JP6821643B2 - 免疫疾患予防剤 - Google Patents
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Description
(1)
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)に属する乳酸菌を有効成分とする、免疫疾患予防剤。
(2)
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株であることを特徴とする(1)記載の、免疫疾患予防剤。
(3)
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2161株であることを特徴とする(1)記載の、免疫疾患予防剤。
(4)
(1)乃至(3)のいずれかに記載の免疫疾患予防剤を含むことを特徴とする免疫疾患予防剤用飲食品、免疫疾患予防剤用栄養組成物、又は免疫疾患予防剤用医薬品。
(5)
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)に属する乳酸菌を有効成分とする、免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加剤。
(6)
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株であることを特徴とする請求項5記載の、免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加剤。
(7)
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2161株であることを特徴とする請求項5記載の、免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加剤。
(8)
(5)乃至(7)のいずれかに記載の免疫疾患予防剤を含むことを特徴とする免疫細胞増殖抑制かつIL10/IL12産生比増加剤用飲食品、免疫細胞増殖抑制かつIL10/IL12産生比増加剤用栄養組成物、又は免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加剤用医薬品。
(9)
下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする乳酸菌のスクリーニング方法。
(A)免疫細胞から産生されるIL-10産生量/IL-12産生量の比を増加させる乳酸菌をスクリーニングするステップ。
(B)免疫細胞の細胞増殖を抑制する乳酸菌をスクリーニングするステップ。
本発明の免疫疾患予防能を発揮させるためには、成人の場合、乳酸菌体重量で1〜1,000mg摂取することが望ましい。乳酸菌体は、古来、発酵乳やチーズの製造に用いられており、本発明の免疫疾患予防剤、免疫疾患予防用飲食品、免疫疾患予防用栄養組成物、及び免疫疾患予防用医薬品は安全性に問題はないという特徴がある。
以下に述べるように、in vitroにおいて、表1に示す43種類の乳酸菌をマウスの免疫細胞に添加して培養し、免疫細胞の増殖活性に与える影響を評価し、コントロール(乳酸菌無添加)と比較して、増殖活性を低下させる乳酸菌をスクリーニングした。
試験に用いた乳酸菌株を表1に示した。ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株、Streptococcus thermophilus及びLactobacillus(Lactobacilluskefiranofaciens、Lactobacillus plantarumを除く)はMRS 培地(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)で37℃16時間培養した。Lactobacillus の中でもLactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus plantarum、及びLactococcus lactis はMRS培地で30℃16時間培養した。Bifidobacteriumは1%グルコースを加えたGAM培地(Nissui Seiyaku Co., Tokyo, Japan)で37℃16時間培養した。Leuconostocは1%グルコースを加えたGAM培地で30℃16時間培養した。
培養液からの菌体サンプルの調整は、常法に従った。具体的には、表1の各乳酸菌株を上記の手順で培養した後に、各乳酸菌培養液から遠心分離によって菌体を回収し、滅菌超純水で洗浄した後、凍結乾燥した。凍結乾燥粉末は滅菌超純水に10 mg/mlの濃度で懸濁した。菌懸濁液を80℃で30分間加熱し、試験サンプルとした。試験に使用するまで凍結保存した。
Lb.: Lactobacillus, Lc.: Lactococcus, B.: Bifidobacterium, Leu.: Leuconostoc
T: Type strain(基準株)
JCM: JapanCollection of Microorganisms, Saitama, Japan.
ATCC: American type culture collection, Manassas, USA.
NCFB: National Collection for Food Bacteria, Reading, UK.
