FR3059678A1

FR3059678A1 - Bacteries lactiques utiles pour traiter les maladies metaboliques, notamment le diabete de type 2

Info

Publication number: FR3059678A1
Application number: FR1661967A
Authority: FR
Inventors: Francois Leulier; Gilles Storelli; Maria Elena Martino; Kassem Makki; Jennifer Rieusset; Hubert Vidal
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Ecole Normale Superieure de Lyon; Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Ecole Normale Superieure de Lyon; Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2018-06-08
Also published as: WO2018104336A1

Abstract

Méthode de criblage de bactéries à tropisme intestinal chez un mammifère, dans lequel on monocolonise des larves de drosophiles et/ou des souris initialement axéniques, par la souche de bactérie à tester, on élève ces larves avec un milieu nutritionnel hypercalorique, ce qui permet de déterminer un impact favorable de la bactérie dans le cadre d'un régime hypercalorique, et d'inférer un effet positif sur la santé métabolique, par exemple le diabète de type II. L'invention propose ainsi une composition comprenant au moins une souche de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, pour utilisation pour la prévention et/ou le traitement des maladies métaboliques, en particulier le diabète de type 2. On peut particulièrement citer L. plantarum WJL ou L. plantarum NIZO2877.

Description

Titulaire(s) : ecole normale supérieure de

LYON,CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE,UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1 .INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES LYON, INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM).

Demande(s) d’extension

Mandataire(s) : INSERM TRANSFERT.

BACTERIES LACTIQUES UTILES POUR TRAITER LES MALADIES METABOLIQUES, NOTAMMENT LE DIABETE DE TYPE 2.

FR 3 059 678 - A1 f5y Méthode de criblage de bactéries à tropisme intestinal chez un mammifère, dans lequel on monocolonise des larves de drosophiles et/ou des souris initialement axéniques, par la souche de bactérie à tester, on élève ces larves avec un milieu nutritionnel hypercalorique, ce qui permet de déterminer un impact favorable de la bactérie dans le cadre d'un régime hypercalorique, et d'inférer un effet positif sur la santé métabolique, par exemple le diabète de type II. L'invention propose ainsi une composition comprenant au moins une souche de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, pour utilisation pour la prévention et/ou le traitement des maladies métaboliques, en particulier le diabète de type 2. On peut particulièrement citer L. plantarum WJL ou L. plantarum NIZO2877.

i

Bactéries lactiques utiles pour traiter les maladies métaboliques, notamment le diabète de type 2

La présente invention concerne une méthode de criblage de bactéries susceptibles d’améliorer la santé métabolique notamment de l’adulte, et permettant de diminuer, ou ralentir la progression, des maladies métaboliques, notamment celles liées à l’alimentation, telles que le diabète de type 2. La présente invention concerne aussi l’utilisation de certaines bactéries lactiques pour d’améliorer la santé métabolique notamment de l’adulte, et permettant de prévenir ou traiter les maladies métaboliques, notamment celles liées à l’alimentation, telles que le diabète de type 2.

Décrit comme « un organe additionnel », la communauté microbienne intestinale (ou microbiote intestinal) joue un rôle clé bénéfique pour l’hôte en exerçant de nombreuses fonctions biologiques, telles que l’aide à l’efficacité de la digestion, le métabolisme des substrats, la lutte contre les pathogènes, ou encore la mise en place et l’homéostasie des réponses immunitaires.

Définis en 2001 par l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) et l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO), les probiotiques sont des «micro-organismes vivants, qui, lorsqu’ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels ».

WO2015173386 décrit l’utilisation combinée d’un modèle drosophile et d’un modèle souris pour cribler des souches bactériennes permettant de favoriser la croissance juvénile humaine et animale en cas de sous-nutrition.

Pasco et Léopold, Plos One 2012, vol 7, 5, e36583, ont montré qu’un régime hypercalorique conduit chez la larve de drosophile à des altérations métaboliques ressemblant aux effets d’un diabète insulino-dépendant et à un retard de maturation se manifestant par un retard d'entrée en métamorphose (transition du stade larvaire au stade pupal). Les auteurs concluent que la drosophile pourrait servir de modèle pour cribler les gènes prédisposant au développement d’une résistance à l’insuline.

Les inventeurs ont trouvé que, de manière inattendue, des bactéries pouvaient avoir un effet favorable permettant d’améliorer certains paramètres métaboliques, peuvent être identifiées sur un modèle de drosophile et confirmées sur un modèle mammifère soumis à un régime hypercalorique (apport en sucre important). Le modèle drosophile décrit ci-après s’avère effectivement sensible à ces bactéries et cela de manière mesurable et possiblement corrélé avec un effet mesurable sur un mammifère soumis à un régime hypercalorique. Les inventeurs ont en outre montré que des souches de bactéries sélectionnâmes sur ces modèles ont de manière inattendue une activité comparable chez la drosophile et les mammifères, avec un effet favorable sur les effets délétères d’un régime hypercalorique, aussi bien chez la drosophile que la souris.

L’invention concerne ainsi une méthode de criblage de bactéries à tropisme intestinal chez un mammifère, incluant l’homme, utilisant un modèle de drosophile axénique. On entend par organisme « axénique » un organisme (e.g. drosophile à un stade de son développement) élevé dans un environnement dépourvu de microorganismes et donc dépourvu de flore intestinale. Conformément à l’invention, ce modèle axénique se verra ensuite inoculé par la souche de bactérie à tester, le rendant monoxénique pour cette souche, et son évolution sera comparée à celle d’un contrôle ou d’un référent.

La bactérie a un « tropisme intestinal » chez un mammifère, ce qui signifie que la bactérie a la capacité de passer la barrière gastrique chez ce mammifère, soit naturellement soit en étant administrée dans une formulation gastro-protégée, et est capable de persister dans l’intestin. Ce tropisme intestinal permettra à une bactérie sélectionnée selon l’invention de produire un effet favorable sur la santé métabolique.

On entend par organisme « monoxénique » un organisme (e.g. drosophile à un stade de son développement) d’origine axénique, élevé en présence d'un unique microorganisme et donc porteur de cet unique microorganisme en guise de flore intestinale.

De manière avantageuse, les souches ayant répondu positivement au test sur modèle drosophile sont ensuite testées sur modèle mammifère, par exemple un modèle souris, possédant de préférence un statut conventionnel, à savoir un microbiote normal (entier).

L’invention propose donc une méthode de criblage de bactéries à tropisme intestinal, dans lequel on monocolonise des embryons de drosophiles initialement axéniques, par la souche de bactérie à tester, ce grâce à quoi l’on obtient des larves monoxéniques pour cette bactérie. On élève ces larves avec un milieu nutritionnel hypercalorique, c’est-à-dire à haute teneur en sucre. On mesure au moins un paramètre de maturation des larves, et on détermine si la bactérie a eu un effet significativement favorable sur le paramètre de maturation. On conclut le cas échéant que ladite souche a un effet favorable sur le paramètre de maturation.

