 증식에까지 확장될 수 있으며, 그러한 조성물로는 음료, 식품, 식이 보충제 및 의약품을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "배양"은 펩톤이 첨가되었거나 또는 펩톤을 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계를 말한다.

위에서 언급한 바와 같이, 펩톤은 배양 배지의 전형적인 구성성분이다. 본 발명자들은 놀랍게도 펩톤의 선택이 세포 부피에 영향을 미치는 수단 및 특정 미생물에서의 특이적인 형태학적 파라미터임을 발견하였으며, 여기서 형태학적 파라미터는 길이-대-직경 비이고 미생물은 전술한 특정 간상 박테리아이다. 상기 "영향을 미치는"은 통계적으로 유의하고 본원에서는 "제어하는"으로도 언급된다. 간상체의 길이와 세포 부피는 배양 배지에 포함되는 펩톤의 선택에 현저하게 좌우되는 것으로 밝혀졌다. 부피 및/또는 L/D 비율을 감소시킴으로써, 높은 세포수 또는 농도가 달성된다; 예를 들어, 도 1에 도시한 데이터 참조. 아울러, 이하에서 좀더 상세히 논의되는 바와 같이, 부피 및/또는 길이-대-직경 비를 감소시키는 것은 본원에서 정의한 바와 같은 간상 박테리아로 하여금 보다 생존가능하게 해주고 생물공학적 생산과정에서 발생할 수 있는 기계적, 화학적 또는 열적 스트레스 조건에 대하여 견딜 수 있게 해주는 수단이다.

바람직한 실시양태에서, 상기 제어는 감소시키는 것이며 상기 펩톤은 지방 스톡(fat stock) 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물이다. 용어 "지방 스톡 펩톤"은 지방 스톡에서 기원하는 펩톤을 언급한다. 지방 스톡 펩톤은 단백질 또는 단백질-함유 조직, 특히 지방 스톡의 육류를 가수분해 또는 소화시킴으로써 수득될 수 있다. 용어 "지방 스톡"은 돼지 및 소 (Bos primigenius taurus 포함)와 같은 도살되는 동물을 언급한다. 카세인으로부터의 펩톤을 포함하여 우유로부터의 펩톤은 "지방 스톡 펩톤"하에 포섭되지 않는 것으로 한다. 용어 "돼지 기원"은 저속(Sus), 바람직하게는 돈종(Sus scrofa), 가장 바람직하게는 돼지(Sus scrofa domestica)의 지방 스톡으로부터 수득한 임의 조직을 언급한다.

본 발명자들은 놀랍게도 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤을 선택함으로써, 보다 높은 세포 농도뿐만 아니라 보다 작은 부피 및/또는 보다 짧은 간상체 (보다 작은 L/D 비율)의 박테리아 세포가 수득되도록 본 발명에 따른 간상 박테리아의 세포 형태를 변형시킬 수 있음을 발견하였다. 바람직하게는, 상기 펩톤은 돼지 조직의 펩신 소화물이다. 펩신 소화물은 효소 펩신의 첨가시 출발 물질로부터 수득되는 제제이다. 상기 출발물질에 관하여, 지방 스톡의, 특히 돼지 기원의 조직, 특히 육류, 보다 구체적으로는 돼지 기원의 위 조직이 바람직하다. 동시에, 돼지 기원의 조직을 포함하는 다른 단백질 공급원 또는 단백질의 사용도 구상된다.

펩톤이 아미노산과 펩티드의 공급원으로서 일차로 고려되지만, 일반적으로는 전체 조직이 그들의 제제에 사용되므로 그들은 다른 구성성분을 포함한다 것 또한 사실이다. 이들 다른 구성성분과 관련하여, 고-농도의 핵산 빌딩 블록, 예컨대 뉴클레오티드, 뉴클레오시드와 핵염기 및 그들의 유도체를 갖는 펩톤이 바람직하다. 그러한 고-농도의 지표로서, 티미딘 및/또는 히포크산틴의 농도가 이용될 수 있다. 티미딘 및 히포크산틴 그 자체 역시 바람직하게는 고-농도로 존재한다. 히포크산틴의 고-농도는 50, 100, 150 또는 200 ㎍/g 초과 농도이다. 티미딘의 고-농도는 20, 40, 60 또는 70 ㎍/g 초과 농도이다. 이들 기준 (핵산 빌딩 블록, 티미딘 및/또는 히포크산틴의 고-농도) 중 어느 것을 충족하는 펩톤을 사용하는 것이 구상되며, 그 펩톤은 반드시 지방 스톡 펩톤 또는 돼지 기원의 펩톤에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 진행에서, 본 발명자들은 부분적으로 상이한 기원의 및/또는 상이한 제조업자로부터의 펩톤을 사용하여 그들 자신의 배지를 제조하였다. 특히 탁월한 방식으로 수행한 돼지 기원의 특정 펩톤은 이전에는 디프코^TM 프로테오스 펩톤 3호(Difco^TM Proteose Peptone No.3)로 알려졌던벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)으로부터 입수가능한 박토^TM 프로테오스 펩톤 3호(Bacto^TM Proteose Peptone No.3)이다. 명칭 변경에도 불구하고, 상기 펩톤의 제조 방법은 변하지 않았다. 박토^TM 프로테오스 펩톤 3호에 대한 추가 정보는 예를 들어 비디 바이오뉴트리언츠(BD Bionutrients)^TM 기술 매뉴얼 3판 (2006년 10월)에서 찾아볼 수 있다; 특히 거기의 9, 42 및 43쪽에 있는 표 참조. 박토^TM 프로테오스 펩톤 3호는 본 발명의 모든 측면에 대하여 돼지 기원의 특히 바람직한 펩톤이다. 박토^TM 프로테오스 펩톤 3호는 종종 본원에서는 프로테오스 펩톤 3호 또는 펩톤 3호로 약칭한다.

추가 바람직한 실시양태에서, 상기 펩톤의 존재하에서 상기 세포의 평균 부피는 3 ㎛³ 미만, 바람직하게는 2 내지 3 ㎛³, 더욱 바람직하게는 1,4 내지 2 ㎛³, 가장 바람직하게는 1.1 내지 1.4 ㎛³이고, 더욱 바람직한 세포 부피는 1.0, 1.2, 1.3 및 1.5 ㎛³을 포함하고; 평균 길이-대-직경 비는 5 미만, 바람직하게는 4 미만 또는 3 미만 또는 2.5 미만, 더욱 바람직하게는 2.2 미만 또는 2.1 미만 또는 2.0 미만, 가장 바람직하게는 1.8 미만이다. 도 1에 각종 상이한 배양 조건에 대한 세포수/ml뿐만 아니라 평균 세포 부피(average cellular volume) ("mean cell volume")를 도시하였다. 도 3에는 상이한 배지에서의 배양에 대하여 측정된 세포 부피의 분포를 도시하였다.

바람직한 실시양태에서, 평균 길이-대-직경 비는 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 또는 1.5이다. 어느 경우에도, 원통형 구조가 존재할 것을 요구하는 용어 "간상"이란 1.0 초과의 값을 의미한다; 상기 참조.

제2 측면에서, 본 발명은 세포의 생존력, 안정성, 보관 수명, DNA 복제, 격막 형성 및/또는 세포 분열을 증가시키기 위한 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물의 용도를 제공하며, 여기서 상기 세포는 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포이다.

당해 실시양태는 본 발명자들의 놀라운 추가 발견, 즉 세포 부피 또는 길이-대-직경 비를 제어하게 해주는 특정 수단, 다시 말하자면 본 발명에 따른 펩톤이 세포의 배양물의 품질 및 상기 세포를 포함하는 또는 그로부터 수득된 조성물 또는 제제의 품질을 증가시키는 것을 추가 제공한다는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따른 품질 파라미터는 생존력, 생명력, 안정성, 보관 수명, DNA 복제, 격막 형성 및 세포 분열이다.

용어 세포의 "생존력"은 살아있으려는 그들의 상태를 의미한다. 그 상태는 세포의 생존, 성장 및 증식에 의하여 표현될 수 있으며 양성 배양성(cultivability)에 의하여 입증할 수 있는 다수의 사안에 대한 것이다. 용어 세포의 "생명력"은 지정된 대사 활성을 갖기 위한 그들의 상태를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "안정성"은 특정 기간에 걸쳐서 또는 프로세싱 후 생존력을 유지하는 능력에 관한 것이며, 프로세싱은 압출, 동결건조, 동결, 건조 및 저장을 포함한다.

