MX2012010770A - Novedosa lactobacillus clasificada como lactobacillus plantarum y su uso. - Google Patents

Abstract

Se describe una nueva bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobadilus plantarum, la cual tiene una excelente habilidad fermentativa produciendo conteos celulares alcanzables altos incluso si se usan varios jugos de verdura o fruta como sustratos fermentativos; la bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobadilus plantarum está caracterizada porque sus conteos celulares viables alcanzables son de 108 CFU/ml o más en ambos casos, cuando se usa ya sea jugo de uva o de naranja al 100% como sustrato fermentativo.

Description

NOVEDOSA LACTOBACILLUS CLASIFICADA COMO LACTOBACILLUS PLANTARUM Y SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva bacteria de ácido láctico que está clasificada como Lactobacillus plantarum adecuada para la fermentación de varios jugos de frutas así como alimentos y bebidas que la contienen.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se considera que en los humanos, organismos nocivos como la Escherichia coli, se vuelven dominantes con el paso de los años y varias sustancias nocivas producidas por el organismo nocivo tienen una influencia adversa en el cuerpo humano. Las bacterias de ácido láctico, las cuales están ampliamente separadas del mundo natural, generan ácido láctico en el intestino humano para mantener ácido el pH intestinal y suprimir el crecimiento y multiplicación de bacterias de putrefacción o bacterias patógenas como Escherichia coli en el intestino y tienen el efecto de hacer mejoras ambientales en el intestino. Además del efecto de hacer mejoras ambientales en el intestino, las bacterias de ácido láctico tienen un efecto fisiológico útil o efectos como el de mejoramiento del estreñimiento, protección de infección, estimulación de la competencia inmunológica, efecto anti-alérgico, efecto protector del cáncer, y similares. En esta situación, para promover la salud al proporcionarle al intestino estas bacterias útiles llamadas probióticos, la ingesta de bebidas con bacterias de ácido láctico, leche fermentada, o preparaciones farmacéuticas que contienen al organismo vivo de estas bacterias se han puesto en práctica.

Las bacterias de ácido láctico usadas en estas bebidas con bacterias de ácido láctico, leche fermentada, o preparaciones con el organismo vivo son aquellas adecuadas para la fermentación de materiales lácteos incluyendo los que provienen del yogur o del queso, específicamente incluyendo la cepa de Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophiles, Lactococcus lactis, y similares.

Por otro lado, como el gusto del consumidor se ha diversificado en años recientes, se ha buscado desarrollar una cepa capaz de ser usada en probióticos en los que la materia prima distinta de los materiales lácteos, por ejemplo, jugo de verduras o jugo de fruta, se puede usar como sustrato fermentativo.

Sin embargo, cuando las cepas antes mencionadas que hasta ahora se han usado en la producción de bebidas con bacterias de ácido láctico fueron utilizadas en la producción con jugos de verduras o jugos de frutas como sustratos fermentativos, fueron incapaces de lograr conteos celulares viables altos para obtener el efecto de probióticos.

Se ha sabido hasta ahora que las bacterias de ácido láctico pertenecientes a Lactobacillus plantarum tienen una habilidad fermentativa potente para jugos de verduras o jugos de frutas. Por ejemplo, se sabe que Lactobacillus plantarum ATCC 14431 alcanza el conteo celular viable de hasta 107 CFU/ml o más cuando un jugo de zanahoria concentrado (componente sólido soluble: 36% de masa; referido de aquí en adelante simplemente como %) diluido 6 veces es usado como sustrato fermentativo (Documento de Patente 1).

Además, en lo que se refiere a una bacteria de ácido láctico adecuada para la fermentación de jugos de frutas en los que se ha reducido el contenido de ácido orgánico, Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843) es conocida. Aunque esta Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843) tiene desventajas tales como post-acidificación fuerte, defecto funcional marcado, y generación del gas dióxido de carbono, también se conoce una tecnología para suprimir dichas desventajas al reducir el contenido de ácido orgánico en el jugo de fruta (Documento de Patente 2).

Sin embargo, estas cepas pertenecientes a Lactobacillus plantarum no siempre generan una concentración de conteo celular viable alcanzable alta para varios jugos de verduras o jugos de frutas, y en particular estas no pueden ser aplicadas al jugo de fruta que incluye uva, la cual es generalmente considerada ¡napropiada como sustrato fermentativo para la bacteria de ácido láctico.