On peut notamment conclure à un effet favorable en comparant à des données de référence préétablies et/ou à des données générées en parallèle sur des larves axéniques ou monocolonisés par une souche de référence.

Un effet favorable est ainsi retenu lorsque les larves monocolonisées par la souche testée présentent un paramètre de maturation en amélioration significative par rapport à un contrôle. Un contrôle peut notamment être constitué de larves axéniques élevées dans des conditions nutritionnelles similaires.

Un effet favorable est ainsi retenu lorsque les larves monocolonisées par la souche testée présentent un paramètre de maturation sensiblement égal ou amélioré par rapport à une référence. Une référence peut notamment être constituée de larves monocolonisées par une souche de référence qui présente elle-même un paramètre de maturation en amélioration significative par rapport à un contrôle correspondant à des larves axéniques élevées dans des conditions nutritionnelles similaires.

Il est aussi possible d’associer une référence et un contrôle.

Les données obtenues avec le groupe contrôle et/ou avec le groupe référent peuvent avoir été obtenue précédemment ou, de préférence, sont générées en parallèle, avantageusement à partir d’un même lot d’embryons que celui utilisé avec la souche à tester.

La méthode de criblage sur le modèle drosophile de bactéries à tropisme intestinal permettant d’améliorer des paramètres de maturation peut donc comprendre le fait de disposer et d’élever des larves de drosophile axéniques sur un milieu nutritionnel, de les inoculer avec la souche bactérienne à tester (les larves sont alors monoxéniques pour cette souche à tester), de mesurer ou déterminer un paramètre de maturation des larves, et de comparer les résultats obtenus avec les données obtenues avec des larves de drosophile axéniques élevées sur le même milieu nutritionnel (groupe contrôle) et/ou avec des larves de drosophile monoxéniques pour une souche de référence élevées sur le même milieu nutritionnel (groupe référent ou de référence).

Le milieu nutritionnel peut être tout milieu apte à permettre le développement des larves sur une période suffisante pour la comparaison, et de préférence, le milieu nutritionnel permet de conduire les larves au moins jusqu’à la métamorphose. Le milieu est avantageusement un milieu hypercalorique, c’est-à-dire riche en sucre, par exemple saccharose, cette richesse en sucre pouvant par exemple aller de 20 à 150 g de sucre par litre de milieu (avant gélification ou solidification si milieu solide ou semi-solide). Typiquement le milieu nutritionnel est un milieu solide ou semi-solide contenant de la levure inactivée et du sucre. Il peut par exemple comprendre de la levure inactivée (10 g/l), de l'agar ou autre gélifiant (7.14 g/l), de l’eau (1L) et du saccharose (50 g/l). Ce milieu est contenu dans des récipients adaptés, par exemple des boîtes de pétri. Il peut être constitué, pour 1 litre de milieu, de 7,14 g d’agar, 10 g de levure inactivée et 50g de saccharose ; le milieu est cuit dans l’eau bouillante pendant 10 min, puis laissé à refroidir pour solidification. A contrario, un milieu standard comprendra de la levure inactivée, mais pas de sucre ajouté.

Pour l’inoculum, les souches bactériennes peuvent être suspendues dans un tampon salin (e.g. PBS) et inoculées à une quantité suffisante, par exemple d’environ 10⁷ CFU à environ 10⁹ CFU, notamment d’environ 10⁸ CFU, typiquement pour environ 7 ml de milieu nutritionnel, un tel volume étant adapté à un groupe de larves standard selon l’invention, par exemple environ 40 embryons ou larves.

Le paramètre de maturation peut être par exemple la prise de taille des larves ou, de préférence, leur maturation, à savoir leur entrée en métamorphose. De préférence, on travaille sur des groupes de plusieurs embryons, notamment de 20 à 60 embryons par groupe, typiquement 40. Chaque groupe peut faire avantageusement l’objet de plusieurs réplicas, typiquement 6 réplicas. L’on détermine des moyennes à comparer aux valeurs contrôle et/ou de référence. Par exemple, on utilise la détermination du J50, à savoir la durée au bout de laquelle 50% des animaux ont achevé leur phase de croissance et sont entrés en métamorphose. Cela permet de comparer les moyennes entre groupe test et groupe contrôle et/ou de référence.

D’un point de vue pratique on utilise de préférence des Drosophila melanogaster (e.g. souche Drosophila yw, ou toute autre souche dites sauvage).

La méthode avec le modèle drosophile peut notamment comprendre les étapes suivantes :

(1 ) on dispose d’un lot d’embryons issus de parents Drosophila melanogaster (e.g. souche Drosophila yw, ou toute autre souche dites sauvage) axéniques.

(2) à J0: on répartit ces embryons en au moins 2 groupes (notamment de 20 à 60 embryons, par exemple 40, de préférence réalisé en plusieurs réplicas, notamment 6 réplicas) sur du milieu nutritionnel hypercalorique, comprenant notamment de la levure inactivée, de l'agar, de l’eau et du saccharose, dans des récipients adaptés, par exemple des boîtes de pétri. Un premier groupe d’embryons est inoculé avec la souche bactérienne à tester (groupe monoxénique). Pour l’inoculum, les souches bactériennes peuvent être suspendues dans un tampon salin (e.g. PBS) et inoculées à une quantité suffisante, par exemple d’environ 10⁷ CFU à environ 10⁹ CFU, notamment d’environ 10⁸ CFU par récipient ou boîte de pétri (notamment volume de 7 ml de milieu nutritif).

(2a) Un groupe formant le groupe axénique est inoculé avec un tampon salin stérile.

(2b) Un groupe faisant intervenir une souche de référence à laquelle on peut comparer les effets de la souche à tester, cette souche de référence monocolonisant un groupe d’embryons.

On conduit l’élevage à une température comprise entre environ 24 et environ 26 °C, typiquement environ 25°C, de préférence avec un cycle jour nuit, par exemple de 12h/12h.

Cette étape (2) peut avantageusement inclure le groupe contrôle et le groupe référence. Dans ce cas, l’étape (2) peut devenir :

(2) à JO: on répartit ces embryons en au moins 2, de préférence 3 groupes (notamment de 20 à 60 embryons, e.g. 40, de préférence réalisé en plusieurs réplicas, notamment 6 réplicas) dans des boites de pétri ou autre récipient contenant du milieu nutritionnel comprenant de la levure inactivée, de l'agar, de l’eau et du saccharose. Un premier groupe d’embryons est inoculé avec la souche bactérienne de référence, qui possède un effet positif dans ce test; on peut ainsi utiliser la souche L. plantarum WJL.

Suivant une modalité, au moins un autre groupe est inoculé avec la souche à tester, on peut aussi tester en parallèle plus d’une souche, et donc inoculer autant de groupes (groupes monoxéniques). Les souches bactériennes peuvent être suspendues dans un tampon salin (e.g. PBS) et inoculées à une quantité suffisante, par exemple d’environ 10⁷ CFU à environ 10⁹ CFU, notamment d’environ 10⁸ CFU par récipient ou boîte de pétri (notamment volume de 7ml de milieu nutritif).

