JP6061530B2

JP6061530B2 - Ｎａｓｈ予防治療剤

Info

Publication number: JP6061530B2
Application number: JP2012164992A
Authority: JP
Inventors: 憲広久保田; 将一角; 百合子永田; 狩野　光芳; 光芳狩野; 幸司宮崎
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2012-07-25
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2032-07-25
Also published as: JP2014024776A

Description

本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防治療剤に関する。

近年、肥満の人で飲酒習慣がないにも関わらず、脂肪肝から肝硬変や肝がんになる患者が増えている。脂肪性肝疾患のうち、明らかな飲酒歴がないのにも関わらず、アルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害を認める症例をＮｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｆａｔｔｙｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ）といい、そのうち肝組織で肝細胞の風船様腫大を伴う脂肪性肝炎を認める症例を特にＮｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＮＡＳＨ）と呼んでいる。当該ＮＡＳＨは、肝硬変や肝がんになるリスクが高いことから、この予防、治療手段の開発が望まれている。

ＮＡＳＨの治療効果を奏する乳酸菌として、ストレプトコッカス・サーモフィラス・エス・エス・ピー・サリヴァリウス（ＣＤ８株）（ＤＳＭ１４６６７）が知られている（特許文献１）。

特表２００５−５１２５９０号公報

しかしながら、前記乳酸菌ストレプトコッカス・サーモフィラス・エス・エス・ピー・サリヴァリウス（ＣＤ８株）は、ヒトに対して、１日あたり１兆８０００億の菌を４カ月間投与した時に、投与前に比べて血清中のＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）の値を約５０％低下するものであり、その効果は低いものであった。そして肝臓の小葉内炎症の低減や線維化の改善については何ら記載されていない。
従って、本発明の課題は、日常的に安全に摂取することが可能で、ＮＡＳＨ予防治療効果も高いＮＡＳＨ予防治療剤を提供することにある。

そこで本発明者は、まず、ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を呈するモデル動物を作製すべく種々検討したところ、全く意外にも、高脂肪食を摂取させて肥満にさせるとともに、肝障害を誘発する薬剤（以下、肝障害剤という）を４回以上投与することにより、大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大しているという、ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を有するモデル動物が作製できること、さらに当該モデル動物を用いれば被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果が評価でき、ＮＡＳＨ予防治療剤がスクリーニングできることを見出した。そして、当該ＮＡＳＨモデル動物を用いて種々の成分を用いてスクリーニングを行い、乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する乳酸菌が、ＮＡＳＨ特有の症状等を改善する作用を有し、ＮＡＳＨ予防治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。

従って、本発明は、乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する乳酸菌を有効成分とするＮＡＳＨ予防治療剤を提供するものである。

本発明のＮＡＳＨ予防治療剤は、乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する乳酸菌を有効成分としており、ＮＡＳＨ特有の症状を顕著に改善し、ＮＡＳＨ予防治療効果が高いという点で有用である。またさらに、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）の値が４０％以上低下するものであるという点でも、効果が高く有用である。

菌体試験群の肝臓における病理組織学的変化を示す図である。Ａ、Ｂ：通常食群（正常肝）、Ｃ、Ｄ：コントロール群（ＮＡＳＨ）、Ｅ、Ｆ：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ群（小葉内炎症が軽微に抑制された所見）、Ｇ、Ｈ：Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群（小葉内炎症が軽微に抑制された所見）。Ａ−Ｈ：×２０。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ：ＨＥ染色、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ：Ｍ−Ｔ染色。

本発明のＮＡＳＨ予防治療剤は、乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する乳酸菌を有効成分とするものである。より詳細には、後記表２に記載の菌末含有高脂肪食（菌末含有高脂肪食あたりの菌数：菌末含有高脂肪食１ｇ中の菌数は以下の式で求める：培養液中の培養終了時の生菌数／凍結乾燥で製造された菌末量（ｇ）×菌末含有高脂肪食１ｇ中の菌末の重量（ｇ）。Ｌ．Ｃｒｉｓｐａｔｕｓ：２．４７×１０¹²／１．７５４×０．０００５＝７．０４×１０⁸／ｇ、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．７４×１０¹²／１．５５×０．０００５＝８．８４×１０⁸／ｇ、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：７．３６×１０¹²／２．７３７×０．０００５＝１．３４×１０⁹／ｇ、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．４×１０¹²／２．９９５×０．０００５＝４．０１×１０⁸／ｇ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：４．６×１０¹¹／２．４４４×０．０００５＝９．４１×１０⁷／ｇ）を１２週間自由摂取させ（マウス１匹あたりの飼料の平均摂取重量Ｌ．Ｃｒｉｓｐａｔｕｓ：２．４ｇ／日、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．４ｇ／日、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：２．４ｇ／日、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．４ｇ／日、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：２．６ｇ／日）、菌末含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与する。四塩化炭素を最終投与してから２４時間後に血液を採取し、血清中のＡＬＴ値をトランスアミナーゼＣII テストワコー（和光純薬）を用いて測定する。そのＡＬＴ値が、乳酸菌非投与のマウス（表２に記載の高脂肪食を１２週間投与し、前記と同様に四塩化炭素を８回投与したマウス）に比べて６５％以上低下する乳酸菌である。この乳酸菌非投与群のマウス１匹あたりの飼料の平均摂取量は、２．５ｇ／日である。この時にマウスが摂取した乳酸菌の菌数は、いずれの菌種でも１×１０¹⁰／ｇ×３ｇ×７×１２＝２．５２×１０¹²よりも少ないものであるが、これよりも少ない菌数で、乳酸菌非投与のマウスに比べてＡＬＴが６５％以上低下する場合は、乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際にも、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下するものである。また、前記ＡＬＴと同様の測定方法によりＡＳＴを測定した時に、乳酸菌非投与のマウスに比べて、血清中のＡＳＴの値が４０％以上低下する乳酸菌を用いることがより好ましい。

