JP5209294B2 - インターロイキン12産生促進剤 - Google Patents
インターロイキン12産生促進剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5209294B2 JP5209294B2 JP2007331913A JP2007331913A JP5209294B2 JP 5209294 B2 JP5209294 B2 JP 5209294B2 JP 2007331913 A JP2007331913 A JP 2007331913A JP 2007331913 A JP2007331913 A JP 2007331913A JP 5209294 B2 JP5209294 B2 JP 5209294B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- production
- interleukin
- component
- lactobacillus
- bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
(2)NK細胞及びCD8+T細胞の細胞傷害活性を増強する。
(3)インターロイキン2と相乗的に作用して細胞傷害性リンパ球を活性化すると共にリンホカイン活性化キラー細胞を誘導する。
(4)ナイーブT細胞からTh1細胞への分化を促す。
さらに、前記ウィルス処理物は、化学的に合成されたもの、例えば合成2本鎖RNA等であってもよく、具体的には、L−イノシン酸・L−シチジル酸コポリマー(poly(I:C))等の合成2本鎖RNAは市販の核酸合成装置により合成することが可能である。また、鞭毛を有する細菌の処理物は、例えば、FliC等のフラジェリンをコードする遺伝子を非病原性細菌やHEK293等の培養細胞株に導入してリコンビナントフラジェリンを強制的に産生させた細菌や培養細胞の処理物であっても良いし、密度勾配遠心法などによりリコンビナントフラジェリンを精製して用いることもできる。
本発明において、「菌体消化酵素による消化率」とは、N−アセチルムラミダーゼの一種であるM−1酵素(EC 3.2.1.17)による消化試験を行った際の被験物質の消化率を意味する。具体的には、以下に示す消化試験を行い、被験物質の消化率を算出することができる。
まず、4mM塩化マグネシウムを含む50mMトリス・マレイト緩衝液(pH7.0)中に被験物質を2mg/mlで懸濁し、M−1酵素を添加(10μg/ml)して37℃で10分反応を行った後、100℃、5分の加熱処理により酵素活性を失活させた。反応液に対してSDS溶液を添加し(終濃度2%)、ボルテックスにて十分攪拌してプロトプラスト状の被験物質を溶解させた後、濁度(OD600)を測定した。消化率の算出には以下の式を用いた。
ここで、IL−12産生促進作用を有するとは、次式により求められるIL−12産生増加能が120%以上のものを意味し、好ましくは150%以上のものを意味する。
このとき、成分(A)と(B)との配合比率に厳格な制限はないが、相乗的なIL−12産生促進作用を奏する点で、成分(A):成分(B)は1:0.0001〜1が好ましく、1:0.001〜1がより好ましく、1:0.01〜1がさらに好ましく、1:0.1〜1が特に好ましい(成分(B)は精製された単一の有効成分量で換算)。
(1)細菌並びにウィルス及び鞭毛を有する細菌の処理物
ラクトバチルス・カゼイ(YIT 9029)については、200mlのDifcoTM Lactobacilli MRS培地(BD社)を用いて、37℃で20時間培養した。菌体は遠心分離(8000回転、10分)により集菌し、滅菌ミリQ水を用いて遠心洗浄を3回繰り返した後、200mlの滅菌ミリQ水に懸濁して、100℃で30分間の加熱処理をした後、凍結乾燥した。合成2本鎖RNA(商品名:poly(I:C))(TLR3リガンド)、サルモネラ菌由来のフラジェリン(TLR5リガンド)、スタフィロコッカス・オウレウス由来のリポテイコ酸(TLR2リガンド)はインビボジェン社よりそれぞれ購入した。
また、ラクトバチルス・ラムノーサス(ATCC7469)については、アメリカンタイプカルチャーコレクションより、ラクトバチルス・ジョンソニー(JCM2012)については、ジャパンコレクションオブマイクロオーガニスムよりそれぞれ購入し、ラクトバチルス・カゼイと同様の方法で加熱死菌体を調製した。
本発明の成分(B)としては、前記合成2本鎖RNAの他、ウィルス由来の2本鎖RNAも利用することができ、その調製方法は特に限定されないが、例えば、ロタウィルス由来の2本鎖RNAの調製方法として、具体的に以下に示す方法を好適に用いることができる。MA104細胞等を用いてロタウィルスを培養し、フレンチプレス等によりウィルス膜を物理的に破壊し、遠心分離により不溶性画分を除去した後、エタノール等によって核酸画分を沈殿させて2本鎖RNAを精製することができる。
鞭毛を有する細菌由来のフラジェリンの調製方法としては、特に限定されないが、一般的な細菌の鞭毛精製法を用いることができる。例えば、サルモネラ菌由来のフラジェリンの調製方法として、具体的には以下に示す方法を好適に用いることができる。ブイヨン培地等で培養したサルモネラ菌を遠心分離により集菌し、生理食塩水に懸濁してホモジナイザーで機械的に破壊し、低速遠心分離にて菌体残渣を除去した後、超遠心分離にて粗フラジェリン画分を得ることができる。さらに、粗フラジェリン画分から密度勾配遠心法により精製フラジェリンを得ることができる。