Suivant une autre modalité, un groupe formant le groupe axénique est inoculé avec un tampon salin stérile.

Suivant une autre modalité, les deux groupes précités sont inclus.

(3) On détermine ensuite le nombre d’animaux qui terminent leur phase de croissance juvénile dans les différentes conditions d’inoculations, selon une fréquence déterminée (qui définit des périodes), de préférence quotidiennement. Pour ce faire on peut notamment compter le nombre de pupes formées, sur la période considérée, de préférence chaque jour. L’entrée en pupe signe la fin de la phase de croissance juvénile et l’entrée en métamorphose.

(4) On compare les résultats de la souche testée avec le groupe axénique et/ou avec la souche de référence. On peut raisonner avec le « J50 » dans chaque condition, à savoir la durée au bout de laquelle 50% des animaux ont achevé leur phase de croissance. On détermine ensuite le J50 moyen de chacun des groupes, et on compare les moyennes obtenues.

On peut par exemple représenter graphiquement le pourcentage cumulé d’animaux entrés en métamorphose relatif au nombre total de pupes obtenues à la fin de l’expérience (environ 40 pupes, avec un lot initial de 40 embryons). Ces courbes permettent de calculer graphiquement le « J50 » dans chaque condition, à savoir la durée au bout de laquelle 50% des animaux ont achevé leur phase de croissance. On détermine ensuite le J50 moyen de chacun des groupes, et on compare les moyennes obtenues.

On tire les conclusions de la ou des comparaisons. La souche bactérienne testée peut être considérée comme répondant positivement au test si la moyenne du J50 d’entrée en métamorphose du groupe inoculé avec cette souche est inférieure à la moyenne du J50 d’entrée en métamorphose du groupe axénique, avec une valeur de p inférieure ou égale à 0,001, de préférence inférieure ou égale à 0,0001 dans le test statistique de Mann-Whitney. Le test est réalisé sur l'ensemble du jeu de données des valeurs des J50 des deux groupes.

La souche bactérienne testée peut être considérée comme ayant un effet fort si la moyenne du J50 d’entrée en métamorphose du groupe inoculé avec cette souche est inférieure à la moyenne du J50 d’entrée en métamorphose du groupe L. plantarum WJL, avec une valeur de p inférieure ou sensiblement égale à 0,01 dans le test statistique de Mann-Whitney. Le test est réalisé sur l'ensemble du jeu de données des valeurs des J50 des deux groupes.

La souche bactérienne testée peut être considérée comme ayant un effet marqué si la moyenne du J50 d’entrée en métamorphose du groupe inoculé avec cette souche est inférieure à la moyenne du J50 d’entrée en métamorphose du groupe L. plantarum NIZO2877, avec une valeur de p inférieure ou sensiblement égale à 0,01 dans le test statistique de Mann-Whitney. Le test est réalisé sur l'ensemble du jeu de données des valeurs des J50 des deux groupes.

La souche bactérienne à tester à la recherche d’un effet favorable sur certains paramètres métaboliques peut être testée sur un modèle mammifère, notamment souris, possédant un microbiote normal. Ce test peut être appliqué d’emblée ou après présélection de la souche sur un modèle drosophile, notamment le modèle drosophile axénique de l’invention. Le principe de la méthode qui va être décrit à propos des souris, peut être extrapolé à un autre modèle mammifère.

Suivant une modalité de l’invention, une souche de bactérie ayant répondu positivement au test sur modèle drosophile est ensuite testée sur modèle mammifère, de préférence un modèle souris, possédant un microbiote normal, et recevant une nourriture riche en sucre et en lipides (régime hypercalorique), et l’on mesure un ou plusieurs paramètres choisis notamment parmi mesure de glycémie sanguine, tolérance au glucose, tolérance au pyruvate, une amélioration de l’un de ces paramètres signant un effet favorable de la bactérie sur le ou les paramètres du modèle, la souche en question pouvant être alors sélectionnée pour sa capacité à améliorer un ou plusieurs de ces paramètres.

La méthode peut comprendre l’élevage d’un groupe de souris (par exemple de 5 à 20 souris, typiquement 10 souris), possédant un statut conventionnel (possédant un microbiote entier), et recevant une nourriture riche en sucre et en lipides (régime hypercalorique).

On peut par ailleurs disposer de données comparatives préalablement obtenues sur des souris possédant un statut conventionnel (possédant un microbiote entier), par exemple de 5 à 20 souris, typiquement 10 souris, élevées avec accès libre à une nourriture de type standard. De préférence cependant, on élève ce groupe de souris en parallèle avec le groupe sous régime hypercalorique.

Par régime standard, on entend notamment un régime classiquement utilisé pour nourrir les animaux de laboratoire sans induire de maladies métaboliques. Un régime typique peut être composé de 16,9% de protéines, 4,3% de lipides et 55,5% de glucides (dont -1% de saccharose et 0% de maltodextrine).

Comme régime hypercalorique, on entend un régime qui diffère du standard par des teneurs en lipides et sucres élevées. Ces régimes sont classiquement utilisés pour induire une obésité, une résistance à l’insuline et un diabète chez les rongeurs. Un régime hypercalorique typique peut être composé de 20% de protéines, 36,1% de lipides et 35,1% de saccharose et de maltodextrine.

Différentes mesures peuvent être effectuées sur les groupes de souris. Elles peuvent être combinées deux à deux ou être toutes réalisées.

Une mesure de glycémie sanguine peut être effectuée sur les groupes de souris. Une ou plusieurs mesures peuvent être effectuées, les mesures étant bien entendu échelonnées dans le temps lorsqu’il y en a plusieurs. De préférence, la mesure de glycémie est précédée par une période de jeûne, notamment de plusieurs heures, typiquement 6 heures environ.

Un test de tolérance au glucose peut être effectué dans le but de mesurer la capacité des animaux à stocker plus ou moins le glucose circulant suite à une injection par voie intrapéritonéale de ce dernier. La glycémie est mesurée à temps zéro, ensuite les animaux sont injectés avec du glucose (par exemple 2g/kg), par exemple par voie intrapéritonéale, et différentes mesures de glycémie sont réalisée à différents temps (par exemple 15, 30, 60 et 90 minutes post-injection) pendant l’expérimentation.

Un test de tolérance au pyruvate peut être réalisé dans le but d’observer la fonction hépatique qui est dérégulée par le régime hypercalorique. Comme décrit pour le test de tolérance au glucose, le test de tolérance au pyruvate consiste à injecter du pyruvate (par exemple 1,5g/kg), par exemple par voie intrapéritonéale. Le taux de glucose est mesuré à différents temps, par exemple 0, 15, 30, 60 et 90 min.

La méthode avec le modèle souris peut comprendre les étapes suivantes :

(1) des souris (par exemple issues de la lignée C57BL/6 et âgées de 4 semaines) possédant un statut conventionnel (possédant un microbiote entier) sont élevés en deux groupes de plusieurs individus (par exemple de 5 à 20 souris, typiquement 10 souris), l’un avec accès libre à une nourriture de type standard pour les souris, l’autre une nourriture riche en sucre et en lipides (régime hypercalorique).