このような性質を有する乳酸菌であれば、その種類は特に制限されるものではなく、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキィーサブスピーシーズ．ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキィーサブスピーシーズ．デルブルッキィー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンチィス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｇｕｌａｔｕｍ）、ヒトの腸内から分離される由来を持つビフィドバクテリウム・ガリカム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇａｌｌｉｃｕｍ）、食品に利用されているビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓ）等の乳酸菌が挙げられる。これらの中でも特に、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、さらにビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７（ＦＥＲＭＢＰ−１０６１３）、ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ０１３２（ＦＥＲＭＢＰ−１１３４９）、ラクトバチルス・サリバリウスＹＩＴ０４３２（ＦＥＲＭＰ−２２１２９）、ストレプトコッカス・サーモフィルスＹＩＴ２００１（ＦＥＲＭＢＰ−７５３８）からなる群から選ばれる１種以上が好ましい。また、これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（NITE-IPOD）（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。なお、特表２００５−５１２５９０号公報に記載のストレプトコッカス・サーモフィラス・エス・エス・ピー・サリヴァリウス（ＣＤ８株）（ＤＳＭ１４６６７）は、現在の分類では、ストレプトコッカス・サリバリウスに分類されるべきものであり、ストレプトコッカス・サーモフィルスとは別種の菌である。

なお、乳酸菌の使用形態は、例えば、細菌菌体（生菌）及び当該細菌菌体の処理物から選ばれる１以上を挙げることができる。当該処理物としては、常法の処理による処理物であれば特に限定されず、例えば、加熱菌体（死菌体）、その凍結乾燥物、それらを含有する培養物、細菌の超音波等による破砕液、細菌の酵素処理液、それらを濾過や遠心分離等の固液分離手段によって分離した固体残渣等；細胞壁を酵素若しくは機械的手段により除去した処理液、当該処理液の濃縮物、それらの希釈物、それらの乾燥物等；細菌を界面活性剤等によって溶解した後、エタノール等によって沈殿させて得られる核酸含有画分；前記細菌の超音波等による破砕液や細胞の酵素処理液等に対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの分離・精製処理を行ったもの等が挙げられる。
前記死菌体は、例えば、加熱処理、抗生物質等の薬物による処理、ホルマリン等の化学物質による処理、紫外線による処理、γ線等の放射線による処理により得ることができる。後述のように、乳酸菌の培養終了時の生菌数を一定量含有するものであれば、生菌・死菌・その他の菌体処理物を問わず、有効性が期待できる。

本発明において、「ＮＡＳＨ予防治療」とは、ＮＡＳＨを予防及び／又は治療することをいい、本発明に用いる乳酸菌は、後記実施例に示すように、乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下するものであり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上低下するものである。また、好ましくは血清中ＡＳＴが４０％以上低下し、より好ましくは５０％以上低下し、さらに好ましくは８０％以上低下するものである。また、好ましくはＮＡＳＨ特有の症状である小葉内の炎症、線維化が改善し、優れたＮＡＳＨ予防治療作用を有するものである。また、本発明に用いる乳酸菌は、小葉内の抗炎症剤、抗線維化剤として用いることもできる。

本発明のＮＡＳＨ予防治療剤を医薬品として使用する場合において、経口投与製剤の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、糖衣錠、丸剤、細粒剤、散剤、粉剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、乳剤、凍結乾燥剤、液剤、エリキシル剤、経口ゼリー剤等が挙げられる。