本試験例における被験物質としては、本発明の有効成分である成分(A)、(B)の他、陰性対照物質として、表1に示す成分(C)、(D)を用いた。
日本SLC社より購入した9週齢のメスのBALB/cマウスの腹腔内に4%チオグリコレート(ディフコ社)溶液2mlを投与した。4日後に腹腔内に誘導されてくる細胞をハンクス溶液(シグマ社)10mlを用いて回収し、腹腔マクロファージとした。腹腔マクロファージはハンクス溶液で3回洗浄後、10%牛胎児血清を含むRPMI 1640培地(シグマ社)に懸濁した。96ウエル培養プレート(ヌンク社)に腹腔マクロファージ(1×105個/ウエル/0.2ml)をまき、成分(A)若しくは(C)(10μg/ml)又は成分(B)若しくは(D)(1μg/ml)を単独で、又は、混合して添加して37℃で培養した。24時間後の培養上清を回収し、IL−12p70の濃度をELISAで定量した。ELISAでのIL−12p70の濃度の定量方法について以下に説明する。96ウエルELISAプレートに抗マウスIL−12抗体(クローン9A5、200倍希釈、ファーミンジェン社)を4℃で一晩吸着させた。1%牛血清アルブミンでブロッキングした後、20倍又は4倍に希釈した培養上清又は標準IL−12p70(ファーミンジェン社)を添加して室温で90分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ビオチン標識抗マウスIL−12抗体(クローンC17.8、1000倍希釈、ファーミンジェン社)を添加して室温で90分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ(20000倍希釈、セロテック社)を添加して室温で30分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、TMB試薬を添加して室温で10分間反応させ、1N硫酸を加えて反応を停止し、450nmの吸光値を測定した。標準IL−12p70から検量線を作成し、培養上清中の濃度を算出した。
成分(A)、(B)、(C)、(D)を単独で添加した場合のIL−12の産生量、成分(A)又は(C)と成分(B)又は(D)とを組み合わせて添加した場合のIL−12の産生量を表1に示した。成分(A)と成分(B)を組み合わせて添加した場合、両成分単独でのIL−12誘導量を加算した値以上に相乗的にIL−12産生が強く誘導された。一方、成分(A)と成分(D)、成分(C)と成分(B)を組み合わせて添加した場合はIL−12産生の相乗的な誘導効果は認められなかった。
(1)N−アセチルムラミダーゼ処理
ラクトバチルス・カゼイ(YIT 9029)、ラクトバチルス・ラムノーサス(ATCC 7469)、ラクトバチルス・ジョンソニー(JCM 2012)を4mM塩化マグネシウムを含む50mMトリス・マレイト緩衝液(pH7.0)中に懸濁し(2mg/ml)、N−アセチルムラミダーゼ(M−1酵素(EC 3.2.1.17)、生化学工業)を添加(10μg/ml)して37℃で10分反応させた。100℃、5分の加熱処理により酵素活性を失活させた後、反応液に対して1/4容量の10%SDS溶液を添加し、ボルテックスにて十分攪拌してプロトプラスト状の被験物質を溶解させた。その後、600nmの吸光度を測定し、消化率を算出した。
さらに、菌株保存機関より入手したラクトバチルス・カゼイ4株、ラクトバチルス・ラムノーサス4株、ラクトバチルス・ゼアエ1株、ラクトバチルス・ファーメンタム3株、ラクトバチルス・ガッセリ4株、ラクトバチルス・ジョンソニー4株、ラクトバチルス・アシドフィルス4株、ラクトバチルス・デルブルッキー4株、ラクトバチルス・ヘルベティカス4株、ラクトバチルス・プランタラム4株の36株の乳酸桿菌について、同様にN−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を調べた。また、マウス腹腔マクロファージ培養系にこれらの乳酸桿菌を添加(10μg/ml)して24時間培養し、上清中に誘導されるIL−12量をELISAで測定した。
ラクトバチルス・カゼイ(YIT 9029)、ラクトバチルス・ラムノーサス(ATCC 7469)、ラクトバチルス・ジョンソニー(JCM 2012)のN−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を表2に示した。
N−アセチルムラミダーゼ処理による成分(A)(ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノーサス)の消化率は5.7%以下であった。
36株の乳酸菌について、N−アセチルムラミダーゼ処理による消化率とIL−12誘導活性を調べ、両者の関係を解析したところ、消化率とIL−12誘導量との間に負の相関(r=0.747)が認められた。すなわち、菌体消化酵素による消化率が高いものはIL−12誘導活性が弱く、逆に、菌体消化酵素による消化率が低いものはIL−12誘導活性が強いことがわかった。
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
(処方) (mg)
ラクトバチルス・カゼイ 10
2本鎖RNA 1
微結晶セルロース 100
乳糖 80
ステアリン酸マグネシウム 0.5
メチルセルロース 12
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