(2) L’administration de la souche bactérienne à tester débute en même temps que la mise des animaux sous ces régimes alimentaires, standard et hypercalorique. L’administration des bactéries par voie orale peut être effectuée plusieurs fois, par exemple 5 fois (à des jours différents), par semaine avec d’environ 10⁸ CFUs à environ 10¹° CFUs, typiquement environ 10⁹ CFUs par souris à chaque administration, pour une durée totale de plusieurs semaines, typiquement 10 semaines. Les souris contrôles ne recevant pas les bactéries sont gavées avec l’excipient (solution saline).

(3) Les souris sont caractérisées métaboliquement grâce à une mesure de la glycémie, cette mesure étant de préférence effectuée après une période de jeûne, notamment de 4 à 8 heures, typiquement après 6 heures de jeûne. La mesure est effectuée par un prélèvement d’une goutte de sang, par exemple à la queue, et en utilisant un lecteur de glycémie ou toute autre méthode ou outils appropriés. Ces mesures sont réalisées de préférence 2 à 4, typiquement 4, semaines après le début du nourrissage décrit plus haut (post-gavage).

(4) Un test de tolérance au glucose peut également être réalisé sur ces souris dans le but de mesurer la capacité des animaux à stocker plus ou moins le glucose circulant suite à une injection par voie intrapéritonéale de ce dernier. Les souris sont mises à jeun pendant de 4 à 8 heures, typiquement 6 heures. La glycémie est mesurée à temps zéro, ensuite les animaux sont injectés avec du glucose (2g/kg), par exemple par voie intrapéritonéale, et différentes mesures de glycémie sont réalisées à différents temps (par exemple 15, 30, 60 et 90 minutes post-injection) pendant l’expérimentation.

(5) Les souris peuvent être caractérisées à nouveau métaboliquement en utilisant les mêmes approches décrites précédemment (glycémie à jeun et/ou test de tolérance au glucose). Par exemple 9 et 10 semaines post-gavage.

(6) Un test de tolérance au pyruvate peut être réalisé dans le but d’observer la fonction hépatique qui est dérégulée par le régime hypercalorique. Comme décrit pour le test de tolérance au glucose, le test de tolérance au pyruvate consiste à injecter du pyruvate (par exemple 1,5g/kg) par voie intrapéritonéale. Le taux de glucose est mesuré à différents temps, par exemple 0, 15, 30, 60 et 90 min.

Les animaux sont sacrifiés (par exemple à la fin de la semaine 10 postgavage) et les différents tissus peuvent être collectés afin de réaliser des expériences plus approfondies comme des dosages sériques dans le sang (insuline), notamment par ELISA. Le dosage de l’insuline peut être réalisé sur du plasma pur (souris standard) ou dilué au % (souris mises sous régime hypercalorique) en utilisant des kits ELISA commerciaux spécifiques pour la détection de l’insuline en suivant les instructions du fabricant.

La souche de bactérie lactique est considérée comme répondant positivement au test si la glycémie et l’insuline à jeun ainsi que les éventuels tests métaboliques sont significativement inférieurs aux groupes contrôles correspondants (souris recevant l’excipient), avec une valeur de probabilité d’erreur p inférieure à 0,05 dans le test Mann-Whitney.

Le criblage peut aussi intégrer un groupe de souris qui sera inoculé avec une souche bactérienne de référence, qui possède un effet positif dans ce test; on peut ainsi utiliser la souche L. plantarum WJL. La souche bactérienne testée est considérée comme répondant très positivement au test si la glycémie et l’insuline à jeun ainsi que les éventuels tests métaboliques sont significativement inférieurs ou sensiblement égaux à ce groupe de référence, avec une valeur de probabilité d’erreur p inférieure à 0,05 dans le test Mann-Whitney.

L’invention propose notamment des souches de bactérie à tropisme intestinal appartenant aux familles suivantes Lactobacillaceae, Streptoccaceae, Enterococcaceae, Leuconostocaceae, Bifidobacteriaceae. Suivant une modalité, l’invention utilise une ou des souches du genre Lactobacillus, en particulier de l’une des espèces suivantes, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus.

Plus particulièrement, il s’agit de bactéries appartenant aux espèces Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactobacillus ίο paracasei, Lactobacillus rhamnosus. Suivant une modalité, la souche est choisie parmi les espèces Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei.

Suivant un mode de réalisation, la souche de bactérie est choisie parmi L. plantarum WJL, L. plantarum G821 (CNCM I-4979), L. plantarum NIZO2877, L. casei ATCC 393, L. casei L919, L. paracasei ATCC25302, L. paracasei Shirota, L. fermentum ATCC9338, L. rhamnosus L900, L. rhamnosus L908, L. rhamnosus GG. Suivant une modalité, la souche est choisie parmi L. plantarum WJL, L. plantarum G821, L. case/'ATCC 393, L. casei L919, L. fermentum ATCC9338.

Les souches ayant été sélectionnées sur le modèle drosophile, sur le modèle souris ou sur les deux modèles sont considérées comme ayant un effet favorable sur la santé métabolique du mammifère cible, dont l’homme. Le modèle souris ou similaire a en outre l’avantage de donner des indications précises sur le ou les paramètres mesurés tels que la glycémie sanguine, le test de tolérance au glucose, le test de tolérance au pyruvate. Ceci permet de prédire un effet favorable de la souche chez le mammifère cible sur la glycémie, la tolérance au glucose et/ou la tolérance au pyruvate (capacité à baisser ou contenir le taux de glucose chez un patient sain ou ayant une intolérance au glucose ou en diabète de type 2, à améliorer la tolérance au glucose et/ou au pyruvate, à améliorer le statut d’un individu ayant une intolérance au glucose ou en diabète de type 2)).

On retient notamment une souche de bactérie ayant conduit à un effet favorable sur le modèle drosophile et sur le modèle mammifère, comme ayant un effet favorable sur la santé métabolique.

Les bactéries répondant positivement à la méthode de l’invention sont utilisables pour diminuer les maladies métaboliques, en particulier l’intolérance au glucose et/ou le diabète de type 2 ou ralentir leur progression.

Pour sélectionner des bactéries destinées à la diminution, ou au ralentissement de la progression, des maladies métaboliques, en particulier de l’intolérance au glucose et/ou du diabète de type 2, on préfère suivre au moins deux des paramètres susvisés sur le modèle mammifère, de préférence les trois paramètres : glycémie à jeun, tolérance au glucose et tolérance au pyruvate.

