JP5019961B2 - インターロイキン10産生促進剤 - Google Patents
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Description
(2)単球/マクロファージからのIL−1レセプターアンタゴニストの産生を増強する。
(3)単球/マクロファージのMHC class II分子、CD86分子の発現を抑制する。
(4)T細胞の増殖を抑制する。
(5)T細胞からのIL−2、IFN−γ、IL−4、IL−5産生を抑制する。
(6)IL−10産生調節性T細胞を誘導する。
(7)好酸球、好中球、マスト細胞からのIL−1、IL−8、TNF−α産生を抑制する。
(8)NK細胞の細胞傷害活性を増強する。
(9)B細胞からのIgE産生を抑制し、IgG産生を増強する。
さらに、前記処理物は、化学的に合成されたもの、例えばDNA、一本鎖RNA、イミダゾキノリン系化合物、イミダゾキノリン系化合物及びリポペプチド等であってもよく、具体的には、非メチル化CpG DNA等のDNA、ポリウリジン等の一本鎖RNAは市販の核酸合成装置により合成することが可能であり、イミダゾキノリン系化合物は、自体公知の方法により製造することが可能であり、Pam3-Cys-Ser-Lys4、Pam2-Cys-Gly-Asp-Pro-Lys-His-Pro-Lys-Ser-Phe等のリポペプチドは公知のペプチド合成法(固相合成法、液相合成法等)を利用して製造することもできる。
本発明において、「菌体消化酵素による消化率」とは、N−アセチルムラミダーゼの一種であるM−1酵素(EC 3.2.1.17)による消化試験を行った際の被験物質の消化率を意味する。具体的には、以下に示す消化試験を行い、被験物質の消化率を算出することができる。
まず、4mM塩化マグネシウムを含む50mMトリス・マレイト緩衝液(pH7.0)中に被験物質を2mg/mlで懸濁し、M−1酵素を添加(10μg/ml)して37℃で10分反応を行った後、100℃、5分の加熱処理により酵素活性を失活させた。反応液に対してSDS溶液を添加し(終濃度2%)、ボルテックスにて十分攪拌してプロトプラスト状の被験物質を溶解させた後、濁度(OD600)を測定した。消化率の算出には以下の式を用いた。
(A)IL−12産生誘導能を有さない酵母としては、特に限定されないが、例えば、サッカロマイセス・セルビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンスが挙げられ、サッカロマイセス・セルビシエを好適に用いることができる。
ここで、IL−10産生促進作用を有するとは、次式により求められるIL−10産生増加能が130%以上のものを意味し、好ましくは150%以上のものを意味する。
(1)細菌及び微生物処理物
ラクトバチルス・カゼイ(YIT 9029)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(YIT 4065)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(YIT 4007)、ラクトバチルス・ラムノーサス(ATCC 7469)、ラクトバチルス・プランタラム(ATCC 14917)、ラクトバチルス・アシドフィルス(ATCC 4356)について、ラクトバチルス属乳酸菌は200mlのDifcoTM Lactobacilli MRS培地(BD社)を用いて、また、ビフィズス菌は1%グルコースを含む200mlのGAM培地(ニッスイ)を用いて、それぞれ37℃で20時間培養した。菌体は遠心分離(8000回転、10分)により集菌し、滅菌ミリQ水を用いて遠心洗浄を3回繰り返した後、200mlの滅菌ミリQ水に懸濁して、100℃で30分間の加熱処理をした後、凍結乾燥した。ホルマリン固定化スタフィロコッカス・アウレウス(商品名:パンソルビン)はカルビオケミ社より、ホルマリン固定化大腸菌(ATCC 11303)及びスタフィロコッカス・アウレウス由来のペプチドグリカンはシグマ社より、酵母(サッカロマイセス・セルビシエ)由来のザイモサンはモレキュラープローブ社よりそれぞれ購入した。
細菌由来のプロトプラストの調製方法としては、特に限定されないが、具体的には以下に示す方法を好適に用いることができる。グラム陽性菌加熱死菌体を4mMの塩化マグネシウムを含む50mMトリス・マレイト緩衝液(pH7.0)に懸濁し、M−1酵素を添加して37℃で16時間反応させて、細胞壁を消化させた。遠心分離により不溶性成分を回収してプロトプラストとした。
細菌由来の細胞壁テイコ酸の調製方法としては、特に限定されないが、具体的には以下に示す方法を好適に用いることができる。ラクトバチルス・プランタラムやスタフィロコッカス・アウレウス等の細胞壁にテイコ酸を含有するグラム陽性菌加熱死菌体を4mMの塩化マグネシウムを含む50mMトリス・マレイト緩衝液(pH7.0)に懸濁し、M−1酵素を添加して37℃で16時間反応させて、細胞壁を消化させた。遠心分離により不溶性成分を除去した後、上清をミリQ水に対して透析した後、凍結乾燥して粗細胞壁テイコ酸画分とした。