Documento de la técnica antecedente Documento de patente Documento de patente 1 : JP-A 2001/252012 Documento de patente 2: PCT JP-A 2008/541774 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema que se resolverá por medio de la invención Así, el propósito de la presente invención es proporcionar una nueva bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum que tenga una excelente habilidad fermentativa alcanzando conteos celulares viables altos incluso si se usan varios jugos de verduras o jugos de frutas como sustratos fermentativos, así como proporcionar alimentos y bebidas que la contengan.

Medios para resolver los problemas Los presentes inventores trabajaron asiduamente para resolver los problemas antes mencionados y encontraron que la bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum, en la que los conteos celulares viables alcanzables llegaron a 108 CFU/ml o más en algunos casos, cuando un cierto jugo de fruta al 100% se usó como sustrato fermentativo, generó conteos celulares viables alcanzables altos incluso si se usaban varios jugos de verduras o jugos de frutas como sustratos fermentativos. De esta manera, se logró la invención.

La invención proporciona una bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum en la que los conteos celulares viables alcanzables son de 108 CFU/ml o más tanto en el caso de usar jugo de uva al 100% como en el de usar jugo de naranja al 100% como sustratos fermentativos.

Además, la invención proporciona alimento y bebida que comprende la bacteria de ácido láctico antes mencionada.

Además, la invención proporciona un producto de fermentación que es producido por la inoculación y fermentación de la bacteria de ácido láctico antes mencionada en materiales alimenticios.

Además, la invención proporciona alimento y bebida que comprende el producto de fermentación antes mencionado.

Además, la invención proporciona un proceso para producir un producto de fermentación que comprende la inoculación y fermentación de la bacteria de ácido láctico antes mencionada en materiales alimenticios.

Efecto de la invención Debido a que la bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum de la invención es capaz de llegar a conteos celulares viables de 108 CFU/ml o más cuando se usan varios jugos de verduras o jugos de frutas, particularmente jugos de frutas, como sustratos fermentativos, se puede usar en la producción de alimentos y bebidas como bebidas usadas en probióticos basados en una variedad de sustratos fermentativos.

En particular, las dos cepas depositadas entre las bacterias de ácido láctico pertenecientes a Lactobacillus plantarum de la invención son capaces de proporcionar alimento y bebida como bebidas de calidad estable, debido que no tienen plásmido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En esta descripción, jugos de fruta al 100% quiere decir aquellos que satisfacen el criterio de jugo al 100% de acuerdo con la indicación estándar de calidad de bebidas de jugo de fruta en la ley JAS (por sus siglas en inglés). Al producir el jugo de fruta cualquier proceso puede ser aplicado, es decir, un proceso para producir "jugo de fruta directo", el cual es producido por tratamiento termal del jugo exprimido de frutas seguido de congelamiento y almacenamiento, o un proceso para producir "jugo concentrado y reconstituyente", el cual es producido por evaporación de agua y concentración bajo calor seguida de congelamiento y almacenamiento. En el "jugo concentrado y reconstituyente", la tasa de concentración para el jugo es preferiblemente de 2 a 10 veces, más preferiblemente de 3 a 8 veces. Mientras el criterio de jugo al 100% se satisfaga en la indicación estándar de calidad de bebidas de jugo de fruta en la ley JAS, se pueden agregar azúcares, perfume y/o anti-oxidante.

En esta descripción, el conteo celular viable alcanzable quiere decir el conteo celular viable que se alcanza mediante la incubación de una cepa de siembra en un medio (Caldo de Lactobacilli MRS, hecho por Difco Co. , esterilizado a 121 °C por 15 minutos en una autoclave) como incubación preliminar hasta el estado estacionario, más específicamente llevando a cabo la incubación preliminar a 30-37X por 16-24 horas, y después inoculando 0.4% por volumen de la solución incubada preliminar sobre un sustrato fermentativo como jugo al 100%, seguido de incubación a 37"C por 48 horas. En esta conexión, el conteo viable es determinado sobre una bandeja de agar MRS. Además, la unidad CFU/ml indicando el conteo celular viable alcanzable representa una habilidad de formación de colonias cuando 1 mi es sembrado sobre una bandeja de cultivo.

En esta descripción, la no existencia de plásmido quiere decir que cuando un ADN plásmido es preparado de forma convencional a partir de 1 mi de medio de cultivo de Lactobacillus fresco, no se detecta ningún ADN plásmido bajo irradiación UV después de la electroforesis en gel de agarosa al 0.7% ni en la subsecuente tinción del gel con bromuro de etidio.

La bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum de la invención (referida de aquí en adelante como "la bacteria de ácido láctico de la invención") incluye aquellas en las que los conteos celulares viables alcanzables son de 08 CFU/ml o más, preferiblemente 108 -1010 CFU /mi tanto en el caso de usar jugo de uva al 100% como en el de usar jugo de naranja al 100% como sustratos fermentativos.