La présente invention a aussi pour objet une composition comprenant au moins une souche de bactérie ayant un tropisme intestinal, en particulier une bactérie lactique de l’espèce L. plantarum, pour utilisation pour la prévention et/ou le traitement des maladies métaboliques, en particulier le diabète de type 2. A titre d’exemple, on peut citer la souche suivante : L. plantarum WJL. L. plantarum WJL (Eun-Kyoung Kim et al., Genome Announcements, November/December 2013, vol. 1, n° 6 e00937-13, GenBank AUTE00000000, Lactobacillus plantarum WJL, whole genome shotgun sequencing project). Cette souche WJL a été initialement isolée et peut être isolée de la drosophile (JH Ryu et al., Science 2008, 319 : 777-782). D’autres souches peuvent être identifiées parmi les bactéries à tropisme intestinal et notamment parmi les espèces et souches mentionnées plus haut, notamment parmi les souches L. plantarum G821 et L. plantarum NIZO2877. La souche G821 est divulgué dans WO2015173386 et déposée à la Collection Nationale de Culture de Microorganismes (Institut Pasteur) sous le numéro d’enregistrement CNCM I-4979 le 11 mai 2015. La souche G821 a été obtenue par évolution expérimentale, c’est-à-dire par accumulation et sélection de variants naturels de la souche L. plantarum NIZO2877 (collection NIZO (2877)).

La composition peut notamment contenir une quantité d’environ 10⁵ à environ 10¹², notamment d’environ 10⁶ à environ 10¹², de préférence d’environ 10⁸ à environ 10¹² cellules bactériennes formant des colonies (CFU) selon l’invention, par gramme de composition. Le terme CFU signifie « colony forming units » selon l’expression technique anglaise. Par gramme de composition, on entend de préférence le probiotique formé des bactéries, co-ingrédients, et excipients ou vecteurs. Par cellules bactériennes, on entend une souche de bactérie unique conforme à l’invention ou un mélange d’au moins deux bactéries, conformes à l’invention.

La composition peut notamment comprendre la ou les bactéries lactiques sous forme vivante. La composition peut se présenter sous une forme prête à l’emploi ou à mélanger ou diluer avec un aliment, un excipient ou un liquide alimentaire tel que de l’eau de boisson.

Il peut s’agir d’une suspension bactérienne, qui peut être congelée et décongelée avant usage.

Il peut s’agir d’une poudre lyophilisée, pouvant être utilisée telle quelle, sous forme de poudre, de granulés, de comprimé, de bolus, de capsule, de gélule, ou utilisée après reprise dans un véhicule approprié. Cette composition peut comprendre un excipient de lyophilisation classique.

La composition peut être une forme d’administration orale (par exemple poudre, gélule, comprimé, bolus) sous une forme gastro-protégée permettant de passer l’estomac et libérer les bactéries dans l’intestin.

Suivant un mode de réalisation, la composition est une composition solide, e.g. comprimé, bolus, gélule, capsule, gastro-protégée permettant de passer l’estomac et libérer les bactéries dans l’intestin. Selon une modalité, la forme, notamment granulés, est utilisable en alimentation en milieu aqueux, pour les poissons notamment.

Suivant un mode de réalisation, la composition est un liquide ou est à dissoudre dans un liquide ou à mettre en suspension dans un liquide, par exemple l’eau de boisson, dans ce cas la composition est initialement solide, e.g. poudre, granulé, comprimé dissolvable, par exemple comprimé effervescent, ou comprimé déliquescent dans le liquide.

Suivant un mode de réalisation, la composition est solide, e.g. poudre, granulé, comprimé, bolus, et destinée ou apte à être mélangée à un aliment.

Suivant un mode de réalisation, la composition est solide, sous une forme prête à l’emploi sans besoin de mélange à un aliment, mais pouvant être néanmoins mélangée à un aliment, par exemple comprimé ou bolus appétant.

L’invention a aussi pour objet une méthode de traitement probiotique pour la prévention et/ou le traitement des maladies métaboliques, en particulier le diabète de type 2, comprenant l’administration à un mammifère incluant l’homme, d’une composition selon l’invention. Par mammifère, en plus de l’homme, on entend les animaux d’élevage, notamment grands animaux, bovin et porc par exemple, les animaux de sport, notamment cheval, et les animaux de compagnie, notamment chat et chien. Suivant une caractéristique de l’invention, on exclut la souris et/ou de manière plus générale les rongeurs. De préférence, la composition est administrée par voie orale.

Ce traitement probiotique comprend l’administration d’une quantité suffisante d’une composition telle que décrite ci-dessus au patient humain ou mammifère. La méthode comprendra l’administration en une ou plusieurs fois, pouvant être échelonnée sur la période de traitement, de doses de composition selon l’invention. Les doses peuvent être fractionnées pour faciliter l’administration. La fréquence d’administration est notamment comprise entre une dose (unique ou fractionnée) tous les jours et une dose tous les mois. Typiquement, la fréquence d’administration sera comprise entre une dose (unique ou fractionnée) tous les jours et une dose toutes les semaines, voire tous les 2, 3, 4, 5 ou 6 jours. Chaque dose (unique ou fractionnée) représente notamment plusieurs grammes à plusieurs dizaines de gramme de composition.

La méthode comprend notamment l’administration d’une composition comprenant une quantité d’environ 10⁵ à environ 10¹², notamment d’environ 10⁶ à environ 10¹², de préférence d’environ 10⁸ à environ 10¹² cellules bactériennes formant des colonies CFU par gramme de composition (par cellules bactériennes, on entend une souche de bactérie unique conforme à l’invention ou un mélange d’au moins deux bactéries, conformes à l’invention).

La méthode comprend de préférence l’administration d’une composition comprenant la ou les bactéries lactiques sous forme vivante.

La forme de la composition peut être solide ou liquide et prendre l’une quelconque des formes présentées supra.

L’invention va être maintenant décrite plus en détail à l’aide de modes de réalisation pris à titre d’exemples non limitatifs.

Les données du tableau 1 représentent l’effet de différentes souches de L. plantarum (souches WJL et NIZO2877) sur la correction du temps d'entrée en métamorphose de larves de drosophiles alimentées sur une base de levure et de saccharose (10 g de levure inactivée pour 50 g de saccharose). Ces résultats démontrent que les deux souches présentent la capacité de tamponner les effets délétères d'une nutrition hypercalorique sur la date d'entrée en métamorphose et que la souche WJL est plus performante que la souche NIZO2877. La souche WJL présente un effet marqué et la souche NIZO2877 un effet modéré (** p<0,01).

Les données des tableaux 2A,B et C montrent l’impact de souches de L. plantarum sur les paramètres métaboliques de souris sous régime alimentaire normal (conventionnel - Standard Calory Diet, SCD). Panel A: Dès 4 semaines de traitement, L. plantarum^WJL améliore la glycémie à jeun (6 heures de jeune avant mesure) et (panels B-C) dès 9 semaines de traitement la tolérance au glucose (IPGTT = test de tolérance au glucose par voie intrapéritonéale ; AUC : aire sous la courbe). La souche NIZO2877 ne montre pas d’effet significatif sur ces paramètres.. * p<0,05 ; ** p<0,01.