スタフィロコッカス・アウレウス由来のリポテイコ酸、大腸菌由来のリポポリサッカライド、ウイルス由来一本鎖RNAと類似の構造を持つイミダゾキノリン誘導体であるガルディモッド、及び非メチル化CpG DNAはいずれもインビボジェン社より購入した。
日本SLC社より購入した9週齢のメスのBALB/cマウスの腹腔内に4%チオグリコレート(ディフコ社)溶液2mlを投与した。4日後に腹腔内に誘導されてくる細胞をハンクス溶液(シグマ社)10mlを用いて回収し、腹腔マクロファージとした。腹腔マクロファージはハンクス溶液で3回洗浄後、10%牛胎児血清を含むRPMI 1640培地(シグマ社)に懸濁した。96ウエル培養プレート(ヌンク社)に腹腔マクロファージ(1×105個/ウエル/0.2ml)をまき、細菌(10μg/ml)または微生物処理物(1又は10μg/ml)を単独で、または、混合して添加して37℃で培養した。24時間後の培養上清を回収し、IL−12p70及びIL−10の濃度をELISAで定量した。ELISAでのIL−12p70及びIL−10の濃度の定量方法について以下に説明する。96ウエルELISAプレートに抗マウスIL−12抗体(クローン9A5、200倍希釈、ファーミンジェン社)または抗マウスIL−10抗体(クローンJES5−SXC1、500倍希釈、ファーミンジェン社)を4℃で一晩吸着させた。1%牛血清アルブミンでブロッキングした後、20倍または4倍に希釈した培養上清または標準IL−12p70(ファーミンジェン社)またはIL−10(ファーミンジェン社)を添加して室温で90分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ビオチン標識抗マウスIL−12抗体(クローンC17.8、1000倍希釈、ファーミンジェン社)またはビオチン標識抗マウスIL−10抗体(クローンJES5−2A5、2000倍希釈、ファーミンジェン社)を添加して室温で90分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼ(20000倍希釈、セロテック社)を添加して室温で30分間反応させた。0.05%トライトンX100を含むリン酸緩衝化食塩水で洗浄後、TMB試薬を添加して室温で10分間反応させ、1N硫酸を加えて反応を停止し、450nmの吸光値を測定した。標準IL−12p70またはIL−10から検量線を作成し、培養上清中の濃度を算出した。
成分(A)及び(B)を単独で添加した場合のIL−10、12の産生量、成分(A)と成分(B)とを組み合わせて添加した場合のIL−10、12の産生量、成分(A)同士、成分(B)同士を組み合わせて添加した場合のIL−10、12の産生量を表1に示した。成分(A)とラクトバチルス・カゼイとを組み合わせて添加した場合、両成分単独でのIL−10誘導量を加算した値以上に相乗的にIL−10産生が強く誘導された。IL−10産生の相乗的な誘導は成分(A)がラクトバチルス・プランタラム、ペプチドグリカン、プロトプラスト、リポテイコ酸、細胞壁テイコ酸、DNA、イミダゾキノリン化合物である場合に特に顕著であった。また、ラクトバチルス・プランタラムとラクトバチルス・ラムノーサスとを組み合わせて添加した場合も同様に相乗的にIL−10産生が強く誘導された。IL−10産生の相乗的な誘導効果は成分(B)がラクトバチルス・カゼイである場合に特に顕著であった。一方、成分(A)同士、成分(B)同士を組み合わせて添加した場合はIL−10産生の相乗的な誘導効果は認められなかった。
(1)N−アセチルムラミダーゼ処理
ラクトバチルス・プランタラム(ATCC 14917)、ラクトバチルス・アシドフィルス(ATCC 4356)、ラクトバチルス・カゼイ(YIT 9029)、ラクトバチルス・ラムノーサス(ATCC 7469)を4mM塩化マグネシウムを含む50mMトリス・マレイト緩衝液(pH7.0)中に懸濁し(2mg/ml)、N−アセチルムラミダーゼ(M−1酵素、生化学工業)を添加(10μg/ml)して37℃で10分反応させた。100℃、5分の加熱処理により酵素活性を失活させた後、反応液に対して1/4容量の10%SDS溶液を添加し、ボルテックスにて十分攪拌してプロトプラスト状の被験物質を溶解させた。その後、600nmの吸光度を測定し、消化率を算出した。
さらに、菌株保存機関より入手したラクトバチルス・カゼイ4株、ラクトバチルス・ラムノーサス4株、ラクトバチルス・ゼアエ1株、ラクトバチルス・ファーメンタム3株、ラクトバチルス・ガッセリ4株、ラクトバチルス・ジョンソニー4株、ラクトバチルス・アシドフィルス4株、ラクトバチルス・デルブルッキー4株、ラクトバチルス・ヘルベティカス4株、ラクトバチルス・プランタラム4株の36株の乳酸桿菌について、同様にN−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を調べた。また、マウス腹腔マクロファージ培養系にこれらの乳酸桿菌を添加(10μg/ml)して24時間培養し、上清中に誘導されるIL−12量をELISAで測定した。