また、医薬品として使用する場合の製剤は、常法によって製造でき、本発明の乳酸菌を単独で使用してもよく、薬学的に許容される担体と組み合わせて使用してもよい。当該薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料、希釈剤、殺菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定化剤、吸収助剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、湿潤剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、等張化剤、無痛化剤、矯臭剤等が挙げられる。

結合剤としては、例えば、デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。

崩壊剤としては、例えば、デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。
滑沢剤としては、例えば、タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
流動性促進剤としては、例えば、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。

希釈剤としては、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

また、本発明のＮＡＳＨ予防治療剤は、上記のような医薬品として用いるだけでなく、飲食品、医薬部外品、ペットフード等として用いることもできる。
この場合には、上記乳酸菌をそのまま、又は種々の栄養成分を加えて、上記飲食品等に含有せしめればよい。この飲食品は、ＮＡＳＨの予防・治療に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品等又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明のＮＡＳＨ予防治療剤を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品；パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用し、又は水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。

さらに飲食品としては、有効成分である乳酸菌を含有する発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵製品が好適に用いられる。これら発酵飲食品の製造は常法に従って製造することができる。例えば発酵乳は、殺菌した乳培地に乳酸菌を接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、さらにフレーバーを添加して最終製品とすることができる。このようにして得られる発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。

また、本発明のＮＡＳＨ予防治療剤の有効成分である乳酸菌を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、ＮＡＳＨ予防治療作用の点で、乳酸菌の菌数を、１×１０⁹以上を１日量として含有する量が好ましく、５×１０⁹〜２×１０¹²を１日量として含有する量がより好ましく、１×１０¹⁰〜１×１０¹²を１日量として含有する量がさらに好ましい。なお、本発明における菌数は乳酸菌培養終了時の生菌数に基づいて算出する。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

実施例１
（１）試験群および試験スケジュール
以下の実験は、C57BL/6N系統、７週齢のマウスを用いて行った。通常食群は、一般的な飼育飼料であるＡＩＮ９３Ｇを１２週間摂取させた試験群である。コントロール群にはＮＡＳＨ発症のため、１２週間の高脂肪食摂取と９〜１２週目にかけて四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した。各乳酸菌投与群には、コントロール群の高脂肪食をベースとして各凍結乾燥菌末を０．０５％混餌した飼料を摂取させた（飼料中の菌数：菌末は培養液を凍結乾燥して製造した。飼料１ｇ中の菌数は以下の式で求める：培養液中の培養終了時の生菌数／凍結乾燥で製造された菌末量（ｇ）×飼料１ｇ中の菌末の重量（ｇ）。Ｌ．Ｃｒｉｓｐａｔｕｓ：２．４７×１０¹²／１．７５４×０．０００５＝７．０４×１０⁸／ｇ、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．７４×１０¹²／１．５５×０．０００５＝８．８４×１０⁸／ｇ、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：７．３６×１０¹²／２．７３７×０．０００５＝１．３４×１０⁹／ｇ、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．４×１０¹²／２．９９５×０．０００５＝４．０１×１０⁸／ｇ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：４．６×１０¹¹／２．４４４×０．０００５＝９．４１×１０⁷／ｇ）。四塩化炭素の投与方法および投与タイミングはコントロール群と同じである。ＡＩＮ９３Ｇ、高脂肪食および乳酸菌菌末を含有した高脂肪食の組成は表２に記載した。各試験ともに飼料および飲料水は自由に摂取させた（マウス１匹あたりの飼料の平均摂取重量通常食：２．４ｇ／日、コントロール：２．５ｇ／日、Ｌ．Ｃｒｉｓｐａｔｕｓ：２．４ｇ／日、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．４ｇ／日、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：２．４ｇ／日、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．４ｇ／日、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：２．６ｇ／日）。
四塩化炭素を最終投与してから２４時間後に剖検を行ない、血液および臓器を採取した。血液から血清を調製しＡＳＴ、ＡＬＴの測定に用いた。また採取した肝臓は、病理組織解析用として１０％中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬し保存した。

（２）血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ値の測定
血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ値はトランスアミナーゼＣＩＩテストワコー（和光純薬）を用いて測定した。操作はマニュアルに従って行なった。

（３）病理組織解析
各試験群、３〜４個体の肝臓を病理組織解析に用いた。ホルマリン溶液にて固定した肝臓を常法により切り出し、パラフィン包埋後、パラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色を施して、光学顕微鏡にて観察した。さらにコラーゲン線維を証明するためにパラフィン切片にＭａｓｓｏｎ’ｓｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（ＭＴ）染色を実施した。
病理組織の診断項目として小葉内炎症、線維化を調べた。
病態のグレーディングは、肝臓切片の全視野を観察して、病態が認められない：−（陰性）、病態が全視野の２０％以下：±（極軽度）、病態が全視野の２０〜５０％：＋（軽度）、病態が全視野の５０〜８０％：＋＋（中程度）、病態が全視野の８０％以上：＋＋＋（重度）とした。