(処方) (mg)
ラクトバチルス・カゼイ 10
フラジェリン 1
微結晶セルロース 100
乳糖 80
ステアリン酸マグネシウム 0.5
メチルセルロース 12
下記の処方で処方したものを加熱殺菌後、褐色瓶にホットパック充填を行い、清涼飲料水を得た。
(処方) (g)
ラクトバチルス・カゼイ 0.4
枯草菌破砕物 0.1
香料 0.8
クエン酸 0.2
果糖 4
スクラロース 0.001
水 94.199
15%脱脂乳に3%グルコースを添加し、120℃で3秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT 9029株を1%接種し、37℃でpH3.6まで培養してヨーグルトベース210gを得た。一方、砂糖97g、クエン酸鉄0.2g、枯草菌破砕物0.3gを水に溶解し、水を加え全量を790gとし、この溶液を110℃で3秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を1g添加した後、15Mpaで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は108cfu/mlであった。
15%脱脂乳に3%グルコースを添加し、120℃で3秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT 9029株を1%接種し、37℃でpH3.6まで培養してヨーグルトベース210gを得た。一方、砂糖97g、クエン酸鉄0.2g、枯草菌加熱処理死菌体0.3gを水に溶解し、水を加え全量を790gとし、この溶液を110℃で3秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を1g添加した後、15Mpaで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は108cfu/mlであった。
Claims (5)
- (A)ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ラムノーサスから選ばれるインターロイキン12産生誘導能を有する細菌と、(B)TLR3又はTLR5のリガンドを組み合わせてなるインターロイキン12産生促進剤。
- TLR3のリガンドが、ウィルスの2本鎖RNA又はL−イノシン酸・L−シチジル酸コポリマーである請求項1記載のインターロイキン12産生促進剤。
- ウィルスの2本鎖RNAが、ロタウィルス由来の2本鎖RNAである請求項2記載のインターロイキン12産生促進剤。
- TLR5のリガンドが、フラジェリンである請求項1記載のインターロイキン12産生促進剤。
- フラジェリンが、枯草菌、大腸菌及びサルモネラ菌から選ばれる1種以上の細菌由来のフラジェリンである請求項4記載のインターロイキン12産生促進剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007331913A JP5209294B2 (ja) | 2007-12-25 | 2007-12-25 | インターロイキン12産生促進剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007331913A JP5209294B2 (ja) | 2007-12-25 | 2007-12-25 | インターロイキン12産生促進剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009155221A JP2009155221A (ja) | 2009-07-16 |
JP5209294B2 true JP5209294B2 (ja) | 2013-06-12 |
Family
ID=40959616
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007331913A Active JP5209294B2 (ja) | 2007-12-25 | 2007-12-25 | インターロイキン12産生促進剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5209294B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR3004109B1 (fr) * | 2013-04-09 | 2016-01-01 | Pf Medicament | Composition comprenant une association d'un extrait de sureau et d'une souche de lactobacillus rhamnosus |
AU2014288647B8 (en) | 2013-07-12 | 2015-10-29 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Novel Lactic Acid Bacterium, Drug, Food or Drink, and Feed which Contain the Novel Lactic Acid Bacterium |