"보관 수명"은 시판 제품의 특성해석에 빈번히 사용되는 파라미터이다. 이번의 경우에, 그 용어는 프로바이오틱 배양물 또는 그로부터 수득된 제제가 숙주에 전술한 건강상의 이익을 부여할 수 있는 때까지, 또는 발효 박테리아가 언급되는 범위내에서 후자의 목적하는 발효 과정 수행능까지의 기간을 표시하는 데 사용된다. 뒤의 3가지 품질 파라미터 (DNA 복제, 격막 형성 및 세포 분열)는 생존력의 현미경적 또는 생화학적 지표로서 볼 수 있다. 용어 "격막"은 세포 분열 진행중에 분열 세포간에 형성되는 경계를 언급한다. 본 발명에 따른 특정 펩톤의 사용시 전술한 품질 파라미터 중 하나 이상이 개선될 수 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 배지가 세포의 생존력을 증가시키거나 또는 상기 배지에서 배양된 세포를 포함하는 제제의 안정성 또는 보관 수명을 증가시키는 세포 배양 배지를 선택하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 간상 그램-양성 박테리아, 바람직하게는 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포이고, 상기 방법은 배양중 상기 세포의 평균 부피 및/또는 평균 길이-대-직경 비를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 낮은 평균 부피 또는 낮은 평균 길이-대-직경 비는 적합한 배지를 나타내며, 바람직한 평균 부피 및 평균 길이-대-직경 비는 본원에서 상기 정의한 바와 같다.

용어 "그램-양성"은 당업계에 잘 확립되어 있다. "그램-양성"은 에탄올로의 탈색시 크리스털 바이올릿 염색을 존속시키려는 특정 박테리아, 즉 그램-양성 박테리아의 능력을 언급한다. 이러한 능력은 그램-음성 박테리아에서는 생기지 않는다. 그램-양성 박테리아의 크리스털 바이올릿 염색 존속능은 펩티도글리칸이 풍부한 두꺼운 세포벽의 존재에 기인한다. 바실루스목, 락토바실루스목 및 비피도박테리아목은 모두 그램-양성 박테리아이다.

본 발명의 당해 측면은 적합한 세포 배양 배지의 동정을 가능케 해주는 스크리닝 방법에 관한 것이다. 이전의 측면은 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아에 관한 것이고, 더군다나 방제제로서 펩톤에 한정되지만, 본 발명에 따른 세포 배양 배지를 선택하는 방법은 펩톤과 같은 특정 작용제에 한정되지 않는다. 결과로서, 일반적으로 간상 그램-양성 박테리아에 적용가능하다. 본 발명의 이러한 특정 측면은 간상 그램-양성 박테리아의 배양물에서의 평균 세포 부피 및/또는 평균 길이-대-직경 비를 낮추는 것이 생존력, 안정성 및/또는 보관 수명을 증가시키는 수단이라는 놀라운 발견에서 연유한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 배지중 아미노산 및/또는 펩티드의 공급원은 세포 배양 배지를 선택하는 상기 방법의 경과 중에 다양하다. 특히, 효소 소화물, 예컨대 동물성 단백질 공급원, 특히 지방 스톡 육류를 포함한 동물의 육류의 펩신 소화물을 비교하는 것이 구상된다.

본 발명은 추가 측면에서 배양중 세포의 평균 부피 및/또는 평균 길이-대-직경 비를 확립하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 세포는 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포이고, 그 평균 부피는 3 ㎛³ 미만, 바람직하게는 2 내지 3 ㎛³, 더욱 바람직하게는 1.4 내지 2 ㎛³, 가장 바람직하게는 1.1 내지 1.4 ㎛³이고 그 평균 길이-대-직경 비는 5 미만, 바람직하게는 4 미만 또는 3 미만 또는 2.5 미만, 더욱 바람직하게는 2.2 미만 또는 2.1 미만 또는 2.0 미만, 가장 바람직하게는 1.8 미만이며, 그 방법은 상기 세포를 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물의 존재하에서 배양하는 단계를 포함한다.

추가 측면에서, 본 발명은 상기 세포를 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물의 존재하에서 소정 기간 동안 배양하는 방법을 제공한다. 배양 시간은 바람직하게는 생존 세포의 최대 농도 및 평균 세포 부피의 최소에 이를 때까지 진행한다. 배양의 바람직한 기(stage)는 소위 정지 성장기이며, 여기서 그 기는 10 내지 48 h, 바람직하게는 12 내지 24 h, 더욱 바람직하게는 14 내지 22 h, 가장 바람직하게는 16 내지 20 h 사이에 도달된다.

추가 측면에서, 본 발명은 세포의 생존력, 안정성, 보관 수명, DNA 복제, 격막 형성 및/또는 세포 분열을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포이고, 여기서 상기 방법은 상기 세포를 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물의 존재하에서 배양하는 단계를 포함한다.

상기 개시한 용도 및 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 프로바이오틱 박테리아 또는 발효 박테리아는 간상 락토바실루스목 및 간상 비피도박테리아목, 바람직하게는 간상 락토바실루스과 및 간상 비피도박테리아과, 더욱 바람직하게는 락토바실루스 및 비피도박테리움으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 분류군은 간상 바실루스목, 바람직하게는 간상 바실루스과이고, 바람직한 속은 바실루스이며, 간상 클로스트리디움목, 바람직하게는 클로스트리디움이다.

바람직하게는, 상기 락토바실루스는 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 카세이, 락토바실루스 델브루에키이, 락토바실루스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실루스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

보다 바람직한 실시양태에서, (a) 락토바실루스 아시도필루스는 락토바실루스 아시도필루스 또는 락토바실루스 아시도필루스 NCFM(Lactobacillus acidophilus NCFM); (b) 락토바실루스 카세이는 락토바실루스 카세이 서브스피시즈 람노수스(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus) (ATCC 7469); (c) 락토바실루스 델브루에키이는 락토바실루스 델브루에키이 서브스피시즈 락티스(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) 또는 락토바실루스 델브루에키이 서브스피시즈 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus); (d) 락토바실루스 존소니이는 락토바실루스 존소니이 La1(Lactobacillus johnsonii La1); (e) 락토바실루스 람노수스는 락토바실루스 람노수스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG) (ATCC 53103); 또는 (f) 락토바실루스 살리바리우스는 락토바실루스 살리바리우스 서브스피시즈 살리바리우스(Lactobacillus salivarius subsp. salivarius)이다.

락토바실루스 속 ("L.") 및 비피도박테리움 속 ("B.")으로부터의 추가의 바람직한 종 및 균주는 락토바실루스 아시도필루스 R0052(L. acidophilus R0052) (랄르망, Lallemand), 락토바실루스 카세이 시로타(L. casei shirota) (야쿠르트, Yakult), 락토바실루스 카세이 이뮤니타즈(L. casei immunitas) (DN114001) (다농, Danone), 락토바실루스 파라카세이 CRL431(L. paracasei CRL431) (크리스티안 한센, Chr. Hansen), 락토바실루스 파라카세이 ST11(L. paracasei ST11) (네슬레, Nestle), 락토바실루스 파라카세이 LP33(L. paracasei LP33) (진몽 바이오테크, GenMont Biotech), 락토바실루스 파라카세이 F19(L. paracasei F19) (메디팜, Medipharm), 락토바실루스 플란타룸 299V(L. plantarum 299V) (프로비 에이비(Probi AB)/랄르망), 락토바실루스 가세리(L. gasseri) (머크(Merck)/세븐 시즈, Seven Seas), 락토바실루스 레우테리 SD2112(L. reuteri SD2112) (바이오가이아, Biogaia), 락토바실루스 람노수스 LGG(L. rhamnosus LGG) (발리오, Valio), 락토바실루스 람노수스 GR-1(L. rhamnosus GR-1) (유렉스 바이오테크, Urex Biotech), 락토바실루스 람노수스 271(L. rhamnosus 271) (프로비 에이비), 락토바실루스 살리바리우스 UCC118(L. salivarius UCC118) (유니버시티 오브 코크, University of Cork), 락토바실루스 헬베티쿠스 CPN4(L. helveticus CPN4) (캘피스(Calpis), 일본), 락토바실루스 헬베티쿠스 (LKB16H) (발리오), 락토코쿠스 락티스 L1A(Lactococcus lactis L1A) (에숨 에이비, Essum AB), 비피도박테리움 락티스(B. lactis) (DN 173 010) (다농), 비피도박테리움 락티스 Bb-12(B. lactis Bb-12) (크리스티안 한센), 비피도박테리움 롱굼 BB-536(B. longum BB-536) (모리나가, Morinaga), 비피도박테리움 롱굼 로셀 152(B. longum Rosell 152) (랄르망), 비피도박테리움 롱굼 SBT-2928(B. longum SBT-2928) (스노우 브랜드 밀크 프로덕츠(Snow Brand Milk Prod.), 일본), 비피도박테리움 브레베(B. breve) 균주 (야쿠르트), 비피도박테리움 락티스 HN019(B. lactis HN019) (호와루(Howaru), 다니스코, Danisco)이다.