Les données des tableaux 3 A,B,C,D,E et F montrent l’impact de l’administration quotidienne de 10⁹ CFU de L. plantarum^N'^>L, sur le métabolisme du glucose de souris sous régime alimentaire riche en calories (High Calory Diet: HCD).. 9 semaines d’administration améliorent de manière prononcée (A) la glycémie à jeun, (B-C) la tolérance au glucose (GTT; AUC : aire sous la courbe), (D-E) la tolérance au pyruvate (PTT) et (F) l'insulinémie à jeun ce qui démontre des propriétés antidiabétiques marquées de la souche L. plantarum^WJL, sur le métabolisme du glucose (* p<0,05 ; ** p<0,01 ; *** p<0,001).

EXEMPLES :

Exemple 1 : modèle drosophile

Le test drosophile est typiquement mené de la manière suivante :

- on dispose d’un lot d’embryons issus de parents Drosophila melanogaster (souche Drosophila yw) axéniques ;

- à JO: on répartit ces embryons en au moins 3 groupes (40 embryons, réalisé en 6 replicats pour un total de 240 embryons par groupe) dans des boites de pétri contenant du milieu nutritionnel comprenant de la levure inactivée, de l'agar, de l’eau et du saccharose. Nous étudions au minimum 3 groupes : un premier groupe d’embryons est inoculé avec la souche bactérienne de référence L. plantarum^WJL, et un ou plusieurs groupe(s) sont inoculés avec la(les) souche(s) à tester (groupes monoxéniques ; dans l’exemple de réalisation souche NIZO2877). Pour l’inoculum, les souches bactériennes sont suspendues dans un tampon salin (e.g. PBS) et sont inoculées à une quantité d’environ 10⁸ CFU par boîte de pétri. Enfin, le groupe formant le groupe axénique est inoculé avec un tampon salin stérile. On conduit l’élevage à environ 25°c, avec un cycle jour nuit de 12h/12h. Typiquement le milieu nutritionnel est constitué, pour 1 litre de milieu, de 7,14 g d’agar, 10 g de levure inactivée et 50g de saccharose. Le milieu est cuit dans l’eau bouillante pendant 10 min, puis laissé à refroidir pour solidification.

- On détermine ensuite quotidiennement le nombre d’animaux qui terminent leur phase de croissance juvénile dans les différentes conditions d’inoculations. Pour ce faire nous comptons le nombre de pupes formées chaque jour. L’entrée en métamorphose signe la fin de la phase de croissance juvénile.

Nous notons la date à laquelle 50% des animaux sont entrés en métamorphose.

- On compare les moyennes obtenues: la souche bactérienne testée est considérée comme répondant positivement au test si la moyenne du J50 d’entrée en métamorphose du groupe inoculé avec cette souche est inférieure à la moyenne du J50 d’entrée en métamorphose du groupe axénique, avec une valeur de p inférieure ou égale à 0,01, dans le test statistique de Mann-Whitney. Le test est réalisé sur l'ensemble du jeu de données des valeurs des J50 des deux groupes.

Le tableau 1 présente les données obtenues en termes de J50 d’animaux entrés en métamorphose relatif au nombre total de pupes obtenues à la fin de l’expérience, dans l’exemple Axénique, L. plantarum^WL et L. plantarum^NIZ02Brr

Les J50 calculés sont présentés dans le tableau 1

	J50 entrée en métamorphose	moyenne	écart type
Axénique	13,8	13,8	13,9	14,2	13,6	14	13,8833333	0,20412415
L.plantarum ^WJL	8,7	8,9	8,7	7,8	8,3	8,3	8,45	0,39874804
L.plantarum ^NIZUZ0	12,17	9,2	10,5	11,1	10,5	11,1	10,7616667	0,9785789

	Analyse statistique
comparaison animaux axéniques	comparaison/ L.plantarumWJL
valeur de p	signification statistique	valeur de p	signification statistique
Axénique	n/a	n/a	<0,01	**
L.plantarumWJL	<0,01	**	n/a	n/a
L.plantarum NIZO2877	<0,01	**	<0,01	**

	Interprétation du test qualitatif (niveau quantitatif)

L.plantarumWJL	SPM (effet marqué)
L.plantarum NIZO2877	SPM (effet intermediaire)


	SPM= souche promotrice de croissance

Exemple 2 : modèle souris

Des souris issues de la lignée C57BL/6 et âgées de 4 semaines ont été utilisées dans cette étude. Les animaux possèdent un statut conventionnel (possédant un microbiote entier) et sont élevés dans des conditions sanitaires contrôlées. Ils ont un accès libre à deux types d’alimentation : la première est une nourriture de type standard et la deuxième est riche en sucre et en lipides (régime hypercalorique).

- à 4 semaines d’âge : 10 souris par groupe expérimental sont étudiés.

L’administration des souches bactériennes L. plantarum WJL et L. plantarum

NIZO2877 a débuté en même temps que la mise des animaux sous régimes alimentaires, standard et hypercalorique. L’administration des bactéries par voie orale est effectuée 5 fois par semaine avec 10^{5 * * * 9 10 * * * * 15} CFU/souris/jour pour une durée totale de 10 semaines. Les souris contrôles ne recevant pas les bactéries sont gavées avec l’excipient (solution saline).

- à 3 semaines post-gavage : les souris sont caractérisées métaboliquement grâce à une mesure de la glycémie après 6 heures de jeûne. La mesure est effectuée par un prélèvement d’une goutte de sang à la queue et en utilisant un lecteur de glycémie. Un test de tolérance au glucose est également réalisé sur ces souris dans le but de mesurer la capacité des animaux à stocker plus ou moins le glucose circulant suite à une injection par voie intrapéritonéale de ce dernier. Les souris sont mises à jeun pendant 6 heures. La glycémie est mesurée à temps zéro, ensuite les animaux sont injectés avec du glucose (2g/kg) par voie intrapéritonéale et différentes mesures de glycémie sont réalisée à différents temps (15, 30, 60 et 90 minutes postinjection) pendant l’expérimentation.

- à 9 et 10 semaines post-gavage : les souris sont caractérisées à nouveau métaboliquement en utilisant les mêmes approches décrites précédemment (glycémie à jeun et test de tolérance au glucose). Cependant, un test de tolérance au pyruvate est réalisé dans le but d’observer la fonction hépatique qui est dérégulée par le régime hypercalorique. Comme décrit pour le test de tolérance au glucose, le test de tolérance au pyruvate consiste à injecter du pyruvate (1,5g/kg) par voie intrapéritonéale. Le taux de glucose est mesuré à temps 0, 15, 30, 60 et 90 min.

- à la fin de la semaine 10 post-gavage : les animaux sont sacrifiés et les différents tissus sont collectés afin de réaliser des expériences plus approfondis comme des dosages sériques dans le sang (insuline). Le dosage de l’insuline est réalisé sur du plasma pur (souris standard) ou dilué au % (souris mises sous régime hypercalorique) en utilisant des kits ELISA commerciaux spécifiques pour la détection de l’insuline en suivant les instructions du fabricant.