（４）結果
（ａ）血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ値の測定
血清中のＡＳＴ値を測定したところ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群では有意な低下が認められた（Ｌ. ｐｌａｎｔａｒｕｍｐ＝０．０２６、Ｌ．ｓａｒｉｖａｒｉｕｓｐ＝０．０２１）。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ群では低下の傾向が認められた（ｐ＝０．０７）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ群でも低下の傾向が認められた。また血清中のＡＬＴ値を測定したところ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群では有意な低下が認められた(Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍｐ＝０．０３１、Ｌ. ｐｌａｎｔａｒｕｍｐ＝０．０１２、Ｌ. ｓａｒｉｖａｒｉｕｓｐ＝０．００８）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ群では低下の傾向が認められた（ｐ＝０．０５４）。しかし、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ群については、ＡＳＴ、ＡＬＴともに顕著な低下は認められなかった。ＡＳＴの結果を表３に示す。ＡＬＴの結果を表４に示す。

（ｂ）病理組織解析
肝臓の病理組織解析を行ない、菌体投与が肝臓におよぼす影響を調べた。その結果、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ群、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ群、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群の一部の個体では小葉内炎症がコントロール群に比べて軽微であった。また、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ群、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの一部の個体では、線維化がコントロール群に比べて軽微であった。結果を図１、表５に示す。

マウス１匹が一日あたりに摂取する菌数は、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．１２×１０⁹、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：３．２×１０⁹、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：９．６２×１０⁸、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：２．４５×１０⁸である。使用したマウスの体重は約３７ｇであるから、マウス摂取量は、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：５．７３×１０¹⁰／ｋｇＢＷ／日、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：８．６５×１０¹⁰／ｋｇＢＷ／日、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．６×１０¹⁰／ｋｇＢＷ／日、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：６．６２×１０⁹／ｋｇＢＷ／日である。アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のガイダンスに従い、マウス摂取量をヒト摂取量に換算すると（計算方法：ヒト投与量（／ｋｇＢＷ／日）＝マウス投与量（／ｋｇＢＷ／日）×３（マウス体表面換算係数）／３７（ヒト体表面換算係数））、ヒト摂取量は、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：４．６５×１０⁹／ｋｇＢＷ／日、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：７．０１×１０⁹／ｋｇＢＷ／日、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．１１×１０⁹／ｋｇＢＷ／日、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：５．３７×１０⁸／ｋｇＢＷ／日である。ヒトの体重を７０ｋｇとすると、マウスと同様の効果を奏するために、ヒト１人が一日に摂取すべき菌数は、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：３．２６×１０¹¹、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：４．９１×１０¹¹、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：１．４８×１０¹¹、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：３．７６×１０¹⁰である。これはいずれも特表２００５−５１２５９０号公報に記載の１兆８０００億（１．８×１０¹²）よりも少ない。したがって、本願発明の乳酸菌は、特表２００５−５１２５９０号公報に記載の乳酸菌よりも少ない菌数で、より高い効果を奏するという有利な点をもつものである。

以上の結果から、ＮＡＳＨモデル動物を用いて、ＮＡＳＨ予防治療剤のスクリーニングができ、前記の乳酸菌がＮＡＳＨ予防治療剤として有用であることが示された。

Claims

ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７、ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ０１３２、ラクトバチルス・サリバリウスＹＩＴ０４３２およびストレプトコッカス・サーモフィラスＹＩＴ２００１からなる群から選ばれる１種以上の乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する前記乳酸菌を有効成分とするＮＡＳＨ予防治療剤。
当該乳酸菌が、さらに、乳酸菌非投与のマウスに比べて、血清中ＡＳＴの値が４０％以上低下するものである請求項１記載のＮＡＳＨ予防治療剤。
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７、ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ０１３２、ラクトバチルス・サリバリウスＹＩＴ０４３２およびストレプトコッカス・サーモフィラスＹＩＴ２００１からなる群から選ばれる１種以上の乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する前記乳酸菌を有効成分とするＮＡＳＨ予防治療用飲食品。
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７、ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ０１３２、ラクトバチルス・サリバリウスＹＩＴ０４３２およびストレプトコッカス・サーモフィラスＹＩＴ２００１からなる群から選ばれる１種以上の乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する前記乳酸菌を有効成分とするＮＡＳＨ予防治療用発酵飲食品。
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＹＩＴ１０３４７、ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ０１３２、ラクトバチルス・サリバリウスＹＩＴ０４３２およびストレプトコッカス・サーモフィラスＹＩＴ２００１からなる群から選ばれる１種以上の乳酸菌を１×１０¹⁰／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目〜１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ（ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する前記乳酸菌を有効成分とするＮＡＳＨ予防治療用飲食品組成物。