특히 바람직한 것은 락토바실루스 아시도필루스 NCFM, 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 카세이 서브스피시즈 람노수스, 락토바실루스 람노수스 GG 및 락토바실루스 델브루에키이 서브스피시즈 락티스이다.

추가 바람직한 실시양태에서, 상기 펩톤은 배양 배지, 예컨대 MRS 배지, 바람직하게는 비디 디프코(BD Difco)^TM 락토바실루스 MRS 브로쓰 또는 GEM 배지에 포함된다. MRS 배지는 당업계에 알려져 있으며 드 망(de Man) 등 (1960) (문헌 [de Man, J.D., Rogosa M. and Sharpe M.E. (1960) A Medium for the Cultivation of Lactobacilli. J. Appl. Bact. 23,130-135])에 의하여 간행물에 기재되어 있다. 포함된 펩톤과 관련하여 서로 상이한 다양한 MRS 배지가 본 발명자들에 의하여 시험되었다. 본원에서 "MRSD"로 명명되는 바람직한 MRS 배지는 MRSD 배지의 특히 양호한 성능에 기여하는 프로테오스 펩톤 3호를 포함하는 MRS 배지이다. MRSD 배지의 구성성분은 본원에서 하기 실시예 1에 제공한다. 대체 바람직한 실시양태에서, 사렐라(Saarela) 등 (2004) (문헌 [Stationary-phase acid and heat treatments for improvement of the viability of probiotic lactobacilli and bifidobacteria; J Appl Microbiol, 96, 1205-1214])에 기재된 바와 같은 GEM (general edible medium, 일반 식용배지)이 사용된다. 전형적으로, GEM은 대두 펩톤을 함유한다; 실시예 1 참조. GEM의 그 밖의 구성성분 또한 실시예 1에 제공한다. 본 발명에 따르면, 대두 펩톤은 여타 펩톤으로 대체할 수 있으며, 여기서는 돼지 기원의 펩톤, 특히 프로테오스 펩톤 3호가 바람직하다.

일반적으로 말하면, 5 내지 50, 10 내지 40, 12 내지 30, 또는 15 내지 25 g/l 범위의 상기 펩톤의 농도가 바람직하다.

보다 바람직한 실시양태에서, (a) 상기 MRS 배지는 5 내지 20 g/l, 바람직하게는 약 10 g/l의 상기 펩톤을 포함하거나; 또는 (b) 상기 GEM 배지는 10 내지 50 g/l, 바람직하게는 20 내지 40 g/l, 더욱 바람직하게는 약 30 g/l의 상기 펩톤을 포함한다. 전술한 바와 같이, 특히 바람직한 펩톤은 박토^TM 프로테오스 펩톤 3호이다.

GEM 배지가 사용된다는 범위내에서, 상기 GEM 배지는 추가로 트윈 80을 바람직하게는 0.5 내지 2 g/l, 더욱 바람직하게는 약 1 g/l의 농도로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 용도 및 방법의 추가 바람직한 실시양태에서, (a) 생존력은 배양에서 또는 제제에서의 생존력이고; (b) 안정성은 제제에서의 안정성이고; (c) 보관 수명은 제제에서의 보관 수명이고; (d) DNA 복제는 배양에서의 DNA 복제이고; (e) 격막 형성은 배양에서의 격막 형성이고; (f) 세포 분열은 배양에서의 세포 분열이다.

바람직한 실시양태에서, 상기 제제는 상기 세포가 보호 매트릭스중에 캡슐화되거나 또는 포매되는 제제, 예컨대 압출물 또는 구형물; 동결건조물; 동결 제제; 및 건조 제제로부터 선택된다.

본원에서 상기 정의한 바와 같은 간상 박테리아의 생존력, 특히 간상 프로바이오틱 박테리아의 생존력은 그들을 보호 매트릭스중에 캡슐화 또는 포매시킴으로써 더욱 증가시킬 수 있음이 당업계에 알려져 있다. 캡슐화 또는 포매의 바람직한 과정은 압출이다. 바람직한 보호 매트릭스는 가루반죽이다. 상기 보호 매트릭스의 추가 또는 대체 구성성분은 탈지유 또는 LyoA일 수 있다; 또한 실시예 2 참조. "LyoA"는 본원에서 젤라틴 (1.5% (w/w)), 글리세롤 (1% (w/w)), 말토덱스트린, 바람직하게는 글루시덱스(Glucidex)12^® (5% (w/w)) 및 락토스 일수화물 (5% (w/w))의 수용액을 지칭하는 데 사용된다.

압출물을 생성하는 압출의 과정은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로 말하면, 겔 또는 점성 또는 가루반죽-유사 조성물을 오리피스를 통해 압착한다. 파스타의 제조가 압출의 일례이다. 본 발명에 따르면, "냉각 압출"로도 불리는 온화한 조건하에서의 압출이 바람직하다. 필요한 범위에서, 압출과정 동안 냉각이 적용되며, 상기 냉각은 온도를 약 20℃ 내지 약 15℃의 범위로 유지시키는 데 일조한다. 본 발명에 따른 간상 박테리아를 가루반죽과 합하고 그 가루반죽을 압출하면, 박테리아 세포는 망상조직, 특히 가루반죽의 글루텐 망상조직 안에 고정화될 것이다. 고정화의 이러한 과정은 본원에서 "캡슐화" 또는 "포매"로도 언급된다.

바람직하게는, 글리세롤 및/또는 코코넛 지방 또는 코코넛 오일을 압출시킬 조성물에 첨가한다. 이렇게 하면 압출과정 동안 압출될 조성물에 포함되고/되거나 수득한 압출물의 임의의 하류 프로세싱에 의하여 수득되는 바와 같은 본 발명에 따른 간상 박테리아의 생존력 및/또는 안정성의 추가 증진을 제공한다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아를 포함하는 조성물을 압출하는 과정에 관한 것이며, 여기서 압출의 단계에 앞서, 글리세롤 및/또는 코코넛 지방 또는 코코넛 오일을 상기 박테리아를 포함하는 상기 조성물에 첨가한다. 압출물중 본 발명에 따른 간상 박테리아의 생존력, 안정성 및/또는 보관 수명을 증진시키기 위한 글리세롤 및/또는 코코넛 지방 또는 코코넛 오일의 용도가 또한 제공되며, 글리세롤 및/또는 코코넛 지방 또는 코코넛 오일은 압출과정 동안 압출물에 존재한다.

구형물은 예를 들어, 박테리아를 습윤 또는 건조 형태로 보호 결합 물질, 예컨대 예를 들어 곡분, 전분, 셀룰로스 물질 등, 및 충분량의 액체와 혼합하여, 예를 들어 스페로나이저(spheronizer)에서 펠릿으로 압착 및/또는 추가 프로세싱될 수 있고 그에 따라 구형을 띠고 본 발명의 박테리아를 함유하는 입상물을 생성하게 되는 빵가루-유사(crumb like) 입상물을 수득함으로써 생성될 수 있다.

동결건조물은 동결건조에 의하여 수득된 조성물이다. 동결건조를 위한 수단 및 방법은 당업계에 알려져 있으며 당업자의 재량에 있다; 또한 첨부 실시예 참조.