RPMI 1640 medium(Life Technologies, Gaithersburg, MD)に、10%非働化ウシ胎仔血清(エンドトキシン保証品)(Life Technologies)、10 mM HEPES(Life Technologies)、2 mM L-グルタミン(Life Technologies)、100 U/mL ペニシリン(Life Technologies)、100 μg/mL ストレプトマイシン(Life Technologies)及び0.05 mM 2-メルカプトエタノールを添加してRPMI培地を作成した。C57BL/6Jマウス(7〜10週齢、雄性;日本チャールス・リバー社)から、腸間膜リンパ節を摘出し、RPMI培地に添加してすり潰し、70μm-セルストレイナー(BD Biosciences, San Jose, CA)で濾過して、細胞分散液を得た。分散液中の細胞はRPMI培地で2回洗浄した後、RPMI培地に再分散した。
調製した細胞を5.0×104cells/ウェルの密度で96ウェルround-bottomed プレート(iwaki, Japan)に播種し、細胞と同数の抗マウスCD3/CD28抗体ビーズ(Life Technologies)及び、各乳酸菌サンプル(終濃度10μg/ml)を加えて200 μlとし、37°C、5% CO2の条件下で3日間培養した。3日間培養後に細胞の増殖活性の上昇に伴い、強く蛍光を発する試薬であるPrestoBlue(R) Cell Viability Reagent (Life Technologies)を製品のプロトコルに従って各ウェルに添加した。さらに7時間培養した後に、培養上清の蛍光強度を測定した。各乳酸菌株を添加した蛍光強度は、細胞に抗マウスCD3/CD28抗体ビーズのみを加えて培養したコントロール群の蛍光強度を100とした相対値で、図1に示した。
表1の乳酸菌の中から、細胞増殖活性がコントロールと比較し増加したLactobacillus gasseri JCM1131T株、細胞増殖活性がコントロールとほぼ同等であったLactobacillus salivarius ssp. salivariusSBT11459、Lactobacillus plantarum SBT11457、及び、細胞増殖活性が低下したLactobacillus helveticus SBT2171の合計4菌株を選び、IL-10/IL-12産生比の測定に供した。以下に述べるように、 in vitroにおいて、上記4菌株をマウスの免疫細胞に添加して培養し、コントロール(乳酸菌無添加)と比較し、IL-10/IL-12産生比を高める乳酸菌をスクリーニングした。
上述の細胞増殖活性測定と同様の手法で調製した。
試験に用いた乳酸菌株を表2に示した。培養液からの菌体サンプルの調製は、Foligneらの方法に準拠した(非特許文献2)。具体的には、各乳酸菌株をMRS 培地(Difco Laboratories)で37℃16時間培養し、各乳酸菌培養液から遠心分離によって菌体を回収した。PBS(−)で洗浄した後に、1×109cfu/mlの濃度でグリセロールを20%含むPBS(−)に懸濁した。試験に使用するまで、−80℃で凍結保存した。
2.0×106cells/mlの濃度に調製した細胞を24ウェルプレート(iwaki)に各ウェルに1mlずつ播種し(2.0×106cells/ウェル)、1×109cfu/mlの濃度に調整した乳酸菌サンプルを20μlずつ添加した(2.0×107cfu/ウェル)。コントロール群には、乳酸菌サンプルの代わりに、グリセロール20%を含むPBS(−)を20μl添加した。37°C、5%CO2の条件下で24時間培養し、培養後に細胞を含む全培養液を遠心分離して培養上清を得た。上清中のIL-10産生量を、IL-10測定キットのMouse IL-10 Ready-SET-Go!(eBioscience, San Diego, CA.)を用いて測定し、その数値を図2に示した。同様に、上清中のIL-12産生量を、IL-12測定キットのmouse IL-12 p70(R&D Systems, Minneapolis, MN.)を用いて測定し、その数値を図3に示した。
表1の乳酸菌の中から、Lactobacillus helveticusに属するラクトバチルス・ヘルベティカスSBT2161株(NITE ABP-01707)、ラクトバチルス・ヘルベティカスSBT0621株(FERMP-21883)、ラクトバチルス・ヘルベティカス BT0064株(FERMP-21079)の合計3菌株を選び、IL-10/IL-12産生比の測定に供した。以下に述べるように、in vitroにおいて、上記4菌株をマウスの免疫細胞に添加して培養し、コントロール(乳酸菌無添加)と比較し、IL-10/IL-12産生比を高める乳酸菌をスクリーニングした。
