CN106795482B - 允许在营养不良的情况下促进人和动物的幼年生长的乳杆菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少一种具有肠道向性的乳杆菌属(Lactobacillus)菌株的药物组合物或益生组合物，所述乳杆菌属菌株尤其选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)这些物种，所述组合物用于旨在在营养不良的情况下促进幼年生长的用途。所述营养不良尤其为以蛋白质缺乏为特征的营养不良。所述菌株可以在果蝇模型上和/或在小鼠模型上进行选择。本发明还涉及使用该组合物的益生性处理方法。

Description

允许在营养不良的情况下促进人和动物的幼年生长的乳杆菌 组合物
本发明涉及在营养不良的情况下促进人和动物的幼年生长的药物组合物或益生组合物。该组合物包含至少一种具有肠道向性的细菌(优选地乳酸细菌)作为活性成分或组分。
被描述为“附加器官”的肠道微生物群落(或肠道微生物丛)通过行使众多生物学功能来发挥对于宿主有益的关键作用，例如有助于消化的效率、底物的代谢、针对病原体的斗争或者免疫应答的确立和稳态。不同肠道细菌种群之间的不平衡具有有时有害的回应，其导致各种不同的病理学状况(例如，慢性炎性疾病，或代谢病症，包括肥胖症或者2型糖尿病)的发展。这些不平衡还潜在地牵涉癌症的发展和行为综合征的确立。因此，维持肠道微生物丛的平衡是必需的：影响其组成和/或其活性将会是用于治疗上述综合征的一个主要成功手段。本着该精神，使用所谓“益生的”细菌菌株来干预由所述微生物丛所影响的病理学状况的想法体现了其全部意义。
2001年由世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)定义，益生菌是“当以足够的量摄入时对于健康产生超过传统营养效应之外的正面效应的活微生物”。
至于本发明，其属于允许优化幼年生长或者在营养不良的背景下恢复正常的幼年生长的条件重建。
因此，本发明的目标在于提出新的组合物，其允许在已经经历或正经历营养不良(尤其是进食不足和/或同化不良)的人或动物受试者中促进幼年生长或者重建正常的幼年生长。
本发明的另一个目标在于提供这样的组合物，其基于使用具有肠道向性的细菌菌株，尤其是共生的或者作为益生菌可接受的菌株。
本发明的另一个目标在于提供这样的组合物，其还可以被纳入在治疗背景中。
本发明的另外一个目标在于提供益生性处理或治疗性处理的方法。
本发明的另外一个目标在于提供这样的组合物和方法，其允许支持按照现行法规(尤其是欧洲法规)的健康和/或营养主张。
本发明基于这样的事实，即某些在动物物种中具有肠道向性的细菌菌株具有在经历营养不良(尤其是进食不足或同化不良)的该同一物种或另一物种的受试者中促进或重建幼年生长的效应。因此，已经能够证明乳杆菌属(Lactobacillus)的细菌菌株在果蝇模型中和在与营养缺乏型营养饮食制度相联合的小鼠模型中均能够促进幼年生长，和此外，已经能够在这些在小鼠中的结果与在这些条件下用这些细菌处理的小鼠中的IGF-1血清滴度的增加之间建立联系。
因此，本发明的目标在于包含至少一种具有肠道向性的细菌菌株(特别是乳酸细菌)的组合物，所述组合物用于为了在营养不良的情况下促进幼年生长而进行使用。营养不良的概念集合了进食不足、进食过量和同化不良。本发明特别地针对进食不足和/或同化不良。本发明优选地针对进食不足。所述组合物的适应症将可以是治疗性的或健康的，例如药物，或者是营养性的，例如益生制剂。
具有“肠道向性”的细菌是指具有通过胃屏障的能力和能够在肠中坚持的细菌。
按照本发明的一个有利的特征，所述细菌可以在用根据本发明的组合物进行处理的人或动物中促进IGF-1的产生。
本发明尤其提出了属于下列科的细菌菌株：乳杆菌科(Lactobacillaceae)、链球菌科(Streptoccaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)。依照一种方式，本发明使用一种或多种乳杆菌属菌株，特别是下列物种之一：德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
更特别地，所述细菌为属于植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌这些物种的细菌。依照一种方式，所述菌株选自植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌这些物种。
依照一个实施方案，所述细菌菌株选自植物乳杆菌WJL、植物乳杆菌G821、干酪乳杆菌ATCC 393、干酪乳杆菌L919、类干酪乳杆菌ATCC25302、类干酪乳杆菌Shirota、发酵乳杆菌ATCC9338、鼠李糖乳杆菌L900、鼠李糖乳杆菌L908、鼠李糖乳杆菌GG。依照一种方式，所述菌株选自植物乳杆菌WJL、植物乳杆菌G821、干酪乳杆菌ATCC 393、干酪乳杆菌L919、发酵乳杆菌ATCC9338。
在一个特别的实施方案中，所述细菌是植物乳杆菌这一物种的细菌，例如菌株WJL，或菌株G821，其于2015年5月11日以登记号CNCM I-4979保藏于国家微生物保藏中心(Collection Nationale de Culture de Microorganismes)(Institut Pasteur)。已经通过植物乳杆菌NIZO2877这一菌株的实验进化(即通过天然变体的积累和选择)而获得了菌株G821。
