JP4851765B2 - 免疫機能調節剤 - Google Patents
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Description
IL類としては、IL 1〜IL 18の存在が知られている。そのうちIL 4はヘルパー2型T細胞から産生され、マスト細胞を活性化してアレルギー反応を増強する因子として、そして液性免疫を促進させる因子として知られている。
IFN類は、産生する細胞の種類によって名称が異なり、IFNα、IFNβ、IFNγの3つが知られている。IFNγは、主としてリンパ球が産生する分子量が約2万の糖蛋白質であって、抗ウイルス作用、マクロファージやナチュラルキラー細胞等の免疫担当細胞の活性化や分化誘導に作用する免疫調節因子として注目されている。そして、細胞性免疫を高める因子として知られている。
本発明の免疫機能調節能を発揮させるためには、成人の場合、乳酸菌体重量で1〜1,000mg摂取することが望ましい。乳酸菌体は、古来、発酵乳やチーズの製造に用いられており、本発明の免疫機能調節剤あるいは免疫機能調節用飲食品は安全性に問題はないという特徴がある。
(試料の調製)
脾臓細胞の培養時に、乳酸菌を添加した場合の細胞の機能変化を調べるために、IFNγ量、IL4量、IgE量を測定した。
実施例1と同様の手法を用いて、ラクトバチルス・ヘルベティカス (Lactobacillus helveticus) SBT2171(FERM P-14381)株、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei) ATCC 393株ならびにビフィドバクテリウム・アドレッセンティス(Bifidobacterium adolescentis) ATCC 15703株のそれぞれの菌体乾燥物を得た。なお、ラクトバチルス・カゼイ ATCC 393株は、特許文献1の実施例でIgE産生抑制作用のあることが示されている菌株であり、この菌株と本発明のラクトバチルス・ヘルベティカス SBT2171(FERM P-14381)株とを比較することで、間接的に特許文献1に記載のラクトバチルス・ヘルベティカスと本発明のラクトバチルス・ヘルベティカス SBT2171(FERM P-14381)株との比較が可能である。また、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス ATCC 15703株は、ヒトの腸内菌の一種であり、発明者らの実験で免疫機能調節作用がほとんど見られなかった菌株であり、陰性コントロールとして使用した。
BALB/cマウス(日本チャールズ・リバー社)に一匹当たり0.05mgのオボアルブミン(シグマ社)と1mgの水酸化アルミニウムを混合したエマルジョンを、腹腔に投与した。10日後に解剖し、脾臓を摘出し、培養液中で脾臓を磨砕し、リンホプレップ(比重1.077;ナイコメッド社)で密度勾配遠心を行い、脾臓細胞浮遊液を得た。
脾臓細胞浮遊液を10%ウシ胎児血清(ギブコ社)、100U/ml結晶ペニシリンGカリウム(ギブコ社)、100μg/ml硫酸ストレプトマイシン(ギブコ社)を含むRPMI1640培地(日水製薬社)を用いて、オボアルブミン(シグマ社)20μgおよびそれぞれの乳酸菌の菌体乾燥物0.04μgと共に、6×105/200μl/ウェルマイクロプレート(96ウェル丸底;Nunc社)で培養した。培養は、5%炭酸ガス、37℃の条件で行なった。乳酸菌の菌体乾燥物を添加しないで、同じ条件で処理したものをブランクとした。
7日目の培養上清を集め、その中のIFNγ量をマウスIFNγ用ELISAミニキット(KM-IFNG;Endogen社)でサンドウィッチELISA法により測定した。すなわち、一次抗体である抗マウスIFNγ抗体をキットの説明書にしたがって緩衝液に溶解し、96ウェルマイクロプレートに100μlを加え、一夜4℃で吸着させた。次いで、ブロッキングを行なった後、10倍に希釈した培養上清100μlを加え、室温で一晩インキュベートさせた。次いで、二次抗体として希釈したビオチン標識抗IFNγ抗体(KM-IFNG;Endogen社)を加え、室温で60分間インキュベートさせた。さらに、0.05%Tween 20(関東化学社)を含むリン酸緩衝化生理食塩水で400倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(554066;Pharmingen社)を50μl加え、37℃で90分間インキュベートさせた。発色用緩衝液(クエン酸−リン酸緩衝液)100mlにo-フェニレンジアミン(和光純薬工業社)40mg、30%過酸化水素水20μlを加えた基質溶液100μlをウェルに添加して酵素反応を行い、492nmの吸光度を測定した。キット付属のマウスIFNγ標準物質より作成した標準曲線から、培養上清中のIFNγ量(ng/ml)を求めた。その結果を図1に示す。
7日目の培養上清をIFNγと同様に10倍希釈して、IL 4量(ng/ml)を、マウスIL 4用ELISAミニキット(KM-IL 4;Endogen社)でサンドウィッチELISA法により測定した。その結果を図2に示す。
図2に示されるように、IL 4産生量はブランク区では2.5±0.8 ng/mlであったのに対し、ラクトバチルス・ヘルベティカス区では0.55±0.31 ng/mlと産生量が顕著に減少した。IL 4産生が、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体により阻害されていることがわかる。ラクトバチルス・カゼイ区とビフィドバクテリウム・アドレッセンティス区では、それぞれ1.8±0.3 ng/mlと2.2±0.9 ng/mlで、産生量がやや減少した