BR122022016606B1 (pt) | 2013-07-12 | 2023-01-24 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd | Lactobacillus paracasei mortos pelo aquecimento, medicamento, alimento ou bebida, ração, agente promotor da produção de il-12 e uso |
KR102333252B1 (ko) | 2013-12-04 | 2021-11-30 | 가부시키가이샤 야쿠르트 혼샤 | 미생물의 산내성 조절 방법 |
CN107174654A (zh) * | 2016-03-10 | 2017-09-19 | 广东思峰生物科技有限责任公司 | 白细胞介素‑12的新用途 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4059648B2 (ja) * | 2001-08-28 | 2008-03-12 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 経口用サイトカイン誘導剤 |
-
2007
- 2007-12-25 JP JP2007331913A patent/JP5209294B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009155221A (ja) | 2009-07-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI359668B (ja) | ||
EP3725321A1 (en) | Composition containing bacterium belonging to genus bifidobacterium as active ingredient | |
WO2020246585A1 (ja) | 栄養組成物 | |
WO2016049879A1 (zh) | 拟杆菌在治疗或预防肥胖相关疾病中的用途 | |
TW201803576A (zh) | 以新生兒為對象的腦功能改善用組成物 | |
JP5019961B2 (ja) | インターロイキン10産生促進剤 | |
US20190240268A1 (en) | Infection protective agent for infants | |
JP5337535B2 (ja) | Nk活性増強剤 | |
JP5209294B2 (ja) | インターロイキン12産生促進剤 | |
EP3777869A1 (en) | Sleep-promoting composition, and medicinal composition and food and beverage composition using said sleep-promoting composition | |
WO2011071134A1 (ja) | インフルエンザ感染症の予防組成物 | |
WO2018190407A1 (ja) | Toll様受容体2活性化用組成物 | |
JP2019116423A (ja) | 整腸用組成物 | |
JP5238166B2 (ja) | インターロイキン12産生抑制剤 | |
JP2009057346A (ja) | 免疫バランス調節用組成物 | |
JP6491422B2 (ja) | 免疫疾患予防剤 | |
JP7436358B2 (ja) | 母乳成分増強用組成物 | |
EP2612673A1 (en) | Intestine immunomodulator | |
JP6061530B2 (ja) | Nash予防治療剤 | |
WO2017022560A1 (ja) | 形質細胞様樹状細胞増加剤 | |
TW201818828A (zh) | 抑制腸道內乳桿菌屬乳酸菌減少用之組成物 | |
JP7266580B2 (ja) | 学童期以降の高血糖に起因する疾患の予防のための乳幼児用組成物 | |
WO2020116511A1 (ja) | ノロウイルス感染抑制用組成物 | |
JP2012126700A (ja) | 胃腸機能亢進剤 | |
JP7309436B2 (ja) | 腎機能障害予防又は改善用組成物、並びに、該腎機能障害予防又は改善用組成物を用いた医薬品組成物及び飲食品組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100514 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120925 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121126 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130129 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130221 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160301 Year of fee payment: 3 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5209294 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160301 Year of fee payment: 3 |