依照一种方式，根据本发明的组合物包含至少一种从这些群中选择的细菌菌株，其具有所要求的特性并且允许促进或重建幼年生长，尽管有着营养不良的插曲。当然，根据本发明的组合物可以包含多于一种符合本发明的需求的细菌菌株。尤其，所述组合物包含选自相同物种或不同物种的2种或更多种这些细菌菌株。
依照一个令人感兴趣的实施方案，所述细菌为植物乳杆菌。合适的菌株为植物乳杆菌G821和植物乳杆菌WJL(Eun-Kyoung Kim等人,Genome Announcements,2013年11/12月,vol.1,no.6e00937-13,GenBank AUTE00000000,Lactobacillus plantarum WJL,wholegenome shotgun sequencing project)。该菌株WJL最初已分离出并且可以从果蝇中分离(JH Ryu等人,Science 2008,319:777-782)。
合适菌株的其他例子为下列：干酪乳杆菌ATCC 393、干酪乳杆菌L919(Koryszewska-Baginska A.等人,2013年9月26日,Genome Announc)、类干酪乳杆菌ATCC25302、类干酪乳杆菌Shirota(Yuki N等人,Int J Food Microbiol.1999年4月1日,48(1):51-7)、发酵乳杆菌ATCC9338、鼠李糖乳杆菌L900(Aleksandrzak-Piekarczyk T.等人,Genome Announc,2013年8月15日)、鼠李糖乳杆菌L908(Koryszewska-Baginska A.等人,2014年2月20日,Genome Announc)、鼠李糖乳杆菌GG(Kankainen M.等人,Proc Natl AcadSci USA,2009年10月6日)。
因此，本发明在技术上提供了教导，即具有肠道向性的细菌菌株促进幼年生长，尤其是在营养不良的(人或动物)患者中。但是，本发明并不局限于该教导，它还向技术人员提供可靠地测定对于本发明来说有用的细菌菌株。不同的标准可以基于测试，其中单独地或相联合地进行使用。在这些标准中，将会注意到在模型动物(例如小鼠)中的IGF-1血清水平、在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的幼虫生长、模型小鼠的生长(例如通过股骨大小或动物大小的获取来举例说明)。在这些标准或相似标准的基础之上，对于技术人员来说可能的是，制定这样的测试，其比较在营养不良的条件下在待测试细菌存在或不存在下所饲养的个体。通过下述方式，本发明还提供了更多：提出无菌动物模型和在待测试细菌存在或不存在下的动物饲养，从而使得能够将测试集中在所测试的菌株的内在特性的分析上并因此摆脱常规动物的常驻肠道微生物丛在功能测试的背景下可能具有的效应。由此得到关于所测试的菌株的功能潜力的测试的增加的可预测性。
“无菌(的)”生物是指在没有微生物并因此没有肠道微生物区系的环境中饲养的生物(例如果蝇、小鼠)。
“单菌(的)”生物是指在单一微生物存在下进行饲养并因此携带该单一微生物作为肠道微生物区系的相关联的无菌生物(例如果蝇、小鼠)。
依照本发明的一个特征，根据本发明的细菌菌株的特征在于，它们对于这样的测试作出阳性反应或者已通过使用这样的测试而被选择，在所述测试中将在缺乏酵母(并因此缺乏蛋白质)的营养培养基上来自无菌果蝇的幼虫的生长与在常规营养培养基上的生长进行比较。实验室的常规营养培养基通常至少包含植物粉，典型地玉米粉，灭活酵母，典型地啤酒酵母或面包酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))，琼脂，和水。缺乏灭活酵母的培养基不允许果蝇幼虫的最佳的胚胎后(即幼年)发育，如已经在G.Storelli等人,Cell Metabolism 14,403-414,2011中所报告的。此外，用待测试细菌接种一组胚胎，这允许将从胚胎出现的幼虫与待测试细菌相关联。因此，可以检测该细菌是否能够促进或允许幼年生长，尽管是缺乏酵母的营养培养基。
所述果蝇测试典型地以下述方式来进行：
-拥有一批来自无菌的黑腹果蝇亲本(例如，果蝇yw这一株系，或任何其他所谓“野生型”的株系)的胚胎；
-在第1天：在包含玉米粉、琼脂和水且缺乏酵母的营养培养基上将这些胚胎分配成至少2个组(40个胚胎，以三次重复实施，对于总共120个胚胎/组)，此外将所述胚胎组之一用在盐水缓冲液(例如PBS)中的大约108CFU的待测试细菌的悬浮液进行接种，这形成单菌组，另一组形成无菌组，在大约25℃下进行饲养直至第7天；典型地，所述培养基由7.14g的琼脂、80g的玉米粉和6g的灭活酵母(对于1升的培养基而言)组成，将所述培养基在沸水中煮10分钟，然后冷却；典型地，不缺乏灭活酵母的相同的培养基包含50g的灭活酵母；
-在第7天：从每个组中回收至少60只来自经接种或未接种的胚胎的果蝇幼虫(分别为单菌幼虫和无菌幼虫)，对它们施行快速的热休克(例如5秒钟；典型地，将幼虫在加热至100℃的板上放置5秒钟；这涉及杀死幼虫而不使其变形以便使得能够测量其大小)；
-测定每个组的幼虫的长度平均值，并比较所获得的平均值；
-如果单菌组的幼虫的长度平均值以下述程度大于无菌组的幼虫的长度平均值，那么认为所测试的细菌菌株对于所述测试作出阳性反应：在对于所述两个组的幼虫的整套大小数据进行的Mann-Whitney统计学检验中具有小于或等于0.001，优选地小于或等于0.0001的p值。