La souche de bactérie lactique étant considérée comme répondant positivement au test si la glycémie et l’insuline à jeun ainsi que les tests métaboliques sont significativement inférieurs aux groupes contrôles correspondant (souris recevant l’excipient), avec une valeur de probabilité d’erreur p inférieure à 0,05 dans le test Mann-Whitney.

Résultats obtenus avec les souches L. plantarum WJL et L. plantarum NIZO2877, et un contrôle non-traités :

Tableau 2A : données brutes

SCD-PBS	SCD-WJL	SCD-#2877
100	81	105
93	102	110
108	117	123
110	97	98
110	92	102
107	88	105
125	91	107
101	85	99
125	116	108
105	100	110

	SCD-PBS	SCD-WJL	SCD-#2877	Analyse statistique
Moyenne	108,4	96,9	106,7	WJL vs. PBS	WJL vs. #2877
Ecart-type	7,3	9,5	4,9	Valeur de p	Significativité	Valeur de p	Significativité
Nb	10	10	10	<0,05	*	<0,05	*

Tableau 2B : données brutes

Temps (min)	TO	T15	T30	T45	T60	T90
	100	223,7	164,0	139,5	132,5	108,8
<Λ £Û	100	278,8	176,3	161,9	163,6	137,3
Û_ t O	100	338,1	178,8	188,1	179,7	129,7
<J (Z)	100	256,8	145,5	135,6	122,0	113,6
	100	224,1	179,3	178,4	163,8	135,3

	T0	T15	T30	T45	T60	T90
, SCD-PBS	Moyenne Ecart-type Nb	100 0 10	264.3 35.3 5	168,8 11,2 5	160,7 18,5 5	152,3 20,1 5	124,9 11,0 5

SCD-WJL	Moyenne	100	200,5	148,5	139,1	130,6	120,9
	Ecart-type	0	16,0	11,1	14,9	8,2	7,0
	Nb	10	5	5	5	5	5

	Moyenne	100	238,2	165,7	150,2	149,9	127,0
SCD-#2877	Ecart-type	0	29,9	4,5	10,7	9,8	7,9
	Nb	10	5	5	5	5	5

Tableau 2C : données brutes

SCD-PBS	SCD-WJL	SCD-#2877
5017.5 8100 9652.5 5595 7065	4800 4507.5 4080 5962.5 3735	6120 6322.5 6825 7267.5 5152.5
	SCD-PBS	SCD-WJL	SCD-#2877	Analyse statistique
Moyenne	7086	4617	6337	WJL vs. PBS	PBS VS. #2877
Ecart-type	1432,2	611,4	567	Valeur de p	Significativité	Valeur de p	Significativité
Nb	5	5	5	<0,01	* *	n/a	n/a

Tableau 3A : données brutes

SCD-PBS	HCD-PBS	HCD-WJL
155	182	156
128	177	155
122	155	148
120	165	164
107	167	141
148	168	157
143	174	157
146	165	187
132	183	150
139		131

	SCD-PBS HCD-PBS HCD-WJL	Analyse statistique
Moyenne	134 \| 170,7 \| 154,6	HCD-PBS vs. SCD-PBS	HCD-WJL vs. HCD-PBS

Ecart-type	12,2	7,4	9,7	Valeur de p	Significativité	Valeur de p	Significativité
Nb	10	9	10	<0,0001	****	<0,01	**

Tableau 3B: données brutes

Temps (min)	T0	T15	T30	T60	T90
	100	210,2	244,1	257,6	254,2
	100	157,8	161,7	176,6	145,3
	100	270,7	250,9	237,1	140,5
</>	100	299,3	197,1	183,2	139,4
Cû û.	100	257,4	232,6	220,6	241,1
Q U (/)	100	468,6	295,2	219,0	182,9
100	298,5	189,6	180,6	153,7
	100	256,2	158,7	162,8	91,7
	100	261,5	190,4	160,9	112,2
	100	237,9	124,8	118,0	99,4

	100	275,6	257,6	243,3	227,6
	100	331,5	332,2	388,6	356,4
	100	296,1	310,5	331,5	330,4
(/)	100	296,1	323,8	331,5	298,9
CÛ û. 1	100	284,4	284,4	284,4	257,8
O U	100	315,0	346,8	493,6	279,2
X	100	290,3	340,9	340,9	315,3
	100	230,8	230,8	230,8	230,8
	100	339,5	348,8	321,5	305,2
	100	274,0	274,0	274,0	274,0

	100	285,9	268,4	239,0	220,9
	100	209,7	259,7	233,1	216,2
	100	297,1	263,4	191,4	182,9
	100	300,0	317,4	266,3	243,8
5	100	277,6	214,4	207,5	204,0
o «J	100	374,2	297,5	289,3	278,0
X	100	262,9	247,1	242,4	241,2
	100	342,9	264,6	258,9	248,0
	100	304,2	249,7	243,6	242,4
	100	245,3	198,8	186,3	178,9

	T0	T15	T30	T60	T90
SCD-PBS Moyenne	100	I 271,8	I 204,5	191,6	156,1

	Ecart-type	0	50,2	41,0	33,6	42,0
	Nb	10	10	10	10	10

	Moyenne	100	290,1	302,2	321,7	285,3
HCD-PBS	Ecart-type	0	25,6	38,0	55,5	36,0
	Nb	10	10	10	10	10

	Moyenne	100	290,0	258,1	235,8	225,6
HCD-WJL	Ecart-type	0	33,7	24,5	25,0	25,1
	Nb	10	10	10	10	10

Tableau 3C: données brutes

SCD-PBS	HCD-PBS	HCD-WJL
16614,4	16624,4	16457,6
7060,5	29375,8	14717,5
13338,4	25006,9	13234,3
10100,4	24360,5	19689,6
15005,3	19944,3	13194,0
17764,3	31868,5	22415,1
10231,3	25576,7	16394,1
6241,7	14711,5	18934,3
7562,5	25316,9	17168,2
3419,3	19571,9	10653,7

	SCD-PBS	HCD-PBS	HCD-WJL	Analyse statistique
Moyenne	10733,8	23235,7	16285,8	HCD-PBS VS. SCD-PBS	HCD-WJL vs. HCD-PBS
Ecart-type	3957,4	4418,2	2668,8	Valeur de p	Significativité	Valeur de p	Significativité
Nb	10	10	10	<0,001	***	<0,05	*

Tableau 3D: données brutes

Temps (min)	T0	T15	T30	T60	T90
	83	87,0	83,0	103,0	90,0
	77	150,0	154,0	144,0	130,0
	88	144,0	165,0	188,0	186,0
	83	137,0	153,0	146,0	131,0
CÛ û.	99	157,0	175,0	175,0	115,0
O U	78	130,0	160,0	140,0	129,0
ΙΛ	109	149,0	151,0	171,0	137,0
	88	152,0	172,0	176,0	132,0
	96	145,0	166,0	174,0	159,0
	92	141,0	171,0	149,0	121,0