ラクトバチルス・プランタラム(ATCC 14917)、ラクトバチルス・アシドフィルス(ATCC 4356)、ラクトバチルス・カゼイ(YIT 9029)、ラクトバチルス・ラムノーサス(ATCC 7469)のN−アセチルムラミダーゼ処理による消化率を表2に示した。
N−アセチルムラミダーゼ処理による成分(A)の消化率は43.5%以上であり、成分(B)の消化率は5.7%以下であった。
36株の乳酸菌について、N−アセチルムラミダーゼ処理による消化率とIL−12誘導活性を調べ、両者の関係を解析したところ、消化率とIL−12誘導量との間に負の相関(r=0.747)が認められた。すなわち、菌体消化酵素による消化率が高いものはIL−12誘導活性が弱く、逆に、菌体消化酵素による消化率が低いものはIL−12誘導活性が強いことがわかった。
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
(処方) (mg)
ラクトバチルス・プランタラム 10
ラクトバチルス・カゼイ 10
微結晶セルロース 100
乳糖 80
ステアリン酸マグネシウム 0.5
メチルセルロース 12
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
(処方) (mg)
リポテイコ酸 10
ラクトバチルス・カゼイ 10
微結晶セルロース 100
乳糖 80
ステアリン酸マグネシウム 0.5
メチルセルロース 12
下記の処方で各種成分を混合して造粒、乾燥、整粒した後に、打錠して錠剤を製造した。
(処方) (mg)
非メチル化CpG DNA 10
ラクトバチルス・カゼイ 10
微結晶セルロース 100
乳糖 80
ステアリン酸マグネシウム 0.5
メチルセルロース 12
下記の処方で処方したものを加熱殺菌後、褐色瓶にホットパック充填を行い、清涼飲料水を得た。
(処方) (g)
ビフィドバクテリウム・ブレーベ 0.4
ラクトバチルス・カゼイ 0.4
香料 0.8
クエン酸 0.2
果糖 4
スクラロース 0.001
水 94.199
15%脱脂乳に3%グルコースを添加し、120℃で3秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT 9029株を1%接種し、37℃でpH3.6まで培養してヨーグルトベース210gを得た。一方、砂糖97g、クエン酸鉄0.2g、ラクトバチルス・アシドフィルス1gを水に溶解し、水を加え全量を790gとし、この溶液を110℃で3秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を1g添加した後、15Mpaで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は108cfu/mlであった。
15%脱脂乳に3%グルコースを添加し、120℃で3秒間殺菌した後、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)YIT 9029株を1%接種し、37℃でpH3.6まで培養してヨーグルトベース210gを得た。一方、砂糖97g、クエン酸鉄0.2g、ペプチドグリカン1gを水に溶解し、水を加え全量を790gとし、この溶液を110℃で3秒間殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られたヨーグルトベースとシロップを混合し、香料を1g添加した後、15Mpaで均質化して容器に充填して発酵乳製品を得た。この発酵乳製品中のラクトバチルス・カゼイの初発菌数は108cfu/mlであった。
Claims (1)
- (A)インターロイキン12産生誘導能を有さない細菌又は微生物処理物と(B)インターロイキン12産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるインターロイキン10産生促進剤であって、(A)細菌として、スタフィロコッカス・アウレウス又は大腸菌、微生物処理物として、スタフィロコッカス・アウレウス由来のペプチドグリカン;グラム陽性菌から調製されたプロトプラスト;ザイモサン;リポテイコ酸;細胞壁テイコ酸;及びリポポリサッカライドよりなる群から選ばれる1種以上のTLR2若しくはTLR4のリガンド、又はTLR7、TLR8若しくはTLR9のリガンド、(B)ラクトバチルス・カゼイ及びラクトバチルス・ラムノーサスから選ばれるラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌である、前記インターロイキン10産生促進剤。
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