因此，本发明的目标在于包含至少一种具有肠道向性的细菌菌株(特别是乳酸细菌)的组合物，所述组合物用于为了在营养不良的情况下促进幼年生长而进行使用，其中所述细菌菌株对于上面所描述的在果蝇上的测试作出阳性反应。作为例子，可以提及下列菌株：植物乳杆菌WJL、植物乳杆菌G821、干酪乳杆菌ATCC 393、干酪乳杆菌L919、类干酪乳杆菌ATCC25302、类干酪乳杆菌Shirota、发酵乳杆菌ATCC9338、鼠李糖乳杆菌L900、鼠李糖乳杆菌L908、鼠李糖乳杆菌GG。其他菌株可以从具有肠道向性的细菌中和尤其是从上面提及的物种中鉴定出来。
在本发明的一个实施方案中，使用菌株WJL或具有“明显的”效应的任何其他菌株(例如，干酪乳杆菌ATCC 393、发酵乳杆菌ATCC 9338、类干酪乳杆菌ATCC 25302)作为参照菌株以便鉴定和选择这样的细菌菌株，其具有“明显的”对于幼年生长的效应，即与该参照菌株例如WJL的效应接近的效应(并非显著地不同于参照菌株例如WJL的效应)，或者“强的”对于幼年生长的效应(显著地大于参照菌株例如WJL的效应)。
为此，将所述果蝇测试(包括60只幼虫/条件)应用于参照菌株例如WJL和待测试菌株(平行地，优选地或者可以拥有对于参照菌株例如WJL事先产生的参照数据，例如在实施例中所给出的数据)。然后，比较关于所述两个菌株而获得的平均值。如果单菌组的幼虫的长度平均值并不显著地不同于参照组(例如WJL)的幼虫的长度平均值，那么认为所测试的细菌菌株为具有明显的效应的菌株，其中在对于整套数据进行的Mann-Whitney统计学检验中具有大于0.001的p值。如果关于待测试菌株的所述平均值显著地大于关于参照菌株例如WJL的平均值，那么该效应是强的，这是当统计学检验的p值小于或等于0.001，优选地小于或等于0.0001时的情况。如果关于待测试菌株的所述平均值显著地小于关于参照菌株例如WJL的平均值，那么该效应被视为中间的，这是当统计学检验的p值小于或等于0.001，优选地小于或等于0.0001时的情况。
因此，本发明的目标在于包含至少一种具有肠道向性的细菌菌株(特别是乳酸细菌)的组合物，所述组合物用于为了在营养不良的情况下促进幼年生长而进行使用，其中所述细菌菌株在上面所描述的果蝇模型中对于生长具有明显或强的效应。作为例子，可以提及下列菌株：植物乳杆菌WJL、植物乳杆菌G821、干酪乳杆菌ATCC 393、干酪乳杆菌L919、类干酪乳杆菌ATCC25302、类干酪乳杆菌Shirota、发酵乳杆菌ATCC9338、鼠李糖乳杆菌L900、鼠李糖乳杆菌L908、鼠李糖乳杆菌GG。其他菌株可以从具有肠道向性的细菌中和尤其是从上面提及的物种中鉴定出来。
本发明的目标尤其在于包含具有肠道向性的细菌菌株(其尤其属于上面提及的科、属或物种，优选地属于乳杆菌属)的组合物，所述组合物用于旨在在营养不良的情况下促进幼年生长的用途，其中所述细菌菌株对于下述测试作出阳性反应：
-拥有一批无菌的黑腹果蝇亲本的胚胎；
-在第1天：在包含玉米粉、琼脂和水且缺乏酵母的营养培养基上将这些胚胎分配成至少2个组(40个胚胎，以三次重复实施，即120个胚胎/组)，将所述胚胎组之一用在盐水缓冲液中的大约108CFU的所述细菌的悬浮液进行接种，这形成测试单菌组，将另一组用在盐水缓冲液中的大约108CFU的参照细菌即植物乳杆菌WJL、干酪乳杆菌ATCC 393、发酵乳杆菌ATCC 9338或类干酪乳杆菌(L.paracasei)ATCC 25302的悬浮液进行接种，从而形成参照单菌组，在大约25℃下进行这两个组的饲养直至第7天；
-在第7天：从每个组中回收至少60只果蝇幼虫，对它们施行热休克；
-测定每个组的幼虫的长度平均值，并比较所获得的平均值；
-所述细菌菌株相对于参照细菌而言具有强的效应，其中用该细菌菌株的测试单菌组的幼虫的长度平均值显著地大于关于用参照菌株的单菌组的平均值，其中在对于所述两个组的幼虫的整套大小数据进行的Mann-Whitney统计学检验中p值小于或等于0.001，优选地小于或等于0.0001。
根据本发明，还可能的是，通过使用无菌小鼠模型来测定具有肠道向性的细菌菌株是否允许在营养不良的情况下促进生长，所述无菌小鼠模型使得能够与微生物丛的不存在和/或与参照细菌菌株的存在相比较地实施在待测试细菌存在下小鼠骨骼生长的监测。该模型可以以最初的意图进行使用或者在对于果蝇测试作出阳性反应的菌株上进行使用。
依照本发明的一个特征，根据本发明的细菌菌株的特征在于，它们对于下面的骨骼生长测试作出阳性反应：
-从相同的小鼠品系(典型地，Balb/c小鼠)开始，建立无菌亲本小鼠品系和单菌亲本小鼠品系(与待测试细菌相关联的)，并且产生幼年鼠，将所述幼年鼠与亲本一起用常规营养培养基进行饲养直至其断奶(在第21天)；为了形成单菌幼年鼠组，使用与待测试细菌菌株单相关联的亲本；
-在第21天：拥有来自这两个品系中每一个品系的8只经断奶的幼年鼠，从而形成单菌组和无菌组，并且将它们以缺乏蛋白质(8％)和脂质(2.5％)的营养饮食制度进行饲养；典型地，常规营养饮食制度包含23％的蛋白质和5％的脂质；
-在第56天：通过对每个个体从口鼻部端部至尾巴基部进行测量，测定关于所考虑的组的小鼠的大小平均值；另一种可能的测量在于处死个体、从中取出股骨和测量这些股骨；
-如果单菌组的个体和/或股骨的平均大小分别以下述程度大于无菌组的个体和/或股骨的平均大小，那么认为所述乳酸细菌菌株对于所述测试作出阳性反应：在Tukey统计学检验中具有小于或等于0.05的p值。