上述のIL-10/IL-12産生比の測定(1)と同様の手法で調製した。
試験に用いた乳酸菌株を表3に示した。培養液からの菌体サンプルは、上述のIL-10/IL-12産生比の測定(1)と同様の手法で調製した。
上述のIL-10/IL-12産生比の測定(1)と同様の手法で測定した。IL-10産生量、IL-12産生量から算出したIL-10/IL-12比を図5に示した。
通常、IL-10やIL-12をはじめとしたサイトカイン類の産生が増加する場合には、免疫細胞の活性化が伴うため免疫細胞の増殖が伴う。しかし、上記の結果より、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)はIL-10/IL-12比を高く誘導し、かつ免疫細胞の増殖を抑える事がわかった。その原因を探るために、Lactobacillus gasseriのJCM1131株及び、Lactobacillus helveticusを選択し、in vitroにおいて、細胞毒性を評価した。
上述の細胞増殖活性測定と同様の手法で調製した。
試験に用いた乳酸菌株を表3に示した。各乳酸菌の培養条件、試験サンプルの調製方法は、上述の細胞増殖活性測定と同様である。
調製した細胞を5.0×104cells/ウェルの密度で96ウェルround-bottomed プレート(iwaki)に播種し、各乳酸菌サンプル(終濃度10μg/ml)を加えて200μlとし、37°C、5% CO2の条件下で3日間培養した。3日間培養後にCyQUANT(R) Direct Cell Proliferation Assay kit (Life Technologies)を製品のプロトコルに従って添加し、さらに1時間培養して、蛍光強度を測定した。蛍光強度から算出した生細胞数を図6に示した。
ラクトバチラス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株を、脱脂乳100gを用いて37℃、12時間培養したものを、新しい同培地3kgに接種し、37℃、12時間培養した。培養終了した発酵乳全量をスターターとして用い、脱脂乳100kgを32℃、20時間発酵させて、免疫疾患予防作用を有するラクトバチラス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus) SBT2171株の発酵乳を得た。ラクトバチラス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171の生菌数は8.2×108個/gであった。
実施例1の(0024)で得られた菌体粉末1部に脱脂粉乳4部を混合し、この混合粉末を打錠機により1gずつ常法により打錠して、ラクトバチラス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)SBT2171株の菌体200mgを含む免疫疾患予防作用を有する菌体粉末錠剤を得た。
表5に示した配合により原料を混合し、造粒した後、カプセルに充填して、免疫疾患予防制作用を賦与したカプセル剤を製造した。
チーズ中の脂肪率が12〜30%となるように調整した原料乳を使用して、数種類の低脂肪硬質ナチュラルチーズを製造した。すなわち、脂肪率を調整した原料乳を75℃で15秒間のプレート加熱殺菌を行った後、30℃まで冷却し、0.01%塩化カルシウムを添加した。次に、これらの原料乳に市販の乳酸菌スターター(クリスチャン・ハンセン社製)0.7%及びラクトバチラス・ヘルベチカス(Lactobacillus helveticus)JCM1120T株(基準株) 1%を添加し、レンネット0.003 %を添加して乳を凝固させた後、カッテングしてpHが6.2〜6.1となるまで撹拌し、ホエーを排出し、カード粒を得た。さらに、このカード粒を型詰めして圧搾し、さらに加塩して、ゴーダチーズタイプの低脂肪硬質ナチュラルチーズを製造した。
Claims (2)
- ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)SBT2161株の生菌体を有効成分とする、免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加剤。
- 請求項1に記載の免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加剤を含むことを特徴とする免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加用飲食品、免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加用栄養組成物、又は免疫細胞増殖抑制かつIL-10/IL-12産生比増加用医薬品。
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