La bacteria de ácido láctico de la invención es separada de verduras encurtidas, té fermentado o heces humanas de forma convencional mediante separación sobre una bandeja de agar MRS y evaluación de la Lactobacillus plantarum aislada basándose en los conteos celulares viables alcanzables en los sustratos fermentativos antes mencionados.

De la Lactobacillus plantarum separada de la forma antes mencionada, se obtuvieron las siguientes 4 cepas.

• Cepa Lactobacillus plantarum YIT 10015 ¦ Cepa Lactobacillus plantarum YIT 0069 ¦ Cepa Lactobacillus plantarum YIT 01 8 ¦ Cepa Lactobacillus plantarum YIT 0132 De estas 4 cepas, YIT 0069, YIT 0148 y YIT 0132 mostraron los valores de puntuación proliferativos de 25 o más que fueron obtenidos dividiendo los conteos celulares viables alcanzables respectivos (CFU/ml) entre 108 seguido por la adición, cuando se usaron jugos de uva, toronja, naranja, piña o manzana al 100% como sustratos fermentativos. El valor de puntuación proliferativo es un índice para juzgar si Lactobacillus plantarum es adecuada para la fermentación de jugos de fruta o no, y es preferiblemente 25 o más, más preferiblemente 30 - 50; debido a que YIT 0148 y YIT 0132 tienen los valores de puntuación proliferativos de 30 - 41 , son particularmente preferidas para usarse en la fermentación de jugos de fruta.

En esta conexión, YIT 0132 y YIT 0148 no tienen plásmido. En general, algunos de los plásmidos en ocasiones tienen resistencia antibiótica, la cual es transferida a otros microorganismos, conduciendo esto a la ocurrencia de bacterias patógenas que tienen resistencia antibiótica. Además, al momento no se ha dilucidado como el gen en el plásmido, del cual la función no es clara, tiene influencia sobre el otro microorganismo o microorganismos, y por lo tanto es deseable que la cepa no tenga plásmido para con esto garantizar la seguridad de la cepa. Los plásmidos son eliminados en ocasiones durante el cultivo o el subcultivo, resultando esto en la inestabilidad de la forma de los microorganismos. Debido a que YIT 0132 y YIT 0148 no tienen plásmido, la estabilidad y calidad del producto puede ser asegurada.

Las cepas YIT 0132 y YIT 0148 son respectivamente llamadas Lactobacillus plantarum YIT 0132 y Lactobacillus plantarum YIT 0148, e internacionalmente depositadas como FERM BP-11349 y FERM BP-11 350 a partir del 24 de Febrero de 2010, en el Organismo Depositario Internacional de Patentes, Instituto Nacional de Ciencia Industrial y Tecnología, Agencia Administrativa Independiente (Dirección: Código postal 305-8566: Higashi 1 -chome -banchi 1 , chu-o no.6, Tsukuba City, Ibaragi Pref.). Estas cepas tienen las siguientes propiedades bacteriológicas.