因此，本发明的目标在于包含至少一种具有肠道向性的细菌菌株(特别是乳酸细菌)的组合物，所述组合物用于为了在营养不良的情况下促进幼年生长而进行使用，其中所述细菌菌株对于在小鼠上的骨骼生长测试作出阳性反应。果蝇测试允许更快速的筛选，因而通常也拥有在果蝇上的测试，并且所述细菌菌株对于果蝇测试和骨骼生长测试作出阳性反应。作为例子，可以提及下述菌株：植物乳杆菌WJL。其他菌株可以从具有肠道向性的细菌中，和尤其是从上面提及的物种和菌株中，尤其是从植物乳杆菌G821、干酪乳杆菌ATCC393、干酪乳杆菌L919、类干酪乳杆菌ATCC25302、类干酪乳杆菌Shirota、发酵乳杆菌ATCC9338、鼠李糖乳杆菌L900、鼠李糖乳杆菌L908、鼠李糖乳杆菌GG这些菌株中鉴定出来。
在本发明的一个实施方案中，使用菌株WJL或具有“明显的”效应的其他菌株作为参照菌株以便鉴定和选择这样的细菌菌株，其具有“明显的”对于幼年生长的效应，即与该参照菌株例如WJL的效应接近的效应(并非显著地不同于参照菌株例如WJL的效应)，或者“强的”对于幼年生长的效应(显著地大于参照菌株例如WJL的效应)。
为此，将所述小鼠测试(包括8只小鼠/条件)应用于参照菌株例如WJL和待测试菌株(平行地，优选地或者可以拥有对于菌株WJL事先产生的参照数据，例如在实施例中所给出的数据)。然后，比较关于所述两个菌株而获得的平均值。如果单菌组的个体和/或股骨的平均大小的平均值并不显著地不同于关于参照组(例如WJL)的相应的平均值，那么认为所测试的细菌菌株为具有明显的效应的菌株，其中在Tukey统计学检验中具有大于0.05的p值。如果关于待测试菌株的所述平均值显著地大于关于参照菌株例如WJL的平均值，那么该效应是强的，这是当统计学检验的p值小于或等于0.05时的情况。如果关于待测试菌株的所述平均值(其已在前面的测试中相关于无菌小鼠进行了描述)显著地小于关于参照菌株例如WJL的平均值，那么该效应被视为中间的，这是当统计学检验的p值小于或等于0.05时的情况。
根据本发明的组合物优选地将会包含具有这样的明显或强的效应的细菌菌株。
根据本发明的细菌菌株的特征可以在于，它们对于血清IGF-1水平具有正面影响。因此，在无菌小鼠模型的基础之上，可能的是证明，用具有低的蛋白质含量的培养基但在细菌存在下进行饲养的小鼠(单菌小鼠)具有更大的生长和同时更高的血清IGF-1水平，相对于用该缺乏蛋白质的培养基并且在细菌不存在下进行饲养的这些相同小鼠(无菌小鼠)而言。这使得能够提出这样的测试，其使得能够测定细菌菌株是否具有增加IGF-1血清水平的潜力，该测试可以与骨骼生长测试相联合地进行应用以便明确或提炼所述菌株在该幼年生长背景下的效应，或者以最初的意图进行应用。
在该情况下，根据本发明的细菌菌株的特征在于，它们对于下面的血清IGF-1水平测试作出阳性反应：
-从相同的无菌小鼠品系(典型地，Balb/c小鼠)开始，建立无菌亲本小鼠品系和单菌亲本小鼠品系(与待测试细菌相关联的)，并且产生幼年鼠，将所述幼年鼠与亲本一起用常规营养培养基进行饲养直至其断奶(第21天)；为了形成单菌幼年鼠组，使用与待测试细菌菌株单相关联的亲本；
-在第21天：拥有来自这两个品系中每一个品系的8只经断奶的幼年鼠，从而形成单菌组和无菌组，并且将它们以缺乏蛋白质(8％)和脂质(2.5％)的营养饮食制度进行饲养；典型地，常规营养饮食制度包含23％的蛋白质和5％的脂质；
-在第56天：抽取每个组的幼年鼠的血液，并测定关于每个组的IGF-1的平均血清水平；IGF-1血清水平的该测量优选地在经稀释的(1:25)血清上进行；优选地使用IGF-1检测的商业ELISA试剂盒，其中依照制造商的使用说明书；
-如果单菌组的IGF-1的平均血清水平以下述程度大于无菌组的平均血清水平，那么认为所述乳酸细菌菌株对于所述测试作出阳性反应：在Tukey统计学检验中具有小于或等于0.05的p值。
因此，本发明的目标在于包含至少一种具有肠道向性的细菌菌株(特别是乳酸细菌)的组合物，所述组合物用于为了在营养不良的情况下促进幼年生长而进行使用，其中所述细菌菌株增加血清IGF-1水平。它尤其是对于上面所描述的在小鼠上的测试作出阳性反应的细菌菌株。
本发明的目标还在于包含至少一种具有肠道向性的细菌菌株(特别是乳酸细菌)的组合物，所述组合物用于为了在营养不良的情况下促进幼年生长而进行使用，其中所述细菌菌株对于在小鼠上的骨骼生长测试作出阳性反应并在这些相同小鼠中增加IGF-1血清水平，所述菌株尤其还对于在果蝇上的测试作出阳性反应。
作为例子，可以提及下述菌株：植物乳杆菌WJL。其他菌株可以从具有肠道向性的细菌中，和尤其是从上面提及的物种和菌株中，尤其是从植物乳杆菌G821、干酪乳杆菌ATCC393、干酪乳杆菌L919、类干酪乳杆菌ATCC25302、类干酪乳杆菌Shirota、发酵乳杆菌ATCC9338、鼠李糖乳杆菌L900、鼠李糖乳杆菌L908、鼠李糖乳杆菌GG这些菌株中鉴定出来。
在本发明的一个实施方案中，使用菌株WJL或具有“明显的”效应的其他菌株作为参照菌株以便鉴定和选择这样的细菌菌株，其具有“明显的”对于IGF-1血清水平的效应，即与该参照菌株例如WJL的效应接近的效应(并非显著地不同于参照菌株例如WJL的效应)，或者“强的”对于IGF-1血清水平的效应(显著地大于参照菌株例如WJL的效应)。
为此，将所述用于测量IGF-1血清水平的小鼠测试(包括8只小鼠/条件)应用于参照菌株例如WJL和待测试菌株(平行地，优选地或者可以拥有对于参照菌株例如WJL事先产生的参照数据，例如在实施例中所给出的数据)。然后，比较关于所述两个菌株而获得的IGF-1血清水平平均值。如果单菌组的IGF-1水平平均值并不显著地不同于关于参照组(例如WJL)的平均值，那么认为所测试的细菌菌株为具有明显的效应的菌株，其中在Tukey统计学检验中具有大于0.05的p值。如果当p值小于或等于0.05时，关于待测试菌株的所述平均值显著地大于关于参照菌株例如WJL的平均值，那么该效应是强的。如果当p值小于或等于0.05时，关于待测试菌株的所述平均值(其事先对于前面的无菌测试进行了描述)显著地小于关于参照菌株例如WJL的平均值，那么该效应被视为中间的。因此，根据本发明的组合物优选地将会包含具有这样的明显或强的效应的细菌菌株，和特别地该细菌菌株同时对于骨骼生长和对于IGF-1血清水平具有明显或强的效应。