용어 "동결 제제"는 본원에서 상기 정의한 바와 같은 간상 박테리아를 포함하고 0℃ 미만, 바람직하게는 -10 내지 -30℃, 가장 바람직하게는 약 -18 내지 -20℃ 범위의 온도에서 저장한 제제를 언급한다.

바람직하게는, 상기 압출물은 가루반죽이고/이거나 곡분과 물을 포함한다.

추가 측면에서, 본 발명은 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포를 포함하는 압출물, 동결건조물 또는 동결 제제를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (aa) 상기 정의한 바와 같은 평균 부피 및/또는 평균 길이-대-직경 비를 확립하는 방법 또는 (ab) 상기 정의한 바와 같은 세포의 생존력, 안정성, 보관 수명, DNA 복제, 격막 형성 및/또는 분열을 증가시키는 방법, 및 (b) 각각 압출, 동결건조 및/또는 동결하는 단계를 포함한다.

추가 측면에서, 본 발명은 3 ㎛³ 미만, 바람직하게는 2 내지 3 ㎛³, 더욱 바람직하게는 1.4 내지 2 ㎛³, 가장 바람직하게는 1.1 내지 1.4 ㎛³의 평균 부피 및/또는 5 미만, 바람직하게는 4 미만 또는 3 미만 또는 2.5 미만, 더욱 바람직하게는 2.2 미만 또는 2.1 미만 또는 2.0 미만, 가장 바람직하게는 1.8 미만의 평균 길이-대-직경 비를 갖는 간상 프로바이오틱 박테리아 및/또는 간상 발효 박테리아를 포함하거나 또는 그들로 이루어지는 조성물을 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 배양 배지, 음료, 인간 또는 동물 소비용 식품, 사료, 식이 보충제, 생물방제제, 의약품, 압출물, 동결건조물, 동결 제제 및 건조 제제로부터 선택된다.

바람직한 배양 배지는 상기 본원에 개시된 것들, 특히 MRS 및 GEM 배지이며, 여기서 본 발명에 따른 상기 조성물은, 배양 배지에 관계하는 범위내에서, 본원에서 상기 정의한 바와 같은 배지, 예컨대 MRS 또는 GEM 배지 및 간상 박테리아를 포함하거나 또는 그들로 이루어진다.

음식물 및 식이 보충제의 예는 요구르트, 치즈, 응고 우유와 그로부터 수득된 제품 및 프로바이오틱스를 포함한다. 추가 예로는 곡물-기재 제품, 예컨대 콘플레이크를 포함한 인스턴트 시리얼; 바, 예컨대 초콜릿 바; 및 뮤즐리(muesli)가 있다. 그러한 제제에로의 본원 개시 압출물의 첨가가 특별히 구상된다.

생물방제제 및 그의 바람직한 실시양태 (생물살충제, 생물보존제)는 앞서 논의된 바 있다.

간상 프로바이오틱 박테리아 및/또는 간상 발효 박테리아를 포함하거나 또는 그들로 이루어지는 조성물이 추가로 제공되며, 그 조성물은 (i) 상기 정의한 바와 같은 평균 부피 및/또는 평균 길이-대-직경 비를 확립하는 방법; (ii) 상기 정의한 바와 같은 세포의 생존력, 안정성, 보관 수명, DNA 복제, 격막 형성 및/또는 분열을 증가시키는 방법; 또는 (iii) 상기 정의한 바와 같은 압출물, 동결건조물 또는 동결 제제를 제조하는 방법에 의하여 수득가능하거나 또는 수득된다.

본 발명의 방법 또는 조성물의 바람직한 실시양태에서, 바람직한 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아는 상기에서 좀더 상세히 정의한 바와 같다.

추가 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물을 환원당, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 말토스 및 락토스의 존재하에 100℃ 내지 130℃의 온도에서 적어도 15분 동안 처리하는 단계를 포함한다.

일반적으로 말하면, 온도가 높아질수록 소정 온도에서의 요구되는 처리 시간이 짧아진다. 특히, 가열 처리는 표준 오토클레이빙 조건 (121℃, 20 min)하에서 또는 배지의 쿠킹 (100℃)에 의하여 수행될 수 있으며, 여기서 인큐베이션 시간은 바람직하게는 1 h 초과, 4 h 초과, 6 h 초과 또는 8 h 초과이다. 120℃ 미만 온도에서의 충분한 가열 처리에 대한 지표는 420 nm 파장에서의 흡광도의 광도 측정 및 그 흡광도와 표준 오토클레이빙 조건 (120℃, 20 min)의 비교일 수 있으며, 여기서 상기 흡광도 값은 바람직하게는 1 초과, 더욱 바람직하게는 2 초과, 가장 바람직하게는 2.9 초과이다.

본 발명자는 놀랍게도 펩톤과 환원당을 함께 가열에 의하여 처리하는 것이 본 발명에 따른 배양의 관점에서 특히 유익함을 발견하였다; 또한 실시예 6 참조.

특정 이론에 의하여 구애받기를 원함이 없이, 당해 발견은 가열 처리중 유익한 반응물의 생성, 예컨대 마이야르 반응(Maillard reaction) 생성물의 생성에 직간접적으로 상관관계가 있을 수 있다고 생각된다.

마이야르 반응은 응축하여 마이야르 반응 생성물로 총칭되는 부분적으로 알려지지 않은 반응 생성물의 고도로 복잡한 망상조직으로 진행하는 아미노산, 펩티드 또는 단백질과 환원당간의 화학 반응인 비-효소적 갈변으로서 분류된다. 마이야르 반응은 다수의 요인, 예컨대 온도, 시간, pH, 수분 활성 및 반응물 공급원과 농도에 의하여 영향을 받는다 (예를 들어, 문헌 [Wijewickreme, A. N. and Kitts, D. D. (1997) Influence of Reaction Conditions on the Oxidative Behavior of Model Maillard Reaction Products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 4571-4576]). 가열한 당-단백질 시스템에서 유래한 마이야르 반응 생성물의 항산화 활성은 잘 연구되어 있으며 (예를 들어, 문헌 [Jing, H. and Kitts, D. D. (2002) Chemical and biochemical properties of casein-sugar Maillard reaction products. Food Chem Toxicol, 40, 1007-1015; Yeboah, F. K., Alli, I. and Yaylayan, V. A. (1999) Reactivities of D-glucose and D-fructose during glycation of bovine serum albumin. J Agric Food Chem, 47, 3164-3172]), 성장 거동에 잠재적으로 영향을 준다.

마이야르 반응 생성물은 DNA-분해 활성의 생성에 의하여 배양 배지의 품질을 개선할 수 있다 (문헌 [Hiramoto, K., Kido, K. and Kikugawa, K. (1994) DNA Breaking by Maillard Products of Glucose-Amino Acid Mixtures Formed in an Aqueous System. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42, 689-694]). 이러한 DNA 분해 활성은 배지 성분에 작용하여, 배지의 가열 중에 및/또는 가열 후에, 상기 배지에서의 성장중에 생성되는 DNA 절단 생성물인 뉴클레오티드와 그의 유도체의 박테리아에의 공급을 향상시킬 수 있다. 로저스(Rogers) 등 (문헌 [Rogers, D., King, T. E. and Cheldelin, V. H. (1953) Growth stimulation of Lactobacillus gayoni by N-D-glucosylglycine. Proc Soc Exp Biol Med, 82, 140-144])은 가열멸균하는 동안 성장 배지중 글루코스 또는 산-가수분해 카세인의 탈락이 락토바실루스 게이요니(Lactobacillus gayoni)의 성장 자극을 감소시켰음을 발견하였으며, 이는 본원에서 발견한 것과 유사한 효과이다 (또한 실시예 6 참조). 그러나, 로저스 등의 논문에는 배양 브로쓰에서의 광학밀도 (OD, 600 nm)로서 기록한 성장 거동만이 기재되었으며 더 이상의 세포 특성 (예를 들어, 세포 형태 또는 안정성)과의 어떠한 관계도 시사하고 있지 않다.