145	268,0	248,0	305,0	264,0
107	199,0	220,0	248,0	200,0
115	187,0	217,0	239,0	203,0
98	170,0	184,0	241,0	209,0
130	178,0	223,0	273,0	244,0
126	224,0	265,0	169,0	195,0
152	208,0	223,0	310,0	255,0
177	231,0	286,0	272,0	245,0
211	330,0	321,0	313,0	281,0

	103	127,0	159,0	236,0	233,0
	100	155,0	170,0	207,0	200,0
	98	114,0	136,0	154,0	148,0
—1	121	207,0	188,0	192,0	183,0
“1 5	88	148,0	172,0	195,0	134,0
û U	116	133,0	168,0	171,0	159,0
X	107	161,0	204,0	214,0	224,0
	135	197,0	166,0	202,0	185,0
	142	198,0	222,0	285,0	227,0
	97	117,0	134,0	171,0	202,0

	TO	T15	T30	T6O	T90
	Moyenne	89,3	139,2	155	156,6	133
SCD-PBS	Ecart-type	7,76	12,72	15,8	20,2	16,6
	Nb	10	10	10	10	10

	Moyenne	140,1	221,7	243,0	263,3	232,9
HCD-PBS	Ecart-type	27,7	37,0	32,9	34,7	27,7
	Nb	10	10	10	10	10

Moyenne	110,7	155,7	171,9	202,7	189,5
Ecart-type	14,2	28,0	19,7	26,2	27,7
Nb	10	10	10	10	10

Tableau 3E: données brutes

SCD-PBS	HCD-PBS	HCD-WJL
1170	14932,5	11505
7432,5	13057,5	10215
10012,5	11595	5115

6660	12780	7852,5
6480	12667,5	8985
6945	8602,5	5190
5175	12637,5	11317,5
8130	9577,5	6142,5
7710	10950	11625
5947,5		7612,5

	SCD-PBS	HCD-PBS	HCD-WJL	Analyse statistique
Moyenne	6566,3	11981,3	8556,0	HCD-PBS vs. SCD-PBS	HCD-WJL vs. HCD-PBS
Ecart-type	1498,5	1542,2	2173,5	Valeur de p	Significativité	Valeur de P	Significativité
Nb	10	9	10	<0,001	***	<0,001	***

Tableau 3F: données brutes

SCD-PBS	HCD-PBS	HCD-WJL
0,70	3,97	1,73
0,25	5,34	2,09
0,25	1,49	3,84
0,62	1,82	1,36
0,61	2,55	0,47
0,63	9,12	1,51
0,15	2,91	3,44
0,47	5,41	4,36
1,04 0,29		1,13

	SCD-PBS	HCD-PBS	HCD-WJL	Analyse statistique
Moyenne	0,5	4,1	2,2	HCD-PBS vs. SCD-PBS	HCD-WJL vs. HCD-PBS
Ecart-type	0,2	1,9	1,1	Valeur de p	Significativité	Valeur de P	Significativité
Nb	10	8	9	<0,001	***	<0,05	*

Chez la souris conventionnelle sous régime alimentaire normal 4 semaines de traitement avec la souche L. plantarum^WL améliore la glycémie à jeun et dès 9 semaines de traitement la tolérance au glucose.

Chez la souris conventionnelle sous régime alimentaire riche en calories, 9 semaines d’administration de la souche L. plantarum^mL améliore de manière prononcée la glycémie à jeun, la tolérance au glucose, la tolérance au pyruvate et l'insulinémie à jeun ce qui démontre des propriétés fonctionnelles marquées de cette souche sur le métabolisme du glucose.

Exemple 3 : Des souches sont disponibles à l'ATCC, à l'Institut Pasteur de Paris, à l'Institut Pasteur de Lille ou publié dans la littérature scientifique et disponible auprès des chercheurs référents des publications mentionnées :

Claims

Revendications

1. Méthode de criblage de bactéries à tropisme intestinal chez un mammifère, susceptibles de diminuer, ou ralentir la progression, des maladies métaboliques, en particulier le diabète de type 2, dans lequel on monocolonise des larves de drosophiles initialement axéniques, par la souche de bactérie à tester, on élève ces larves avec un milieu nutritionnel hypercalorique, on mesure au moins un paramètre de maturation des larves, on détermine si la bactérie a eu un effet significativement favorable sur le paramètre de maturation, et l’on conclut le cas échéant que ladite souche a un effet favorable sur la maturation.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle on détermine si la bactérie conduit à un paramètre de maturation en amélioration significative par rapport à un contrôle constitué de larves axéniques élevées dans des conditions nutritionnelles similaires.
3. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle on détermine si la bactérie conduit à un paramètre de maturation sensiblement égal ou amélioré par rapport à une référence constituée de larves monocolonisées par une souche de référence qui présente elle-même un paramètre de croissance en amélioration significative par rapport à un contrôle correspondant à des larves axéniques élevées dans des conditions nutritionnelles similaires.
4. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle on élève des embryons de drosophile axéniques sur un milieu nutritionnel, on les inocule avec la souche bactérienne à tester (les larves issues de ces embryons sont alors monoxéniques pour cette souche à tester), on mesure un paramètre de maturation des larves, et on compare les résultats obtenus avec les données obtenues avec des larves de drosophile axéniques élevées sur le même milieu nutritionnel (groupe contrôle) et/ou avec des larves de drosophile monoxéniques pour une souche de référence élevée sur le même milieu nutritionnel (groupe de référence).
5. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle à JO: on répartit des embryons en au moins 2 groupes sur du milieu nutritionnel hypercalorique, comprenant notamment de la levure inactivée, de l'agar, de l’eau et du saccharose, dans des récipients adaptés, un premier groupe d’embryons est inoculé avec la souche bactérienne à tester (groupe monoxénique), le groupe formant le groupe axénique est inoculé avec un tampon salin stérile.
6. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle, une souche de bactérie ayant répondu positivement au test sur modèle drosophile est ensuite testée sur modèle mammifère, de préférence un modèle souris, possédant un microbiote normal, et recevant une nourriture riche en sucre et en lipides (régime hypercalorique), et l’on mesure un ou plusieurs paramètres choisis parmi mesure de glycémie sanguine, test de tolérance au glucose, test de tolérance au pyruvate, et on sélectionne une souche ayant apporté une amélioration de l’un de ces paramètres.

5
7. Méthode selon la revendication 6, dans laquelle on dispose d’un contrôle avec des souris possédant un microbiote entier et élevées avec accès libre à une nourriture de type standard.
8. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle on retient une souche de bactérie ayant conduit à un effet favorable sur le modèle

10 drosophile et/ou sur le modèle mammifère, comme ayant un effet favorable sur la santé métabolique.
9. Composition comprenant au moins une souche de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, pour utilisation pour diminuer, ou ralentir la progression, des maladies

15 métaboliques, en particulier le diabète de type 2.
10. Composition selon la revendication 9, dans laquelle L. plantarum est L. plantarum WJL ou L. plantarum NIZO2877.