包含至少一种按照本发明的细菌菌株的根据本发明的组合物能够用作旨在在营养不良(尤其是具有蛋白质缺乏的营养不良)的情况下促进幼年生长的药物或益生制剂。依照本发明的一个特征，待处理的受试者(其是营养不良的或已经经过了营养不良的)可以具有比在相同年龄和性别的且非营养不良的个体中所碰到的IGF-1血清水平低的IGF-1血清水平。
所述组合物可用于从出生至青春期的人。
所述组合物可用于处于断奶和性成熟之间的哺乳动物，尤其是农用动物(牛、绵羊、山羊、猪、禽类)、伴侣动物(狗、猫)和体育运动用动物(马、单峰驼、双峰驼)。
所述组合物包含105至1012，尤其是106至1012，优选地108至1012个根据本发明的形成菌落的细菌细胞(CFU)/克组合物这样的量。按照英语的技术表述，术语“CFU”表示“菌落形成单位”。“组合物的克数”优选地涉及由细菌、共组分和赋形剂或载体形成的药物组合物或益生组合物。“细菌细胞”涉及按照本发明的单一细菌菌株，或者至少两种按照本发明的细菌的混合物。
所述组合物包含以活的形式的乳酸细菌。所述组合物可以是细菌悬浮液，其可以进行冷冻和在使用前进行解冻；或者冻干粉末，其可以就这样进行使用或在接纳在合适的载体中之后进行使用。在这种情况下，所述组合物可以包含惯用的冻干赋形剂。
所述组合物可以是口服施用形式(例如，粉剂、明胶胶囊、片剂)，其任选地以使得能够通过胃并在肠中释放细菌的保护胃的形式。
本发明的目标还在于用于在营养不良的情况下促进幼年生长的益生性处理或治疗性处理的方法，所述方法包括向有此需要的(即营养不良的或已经经历了营养不良时期的，所述营养不良尤其具有蛋白质缺乏)人患者(从出生至青春期)或动物患者(从断奶至性成熟)施用根据本发明的组合物。有此需要的患者可以具有比在相同年龄和性别的且非营养不良的个体中所碰到的IGF-1血清水平低的IGF-1血清水平。
如所指出的，所述方法可以是治疗性处理或益生性(或营养补充的)处理。所述方法包括施用足够量的上面所描述的组合物。数量和施用频率将会尤其取决于营养不良的严重度、患者的年龄和患者的状况。所述方法将会包括以一次或几次施用根据本发明的组合物的剂量，所述施用可以在受试者的生长期(直至青春期或性成熟)内分期进行。所述剂量可以是分成几部分的以有助于施用，尤其是根据患者的年龄。施用频率尤其在每天一剂(单一的或分成几部分的)和每月一剂之间。典型地，施用频率将会在每天一剂(单一的或分成几部分的)和每周一剂之间，甚至每2、3、4、5或6天一剂。每个剂量(单一的或分成几部分的)尤其相当于几克至几十克的组合物。所述方法尤其包括施用这样的组合物，其包含105至1012，尤其是106至1012，优选地108至1012个形成菌落的细菌细胞(CFU)/克组合物这样的量(细菌细胞涉及按照本发明的单一细菌菌株，或者至少两种按照本发明的细菌的混合物)。所述方法尤其包括施用包含以活的形式的乳酸细菌的组合物。该组合物可以是细菌悬浮液，其可以进行冷冻和在使用前进行解冻；或者冻干粉末，其可以就这样进行使用或在接纳在合适的载体中之后进行使用。在这种情况下，该组合物可以包含惯用的冻干赋形剂，可以是口服施用形式(例如，粉剂、明胶胶囊、片剂)，其任选地以使得能够通过胃并在肠中释放细菌的保护胃的形式，或者可以是直肠形式(例如，栓剂)。
在一个实施方案中，根据本发明的组合物，尤其是在所述处理方法中所使用的组合物，包含至少一种不在待处理的患者所属于的物种中天然地存在的细菌菌株。因此，它可以是不在人中或在动物中天然地存在的细菌。在该设定下，当存在几种不同的细菌时，它们之一不是天然存在的就足够了。另一方面，该细菌经证明在待处理的患者中或在相应的物种(根据本发明，人或动物)中具有肠道向性，并且符合根据本发明的活性菌株的定义。
本发明还涉及通过使用无菌果蝇模型和/或无菌小鼠模型来筛选能够在营养不良的情况下促进幼年生长的细菌的方法。
用果蝇模型的方法包括下列步骤：
-拥有一批来自无菌的黑腹果蝇(例如，果蝇yw这一株系或任何其他所谓“野生型”的株系)的胚胎；
-在包含对于果蝇来说有营养的介质且缺乏酵母的营养培养基上将这些胚胎分配成至少2个组，此外将所述胚胎组之一用待测试细菌的悬浮液进行接种，这形成单菌个体组，另一组形成无菌组；
-在合适的温度(通常大约25℃)下进行饲养；
-在合适的饲养期(通常大约7天)结束时，从每个组中回收来自最初经接种或未接种的胚胎的果蝇幼虫(无菌幼虫和单菌幼虫)，优选地以相等的数目进行回收；
-测定每个组的幼虫的长度平均值，并比较所获得的平均值；
-如果单菌组的幼虫的长度平均值以下述程度大于无菌组的幼虫的长度平均值，那么认为所测试的细菌菌株对于所述测试作出阳性反应：在对于所述两个组的幼虫的整套大小数据进行的Mann-Whitney统计学检验中具有小于或等于0.001，优选地小于或等于0.0001的p值。
优选地，所述筛选方法重新采取上面描述过的果蝇测试的特征。
用小鼠模型的方法包括下列步骤：
-拥有来自源于相同小鼠株系(典型地，Balb/c小鼠)的两个品系的幼年鼠，所述两个品系即无菌亲本小鼠品系和单菌亲本小鼠品系(与待测试细菌相关联的)；
-将它们以缺乏蛋白质和优选地还缺乏脂质的营养饮食制度进行饲养；