도 1: 상이한 제조업자 또는 조성의 배지에서 16 h 동안 성장한 락토바실루스 아시도필루스 NCFM의 세포 농도 및 세포 부피. 독립 실험의 수는 괄호 안에 표시하였다. 2회1조로 측정한 것을 평균치 ± 최대 및 최소로서 나타낸다. 다중 측정의 경우, 값은 평균치 ± S.D.로서 나타낸다. 박토^TM 프로테오스 펩톤 3호를 포함하는 배지 ("GEM 박토 펩톤 3호" 및 "MRSD")의 탁월한 성능은 명백하다. 데이터는 독일 십진수(German decimal number) 포맷으로 나타낸다.
도 2: 저장온도의 함수로서 동결건조 락토바실루스 아시도필루스 NCFM 제제의 선형화 D 값 (D = 십진 감소 시간). 배양 브로쓰를 대두 펩톤을 함유하는 GEM 및 MRSD에 보급하였다. 각각의 값은 상응하는 온도에서의 적어도 3개 저장 시간의 평균이다.
도 3: 대두 펩톤을 함유하는 GEM (A), 프로테오스 펩톤 3호를 함유하는 GEM (B) 및 MRSD (C)에서 16 h 동안 성장한 락토바실루스 아시도필루스 NCFM의 세포 부피 분포 및 위상차 사진. 세포 농도 (CC) 및 평균 세포 부피 (CV)를 각 배양에 대하여 나타낸다. 바 치수(bar dimension): 100 ㎛. 프로테오스 펩톤 3호를 포함하는 GEM 배지 및 MRSD로 현저히 더 작은 평균 세포 부피 (CV) 및 더 작은 L/D 비율이 관찰된다.
도 4: 37℃에서의 저장 후 동결건조 락토바실루스 아시도필루스 NCFM 제제의 생존력 상실. 동결건조 후 모든 샘플에 대한 평균 잔류 함수량은 3.3% ± 0.2%이었다. 평균 중량이동은 11.3%의 상대습도에서 저장한 샘플 (A)에 대하여 + 0.9 ± 0.3% (w/w) 및 건조 및 기밀성(gas-tight) 방식으로 저장한 샘플 (B)에 대하여 +0.3 ± 0.1% (w/w) 이었다.
도 5: 반복되는 압출과정 동안 락토바실루스 아시도필루스 NCFM의 박테리아 사멸(die-off). 측정은 3회1조로 행하였으며 평균치 ± S.D.로 나타낸다.
도 6: 상이한 가열 처리 MRS(D) 배지에서 18 h 동안 성장한 락토바실루스 아시도필루스의 총 세포 농도 및 평균 세포 부피. 부가적으로, 적용 배지의 갈변도는 420 nm에서의 흡광도(extinction) (또는 absorbance)로서 표시된다. 완전 자극 효과 (작은 세포 부피 및 높은 세포 농도)에 도달하기 위해서는 심지어 121℃에서 20 min 또는 100℃에서 8 h의 가열 처리가 필요함이 도해되어 있다. 이러한 자극 효과는 필경 마이야르 반응 생성물에 의하여 초래된 배지의 결과로서 생기는 갈변과 상관관계가 있다.
도 7: 선택 성분을 벌크 배지와 별도로 오토클레이빙하고 그후에 보충한 MRS(D) 배지에서 18 h 동안 성장한 락토바실루스 아시도필루스의 총 세포 농도 및 평균 세포 부피. 부가적으로, 적용 배지의 항산화능과 갈변을 나타낸다. 데이터에 따르면 완전 자극 효과 (작은 세포 부피 및 높은 세포 농도)에 도달하기 위해서는 글루코스 및 펩톤 3호의 존재하에서 벌크 배지를 가열 처리하여야 하는 것으로 보인다. 데이터는 독일 십진수 포맷으로 나타낸다.

하기 실시예는 본 발명을 실례를 들어 설명하지만 제한으로서 해석되지 않아야 한다.

하기 실시예를 위한 재료 및 방법:

균주 및 배지

락토바실루스 아시도필루스 NCFM을 다니스코 에이/에스(Danisco A/S, 덴마크 코펜하겐)로부터 입수하였다. 장기 저장을 위해, 박테리아를 -70℃에서 글리세롤 스톡 (33% v/v)으로서 유지하였다. 드 망 등 (1960)에 따른 기성(prefabricated) MRS 배지 (디프코^TM, 벡톤 디킨슨 게엠베하, 독일 하이델베르크) (여기서는 "MRSD"로 호칭)를 배양에 사용하였다. MRSD는 리터당 10 g 프로테오스 펩톤 3호, 10 g 우육 추출물, 5 g 효모 추출물, 20 g 덱스트로스, 1 g 폴리소르베이트 80, 2 g 시트르산암모늄, 5 g 아세트산나트륨, 0.1 g 황산마그네슘, 0.05 g 황산망가니즈 및 2 g 인산이칼륨을 함유하였다. 단일 실험을 위해, 다른 제조업체로부터의 동일 농도의 성분을 갖는 기성 MRS 배지를 사용하였다. 그들은 MRSR (카를 로스 게엠베하 앤드 컴퍼니 카게(Carl Roth GmbH & Co., KG), 독일 카를쉬루헤), MRSA (애플리켐 게엠베하(Applichem GmbH), 독일 다름슈타트) 및 MRSS (샬라우 케미 에스.에이(Scharlau Chemie S.A.), 스페인 센트메나트)로 표시한다. MRSS는 탄소원으로서 0.2% 글루코스 또는 0.2% 락토스로 조사하였다.

추가로, VTT (핀란드 기술연구센터) [Saarela et al. (2004)]에서 개발한 일반 식용 배지 (GEM)를 사용하였다. GEM은 리터당 30 g 대두 펩톤 (세르바 엘렉트로포레스 게엠베하(Serva Elektrophorese GmbH), 독일 하이델베르크), 7 g 효모 추출물 (세르바), 20 g 덱스트로스 (카를 로스), 0.4 g 인산이칼륨 (카를 로스), 1 g 인산이수소칼륨 (카를 로스), 1 g 황산마그네슘 (머크) 및 1 g 폴리소르베이트 80 (카를 로스)을 함유하였다. 일부 실험에서는 GEM중의 대두 펩톤을 다음과 같은 다양한 펩톤으로 대체하였다: 프로테오스 펩톤 3호 (디프코^TM 또는 같은 제품의 다른 이름 박토^TM, 벡톤 디킨슨), 대두 펩톤 (플루카 케미 게엠베하(Fluka Chemie GmbH), 독일 오베라히잉), 소이톤(Soytone) (디프코^TM, 벡톤 디킨슨), 트립톤 (박토^TM, 벡톤 디킨슨), 캐시톤(Casitone) (메르크 카게아아(Merck KGaA), 독일 다름슈타트). 모든 배지는 1 리터들이 병에서 121℃에서 20분 동안 완전한 조성물로서 멸균하였다.

상기 정의한 바와 같은 배양 배지와 조건을 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 카세이 서브스피시즈 람노수스, 락토바실루스 델브루에키이 서브스피시즈 락티스, 락토바실루스 델브루에키이 서브스피시즈 불가리쿠스, 락토바실루스 존소니이 La1, 락토바실루스 람노수스 GG 및 락토바실루스 살리바리우스 서브스피시즈 살리바리우스에 대하여 사용하였다.

배양 조건

전배양물(preculture)의 제조를 위하여, 50 ml의 MRSD에 2 ml의 글리세롤 스톡 배양물로 접종하고 6 h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 주 배치 발효물에 1% (v/v) 전배양물로 접종한 다음 특별히 명기하지 않는 한 정치 배양으로 정지 성장기까지 16 h 동안 인큐베이션하였다. 모든 발효는 37℃에서 행하였다.

동결건조용 샘플 제조

동결건조물의 제조를 위하여, 샘플을 수확하여 원심분리 (8 min, 5000 x g)를 통해 분리한 다음, 상청액을 (w/w) 1.5% 젤라틴, 1% 글리세롤, 5% 말토덱스트린 (글루시덱스 12^®) 및 5% 락토스 일수화물을 함유하는 동일 부피의 동결방지 및 라이오프로텍티브(lyoprotective) 매트릭스 LyoA로 대체하였다 (문헌 [Wesenfeld (2005) [Vitalitaet und Stabilitaet von probiotischen Mikroorganismen nach der Gefriertrocknung (Lyophilisation); Dissertation an der Fakultaet fuer Prozesswissenschaften der Technischen Universitaet Berlin)]). 이들 혼합물을 1 ml 분량으로 5 ml들이 유리 바이알에 분취하여, -70℃에서 적어도 20 h 동안 동결시킨 다음 28 h 동안 동결건조시켜 (감마 에이(Gamma A), 마르틴 크리스트 게프리에르트록눙산라겐 게엠베하(Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH), 독일 오스테로드) 하기 저장온도 프로파일을 갖는 0.022 mbar의 최소 압력이 되게 하였다: 22 h -20℃, 3 h +10℃, 3 h +30℃.