CUADRO 1 Propiedades bacteriológicas de Lactobacilli: YIT 0132 y YIT 0148 incubadas en Caldo MRS Lactobacilli a 37°C por 24 horas (Propiedades varias) YIT 0132 YIT 0148 Morfología celular Forma de varilla Forma de varilla Tinción de Gram Actividad de catalasa Movilidad Espora Crecimiento a 15°C Crecimiento a 45°C Crecimiento anaeróbico Crecimiento aeróbico Generación de gas CUADRO 2-1 Propiedades fermentativas de azúcares; medidas por API 50CH YIT 0132 YIT 0148 Control Glicerol Eritritol D- Arabinosa L-Arabinosa + + D-Ribosa + + D-Xilosa L-Xilosa D-Adonitol Metil-ß D-xilopiranósido D-Galactosa + + D-Glucosa + + D-Fructosa + + D-Manosa + + L-Sorbosa L-Ramnosa Peso Peso Dulcitol Inositol D-Manitol + + D-Sorbitol + + etil-a D-manopiranósido + + Metil-a D-glucopiranósido N-Acetil glucosamina + + Amigdalina + + Arbutina + + Esculina citrato férrico + + Salicina " + + D-Celobiosa + + D-Maltosa + + D-Lactosa + + D-Melibiosa + + D-Sacarosa + + D-Trehalosa + + CUADRO 2-2 YIT 0132 YIT 0148 Inulina - - D-Melec¡tosa + + D-Rafinosa + + Almidón - - Glicógeno - - Xilitol - - Gentiobiosa + + D-Turanosa + + D-Lixosa - - D-Tagatosa - - D-Fucosa - - L-Fucosa - - D-Arabitol - - L-Arabitol - - Gluconato Peso Peso 2 Queto-gluconato - - 5 Queto-gluconato - - +: positivo; d: débil; -: negativo (16S rADN) Usando la secuencia base 16S rADN, la cepa fue identificada de la siguiente manera. Es decir, el organismo fue incubado en un medio MRS a 37°C por 24 horas, la solución incubada fue lavada por centrifugación, y se extrajo ADN del gránulo de organismo; la longitud completa de la secuencia 16S rADN fue amplificada con PCR usando el ADN extraído como modelo, y la secuencia base del producto amplificado fue determinada mediante el método del Dye Terminator; la secuencia base resultante fue buscada en una base de datos para identificar la especie del organismo. Las secuencias base 16S rADN de YIT 0132 y YIT 0148 (SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2) tuvieron respectivamente 99.9% y 99.8% de homología con la de Lactobacillus plantarum (No. de acceso D79210), y además tuvieron respectivamente 99% o más de homología alta con aquellas de Lactobacillus paraplantarum (No. de acceso AJ306297) y Lactobacillus pentosus (No. de acceso D79211 ). Estas tres especies están emparentadas, y por tanto no es posible discriminar entre ellas usando la secuencia 16S rADN. Para discriminación, en consecuencia, un método PCR en el que se usó un iniciador específico de especie apuntando hacia la secuencia de genes recA (Appl. Environ. Microbiol., 67, 3450-3454 (2001)) se usó con las cepas estándar de estas 3 especies como referencia. Como resultado, se confirmó que YIT 0132 y YIT 0148 eran Lactobacillus plantarum.

En esta conexión, además de las cepas antes mencionadas como bacterias de ácido láctico de la invención, también es posible utilizar cualquier variante de las cepas anteriores que ejerzan la misma habilidad fermentativa para jugos de fruta.

Las bacterias de ácido láctico de la invención antes mencionadas se originan en alimentos y su segundad ha sido confirmada. Así, pueden ser utilizadas en varios usos de la misma manera que las bacterias de ácido láctico usadas hasta ahora en probióticos, y se espera que su ingestión muestre un efecto fisiológico como el efecto antidiarreico.

No hay limitación estricta en la cantidad de bacteria de ácido láctico de la invención que se debe tomar en un humano o animal, y la dosis preferida es 105 CFU - 1013 CFU por un día como conteos celulares viables, particularmente 08 CFU- 1012 CFU. La bacteria de ácido láctico de la invención es preferiblemente tomada de forma continua, pero puede ser tomada a ciertos intervalos, por ejemplo, un mes si y otro no, una semana sí y otra no, un día sí y un día no, o tomada dentro de un periodo corto de tiempo.

Para alcanzar el efecto fisiológico de la bacteria de ácido láctico de la invención, por ejemplo, se puede utilizar como una preparación farmacéutica convencional, la cual es preparada mezclándose con un portador inofensivo farmacéuticamente aceptable sólido o líquido. Dicha preparación farmacéutica incluye, por ejemplo, preparaciones sólidas como tabletas, gránulos, polvos, cápsulas, y similares, preparaciones líquidas como soluciones, suspensiones, emulsiones, y similares, y preparaciones liofilizadas. Estas preparaciones pueden ser preparadas de acuerdo a las formas farmacéuticas convencionales. El portador farmacéuticamente inofensivo antes mencionado incluye, por ejemplo, glucosa, lactosa, sacarosa, almidón, manitol, dextrina, glicérido de ácido graso, polietilen glicol, almidón hidroxietil, etilen glicol, éster de ácido graso sorbitán polioxietileno, aminoácido, gelatina, albúmina, agua, solución salina fisiológica, y similares. Además, si se requiere, se pueden agregar apropiadamente un aditivo convencional como un estabilizador, agente humectante, agente emulsionante, agente de unión, agente de ajuste de la tonicidad, diluyente, y similares.