-在合适的饲养期结束时，测定每个组的一个或多个参数的值的平均值，这些参数与生长(例如，体重增加，骨骼生长，例如通过测量个体的大小或其股骨的大小)相关和/或与血清IGF-1水平相关；
-如果单菌组的所测量的参数的平均值以下述程度大于无菌组的所测量的参数的平均值，那么认为所述乳酸细菌菌株对于所述测试作出阳性反应：在Tukey统计学检验中具有小于或等于0.05的p值。
优选地，所述筛选方法重新采取上面所描述的关于骨骼生长或IGF-1血清水平的小鼠测试的特征。
所述筛选方法还可以是与参照菌株(例如菌株WJL)的比较测试，并且该测试在这种情况下重新采取上面对于果蝇测试或小鼠测试所描述的特征。
本发明的目标还在于以活的或杀死的形式的菌株G821(CNCM I-4979)的纯培养物或分离物，在保存介质或培养介质中包含活的该菌株的组合物，包含该菌株和任选地冻干赋形剂和/或防腐剂的冻干组合物，在保存介质中包含以杀死的形式的该菌株或在保存介质中包含杀死的该菌株的组合物，在对于口服施用或直肠施用来说可接受的介质或赋形剂中包含活的或杀死的该菌株的可施用给人或动物的组合物。所述保存介质、培养介质、冻干赋形剂、防腐剂、对于口服施用或直肠施用来说可接受的介质或赋形剂是上面所描述的那些或者技术人员熟知的那些。
现在，将借助于作为非限制性实例而选取的本发明的实施方案并参考附图来更详细地描述本发明，在所述附图中：
-图1是显示了从第28天至第56天小鼠的生长速率(以“cm/天”表示)的图；GF：无菌小鼠；WJL：在植物乳杆菌WJL这一菌株存在下饲养的小鼠；NIZO 2877：在植物乳杆菌WJLNIZO 2877这一菌株存在下饲养的小鼠；*p<0.05；***p<0.001；
-图2是显示了在第56天在GF、WJL或NIZO 2877小鼠中股骨的大小的图；*p<0.05；***p<0.001；
-图3是显示了在第56天GF、WJL或NIZO 2877组的雄性小鼠的血清水平(以“ng/ml”表示)的图；*p<0.05；***p<0.001；
-图4是显示了在营养不足的条件下在7天时果蝇幼虫的大小的图：阴性对照组(在产卵后未在生长培养基上添加细菌)，和以在生长培养基上添加植物乳杆菌NIZO 2877、WJL或G821这一菌株为特征的组。
实施例1：在单菌果蝇上的细菌的功能筛选
第1天：采用无菌的成年果蝇(黑腹果蝇yw)；将它们放置在包括底的产卵笼(培养皿类型)中，在所述底上布置常规营养培养基；通过在25℃下将该成年群体在笼中维持一夜来确保产卵。
第0天：切割出6个营养培养基碎块以便以6次收集40个胚胎，将所述碎块中的每一个放置在包含在培养皿中的营养缺乏型营养培养基上，用无菌的1×PBS接种三个平皿，然后用在1×PBS中的细菌的悬浮液接种另外三个平皿。
在25℃下温育7天。
第7天：然后从每个平皿中回收已在那里发育的幼虫(从20只幼虫/平皿开始该实验是可采用的，我们因此在下面使用具有多于60只个体的组)。使幼虫经历热休克处理(在加热至100℃的板上5秒钟)，然后测量幼虫的大小。
将该实验方案应用于不同的细菌菌株，并且将实验和结果概括在下面的表1中：
Figure BDA0001194406530000171
关于“幼虫生长”表型测试的验证有效标准的指导：
所述菌株应当至少满足标准1以便经验证是有效的，并且其活性的程度可以根据标准1+2来定性。
定性标准1＝相对于无菌条件而言促进生长的菌株：
相对于无菌个体的值而言，将统计学检验应用于相关联的个体的全部长度值(至少60只幼虫/条件)。小于0.001的p值(Mann-Whitney检验)将所述菌株视为是“促进生长的”。在该情况下，下列菌株被视为是促进生长的：
植物乳杆菌WJL
植物乳杆菌NIZO2877
干酪乳杆菌ATCC 393
发酵乳杆菌ATCC 9338
类干酪乳杆菌ATCC 25302
类干酪乳杆菌Shirota
干酪乳杆菌L919
鼠李糖乳杆菌L900
鼠李糖乳杆菌L908
鼠李糖乳杆菌GG。
下列菌株不具有促进生长的效应：
发酵乳杆菌KLD
发酵乳杆菌LMG
类干酪乳杆菌BL23
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii spp.bulgaricus)ATCC11842。
定量标准2＝促进生长的效应的程度(具有事先经验证有效的标准1)：
相对于与植物乳杆菌WJL这一菌株单相关联的个体的值而言，将统计学检验应用于与所测试的菌株相关联的个体的全部长度值(至少60只幼虫/条件)。
出现三种特定情形：
统计学检验的p值大于0.001(Mann-Whitney检验)，该菌株将被视为对于幼虫生长具有“明显的”效应(与植物乳杆菌WJL这一菌株类似的效应)。
在本实施例中，下列菌株具有明显的效应：
干酪乳杆菌ATCC 393
发酵乳杆菌ATCC 9338
类干酪乳杆菌ATCC 25302
类干酪乳杆菌Shirota
干酪乳杆菌L919
鼠李糖乳杆菌L900
鼠李糖乳杆菌L908
鼠李糖乳杆菌GG
植物乳杆菌WJL。
统计学检验的p值小于0.001(Mann-Whitney检验)，如果个体的平均大小小于与植物乳杆菌WJL相关联的个体的平均大小，那么该菌株将被视为对于幼虫生长具有“中间的”效应(在本实施例中，植物乳杆菌NIZO 2877这一菌株的情况)。如果个体的平均大小大于与植物乳杆菌WJL相关联的个体的平均大小，那么该菌株将被视为具有“强的”效应(在本实施例中未鉴定出的情况)。
“幼虫生长”表型测试实施例的分析
-已经测试了14个乳杆菌属菌株(表1)以便借助于在黑腹果蝇中的“幼虫生长”测试来测定其促进生长的潜力。
-这些菌株是从ATCC、巴黎巴斯德研究所、里尔巴斯德研究所处可得的，或者是在科学文献中发表且从所提及的出版物的负责研究者处可得的(表2)。