캡슐화 실험을 위한 샘플 제조

박테리아의 캡슐화는 듀럼(durum) 밀가루 매트릭스에 천연 배양 브로쓰의 혼입에 의하여 구현하였다. 가루반죽 제조를 위해, 16 h 성장 배양물을 10℃ 미만의 빙수에서 냉각하여, 듀럼 밀가루와 1:3 (g/g)의 비율로 혼합한 다음 휴대용 배합기로 수작업으로 혼련하였다. 그렇게하여 곡분을 점차적으로 용기에 넣어, 균질한 말랑말랑하고 연한(crumby) 가루반죽이 생성되도록 보장하였다. 생성되는 가루반죽을 1축 파스타 압출기 (PN 100, 하우슬러 게엠베하(Haussler GmbH), 독일 하일리히크로이츠탈)의 혼합탱크에 옮기고 112.5 g/min의 일정한 질량 유량으로 38.2 mm²의 총 다이 개구 면적을 갖는 76 x 0.8 mm 테플론-코팅 다이를 통해 압출시켰다. 파스타 절단 장치를 펠릿화에 사용하여, 약 4 내지 5 mm 길이의 펠릿을 생성하였다. 모든 샘플을 적어도 3개1조로 취하였다.

총 세포수 및 세포 부피 분포의 측정

세포수 및 세포 부피 분포를 베크만 멀티사이저^TM 3 쿨터 카운터^®(Beckman Multisizer^TM3 Coulter Counter^®, 베크만 쿨터 게엠베하(Beckman Coulter GmbH), 독일 크레펠트)로 측정하였다. 펄스 데이터를 멀티사이저^TM 3 소프트웨어 버전 3.53에 의하여 크기 특징으로 변환하였다. 부가적으로, 세포 형태를 현미경 검사 (악시오스코프(Axioskop) 40 FL, 카를 자이스 게엠베하(Carl Zeiss GmbH), 독일)에 의하여 제어하였다.

세포 생존의 측정

콜로니-형성 단위 (cfu)를 MRS-한천 (애플리켐)상에서 플레이트 계수법에 의하여 측정하였다. 플레이트를 37℃에서 48 내지 72 h 동안 호기적으로 인큐베이션하였다. 동결건조 샘플을 연속 희석에 앞서 0.85% NaCl 용액에서 재-수화시켰다. 캡슐화된 박테리아가 들어있는 펠릿을 미리 가온한 (37℃) 0.85% NaCl 용액에서 1:10 (w/w)으로 재-수화시켰다. 샘플 튜브를 튜브 어댑터상에 클램핑한 다음 30 min 동안 37℃에서 최대 주파수로 자동 혼합하였다 (볼텍스-지니(Vortex-Genie) 2, 사이언티픽 인더스트리즈 인코포레이티드, Scientific Industries Inc.). 용해된 가루반죽이 들어있는 용액을 십진 희석(decimal dilution)에 사용하고 전술한 바와 같이 플레이팅하였다. 저장중 생존력 상실은 보통 저장 개시에서의 그램당 cfu의 초기수 (N₀)로 나눈 저장후 그램당 cfu (N)의 log로서 표시하였다. 압출과정에 의한 캡슐화 전 (N₀) 및 후 (N) 샘플에 대하여 동일한 계산을 적용하였다.

박테리아 제제의 저장

아레니우스 관계식(Arrhenius relationship)이 보관 수명 거동의 특성해석에 적합한 것으로 예측하여, 가속 보관 수명 시험 (ASLT) 방법 (문헌 [Achour et al. (2001) (Application of the accelerated shelf life testing method ASLT to study the survival rates of freeze-dried Lactococcus starter cultures; Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 76, 624-628)]; 및 [King et al. (1998) (Accelerated storage testing of freeze-dried and controlled low-temperature vacuum dehydrated Lactobacillus acidophilus; J Gen Appl Microbiol, 44, 160-165)]을 이용하여 저장 후 박테리아 제제의 생존율을 평가하였다. 따라서, 동결건조 제제 및 가루반죽-캡슐화 펠릿을 기밀성 캡으로 밀폐한 건조 유리 바이알중 암실에서 또는 규정 상대습도의 분위기에서 저장하였다. 후자의 경우에, 개방 바이알을 포화 염화리튬 (머크) 용액으로 채워 11.3%의 상대습도가 되게 한 건조기에 저장하였다 (문헌 [Greenspan (1977) (Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions; J Res Natl Bur Stand A.,81, 89-96)]).

D 및 z 값

상이한 증식 박테리아의 저장 거동을 비교하기 위하여, D_T (아래 첨자, 대문자 T) 및 z 값을 계산하였다. D_T는 소정 저장시간 t [h] 경과 후 소정 저장온도 T [℃]에 대한 D 값 (집단에서 1 로그 변이 수득에 요구되는 시간)이며 시간(hour)으로 나타낸다. z 값은 ℃으로 나타내는 D 값의 10배 변이 수득에 요구되는 온도범위이다.

실시예 1

성장 배지가 간상 박테리아의 세포 형태에 미치는 영향

락토바실루스 아시도필루스 NCFM을 상이한 기성 MRS 배지에서 및 GEM에서 16 h 동안 성장시켰다. 규정 시간을 선택하여 집단이 정지 성장기에 도달한 것을 보장하였고, 따라서 지수 성장기에서의 가지각색의 성장 및 세포 분열 속도에 의하여 초래된 상이한 사슬 생성도로서의 현상은 무효로 한다(blanked out).

데이터를 증가하는 세포수의 순서대로 플롯팅한 결과를 도 1에 도해하였다. 입자 및 세포수 분석에 따르면 상이한 배지는 락토바실루스 아시도필루스 NCFM의 세포 크기 형상 및 총 세포수에 대하여 현저한 변이를 가져오고, 그에 따라 ml당 2.8^*10⁷ (MRSR) 내지 1.0^*10⁹ (MRSD) 세포에 이르고, 그에 상응하는 평균 세포 부피는 각각 2.61 내지 1.38 ㎛³인 것으로 드러났다 (도 1). 일반적으로, 평균 세포 부피는 세포수 감소에 따라 증가한다.

펩톤이 성장 거동 및 세포 형태에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 표준 대두 펩톤을 두 종의 다른 대두 펩톤, 카세인으로부터의 두 종의 펩톤 및 프로테오스 펩톤 3호 (상기 및 도 1 참조)를 포함하여 5종의 다른 선택 펩톤으로 대체한 GEM에서 락토바실루스 아시도필루스 NCFM을 증식시켰다. 변형 GEM에서, 변이는 디프코^TM로부터의 시험된 소이톤에 대하여 ml당 6.9^*10⁸ 세포 내지 프로테오스 펩톤 3호에 대하여 ml당 8.1^*10⁸ 세포에 이르렀다. 결과는, 함유하는 펩톤이 세포수와 세포 크기에 높은 영향을 미침을 증명해 보여준다. 추가로, 프로테오스 펩톤 3호를 포함하는 배지의 사용은 최고 세포수 및 최소 평균 세포면적을 가져옴이 분명하다.

다른 균주 및 종. 유사한 관찰결과 (프로테오스 펩톤 3호의, 특히 MRSD 배지의 탁월한 성능)가 락토바실루스 아시도필루스, 락토바실루스 카세이 서브스피시즈 람노수스, 락토바실루스 람노수스 GG 및 락토바실루스 델브루에키이 서브스피시즈 락티스에 대하여 관찰되었으며, 그에 따라 프로테오스 펩톤 3호가 다양한 종 및 균주에 걸쳐서 유익한 효과가 있음을 증명해 보여준다.