La bacteria de ácido láctico de la invención puede ser formulada no solamente en las preparaciones farmacéuticas antes mencionadas, sino también agregadas en alimentos o bebidas sólidos o líquidos. Cuando se agrega a alimentos y bebidas, puede ser agregada sola o en conjunto con varios ingredientes nutricionales. Prácticamente, cuando la bacteria de ácido láctico de la invención es agregada a alimento o bebida, un aditivo que puede ser usado como alimento o bebida puede ser preferiblemente usado y formulado de modo convencional en forma comestible, esto es, forma granular, forma de grano, tabletas, cápsulas, pasta, y similares. Los tipos de alimentos y bebida son, por ejemplo, productos de carne procesada como jamón, salchicha, etc., productos marinos procesados como pasta de pescado hervido, pastel de pasta de pescado en forma de tubo, etc., alimentos como pan, pastel, mantequilla, leche en polvo, y similares, asi como agua, bebidas como el jugo de fruta, leche, bebidas refrescantes y té. En esta conexión, el alimento y la bebida incluyen alimento del ganado.

Además, el alimento y la bebida utilizables adecuados para la bacteria de ácido láctico de la invención incluyen leche fermentada, leche de soya fermentada, jugo de fruta fermentado, jugo de verdura fermentado, y similares, los cuales son obtenidos por inoculación de la bacteria de ácido láctico en varios materiales alimenticios como leche animal, leche de soya, jugo de fruta, jugo de verdura, y similares, seguido esto de fermentación. Por encima de todo, se prefiere particularmente una bebida que contiene jugo de fruta fermentado. Este tipo de alimento y bebida es preferido debido a que contiene la bacteria de ácido láctico en un estado viable.

El alimento y bebida que contiene el producto fermentado antes mencionado como leche fermentada, leche de soya fermentada, jugo de fruta fermentado y jugo de verdura fermentado puede ser producido de acuerdo a las formas convencionales. Específicamente, al producir un bebida de jugo de fruta fermentada con una bacteria de ácido láctico de la invención, una bacteria de ácido láctico de la invención es primero inoculada sola o en conjunto con otro microorganismo en jugo de fruta, el cual es esterilizado bajo una condición adecuada para que el jugo se pueda usar, esto seguido de incubación; el producto es homogeneizado para dar una base de jugo fermentado. Esta base de jugo fermentado es entonces mezclada con una bebida que contiene jugo de fruta al 100%, jarabe u otro jugo sin fermentar, al que se le agrega entonces un sabor, etcétera, produciendo un producto final.

Los jugos de fruta usados como materias primas para las bebidas de jugo de fruta fermentadas antes mencionadas incluyen, pero no están limitadas a, jugos de uva, toronja, naranja, piña, manzana, y similares, particularmente se prefieren jugos de fruta de naranja y manzana.

La bebida de jugo de verdura fermentada también puede ser producida de la misma forma que la bebida de jugo de fruta fermentada antes mencionada. Los jugos de verdura usados como materias primas para las bebidas de jugo de verdura fermentadas antes mencionadas incluyen, pero no están limitadas a, jugos de zanahoria, por ejemplo, zanahoria, Murasaki ninjin (zanahoria); batata, por ejemplo, Ayamurasaki, J-Red; col; y tomate, y particularmente se prefieren jugos de verdura de zanahoria, Ayamurasaki, y J-Red.

La bebida de jugo de fruta fermentada y la bebida de jugo de verdura se pueden combinar con un ingrediente opcional como agente edulcorante como jarabe, agente emulsionante, espesante (estabilizador), varias vitaminas, y similares. El jarabe incluye azúcares, por ejemplo glucosa, sacarosa, fructosa, solución de fructosa-glucosa, solución de glucosa-fructosa, palatinosa, trehalosa, lactosa, xilosa, maltosa, miel, jarabe; alcoholes de azúcar, por ejemplo sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, palatinita, jarabe de almidón viscoso reducido, jarabe de almidón viscoso de malta reducido, y agentes edulcorantes altamente dulces, por ejemplo aspartame, taumatina, sucralosa, acesulfame K, estevia, y similares. Adicionalmente, vitaminas, por ejemplo, vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina E; minerales, por ejemplo calcio, magnesio, cinc, hierro, manganeso; agente con sabor ácido, por ejemplo ácido cítrico, ácido láctico, ácido acético, ácido mélico, ácido tartárico, ácido glucónico; grasa láctea, por ejemplo crema, mantequilla, crema ácida; sabor, por ejemplo del tipo yogur, tipo baya, tipo naranja, tipo membrillo Chino, tipo perilla, tipo cítrico, tipo manzana, tipo menta, tipo uva, tipo chabacano, pera, crema pastelera, durazno, melón, plátano, tropical, tipo hierba, té negro, café; extracto herbal; extracto de azúcar moreno y similares se pueden combinar.