Figure BDA0001194406530000201
-在与待测试细菌菌株相关联和然后在缺乏酵母的营养培养基中饲养幼年个体之后的第7天，关于每种条件研究最少60只个体的大小。表1呈现了这些数据集的平均值和标准偏差。
-这些结果的统计学分析使得能够根据“幼虫生长测试”的标准1来选出符合要求的10个属于不同乳杆菌属物种的菌株。该选择揭示了严格菌株特异性的且并不必然地与给定的乳杆菌属物种相关的功能效应。
-结果的统计学分析使得能够根据标准2将植物乳杆菌NIZO2877这一菌株的效应视为“中间的”，而9个其他的促进生长的菌株具有“明显的”效应。
实施例2：在果蝇模型上具有强的效应的菌株的描述
用3个细菌菌株重做实施例1的果蝇测试：
-植物乳杆菌WJL
-植物乳杆菌NIZO2877
-植物乳杆菌G821。
结果的分析(参见图4)显示了下列效应：
“无菌的”对“NIZO 2877”，p<0.001(***)
“NIZO 2877”对“WJL”，p<0.0001(****)
“G821”对“WJL”，p<0.0001(****)
“无菌的”对“WJL”或“G821”，p<0.0001(****)。
结论：
-植物乳杆菌WJL：明显的效应
-植物乳杆菌NIZO2877：中间的效应
-植物乳杆菌G821：强的效应。
实施例3：在小鼠上的细菌的功能筛选-表型分析
在小鼠中研究了借助于实施例1的“幼虫生长”测试而鉴定出的具有“中间的”和“明显的”效应的两个菌株(分别为植物乳杆菌NIZO2877和植物乳杆菌WJL)的促进幼年生长的效应。
研究了在三个来自相同无菌小鼠集群的个体组中的雄性后代(最少15只个体)：第一组由无菌幼年鼠组成(GF组)，第二组由来自与植物乳杆菌WJL这一菌株单相关联的亲本的幼年鼠组成(WJL组)，和第三组由来自与植物乳杆菌NIZO2877这一菌株单相关联的亲本的幼年鼠组成(NIZO 2877组)。将亲本和幼年鼠用常规营养培养基进行饲养直至幼年鼠断奶(第21天)，然后将经断奶的幼年鼠用缺乏蛋白质和脂质(分别为8％和2.5％)的营养培养基进行饲养直至第56天。
常规营养培养基：23％蛋白质和5％脂质。
营养缺乏型营养培养基：8％蛋白质和2.5％脂质。
研究了阐明这些个体的幼年生长的三个参数：(1)在断奶后28天的时间段(从第28天至第56天)期间的大小增加；(2)在第56天，代表了所测试的群体的一批个体(最少9只个体)的股骨大小；和最后，(3)在第56天，在至少8只个体中生长因子IGF-1的血清水平。
通过使用Tukey检验进行了统计学分析，其中使用软件GraphPad(GraphPad Prism5.04,San Diego,USA)；p值<0.05被认为是显著的。
(1)大小增加：
在第28天和第56天，通过短暂暴露于异氟烷来使小鼠麻醉，以使得能够测量小鼠的大小(从口鼻部至尾巴基部)。
表3：生长速率(以cm表示的大小增加/天，从第28天至第56天)-Nb＝小鼠数目
Figure BDA0001194406530000221
这些数据汇集在图1中。
(2)股骨大小：
在第56天处死小鼠，取出无肌肉的股骨，并用游标卡尺测量其长度。
表4：在第56天，在雄性中以mm表示的股骨长度
Figure BDA0001194406530000231
这些数据汇集在图2中。
(3)在血清中IGF-1的滴度：
在从在第56天处死的小鼠的血液开始获得的血清上测量IGF-1的滴度。所述测量在经稀释的(1:25)血清上进行，其中使用试剂盒ELISA Ready-Set-Go(eBioscience,USA)，依照制造商的使用说明书。
表5：以pg/ml表示的IGF-1血清滴度(从ELISA平板开始的双重测量)
Figure BDA0001194406530000241
这些数据汇集在图3中。
结果阐明了植物乳杆菌WJL这一菌株于对生长速率的“明显的”效应(相对于无菌条件而言p值<0.001)和植物乳杆菌NIZO2877这一菌株的“中间的”效应(相对于无菌条件而言p值<0.05，和相对于植物乳杆菌WJL条件而言p值<0.001)。这些效应用参数“IGF-1水平”得到了证实(不同测试的相同的p值范围)，然后用参数“股骨大小”得到了加强(在无菌条件和植物乳杆菌NIZO 2877条件之间，p值<0.001)。
所有这些结果通过科学证据证明了某些对于“幼虫生长”测试也作出阳性反应的乳杆菌属菌株的促进幼年生长的效应。
在此所引用的所有公共文献通过提及而合并入本文。同样地，技术人员将能够参考这些各种各样的文献和在此已提及的商业菌株保藏物。

Claims (15)

1.包含至少一种具有肠道向性的乳杆菌属(Lactobacillus)菌株的组合物用于制造旨在在营养不良的情况下促进幼年生长的药物或益生制剂的用途，所述乳杆菌属菌株选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)这些物种，其中所述乳杆菌属菌株对于下述测试(A)、(B)、(C)和(D)中的至少一个作出阳性反应：
测试(A)：
(a)拥有一批无菌的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)亲本的胚胎；
(b)在第1天：在包含玉米粉、琼脂和水且缺乏酵母的营养培养基上将这些胚胎分配成至少2个组，此外将所述胚胎组之一用在盐水缓冲液中的大约108CFU的待测试细菌的悬浮液进行接种，这形成单菌组，另一组为无菌组，在大约25℃下进行这两个组的饲养直至第7天；
(c)在第7天：从每个组中回收至少60只果蝇幼虫，对它们施行热休克；