실시예 2

두 형태학적으로 다양한 집단에 대한 가속 저장 시험의 적용

가속 보관 수명 시험 (ASLT)을 확립하기 위하여, 락토바실루스 아시도필루스 NCFM의 동결건조 제제를 상이한 온도 (4, 20, 26, 37, 45 및 60℃)에서 저장하고 2일 (60℃) 내지 520일 (4℃)의 기간에 걸쳐서 빈번히 분석하였다. 이들 시험 시리즈를 대두 펩톤을 포함하는 GEM 및 MRSD에서 성장한 박테리아에 대하여 수행하였다. 상응하는 저장온도에 대하여 평균 log D 값을 플롯팅한 결과 (도 2) 0.99 보다 높은 회귀 계수가 나왔다 (표 1). MRSD에서 증식한 세포의 제제는 GEM에서 성장한 것들보다 안정하였다. 예를 들어, 4℃에서의 저장은 1.06의 log D₄ _℃값 차이를 가져오는데, 이는 GEM 배양물로 제조된 제제와 비교하여 MRSD 배양물로 제조된 제제에서의 11배 증진된 보관 수명에 해당한다.

또한, GEM 배양물로부터의 제제는 15.9℃의 z 값 (도 2에서 회귀방정식의 기울기의 역수)을 가졌으며, 이는 MRSD 제제의 것보다 4.5℃ 낮은 것이다 (표 2). 이러한 차이는 MRSD 배양물로부터의 제제가 동일 보관 수명을 유지하는 GEM 배양물로부터의 제제보다 4.5℃ 더 높은 온도에서 저장 가능함을 암시한다.

실시예 3

펩톤이 동결건조 및 저장중 안정성 거동에 미치는 영향

특히 프로세싱 후의 세포 안정성에 미치는 펩톤의 영향을 조사하기 위하여, 락토바실루스 아시도필루스 NCFM의 배양물을 16 h 동안 대두 펩톤을 함유하는 GEM (원 조성물), 프로테오스 펩톤 3호를 대신 함유하는 GEM, 및 MRSD에서 증식시켰다. 배양물의 특징을 도 3에 도시하였다.

수확 후, 샘플을 준비하여, 1 ml 분량으로 동결건조한 다음 상이한 분위기 조건하에 37℃에서 저장하였다 (도 4). 동결건조 후의 세포 생존은 MRSD, GEM (프로테오스 펩톤 3호) 및 GEM (대두 펩톤)에서 증식한 제제에 대하여 각각 104%, 77% 및 34%이었다. GEM에 프로테오스 펩톤 3호의 사용은 대두 펩톤을 대신 포함하는 GEM과 비교하여 동결건조 절차 중에 안정성 증진을 가져왔다. 이러한 안정성 경향은 도 4 및 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이 제제의 저장 중에 또한 검출가능하였다. 도 4에서 플롯팅한 생존력 상실에 대한 회귀 계수 (R²)는 0.87 내지 0.99이었으며, 이는 저장중 박테리아 생존력의 일관된 감소를 표시한다 (표 2). 양쪽 저장 조건에서, 대두 펩톤 대신에 프로테오스 펩톤 3호를 함유한 GEM에서 성장한 박테리아가 들어있는 제제가 약 40%의 D₃₇ _℃값 증가 (85 h → 115 h 및 168 h → 232 h; 표 2)를 보이면서 뚜렷하게 보다 안정하였다. 펩톤 3호를 함유한 GEM 및 MRSD에서 성장한 집단의 평균 세포 크기는 대략 유사하였다 (도 3).

MRSD 배양물의 안정성은 동일 펩톤을 함유한 GEM에서 성장한 배양물에 대해서보다 여전히 더 높았다. 그러므로 GEM에서 대두 펩톤을 프로테오스 펩톤 3호로 대체하는 것 역시 건조상태로 저장중에 박테리아 안정성의 증진을 가져왔지만, D₃₇ _℃값으로 해명되는 이러한 안정성 증진은 MRSD 배양물의 값에는 도달하지 못하였다. 특히 최소 수분 교환 상태의 조건하에서 저장한 제제는 1048 h의 최고 평균 D₃₇ _℃값을 가져왔다 (도 4B, 표 2).

11.3%의 상대습도에서 및 스냅 캡(snap cap)으로의 기밀 방식으로 저장한 샘플의 평균 중량이동은 각각 +0.9 ± 0.3% (w/w) 및 +0.3 ± 0.1% (w/w)이었다. 이들 중량이동은 주변 분위기와의 증기 평형 동안 오로지 샘플-매트릭스의 수분 수착에 의하여 초래됨을 추정할 수 있다. 11.3%의 상대습도에서 저장한 샘플에서의 보다 높은 수분 흡수는 제제에 증진된 수분 활성을 가져왔고 그리하여 분해 반응-응답성 박테리아 사멸의 증가로 귀결되었다 (도 4A 및 B, 표 2). 제시된 결과는 저장중 박테리아 생존력에 대한 기존 분위기중 상대습도-응답성 수분 활성의 높은 영향을 표시한다.

실시예 4

펩톤이 상이한 보호 포뮬러로의 동결건조중 안정성 거동에 미치는 영향

동결건조 진행중에 보호 매트릭스가 채용될 수 있다. 하나의 옵션은 10% 탈지유의 첨가이다. LyoA로 지칭되는 또 다른 보호 매트릭스가 문헌 [Wesenfeld (2005)]에 기재되어 있다. MRSD 배지 또는 대두 펩톤을 포함하는 GEM 배지 어느 한쪽과 연계한 10% 탈지유 및 LyoA의 효과를 평가하였다. 모든 실험에 대하여, 박테리아를 8시간 동안 배양하고, 원심분리한 다음, 상청액을 각각의 보호 매트릭스로 대체하였다. 실험 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

표 3의 결과는 돼지 프로테오스 펩톤 3호를 함유하는 배지에서 성장시 락토바실루스 아시도필루스의 증진된 안정성을 설명한다. 배지의 효과 (및 그러므로 세포집단 특징, 도 1 및 3 참조) 외에도, 보호 매트릭스의 높은 영향이 증명하여 보여진다.

실시예 4

압출과정중 상이한 형태를 갖는 세포의 거동

가루반죽 매트릭스중에 락토바실루스 아시도필루스 NCFM의 고정화는 산업상의 이용을 위한 추가 프로세싱 단계이었다. 압출과정이 상이한 크기를 갖는 박테리아에 미치는 영향을 조사하였다. 가루반죽에 박테리아의 배치식 혼입 후, 23.4% 및 65.0%의 미리 일어나는(prearising) 사멸 (곡분 첨가에 의하여 초래된 희석을 포함하여 배양 브로쓰 참조)이 각각 짧은 세포 (MRSD에서 16 h 성장) 및 신장형 세포 (대두 펩톤을 포함하는 GEM에서 16 h 성장)에 대하여 검출될 수 있었다. 압출과정중 기계적인 힘의 효과를 고려하기 위하여, 생성된 펠릿을 압출기의 공급 탱크로 환송하여 다시 압출하였다. 당해 절차를 3회 반복하였다. 반복 압출과정 후, 혼입된 MRSD 및 GEM 브로쓰에 대하여, 압출 단계당 평균 사멸은 각각 33.7% 및 62.4%이었다 (도 5). 0.89 (캡슐화 GEM 배양물) 및 0.98 (캡슐화 MRSD 배양물)의 상관계수는 각 압출과정중 상대적인 일관된 박테리아 사멸을 표시한다.

실시예 5

락토바실루스 아시도필루스를 37℃에서 18 h 동안 MRS(D) (타입 디프코(Type Difco)에 필적하는 MRS: 모든 성분은 수작업으로 칭량하며; 복합 화합물 펩톤, 육류 추출물 및 효모 추출물은 타입 디프코임)에서 성장시켰다.

MRS(D) 성분의 가용화 후, 배지를 100℃에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 h 동안 밀폐된 반응 튜브에서 가열 처리하였다. 참조로서 MRS(D) 배지를 표준 조건 (121℃, 20 min)하에서 배지 제조업자로부터 명시한 바와 같이 오토클레이빙하였다.

모든 배양 튜브를 중량 손실 (증발)의 계산을 위하여 비운채로 및 배지를 넣고 가열 처리 전후로 칭량하였다. 결과적으로, 어떠한 영향을 미치는 중량이동도 검출할 수 없었다.