Al producir una bebida de jugo de fruta o verdura fermentada, se pueden usar al mismo tiempo un microorganismo o microorganismos diferentes de las bacterias de ácido láctico de la invención. Dichos microorganismos incluyen, por ejemplo, una bacteria Bifidobacterium como Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium suis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium globosum, etcétera; una bacteria Lactobacillus como Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus salivalius, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Delbrueckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus paraplantarum, etcétera; una bacteria Streptococcus como Streptococcus thermophiles, etcétera; una bacteria Lactococcus como Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subsp. Cremoris, etcétera; una bacteria Enterococcus como Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, etcétera; una bacteria Bacillus como Bacillus subtilis; levadura perteneciente a Saccharomyses o Torulaspora o Candida como Saccharomyses cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Candida kefyr, etcétera.

EJEMPLOS La presente invención será explicada con mayor detalle por medio de los siguientes ejemplos que no pretenden limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Prueba de fermentación para jugo de fruta por varias bacterias de ácido láctico. (1) Cepa Para descubrir una cepa que tuviera habilidad fermentativa alta para jugo de fruta, las 43 cepas de Lactobacilli como se muestran en el Cuadro 3 fueron seleccionadas para la prueba, dichas cepas fueron aisladas principalmente de árboles frutales. (2) Organismos de siembra e Incubación El caldo MRS Lactobacilli (Difco Co.) fue esterilizado en una autoclave a 12TC por 15 minutos, y entonces se le inocularon las cepas. Debido a que las especies Sporolactobacillus tuvieron que ser incubadas en una condición anaeróbica, el recipiente fue llenado con atmósfera N2 y cerrado fuertemente con un tapón de goma butilo. Debido a que las otras especies son aerobias, el recipiente se cubrió con una tapa de aluminio y se incubó a 30'C por 16 horas hasta que alcanzó el estado estacionario. (3) Propiedad proliferativa con Jugo de Fruta Jugos al 100% reducidos, concentrados y disponibles comercialmente (jugo de uva (Dole Ltd.) y jugo de naranja (Yakult Honsha)) fueron respectivamente distribuidos asépticamente en tubos de ensayo, en los que se inoculó un volumen de 0.4% de solución celular, y se incubaron a 37°C por 48 horas. (4) Medición de Conteos Celulares Viables La solución incubada fue apropiadamente diluida con un diluyente esterilizado (solución al 0.1 % de extracto de levadura) y se aplicó sobre una bandeja agar MRS con un sistema espiral, y se midieron los conteos celulares viables. Se investigó la propiedad proliferativa de las 43 cepas puestas. a prueba en los jugos de fruta. Los resultados se muestran en el Cuadro 3. (5) Investigación de la Propiedad Proliferativa en los Jugos de Fruta La mayoría de los organismos no mostraron proliferación en jugo de uva, pero sólo las dos cepas de Lactobacillus plantarum crecieron bien, en donde los conteos celulares viables se incrementaron a 1 x 108 CFU/ml. En el caso del jugo de naranja, la mayoría de los organismos crecieron, con excepción de unas cuantas cepas, y los conteos celulares viables alcanzaron 1 x 107 CFU/ml o más. No se observó crecimiento en ninguna de las cepas de Sporolactobacillus incubadas anaeróbicamente ni en jugo de uva ni en jugo de naranja. A partir de los anteriores resultados, se dilucidó que, cuando se usaron el jugo de uva y el jugo de naranja como sustratos fermentativos, la bacteria de ácido láctico que muestra conteos celulares viables alcanzables de hasta 1 x 108 CFU/ml es únicamente Lactobacillus plantarum.

CUADRO 3-1 CUADRO 3-2 *EI símbolo (-) indica los conteos celulares viables que son menores que el límite de detección (2 x 106 CFU/ml).

EJEMPLO 2 Prueba de fermentación para Jugo de Fruta por Lactobacillus plantarum (D Cepa Las 12 cepas de Lactobacillus plantarum fueron dirigidas.