同条件で脾臓細胞の培養を継続して14日目に培養上清を集め、その中のIgE抗体量をサンドウィッチELISA法により測定した。すなわち、一次抗体であるモノクロナール抗マウスIgE抗体(260753;生化学工業社)を炭酸ナトリウム緩衝液に10μg/mlとなるように溶解し、96ウェルマイクロプレートに50μl加え、一夜4℃で吸着させた。次いで、ブロッキングを行なった後、培養上清50μlを加え、37℃で90分間インキュベートさせた。次いで、二次抗体として0.05%Tween 20を含むリン酸緩衝化生理食塩水で200倍に希釈したビオチン標識抗マウスモノクロナールIgE抗体(280913;生化学工業社)を50μl加え、37℃で90分間インキュベートさせた。さらに、0.05%Tween 20を含むリン酸緩衝化生理食塩水で400倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(554066;Pharmingen社)を50μl加え、37℃で90分間インキュベートさせた。発色用緩衝液(クエン酸−リン酸緩衝液)100mlにo-フェニレンジアミン(和光純薬工業社)40mg、30%過酸化水素水20μlを加えた基質溶液100μlをウェルに添加して酵素反応を行い、492nmの吸光度を測定した。モノクロナールマウスIgE標準液より作成した標準曲線から、培養上清中のIgE抗体量(ng/ml)を求めた。その結果を図3に示す。
なお、特許文献1の実施例においては、本試験例に使用した菌株と同一のラクトバチルス・カゼイATCC 393株と、本発明の菌株とは異なるラクトバチルス・ヘルベティカスATCC 15009株によるマウス脾臓細胞のIgE産生量は、それぞれ10.83ng/ml、28.56ng/mlであり、ラクトバチルス・カゼイATCC 393株のほうがIgE産生抑制作用が強い。一方、本試験例においては、上述したようにラクトバチルス・カゼイ ATCC 393株より本発明のラクトバチルス・ヘルベティカス SBT2171(FERM P-14381)株のほうがIgE産生抑制作用が強い。このことは、特許文献1に示されているラクトバチルス・ヘルベティカス ATCC 15009株と比較して本発明のラクトバチルス・ヘルベティカス SBT2171(FERM P-14381)株は、IgE産生抑制作用が極めて強いことを示している。
このようにラクトバチルス・ヘルベティカスSBT2171(FERM P-14381)株は脾臓細胞のIFNγ産生を飛躍的に促進し、IL 4産生ならびにIgE産生を飛躍的に抑制することが判明した。
(マウスでの経口摂取実験)
試験例1の結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスが脾臓細胞の機能を調節し、IFNγならびにIL 4のサイトカイン産生量を調節してIgE産生量を顕著に低下させることが判明したが、このサイトカイン産生量の調節ならびにIgE産生量調節がマウス生体内でも立証されるかを確認した。
表1に示す割合でマウス用飼料を調製した。
BALB/cマウス(6週齢、雌性;日本クレア社)を12匹ずつ3群に分け、表1に示した飼料を、それぞれ自由摂取させた。試験開始7日目に、一匹あたり0.05mgのオボアルブミン(シグマ社)と1mgの水酸化アルミニウムを混合したエマルジョンを腹腔に投与した。試験開始21日目に、7日目と同様に、オボアルブミンと水酸化アルミニウムの投与を行った。試験開始後28日目に採血し、リンホプレップ(比重1.077;ナイコメッド社)で密度勾配遠心を行い、末梢血単核球画分を調製した。免疫原であるオボアルブミンを0.1mg/mlになるように培養液中に加えて末梢血単核球画分を培養プレートに培養した。
3日間培養し、培養上清中のIFNγ量を、マウスIFNγELISAキット(Endogen社)を用いて定量した。IFNγ量の産生量を測定した結果を図4に示す。
図4に示されるように、実験動物飼料であるCE−2粉末のみを与えたC群では2.2±0.8 ng/mlであったのに対し、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体乾燥物を添加したA群では20±3.5 ng/mlとなりIFNγ産生量が顕著に増加した。ラクトバチルス・ヘルベティカス発酵物散剤を添加したB群では23±4.4 ng/mlとなり、いずれも飛躍的に産生量が増大した。
IFNγと同様にIL 4量(ng/ml)を定量した結果を図5に示す。図5に示されるように対照のC群では2.9±0.9 ng/mlであったのに対し、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体乾燥物を添加したA群では1.8±0.3 ng/ml、ラクトバチルス・ヘルベティカス発酵物散剤を添加したB群では1.8±0.3 ng/mlとなり、いずれもIL 4産生量が顕著に減少した。IL 4産生が、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体により阻害されていることがわかる。
各群のマウスの眼窩静脈叢から採血し、血清を分離して血清中のIgE濃度を、試験例1に示したELISA法により測定した。なお、血清は20倍希釈したものを用いた。その結果を図6に示す。
図6に示されるように対照のC群では11.9±3.4μg/mlであったのに対し、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体乾燥物を添加したA群では6.5±2.6μg/ml、ラクトバチルス・ヘルベティカス発酵物散剤を添加したB群では5.1±2.4μg/mlとなり、IgE産生量がいずれも顕著に減少した。
この試験の結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスを経口摂取したマウスのサイトカイン産生量が調節され、血清IgEが調節されることが生体内でも確認された。
LH: ラクトバチルス・ヘルベティカス
BA:ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス
A: A群(ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体乾燥物0.05%投与群)
B: B群(ラクトバチルス・ヘルベティカス発酵物散剤10%投与群)
C: C群(実験動物用飼料のみ投与群)
Claims (1)
- ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株(FERM P‐14381)の菌体を有効成分とする免疫機能調節剤。
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