(d)测定每个组的幼虫的长度平均值，并比较所获得的平均值；
(e)如果单菌组的幼虫的长度平均值以下述程度大于无菌组的幼虫的长度平均值，那么认为所测试的细菌菌株对于所述测试作出阳性反应：在对于所述两个组的幼虫的整套大小数据进行的Mann-Whitney统计学检验中具有小于或等于0.001的p值；
测试(B)：
(a)从相同的小鼠品系开始，建立无菌亲本小鼠品系和单菌亲本小鼠品系，并且产生幼年鼠，将所述幼年鼠与亲本一起用常规营养培养基进行饲养直至其断奶；
(b)在第21天：拥有来自这两个品系中每一个品系的8只经断奶的幼年鼠，从而形成单菌组和无菌组，并且将它们以缺乏蛋白质和脂质的营养饮食制度进行饲养；
(c)在第56天：通过对每个个体从口鼻部端部至尾巴基部进行测量，测定关于每个所考虑的组的小鼠的大小平均值，或者取出每个组的个体的股骨并对其进行测量；
(d)如果单菌组的个体或股骨的平均大小以下述程度大于无菌组的个体或股骨的平均大小，那么认为所述乳杆菌属菌株对于所述测试作出阳性反应：在Tukey统计学检验中具有小于或等于0.05的p值；
测试(C)：
(a)从相同的无菌小鼠品系开始，建立无菌亲本小鼠品系和单菌亲本小鼠品系，并且产生幼年鼠，将所述幼年鼠与亲本一起用常规营养培养基进行饲养直至其断奶；
(b)在第21天：拥有来自这两个品系中每一个品系的8只经断奶的幼年鼠，从而形成单菌组和无菌组，并且将它们以缺乏蛋白质和脂质的营养饮食制度进行饲养；
(c)在第56天：抽取每个组的幼年鼠的血液，并测定关于每个组的IGF-1的平均血清水平；
(d)如果单菌组的IGF-1的平均血清水平以下述程度大于无菌组的平均血清水平，那么认为所述乳杆菌属菌株对于所述测试作出阳性反应：在Tukey统计学检验中具有小于或等于0.05的p值；
测试(D)：
(a)拥有一批无菌的黑腹果蝇亲本的胚胎；
(b)在第1天：在包含玉米粉、琼脂和水且缺乏酵母的营养培养基上将这些胚胎分配成至少2个组，将所述胚胎组之一用在盐水缓冲液中的大约108CFU的所述细菌菌株的悬浮液进行接种，这形成测试单菌组，将另一组用在盐水缓冲液中的大约108CFU的参照细菌即植物乳杆菌WJL、干酪乳杆菌ATCC 393、发酵乳杆菌ATCC 9338或类干酪乳杆菌(L.paracasei)ATCC 25302的悬浮液进行接种，从而形成参照单菌组，在大约25℃下进行这两个组的饲养直至第7天；
(c)在第7天：从每个组中回收至少60只果蝇幼虫，对它们施行热休克；
(d)测定每个组的幼虫的长度平均值，并比较所获得的平均值；
(e)所述细菌菌株相对于参照细菌而言具有强的效应，其中用该细菌菌株的测试单菌组的幼虫的长度平均值显著地大于关于用参照菌株的单菌组的平均值，其中在对于所述两个组的幼虫的整套大小数据进行的Mann-Whitney统计学检验中p值小于或等于0.001。
2.根据权利要求1的用途，其中所述乳杆菌属菌株选自植物乳杆菌WJL、植物乳杆菌G821、干酪乳杆菌ATCC393、干酪乳杆菌L919、发酵乳杆菌ATCC9338。
3.根据权利要求1的用途，其中在测试(A)中，所述药物或益生制剂包含这样的细菌菌株，所述细菌菌株在该相同的在果蝇上的测试之中相对于植物乳杆菌WJL这一菌株而言具有强的效应，其中当在对于所述两个组的幼虫的整套大小数据进行的Mann-Whitney统计学检验中p值小于或等于0.001时，用该细菌菌株的单菌组的幼虫的长度平均值显著地大于关于用菌株WJL的单菌组的平均值。
4.根据权利要求1的用途，其中在测试(B)中，所述药物或益生制剂包含这样的细菌菌株，所述细菌菌株在该相同的在小鼠上的测试之中相对于植物乳杆菌WJL这一菌株而言具有强的效应，其中当在Tukey统计学检验中p值小于或等于0.05时，用该细菌菌株的单菌组的小鼠或其股骨的大小平均值显著地大于关于用菌株WJL的单菌组的平均值。
5.根据权利要求1的用途，其中在测试(C)中，所述药物或益生制剂包含这样的细菌菌株，所述细菌菌株在该相同的在小鼠上的测试之中相对于植物乳杆菌WJL这一菌株而言具有强的效应，其中当在Tukey统计学检验中p值小于或等于0.05时，用该细菌菌株的单菌组的IGF-1血清水平平均值显著地大于关于用菌株WJL的单菌组的平均值。
6.根据权利要求1的用途，其中在测试(D)中，所述药物或益生制剂包含105～1012CFU的对于所述测试作出阳性反应的乳杆菌属细菌/克药物或益生制剂。
7.根据权利要求1的用途，其中在测试(A)和(D)的(b)项中，每组有40个胚胎。
8.根据权利要求1的用途，其中在测试(A)和(D)的(b)项中，当以三次重复实施时，每组有120个胚胎。
9.根据权利要求1的用途，其中在测试(B)和(C)的(a)项中，所述无菌亲本小鼠品系和单菌亲本小鼠品系与待测试细菌相关联。
10.根据权利要求1的用途，其中在测试(B)和(C)的(a)项中，所述幼年鼠在第21天断奶。
11.根据权利要求1的用途，其中在测试(B)和(C)的(b)项中，所述缺乏蛋白质和脂质的营养饮食制度包含8％蛋白质和2.5％脂质。
12.根据权利要求1的用途，其中所述乳杆菌属菌株为植物乳杆菌菌株。
13.根据权利要求12的用途，其中所述植物乳杆菌菌株为以登记号CNCMI-4979保藏于国家微生物保藏中心(Institut Pasteur)的植物乳杆菌菌株G821。
14.根据权利要求1至13中任一项的用途，其中所述营养不良以蛋白质缺乏为特征。
15.根据权利要求1至13中任一项的用途，其中所述营养不良以低于正常水平的IGF-1血清水平为特征。
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