El origen de estas cepas fue: cepa YIT 0220 de ATCC 14431 , cepa Y 50097 de leche fermentada disponible comercialmente, cepa YIT 0102 de una cepa estándar (ATCC 14917), y cepa Y 99005, cepa 299v aislada de un producto lácteo. Las otras fueron aisladas de encurtidos, té fermentado y heces humanas. (2) Organismos de siembra e Incubación Se distribuyó el caldo MRS Lactobacilli (Difco Co.) en pequeños tubos de ensayo y fue esterilizado en una autoclave a 121 °C por 15 minutos, y entonces se le inocularon los organismos. Los tubos de ensayo fueron cubiertos con tapas de aluminio e incubados a 37°C por 16 horas hasta que alcanzaron un estado estacionario. (3) Propiedad proliferativa con Jugo de Fruta Jugos al 100% reducidos, concentrados y disponibles comercialmente (jugo de uva (Dole Ltd.), jugo de toronja (Yakult Honsha), jugo de naranja (Yakult Honsha), jugo de piña (Yakult Honsha), y jugo de manzana (Yakult Honsha)) fueron respectivamente distribuidos asépticamente en tubos de ensayo, en los que se inoculó un volumen de 0.4% de solución de organismo, y se incubaron a 37°C por 48 horas. (4) Medición de Conteos Celulares Viables La solución de cultivo fue apropiadamente diluida con un diluyente esterilizado (solución al 0.1 % de extracto de levadura) y se aplicó sobre una bandeja agar MRS con un sistema espiral, y se midieron los conteos celulares viables. El Cuadro 4 muestra los resultados. Los valores de puntuación proliferativos en los jugos de fruta fueron calculados dividiendo los conteos celulares viables alcanzables respectivos (CFU/ml) entre 108 seguido por adición, cuando se usaron jugos de uva, toronja, naranja, pina o manzana al 100% como sustratos fermentativos. Los resultados también se muestran en el Cuadro 4. (5) Investigación de la Propiedad Proliferativa en los Jugos de Fruta Cuando se usaron el jugo de uva y de piña al 100% como sustratos fermentativos, las siguientes 4 cepas mostraron los conteos celulares viables alcanzables de 08 CFU/ml o más en ambos casos: YIT 10015, YIT 0069, YIT 0148 y YIT 0132. Como resultado, las 3 cepas, YIT 0069 (puntuación proliferativa: 27), YIT 0148 (puntuación proliferativa: 30), y YIT 0132 (puntuación proliferativa: 41 ), mostraron una puntuación proliferativa marcadamente más alta que la cepa estándar YIT 0102 de Lactobacillus plantarum (puntuación proliferativa: 14), las cepas YIT 0220 (puntuación proliferativa: 10), y Y99005 (puntuación proliferativa: 18) las cuales se conocen por tener una habilidad fermentativa con jugos de verdura y jugos de fruta.

CUADRO 4 Unidad: CFU/ml EJEMPLO 3 Confirmación de la existencia de Plásmido en la cepa Lactobacillus plantarum (1) Cepas e Incubación La cepa fue incubada en un medio MRS a 37°C por 20 horas. (2) Preparación de ADN plásmido El organismo se recolectó de 1 mi de solución incubada fresca por centrifugación a 3,000 x g, y se suspendió en 200 µ? de solución de lisis (50 pg/ml de N-acetilmuramidasa SG, 3 mg/ml de lisozima de huevo, 100 pg/ml de RNasa A, 50 mM de Tris-HCI (pH 8.0), 10 mM de EDTA). Esto se mantuvo a 37°C por 30 minutos para formar un protoplasto. El organismo formado por protoplasto se recolectó a 3,000 x g y se trató con un kit disponible comercialmente (BioRad Miniprep.) para preparar un plásmido mediante un método álcali para producir un ADN plásmido. (3) Detección de ADN plásmido El ADN plásmido se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0.7%, el cual después se tiñó con bromuro de etidio y se fotografió bajo radiación UV para evaluar la existencia del plásmido. Los resultados se muestran en el Cuadro 5. (4) Existencia de Plásmido Las 7 cepas que mostraron una buena habilidad fermentativa de jugo en el Ejemplo 2 fueron seleccionadas para investigación. En 5 de las 7 cepas, se observaron plásmidos. Entre estas cepas, ni YIT 0132 ni YIT 0148 tuvieron plásmido, y sus cepas mostraron conteos celulares viables alcanzables de 108 CFU/ml o más con el jugo de uva y el jugo de toronja en el Ejemplo 2.

CUADRO 5 +: existencia de plásmido -: no existencia de plásmido EJEMPLO 4 Bebidas de Bacterias de Ácido Láctico (1 ) El jugo de fruta o jugo de verdura ajustado a Brix (Bx) 10 como se muestra en el Cuadro 6 fue esterilizado en una condición como la que se describe en el Cuadro 6. Después de enfriar, la Lactobacillus plantarum YIT 0132 pre-incubada en un caldo MRS fue inoculada en el mismo al 0.4% e incubada a 37°C por 48 horas. Para el jugo de fruta o verdura fermentado resultante, los conteos celulares viables al momento de la producción fueron medidos sobre una bandeja de agar MRS (Cuadro 6).