마이야르 반응 생성물에 의하여 초래된 배지중 갈변도를 분광광도계로 420 nm에서의 흡광도 (E420nm)에 의하여 기록하였다 (문헌 [Morales et al., 2001 (Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence. Food Chemistry, 72, 119-125.)]).

도 6에서 알 수 있는 바와 같이, MRS(D) 배지의 쿠킹 시간과 달성가능한 세포 농도 및 특징적인 평균 세포 부피와의 직선 관계가 존재한다. 이들 두 파라미터에 따라, 8 h 동안 쿠킹되는 MRS(D) 배지는 표준 방법을 이용하여 오토클레이빙한 배지와 동일한 품질을 갖는다.

실시예 6

락토바실루스 아시도필루스 NCFM을 4가지 변형 MRS(D) 배지 (타입 디프코에 필적하는 MRS: 모든 성분은 수작업으로 칭량하고; 복합 화합물 펩톤, 육류 추출물 및 효모 추출물은 타입 디프코임)에서 성장시켰다. 각 배지에 대하여, 증기 멸균중에 하나의 성분을 탈락시켰다. 당해 성분을 추후에 냉각 벌크 배지에 최초 농도로 용해시켰다:

배지 1) 벌크 배지의 오토클레이빙 후 글루코스 보충.

배지 2) 벌크 배지의 오토클레이빙 후 펩톤 3호 보충.

배지 3) 벌크 배지의 오토클레이빙 후 육류 추출물 보충.

배지 4) 벌크 배지의 오토클레이빙 후 효모 추출물 보충.

참조로서, 8 h 동안 쿠킹한 MRS(D) 배지를 사용하였다. 배지를 부가적으로 항산화능의 측정 (포토켐(PHOTOCHEM)^® 시스템, 아날리틱 예나 악티엔게젤샤프트(Analytik Jena AG), 독일) 및 420 nm에서의 흡광도 측정에 의하여 특성해석하였다. 항산화능의 결과는 수용성 물질에 대한 아스코르브산의 당량 농도 단위로 제시한다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 가열멸균 과정중 MRS(D)로부터 글루코스의 탈락은 세포 성장에 현저한 효과를 나타낸다. 글루코스 부재하의 멸균은 락토바실루스 아시도필루스의 불량한 성장 및 바람직하지 못한 세포 형상을 동반하는 배지를 초래한다. 육류 또는 효모 추출물의 탈락은 모든 성분을 함께 가열 처리한 배지와 동등한 성장 배지의 완전 자극 효과를 가져왔다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 뉴클레오티드 유도체가 마이야르 반응 생성물의 존재하에서 보다 높은 정도로 이용가능한 것으로 생각된다.

Claims

배양중 간상 프로바이오틱(rod-shaped probiotic) 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포의 부피 및/또는 길이-대-직경 비를 제어하기 위한 펩톤의 용도.
제1항에 있어서, 상기 제어가 감소시키는 것이고 상기 펩톤이 지방 스톡(fat stock) 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물인 용도.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩톤의 존재하에서 상기 세포의 평균 부피가 3 ㎛³미만, 바람직하게는 2 내지 3 ㎛³, 더욱 바람직하게는 1.4 내지 2 ㎛³, 가장 바람직하게는 1.1 내지 1.4 ㎛³이고, 평균 길이-대-직경 비가 5 미만, 바람직하게는 4 미만 또는 3 미만 또는 2.5 미만, 더욱 바람직하게는 2.2 미만 또는 2.1 미만 또는 2.0 미만, 가장 바람직하게는 1.8 미만인 용도.
간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포의 생존력, 안정성, 보관 수명, DNA 복제, 격막 형성 및/또는 세포 분열을 증가시키기 위한 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물의 용도.
배양중 간상 그램-양성 박테리아, 바람직하게는 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포의 평균 부피 및/또는 평균 길이-대-직경 비를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 낮은 평균 부피 또는 낮은 평균 길이-대-직경 비는 적합한 배지를 나타내고, 바람직한 평균 부피 및 평균 길이-대-직경 비는 제3항에서 정의한 바와 같은 것인,
상기 세포의 생존력을 증가시키거나 또는 배지에서 배양된 상기 세포를 포함하는 제제의 안정성 또는 보관 수명을 증가시키는 세포 배양 배지를 선택하는 방법.
간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포를 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물의 존재하에서 배양하는 것을 포함하며, 여기서 상기 세포의 평균 부피는 3 ㎛³ 미만, 바람직하게는 2 내지 3 ㎛³, 더욱 바람직하게는 1.4 내지 2 ㎛³, 가장 바람직하게는 1.1 내지 1.4 ㎛³이고, 상기 세포의 평균 길이-대-직경 비는 5 미만, 바람직하게는 4 미만 또는 3 미만 또는 2.5 미만, 더욱 바람직하게는 2.2 미만 또는 2.1 미만 또는 2.0 미만, 가장 바람직하게는 1.8 미만인,
배양중 상기 세포의 평균 부피 및/또는 평균 길이-대-직경 비를 확립하는 방법.
간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포를 지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물의 존재하에서 배양하는 것을 포함하는, 상기 세포의 생존력, 안정성, 보관 수명, DNA 복제, 격막 형성 및/또는 세포 분열을 증가시키는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로바이오틱 박테리아 또는 발효 박테리아가 간상 락토바실루스목(Lactobacillales), 간상 비피도박테리아목(Bifidobacteriales), 간상 바실루스목(Bacillales) 및 간상 클로스트리디움목(Clostridiales), 바람직하게는 간상 락토바실루스과(Lactobacillaceae), 간상 비피도박테리아과(Bifidobacteriaceae) 및 간상 바실루스과(Bacillaceae), 더욱 바람직하게는 락토바실루스(Lactobacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 바실루스(Bacillus) 및 클로스트리디움(Clostridium)으로부터 선택되는 것인 용도 또는 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 생존력은 배양에서 또는 제제에서의 생존력이고;
(b) 안정성은 제제에서의 안정성이고;
(c) 보관 수명은 제제에서의 보관 수명이고;
(d) DNA 복제는 배양에서의 DNA 복제이고;
(e) 격막 형성은 배양에서의 격막 형성이고;
(f) 세포 분열은 배양에서의 세포 분열인 용도 또는 방법.
제9항에 있어서, 상기 제제는 상기 세포가 보호 매트릭스중에 캡슐화되거나 또는 포매되는 제제, 예컨대 압출물 또는 구형물; 동결건조물; 동결 제제; 및 건조 제제로부터 선택되는 것인 용도 또는 방법.
제6항 또는 제7항에서 정의한 바와 같은 방법 및 각각 압출, 동결건조 및/또는 동결하는 것을 포함하는, 간상 프로바이오틱 박테리아 또는 간상 발효 박테리아의 세포를 포함하는 압출물, 동결건조물 또는 동결 제제를 제조하는 방법.
평균 부피가 3 ㎛³ 미만, 바람직하게는 2 내지 3 ㎛³, 더욱 바람직하게는 1.4 내지 2 ㎛³, 가장 바람직하게는 1.1 내지 1.4 ㎛³이고/거나 평균 길이-대-직경 비가 5 미만, 바람직하게는 4 미만 또는 3 미만 또는 2.5 미만, 더욱 바람직하게는 2.2 미만 또는 2.1 미만 또는 2.0 미만, 가장 바람직하게는 1.8 미만인 간상 프로바이오틱 박테리아 및/또는 간상 발효 박테리아를 포함하거나 또는 그들로 이루어지는 조성물.
제12항에 있어서, 배양 배지, 음료, 인간 또는 동물 소비용 식품, 사료, 식이 보충제, 생물방제제, 의약품, 압출물, 동결건조물, 동결 제제 및 건조 제제로부터 선택되는 조성물.
제6항, 제7항 및 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득가능하거나 또는 수득되는, 간상 프로바이오틱 박테리아 및/또는 간상 발효 박테리아를 포함하거나 또는 그들로 이루어지는 조성물.
지방 스톡 펩톤, 바람직하게는 돼지 기원의 펩톤, 더욱 바람직하게는 돼지 기원의 펩신 소화물을 환원당, 예컨대 글루코스, 프룩토스, 갈락토스, 말토스 및 락토스의 존재하에 100℃ 내지 130℃의 온도에서 적어도 15분 동안 처리하는 것을 포함하는, 세포 배양 배지를 제조하는 방법.