Además, el sabor de estas bebidas de bacterias de ácido láctico fue evaluado libremente, indicando que todas eran apropiadas para beberse. En particular, la naranja, la manzana, la zanahoria, Ayamurasaki y J-Red tuvieron buen sabor.

CUADRO 6 *Unidad: CFU/ml "Preparado exprimiendo el tomate, removiendo la pulpa por centrifugación, y por concentración EJEMPLO 5 Bebidas de Bacterias de Ácido Láctico (2) Se disolvieron leche descremada (10%) y extracto de levadura (0.03%) en agua caliente y se esterilizaron a 35°C por 3 segundos. Después de enfriar, la Lactobacillus plantarum YIT 0132 pre-incubada en un caldo MRS fue inoculada en el mismo al 0.4% e incubada a 37"C por 48 horas. La bebida de bacterias de ácido láctico resultante tuvo los conteos celulares viables de 5.2 x 08 CFU/ml al momento de la producción sobre una bandeja de agar MRS. El sabor fue moderadamente ácido, haciendo sencillo el bebería.

EJEMPLO 6 Bebidas de Bacterias de Ácido Láctico (3) El jugo de fruta o jugo de verdura ajustado a Brix (Bx) 10 como se muestra en el Cuadro 7 fue esterilizado en una condición como la que se describe en el Cuadro 7. La Lactobacillus plantarum YIT 0148 pre-incubada en un caldo MRS fue inoculada en el mismo al 0.4% e incubada a 37°C por 48 horas. Para el jugo de fruta o verdura fermentado resultante, los conteos celulares viables al momento de la producción fueron medidos sobre una bandeja de agar MRS (Cuadro 7). Además, el sabor de estas bebidas de bacterias de ácido láctico fue evaluado libremente, indicando que todas eran apropiadas para beberse. En particular, la naranja, la manzana, la zanahoria, Ayamurasaki y J-Red tuvieron buen sabor.

CUADRO 7 *Unidad: CFU/ml "Preparado exprimiendo el tomate, removiendo la pulpa por centrifugación, y por concentración EJEMPLO 7 Bebidas de Bacterias de Ácido Láctico (4) Se disolvieron leche descremada (10%) y extracto de levadura (0.03%) en agua caliente y se esterilizaron a 35°C por 3 segundos. Después de enfriar, la Lactobacillus plantarum YIT 0148 pre-incubada en un caldo MRS fue inoculada en el mismo al 0.4% e incubada a 37°C por 48 horas. La bebida de bacterias de ácido láctico resultante tuvo los conteos celulares viables de 3.2 x 108 CFU/ml al momento de la producción sobre una bandeja de agar MRS. El sabor fue moderadamente ácido, haciendo sencillo el bebería.

Aplicación Industrial Las bacterias de ácido láctico de la invención muestran conteos celulares viables alcanzables altos incluso si se usan varios jugos de verdura o fruta como sustratos fermentativos. Asi, las bacterias de ácido láctico de la invención pueden ser usadas adecuadamente en probióticos.

Claims (8)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum en la cual los conteos celulares viables alcanzables son 108 CFU/ml o más en ambos casos cuando una solución de la bacteria pre-incubada en caldo MRS Lactobacilli a 37°C por 16 horas hasta el estado estacionario es inoculada a un volumen de 0.4% en 100% de jugo ya sea de uva o de naranja como sustrato fermentativo e incubada a 37°C por 48 horas.

2.- La bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque su valor de puntuación proliferativo calculado dividiendo los conteos celulares viables alcanzables respectivos (CFU/ml) entre 108 seguido de adición es 25 o más, cuando una solución de la bacteria pre-incubada en caldo MRS Lactobacilli a 37°C por 16 horas hasta el estado estacionario es inoculada a un volumen de 0.4% en jugo de uva, toronja, naranja, piña o manzana al 100% como sustrato fermentativo, respectivamente, e incubada a 37°C por 48 horas.

3.- La bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque no tiene plásmido.

4 - La bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque es Lactobacillus plantarum YIT 0132 (FERM BP-11349) o Lactobacillus plantarum YIT 0148 (FERM BP-11350).

5. - Un alimento y bebida que comprende una bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. - Un producto de fermentación que se prepara por inoculación y fermentación en un material alimenticio de una bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. - Un alimento y bebida que comprenden un producto de fermentación de la reivindicación 6.

8. - Un proceso para producir un producto de fermentación, el cual comprende la inoculación y fermentación en un material alimenticio de una bacteria de ácido láctico perteneciente a Lactobacillus plantarum de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.